Summary
Denne protokollen replikerer fysiologiske eller patologiske blodstrøm in vitro for å hjelpe til med å bestemme cellerespons i sykdoms patologier. Ved å introdusere et trykkdempekammer nedstrøms for en blodpumpe, kan blodstrømmen på tvers av blodkar bli rekapitulert og pålagt et monolag av vaskulært endotel eller en mimetisk ko-kulturen.
Abstract
Vaskulær sykdom er en vanlig dødsårsak i USA. Heri presenterer vi en metode for å undersøke bidraget av strømningsdynamikk mot vaskulær sykdom patologi. Usunne arteriene ofte har vegg avstivning, arrdannelse eller delvis stenose som kan alle påvirke væskemengder, og omfanget av pulserende strømning, eller pulsatility indeksen. Replikasjon av forskjellige strømningsforhold er resultatet av innstiller en strømningstrykket dempekammeret nedstrøms for en blodpumpe. Innføring av luft i et lukket system gjør det mulig for strømnings et komprimerbart medium for å absorbere pulserende trykk fra pumpen, og derfor varierer den pulsatility indeksen. Metoden som er beskrevet heri er bare gjengitt, med meget kontrollerbar inngang, og lett målbare resultater. Noen av begrensningene er gjenskaping av komplekset fysiologiske pulsbølgeform, som bare er tilnærmet ved hjelp av systemet. Endotelceