Summary
इस प्रोटोकॉल रोग विकृतियों में सेल प्रतिक्रिया का निर्धारण करने में सहायता करने के लिए इन विट्रो में शारीरिक या रोग रक्त के प्रवाह को दोहराता है। एक रक्त पंप के बहाव के चैम्बर भिगोना एक दबाव को शुरू करके, वाहिका भर में रक्त के प्रवाह को recapitulated जा सकता है और नाड़ी अन्तःचूचुक या एक अनुकरण करनेवाला सह संस्कृति की एक monolayer पर लगाया।
Abstract
रोग संयुक्त राज्य अमेरिका में मौत का एक आम कारण है। इस के साथ साथ, हम रोग विकृतियों की ओर प्रवाह की गतिशीलता के योगदान की जांच करने के लिए एक तरीका मौजूद है। दीवार stiffening, जख्म, या सभी तरल पदार्थ के प्रवाह की दर को प्रभावित कर सकता है जो आंशिक एक प्रकार का रोग है, और गुणवाला प्रवाह की भयावहता, या pulsatility सूचकांक के साथ अक्सर मौजूद अस्वस्थ धमनियों। विभिन्न प्रवाह की स्थिति की प्रतिकृति एक रक्त पंप के बहाव के चैम्बर भिगोना एक प्रवाह दबाव ट्यूनिंग का परिणाम है। एक सिकुड़ाया मध्यम पंप से गुणवाला दबाव को अवशोषित, और इसलिए pulsatility सूचकांक भिन्न करने के लिए एक बंद प्रवाह प्रणाली के भीतर हवा का परिचय देता है। इस के साथ साथ वर्णित विधि बस अत्यधिक चलाया इनपुट, और आसानी से मध्यम श्रेणी का परिणाम के साथ reproduced है। कुछ सीमाओं में ही प्रणाली द्वारा अनुमानित है, जो जटिल शारीरिक नाड़ी तरंग, का मनोरंजन कर रहे हैं। Endothelial कोशिकाओं, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, और fibroblasts रक्त के प्रवाह के लिए thr से प्रभावित हैंधमनी Ough। रक्त के प्रवाह के गतिशील घटक कार्डियक आउटपुट और धमनियों की दीवार के अनुपालन से निर्धारित होता है। प्रवाह की गतिशीलता के संवहनी सेल Mechano पारगमन साइटोकाइन जारी है और धमनी के भीतर प्रकार की कोशिकाओं के बीच परस्पर बात को गति प्रदान कर सकते हैं। नाड़ी कोशिकाओं के सह संस्कृति रक्त वाहिनियों की दीवार और यांत्रिक सिगनल को संवहनी प्रतिक्रिया पर एक अधिक सटीक तस्वीर को दर्शाती सेल सेल बातचीत है। प्रवाह के गतिशील और मतलब (या स्थिर) घटकों के लिए सेल प्रतिक्रिया सहित प्रवाह की गतिशीलता के योगदान, इसलिए रोग विकृति और उपचार प्रभावकारिता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण मीट्रिक है। इन विट्रो सह संस्कृति मॉडल को शुरू करने और दबाव नकली कार्डियक आउटपुट पैदा करता है जो रक्त पंप के बहाव भिगोना के माध्यम से, विभिन्न धमनी रोग विकृतियों की जांच की जा सकती है।
Introduction
हृदय रोगों के लिए रुग्णता दरों कई अस्वस्थ वाहिका से उत्पन्न के साथ, अमेरिका में सबसे बड़े हैं। स्वस्थ धमनियों एक endothelial सेल (ईसी) monolayer साथ लेपित मुलायम ल्यूमिनल सतह के साथ, लोचदार ऊतक से मिलकर बनता है। धमनी प्रवाह सकारात्मक मतलब प्रवाह की दर के साथ एक oscillating लहर समारोह के रूप में मॉडलिंग की जा सकती है। pulsatility सूचकांक (पीआई) दोलन परिमाण का भागफल और मतलब प्रवाह (।। पीआई = (अधिकतम - मिन) / माध्य) है, एक और चर पोत लोच के साथ इन विट्रो में मॉडलिंग कर दिया गया है 2 धमनी लोच प्रवाह के भंडारण में महत्वपूर्ण है। दिल संकुचन से ऊर्जा, सिस्टोलिक दबाव में विस्फारित, और रक्त प्रवाह में गड़बड़ी नियमन करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। दिल एक सुसंगत, गुणवाला, बड़ा प्रवाह को बनाए रखता है क्योंकि, धमनी विस्तार प्रवाह वेग, कतरनी तनाव, और पीआई को कम करने से प्रवाह स्थिरता बढ़ाने, पार के अनुभागीय क्षेत्र बढ़ जाती है। लोच के लिए अक्सर अस्वस्थ धमनियों वर्तमान परिवर्तनया अनुपालन, संवहनी remodeling, निशान ऊतक या कड़ा हो जाना 3, 4 से stiffening प्रदर्शित। इसके अतिरिक्त, ऐसे neointimal हाइपरप्लासिया (एनआईएच), 5 धमनीविस्फार और उच्च रक्तचाप के 6 और नाड़ी फाइब्रोसिस के रूप में 4 अन्य संवहनी विकारों, पोत व्यास कसना सकता है। हालांकि, मौजूदा दवा उपचार और संवहनी रोगों की युक्ति उपचार अक्सर अक्सर पोत आकृति विज्ञान और गुणों में परिवर्तन से जटिल है, जो रोग में पोत दीवार अनुपालन या रक्त प्रवाह की गतिशीलता के महत्व की उपेक्षा। न तो बैलून एंजियोप्लास्टी और न ही स्टेंटिंग दीवार लोच 7 की जटिलता का जवाब। इसलिए, खून की इन विट्रो मॉडलिंग धमनी रोग और उपचार से उत्पन्न बहती रोग विकृतियों और उपचार के भविष्य के प्रभावकारिता की जांच में महत्वपूर्ण है। इस के साथ साथ, हम रोग pathol में सेल प्रतिक्रिया का निर्धारण करने के लिए बनाया गया शारीरिक और रोग रक्त के प्रवाह को नकल करने की एक विधि का वर्णनogies। द्रव का प्रवाह वाहिका के भीतर सभी कोशिकाओं को प्रभावित करने, पोत स्वास्थ्य में एक महत्वपूर्ण यांत्रिक संकेत है जो पोत दीवार, पर कतरनी तनाव का कारण बनता है। तरल पदार्थ कतरनी के लिए संवहनी अन्तःचूचुक पर कई यांत्रिक सेंसर एन्दोथेलिअल 8 mechanosensing के लिए हाल ही में एक अध्ययन में दिखाया प्राथमिक बरौनी सहित पहचान की गई है। Endothelial सेल गतिविधि और आकृति विज्ञान प्रवाह वेग, दिशा, और pulsatility से प्रभावित हैं। इसके अतिरिक्त, चिकनी पेशी सेल (एसएमसी) प्रवास मध्य द्रव 9 के माध्यम से कम वेग प्रवाह की Mechano-संकेतों से प्रभावित किया जा सकता है, और भी प्रवाह और साइटोकाइन के माध्यम से प्रवाह संकेतों के Mechano पारगमन के लिए उनकी प्रतिक्रिया के माध्यम से endothelial कोशिकाओं से पैराक्राइन संकेत के माध्यम से किया जा सकता है 10 रिलीज। मतलब कतरनी, पीआई, और पैराक्राइन सिगनल की "खुराक" निर्भरता भी दूसरे पर आश्रित हो सकता है। Monolayer संस्कृति में यह अंत, विभिन्न "खुराक" के साथ तरल पदार्थ कतरनी को संवहनी सेल प्रतिक्रिया के निर्धारण के लिएया इन विट्रो में सह संस्कृति संवहनी पुर्ननिर्माण में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और रोग और उपचार भविष्यवाणी सुधार सकता है। इस प्रयोग में इस्तेमाल प्रवाह प्रणाली एक रक्त पंप, एक नदी के ऊपर प्रवाह भिगोना हवा जलाशय, केवल प्रयोगात्मक स्थापना, एक बहाव सेल संस्कृति, समानांतर प्लेट प्रवाह चैम्बर, और मीडिया जलाशय के दौरान इस्तेमाल एक बहाव फ्लो मीटर के होते हैं। , प्रवाह दर का मतलब है जैसे संवहनी प्रवाह चर का नियंत्रण प्रति मिनट धड़कता है, और पीआई नियंत्रित प्रवाह की दर, नाड़ी आवृत्ति, और दबाव की शुरूआत भिगोना के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। गुणवाला रक्त पंप बड़ा प्रवाह की दर, और नाड़ी आवृत्ति मतलब के लिए सीधे संबंधित है, नियंत्रित स्ट्रोक आवृत्ति पर, चर स्ट्रोक विस्थापन के साथ उपलब्ध हैं। प्रवाह सर्किट के भीतर एक हवा जलाशय का परिचय प्रवाह दोलन भयावहता को कम करने, दबाव भिगोना के लिए अनुमति देता है। भिगोना कक्ष के भीतर हवा होने का प्रवाह लहर से अतिरिक्त दबाव अनुमति देता है, सिकुड़ाया है, जबकि मीडिया, एक असंपीड्य द्रव हैहवा संपीड़न द्वारा अवशोषित। मीडिया अनुपात करने के लिए हवा में ज्यादा भिगोना कैसे होता है पर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है। चौड़ाई में 50 मिमी से लंबाई में 75 मिमी एक कस्टम सेल संस्कृति प्रवाह कक्ष एक्रिलिक से बनाया गया था। प्रवाह इनलेट पोर्ट के माध्यम से प्रवेश करती है, और प्रवाह कक्ष की सम्पूर्णता भर में लगातार प्रवाह प्रदान करने, इनलेट कई गुना के माध्यम से फैलता है। इसी प्रवाह और संरचनाओं चैम्बर दुकान पर मौजूद हैं। प्रकोष्ठों क्रियाशील स्लाइड्स पर वरीयता प्राप्त, और बाद में प्रवाह कक्ष से जुड़े होते हैं। यह आसानी से अध्ययन के बाद लिया गया बड़ी आबादी के लिए अनुमति देता है। सह संस्कृति प्रयोगों साइटोकाइन / प्रवाह परिवहन की अनुमति है जबकि संस्कृतियों के बीच सेल करने वाली सेल संपर्क समाप्त करने के लिए एक झरझरा पॉली कार्बोनेट झिल्ली उपयोग कर सकते हैं। यह प्रणाली पहले से, उच्च गड़बड़ी प्रवाह और endothelial monolayer संस्कृति और चुनाव आयोग / एसएमसी सह संस्कृति 1, 10 पर उसके प्रभाव मॉडल करने के लिए सेल प्रतिक्रिया के लिए विकृतिविज्ञानी उच्च गड़बड़ी की बीमारी की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इन प्रवाह चोर मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन करकेditions, हम प्रतिक्रिया सेल प्रवाह संकेत योगदान का निर्धारण करने में दूसरों की सहायता करने के लिए उम्मीद है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. silanization और स्लाइड के बायोमोलिक्यूल functionalization या polycarbonate झिल्ली
नोट: इस प्रोटोकॉल के भीतर रसायनों और समाधान के कई उच्च वाष्पीकरण दर (इथेनॉल (EtOH), एसीटोन, आदि) है। अन्य चरणों कम वाष्पीकरण दरों के लिए लंबे समय तक ऊष्मायन बार करना पड़ेगा। पैराफिन फिल्म कंटेनर सील करने के लिए सिफारिश की है। सावधानी: (सहित: सल्फ्यूरिक एसिड, एसीटोन, (3-aminopropyl) triethoxysilane, glutaraldehyde, EtOH) के रसायनों के कई खतरनाक, या अस्थिर माना जाता है। उपयोग करने से पहले उचित भंडारण, हैंडलिंग, और निपटान के लिए प्रत्येक सामग्री की सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (एमएसडीएस) से परामर्श करें।
- पूर्ण विसर्जन सुनिश्चित करने, उन्मुखीकरण के संबंध के बिना स्वच्छ, गिलास स्लाइड धुंधला डिश में 1 मिमी से 50 मिमी से 75 मिमी को मापने नई गिलास स्लाइड रखें। कदम 1.1-1.12 के लिए कंटेनर का प्रयोग करें।
नोट: सभी बाद काएं के लिए, 50 मिमी से 75 मिमी के आकार में कटौती 0.4 माइक्रोन रोमकूप आकार के साथ सह संस्कृति के लिए, पॉली कार्बोनेट शामिल हैं (पीसी) झिल्ली,पीसी functionalization और चुनाव आयोग बोने के लिए पी एस। - सल्फ्यूरिक एसिड (20%), हे / एन में स्लाइड को विसर्जित कर दिया।
सावधानी: उपयोग करने से पहले सल्फ्यूरिक एसिड के लिए एमएसडीएस से परामर्श करें। - 5 मिनट, तीन बार के लिए विआयनीकृत पानी में (डीआई) डुबो हर बार डि बदलकर स्लाइड धो लें।
- 30 मिनट के लिए एसीटोन में स्लाइड को विसर्जित कर दिया।
सावधानी: उपयोग करने से पहले एसीटोन के लिए एमएसडीएस से परामर्श करें। - 6% (3-aminopropyl) triethoxysilane / एसीटोन समाधान हे / एन में स्लाइड को विसर्जित कर दिया।
सावधानी: उपयोग करने से पहले (3-aminopropyl) triethoxysilane और एसीटोन के लिए एमएसडीएस से परामर्श करें। - एसीटोन हर बार बदल रहा है, 5 मिनट, तीन बार के लिए एसीटोन में स्लाइड को विसर्जित कर दिया।
सावधानी: उपयोग करने से पहले एसीटोन के लिए एमएसडीएस से परामर्श करें। - 5 मिनट, तीन बार के लिए डि में डुबो हर बार डि बदलकर स्लाइड धो लें।
- 60 मिनट के लिए 1.5% glutaraldehyde / डि समाधान में स्लाइड को विसर्जित कर दिया।
सावधानी: उपयोग करने से पहले glutaraldehyde के लिए एमएसडीएस से परामर्श करें। - 5 मिनट, दो बार के लिए डि में डुबो हर बार डि बदलकर स्लाइड धो लें।
- प्लेस स्लाइडबाँझ, लामिना का प्रवाह हुड में 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल (EtOH) में है।
- EtOH निकालें और लुप्त हो जाना अवशेषों शेष अनुमति देते हैं। स्लाइड rehydrate करने के क्रम में बाँझ डि और नाली में विसर्जित स्लाइड।
नोट: स्लाइड या पीसी झिल्ली एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर कांच स्लाइड धारक में बंद है और संग्रहित किया जा सकता है। सेल संस्कृति के लिए उपयोग करने पर, दोहराने 1.10 और 1.11 कदम। - स्लाइड धारक से स्लाइड निकालें और लामिना का प्रवाह हुड में 100 मिमी वर्ग पेट्री डिश से एक 100 मिमी में जगह।
नोट: इस कंटेनर शेष सभी चरणों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।- मोनोकल्चर प्रयोग के लिए endothelial सेल बोने के लिए स्लाइड या पीसी तैयार करें।
- कोट क्रियाशील स्लाइड या पीसी एक तरफ 1 मिलीलीटर फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान (25 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ (कदम 1.11), सेल संस्कृति कक्ष के संपर्क में अनुमानित क्षेत्र को कवर।
- 1-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट बाँझ इनक्यूबेटर में स्लाइड्स या पीसी सेते हैं।
- ऊष्मायन के बाद, एक जीएलए का उपयोग कर शेष समाधान महाप्राणएक वैक्यूम से जुड़ा एसएस वातशोषक पिपेट।
नोट: स्लाइड्स अब भविष्य में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन संग्रहित किया जा सकता है।
- केवल चुनाव आयोग / एसएमसी सह संस्कृति तैयार करने के लिए 1.12.2 चरणों का पालन करें। तैयार है और सह संस्कृति के प्रयोग के लिए चिकनी पेशी सेल (एसएमसी) संस्कृति बीज।
- प्रवाह कक्ष वैक्यूम के साथ पंक्ति में जो 50 मिमी बाहरी व्यास, 30 मिमी से 50 मिमी के भीतरी व्यास, 0.5 मिमी की मोटाई 75 मिमी के आयाम, और छेद के साथ स्लाइड (कदम 1.11), के शीर्ष पर जगह सिलिकॉन गैसकेट।
- 10% FBS / DMEM के निलंबन में 1 मिलीलीटर एसएमसी तैयार करें। 7% 3 NaHCO और 7.4 के पीएच 0.1 एम NaOH समाधान के साथ 2 मिलीग्राम / एमएल कोलेजन प्रकार मैं के 1 मिलीलीटर समाधान बेअसर, और 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम सेल घनत्व के साथ एसएमसी निलंबन के साथ मिश्रण।
- गैसकेट भीतर एसएमसी समाधान बिखरा हुआ है और 30 मिनट के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड सेते हैं और 5%।
- ऊष्मायन के बाद, संशोधित है Dulbecco में मिलाया 25 मिलीलीटर 0.1% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ स्लाइड कवर72 घंटे के लिए ईगल मध्यम (DMEM)।
- मोनोकल्चर प्रयोग के लिए endothelial सेल बोने के लिए स्लाइड या पीसी तैयार करें।
- कांच स्लाइड / पॉली कार्बोनेट झिल्ली पर संस्कृति endothelial कोशिकाओं (ईसीएस)।
- बीज गिलास स्लाइड या polycarbonate झिल्ली की फ़ाइब्रोनेक्टिन सतहों पर 6.0 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल की प्रारंभिक एकाग्रता के साथ, 10% FBS / DMEM में 1 मिलीलीटर ईसीएस,।
- 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को सेते हैं, और 10% FBS के 120 मिनट के लिए।
- 37 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेटर में अतिरिक्त 10% FBS / DMEM के साथ कोशिकाओं, और जगह से युक्त कवर स्लाइड, 5% सीओ 2 हे / एन, 70% -80% मिला हुआ है जब तक।
तरल पदार्थ चिपचिपाहट और बड़ा प्रवाह दर 2. निर्धारण
नोट: घूर्णन viscometers संवेदनशील उपकरण हैं, और viscometer उपयोगकर्ता पुस्तिका, औजार zeroing, या माप प्रदर्शन से पहले सलाह ली जानी चाहिए।
- प्रयोग के लक्षित वाहिका के साहित्य से वांछित द्रव कतरनी (τ) निर्धारित करते हैं।
- Measurएक घूर्णी viscometer का उपयोग कर ई 1% FBS / (μ) DMEM चिपचिपापन।
- Poiseuille समीकरण से अपेक्षित बड़ा प्रवाह दर (क्यू) का निर्धारण करते हैं:
,
जहां τ = द्रव कतरनी, μ = चिपचिपाहट, क्यू = वॉल्यूम। प्रवाह की दर, डब्ल्यू = चैम्बर चौड़ाई, और ज = कक्ष ऊंचाई)। - सेट पंप 2.3 कदम में निकाली गई प्रवाह की दर, और बाद के सभी चरणों के लिए उपयोग करने के लिए।
, Pulsatility सूचकांक 3. निर्धारण
नोट: इस प्रणाली के भीतर सभी कनेक्शन बंदरगाहों उचित आकार लॉक-रिंग-से-कंटिया, या मादा Luer करने वाली कंटिया कनेक्शन के साथ जोड़ा जाना चाहिए। कनेक्ट पीवीसी टयूबिंग तो कंटिया फिटिंग से जुड़ा हो सकता है, और सर्किट पूरा किया।
- सही प्रवाह की दिशा में चैम्बर (चित्रा 3) और अल्ट्रासोनिक फ्लो मीटर भिगोना साथ, चित्रा 2 के रूप में प्रवाह सर्किट कनेक्ट करें।
अल्ट्रासोनिक फ्लो मीटर उपकरणों की एक संवेदनशील टुकड़ा है, और ध्यान दें:उपयोगकर्ता पुस्तिका उपयोग करने से पहले सलाह ली जानी चाहिए। - जलाशय मात्रा के भीतर डूबे हुए है (पंप करने के लिए) जलाशय दुकान ट्यूब सुनिश्चित करने के द्वारा, डि पानी के साथ प्रवाह सर्किट और जलाशय भरें। एक प्रवाह मीटर का उपयोग प्रवाह तरंग कल्पना।
- भिगोना कक्ष पर खुली हवा रिलीज वाल्व तरल पदार्थ / हवा की मात्रा अनुपात बदलने के लिए। बंद विभिन्न तरल पदार्थ के स्तर के अंतराल पर हवा रिलीज वाल्व और गणना pulsatility सूचकांक (पीआई = (वी मैक्स - वी मिन) / वी मीन) प्रवाह तरंग शिखर (वी मैक्स), गर्त (वी मिन) का उपयोग करके, और मतलब (वी मतलब है)। नोटबुक में रिकार्ड पीआई मूल्यों।
- मार्क भविष्य में उपयोग के लिए एक इत्तला दे दी लगा, स्थायी स्याही पेन का उपयोग कर, भिगोना कक्ष पर तरल पदार्थ के स्तर पर और पीआई जिसके परिणामस्वरूप। पैथोलॉजी साहित्य 11 से वांछित पीआई स्तर निर्धारित।
- सिलिकॉन ट्यूब Formation- वैकल्पिक, नियंत्रित pulsatility के और अधिक उन्नत विधि
- , जैसे (एक बस अलग अनुपात में सिलिकॉन elastomer का आधार है और इलाज के एजेंट मिक्स1 से 36: 10 से ई-से-crosslinker अनुपात। 1) विविध लक्षित लोचदार moduli के लिए, पहले से सचित्र के रूप में 2
- संक्षेप में एक पूर्व निर्धारित आधार-से-crosslinker अनुपात के साथ सिलिकॉन prepolymer मिश्रण में स्टील प्रवेशनी (14 जी) की सूई, बार-बार डुबकी इलाज प्रक्रिया से सिलिकॉन नलियों बनाना।
- इलाज की प्रक्रिया के बीच में दिशा स्विचिंग, प्रवेशनी पर बहुलक कोटिंग का इलाज करने के लिए 4 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक ओवन में prepolymer लेपित प्रवेशनी रखें।
- एक ही सिलिकॉन elastomer मिश्रण के साथ सूई प्रक्रिया को दोहराएं और 0.3 ~ में मिमी मोटी नलियों जो परिणाम अतिरिक्त 4 घंटा, के लिए ओवन में वापस जगह है।
- स्टेनलेस स्टील प्रवेशनी से Ultrathin सिलिकॉन ट्यूब निकालें।
- 3.3 में के रूप में प्रत्येक के लिए बजाय चैम्बर भिगोना के सर्किट, और परीक्षण पीआई प्रवाह करने की नलियों कनेक्ट करें।
4. पम्प बंध्याकरण
- 1 में प्रवाह कक्ष (चित्रा 2), पीवीसी ट्यूबिंग, और गास्केट को विसर्जित कर दिया0% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ 2)। चरण 4 से पहले बाँझ डि से धो लें।
- एक स्पेयर इनक्यूबेटर शेल्फ पर रक्त पंप रखें।
नोट: इनक्यूबेटर अलमारियों स्टेनलेस स्टील के होंगे, और पूरे प्रवाह सर्किट के वजन का समर्थन करने के लिए सक्षम होना चाहिए। - जलाशय मात्रा के भीतर डूबे हुए है जलाशय आउटलेट ट्यूब (पंप करने के लिए) सुनिश्चित करके 10% एच 2 ओ 2 के साथ प्रवाह सर्किट और जलाशय भरें। पर यूवी प्रकाश के साथ लामिना का प्रवाह हुड में 20 मिनट के लिए सर्किट के माध्यम से पंप द्वारा ओ 2 एच 2 प्रसारित।
- महाप्राण सब एच 2 ओ ट्यूबिंग से 2, और प्रवाह सर्किट के माध्यम से पंप द्वारा बाँझ पीबीएस से धो लें।
5. फ्लो चैंबर विधानसभा
नोट: प्रवाह कक्ष वैक्यूम बंदरगाहों और इनलेट और आउटलेट प्रवाह बंदरगाहों (देखें चित्र 2) के साथ, एक एक्रिलिक, कस्टम मेड प्लेट के होते हैं। चैंबर विधानसभा संस्कृति स्लाइड के शीर्ष पर प्रवाह कक्ष और गास्केट रखने के होते हैं, समर्थकPerly गठबंधन, और नीचे वर्णित है।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 1% FBS / DMEM वार्म अप और प्रवाह कक्ष तैयार करते हैं।
- सेल पक्ष के साथ शीर्ष पर है और जगह गैसकेट (कदम 1.13 से) मीडिया के बाहर चुनाव आयोग स्लाइड ले लो।
- (वैकल्पिक) मीडिया के बाहर पीसी झिल्ली लो सेल पक्ष के साथ शीर्ष पर है और जगह गैसकेट (कदम 1.13 से)। पीसी झिल्ली के नीचे वरीयता प्राप्त एसएमसी (कदम 1.12.2) के साथ सह संस्कृति स्लाइड रखें।
- गैसकेट में छेद (चित्रा 2) के साथ प्रवाह कक्ष के निर्वात चैनल संरेखित करें।
- वैक्यूम करने के लिए कोई मीडिया लीक सुनिश्चित वैक्यूम बंदरगाहों (चित्रा 2) के लिए वैक्यूम ट्यूब संलग्न।
- वसंत अकड़न, प्रवाह कक्ष के प्रत्येक पक्ष (आंकड़े 2 और 5) पर एक साथ गिलास स्लाइड और दबाना प्रवाह कक्ष विधानसभा के नीचे जगह पाली कार्बोनेट शीट।
- प्लेस प्रवाह 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्रणाली और 5% सीओ 2, और कम pulsatility पर भरा जलाशय से पम्पिंग द्वारा मीडिया के साथ सर्किट भरें।कोशिकाओं शर्त के लिए 4 घंटे के लिए इस प्रवाह को बनाए रखें।
- वांछित समय के लिए तरल पदार्थ के रूप में चिह्नित पीआई स्तर के लिए चैम्बर भिगोना में मात्रा और संस्कृति को समायोजित करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
प्रवाह की स्थिति का रखरखाव प्रवाह सर्किट (चित्रा 1) की सही विधानसभा पर निर्भर है। व्यास ट्यूबिंग से पहले और संस्कृति कक्ष के बाद प्रवाह प्रतिरोध और बाद में दबाव बूंद को कम करने के लिए बड़ा व्यास के साथ विधानसभा में एक महत्वपूर्ण चयन है। इरादा दबाव और प्रवाह वेग को सुनिश्चित करने के उद्देश्य से ट्यूबिंग के साथ प्रयोग से पहले फ्लो मीटर के साथ प्रणाली को इकट्ठा। सिलिकॉन गैसकेट (चित्र नहीं) पर perforations के साथ संस्कृति कक्ष वैक्यूम चैनल (चित्रा 2), के संरेखण, प्रवाह सर्किट के भीतर सील रखता है। सील सुनिश्चित करने के लिए, वसंत अकड़न गैसकेट पर अतिरिक्त दबाव लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। गिलास स्लाइड, पाली कार्बोनेट शीट द्वारा संरक्षित चैम्बर क्षेत्र (चित्रा 6) फिट करने के लिए कटौती की जानी चाहिए। प्रवाह वेग अतिरिक्त बनाए रखने के जवानों में जटिलताओं के लिए योगदान कर सकता है, क्योंकि मीडिया मीडिया चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए dextran के अलावा के माध्यम से बदला जा सकता है। बढ़ी हुई viscos के माध्यम सेअल्पसंख्यक, द्रव कतरनी कम वेग पर बनाए रखा जा सकता है। प्रणाली की प्रतिक्रिया और अखंडता बस भिगोना कक्ष और जलाशय (चित्रा 3) के भीतर तरल पदार्थ का स्तर और तरल पदार्थ के रंग देख कर प्रयोग के बीच में जाँच की जा सकती है। तरल पदार्थ के स्तर का एक निरंतर मूल्य बनाए रखने चाहिए। प्रारंभिक द्रव स्तर जलाशय और मुआयना तुलना के लिए चैम्बर भिगोना दोनों पर चिह्नित किया जाना चाहिए। समायोजन प्रयोग दीक्षा, या चैम्बर भिगोना करने के लिए हवा के प्रवेश द्वार की अनुमति पर मीडिया के अलावा द्वारा बनाया जा सकता है। 4 प्रवाह वेग के एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग दिखाता है चित्रा। फिनोल लाल रंगाई प्रयोग के पाठ्यक्रम पर कमी करनी चाहिए। प्रयोग के पूरा होने पर, मीडिया सर्किट से पलायन करने की अनुमति दी जानी चाहिए, और भविष्य के उपाय या उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत। मीडिया मेटाबोलाइट सामग्री के लिए विश्लेषण या साइटोकिन्स जारी की है, या सेल पंथ के लिए इसे का उपयोग करके सेलुलर प्रतिक्रियाओं को पैराक्राइन सिगनल पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैUre। प्रकोष्ठों आकृति विज्ञान और confluency (चित्रा 5) के लिए चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के तहत imaged किया जा सकता है। आकृति विज्ञान की तरह तकला 24 घंटा (चित्रा 7) पर HPF के बाद ईसीएस में मनाया जाता है।
चित्रा 1. प्रवाह सर्किट योजनाबद्ध। स्कीम के भीतर लेबल फ्लो मीटर भिगोना चैम्बर द्वारा निर्धारित pulsatility सूचकांक का स्तर मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। प्रवाह तरंग प्रणाली दबाव शारीरिक रहता है सुनिश्चित करने का इरादा कनेक्शन ट्यूब व्यास के साथ मापा जाना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. फ्लो चाmber डिजाइन और माप। आउटर चैनल वैक्यूम से जुड़ा है। केंद्र चित्र चैम्बर के clamping को दर्शाता है। सही में पिक्चर गैसकेट डिजाइन को दिखाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. प्रवाह भिगोना चैंबर। प्रवाह भिगोना चैम्बर योजनाबद्ध प्रवाह की दिशा और कनेक्शन इरादा इंगित करता है। एयर रिलीज वाल्व आउटलेट वाल्व बंद कर दिया है, खोला जाता है, और तरल पदार्थ वांछित पीआई स्तर के लिए चैम्बर भरता है। आउटलेट वाल्व और हवा रिलीज वाल्व, प्रवाह शुरू और चैम्बर स्तर को बनाए रखता भीतर तरल पदार्थ का स्तर के समापन के उद्घाटन के अवसर पर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 
चित्रा 4। विभिन्न pulsatility सूचकांक के साथ नमूना प्रवाह लहरें। उच्च Pulsatility फ्लो (बाएं) और कम Pulsatility फ्लो (दाएं)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5। सह संस्कृति प्रवाह योजनाबद्ध। सह संस्कृति कोलेजन जेल में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ endothelial कोशिकाओं पर गुणवाला प्रवाह को दिखाती है। कोशिकाओं से साइटोकाइन रिहाई झरझरा पॉली कार्बोनेट झिल्ली के माध्यम से पार कर सकते हैं। कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6। प्रवाह की स्थिति के साथ Endothelial सेल आकारिकी परिवर्तन। क्रियाशील पॉली कार्बोनेट झिल्ली पर मिला हुआ endothelial सेल संस्कृति। (बाएं) प्रवाह से पहले और प्रवाह (दाएं) के बाद दिखाया गया है। प्रवाह भिन्न परिस्थितियों, स्थिर (कोई वेग), स्थिर (निरंतर वेग), उच्च नाड़ी (उच्च pulsatility) के तहत दिखाया गया है। कोशिकाओं 2% क्रिस्टल वायलेट के साथ दाग रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7। चिकनी पेशीसेल प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रवाह की स्थिति के साथ बदलता है। अलग-अलग परिस्थितियों, स्थिर (कोई वेग), सतत प्रवाह (निरंतर वेग), और उच्च नाड़ी के तहत α चिकनी पेशी actin (एसएमए) और मायोसिन भारी श्रृंखला (एस-एमएचसी) की चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं अभिव्यक्ति। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े के संस्करण।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस प्रोटोकॉल इन विट्रो में गुणवाला प्रवाह reproducing की एक विधि का वर्णन है, और रोग विकृतियों को प्रवाह की स्थिति के योगदान को निर्धारित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई पहला कदम हो सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग पिछले अध्ययनों से इस प्रोटोकॉल अनुभवी प्रयोगशालाओं के लिए करना है, प्रवाह की स्थिति इसके अतिरिक्त संवहनी भड़काऊ प्रतिक्रिया। 1, 10 के लिए योगदान कर पाया है। जैसे, न गहराई द्रव यांत्रिकी में, और न ही जैव रासायनिक विश्लेषण के साथ वर्णित है। और अधिक उन्नत तरल गतिकी, 1 और उन्नत तकनीकों के लिए, साहित्य से परामर्श विस्तारित अवधि के हैं पर द्रव कतरनी के तहत संवर्धन कोशिकाओं में 2 महत्वपूर्ण:। 1), एक सील प्रवाह सर्किट बनाए रखने के जलाशय को छोड़कर, और 2) प्रयोग भर में प्रदूषण को रोकने के। प्रवाह सर्किट की सील वांछित प्रवाह मानकों को प्रभावित करने अनायास ही हवा की शुरूआत के साथ, मीडिया की मात्रा और सही पीआई स्तर को बनाए रखने में आवश्यक है। सिस्टम मई पी में अतिरिक्त हवाartially, धारा के भीतर प्रवाह में बाधा डालती प्रवाह पथ को परेशान और समग्र प्रणाली के अनुपालन में वृद्धि। बड़ा प्रवाह दर को बनाए रखा होगा, जबकि, स्थानीय वेग में बढ़ जाती है, और सतह discontinuities के लिए नेतृत्व करेंगे इस आंशिक बाधा से पार के अनुभागीय क्षेत्र में कमी आई है। प्रवाह वेग परिवर्तन और सतह discontinuities दोनों अस्थिरता प्रवाह करने के लिए योगदान है, और संभवतः अशांति होगी। अन्त में, दबाव प्रवाह प्रणाली में किसी भी फंस हवा जिससे इसकी वांछित स्तर से गड़बड़ी घटते प्रवाह का एक सिकुड़ाया भिगोना के रूप में कार्य करेगा। प्रवाह सर्किट निरंतर मात्रा के रूप में है, फंस हवा भी समय के साथ मेटाबोलाइट एकाग्रता बढ़ती है, प्रभाव कोशिकाओं पर प्रतिकूल सकता है, जो मीडिया के रिसाव का कारण होगा। रक्त पंप सील और समारोह इसलिए इनक्यूबेटर में पंप की नियुक्ति को सील जटिलताओं पेश हो सकता है, तापमान पर निर्भर हैं। पंप सील या malfunc के माध्यम से प्रवाह सर्किट और मीडिया के नुकसान के भीतर हवा के दोनों वृद्धि की उपस्थितिtion के सेल पर्यावरण की परिवर्तनशीलता में वृद्धि, और गलत परिणाम के लिए ले जा सकता है। प्रयोग के दौरान प्रदूषण की रोकथाम के सभी सेल संस्कृति में महत्वपूर्ण है। प्रवाह सर्किट की सील फिर से के रूप में अच्छी तरह से प्रदूषणों से प्रवेश को रोकने के लिए बल दिया जाना चाहिए। प्रवाह मीडिया इसलिए उपयोग आवश्यक है तुरंत बाद सर्किट की सफाई, पोषक तत्वों और सूक्ष्मजीव के विकास के लिए आवश्यक शर्करा के कई प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, एक अपारदर्शी पंप कवर, समग्र पंप की नसबंदी में पराबैंगनी विकिरण के प्रभाव को कम कर देता है। यह इथेनॉल के साथ एक्रिलिक पिस्टन की असंगति के साथ मिलकर, सर्किट का उपयोग हाइड्रोजन पेरोक्साइड का पूरा नसबंदी की आवश्यकता है (एच 2 ओ 2)। सिस्टम उपयोग में नहीं है जब प्रदूषण को विकास की रोकथाम, समाधान स्टरलाइज़, और एक बाँझ वातावरण सभी संदूषण की अनुमति या सेल संस्कृति स्टरलाइज़ द्वारा या तो जटिलताओं को पेश हो सकता बनाए रखने का उपयोग करें। इस तकनीक की सीमाओं को उचित करने में असमर्थता शामिलLy शारीरिक रक्त के प्रवाह में जटिल प्रवाह लहर मॉडल। प्रवाह प्रणाली एक करीबी सन्निकटन की पेशकश करता है, वहीं शारीरिक प्रवाह में देखा जटिल तरंग के विभिन्न पहलुओं को नियंत्रित या बदला नहीं जा सकता है। इसके अलावा, प्रवाह घूमकर में कतरनी तनाव के पीछे कुछ धमनी रोग में देखा एक उलझन है, और इस प्रवाह प्रणाली के साथ दोहराया नहीं हो सकता है। इसके अतिरिक्त, सेल प्रतिक्रिया के दीर्घकालिक अध्ययन मुख्य रूप से की वजह से पंप का प्रदर्शन करने के लिए और अधिक जटिल और चुनौतीपूर्ण हो सकता है। बहाव के प्रतिरोध को कम करने प्रवाह प्रणाली और पम्पिंग दक्षता की अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक है। अन्त में, ऊपर प्रणाली physiologically वाहिका मॉडल नहीं है, और धमनियों के खिंचाव या बेसल झिल्ली कठोरता से उत्पन्न यांत्रिक सिगनल पर विचार नहीं करता है, जो कांच स्लाइड और पॉली कार्बोनेट झिल्ली, का उपयोग करता है। इससे पहले, एक अध्ययन सिरिंज का उपयोग गुणवाला प्रवाह reproducing में सक्षम एक गुणवाला प्रणाली का इस्तेमाल किया गया है 1 2 पंप। रेपर प्रणाली की प्रभावकारिताउच्च गड़बड़ी oducing पंप की गति और सीलिंग पर सीमाओं से प्रभावित किया जा सकता है। चैम्बर भिगोना की विधि पंप प्रोग्रामिंग की आवश्यकता नहीं, अपने आवेदन में अतिरिक्त सरल है। प्रवाह प्रणाली के भविष्य के अनुप्रयोगों प्रवाह कक्ष और स्लाइड को बदलने के लिए लोचदार टयूबिंग के समावेश से धमनियों के खिंचाव का एक परिणाम के रूप में यांत्रिक संकेतन के लिए अनुमति होगी। इस सुधार के माध्यम से, बेमेल अनुपालन और ल्यूमिनल सतह discontinuities आगे अध्ययन किया जा सकता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
लेखकों (डब्ल्यूटी को HL097246 और HL119371) अहा (डब्ल्यूटी को 13GRNT16990019) और NHLBI सहित धन स्रोतों को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber. |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
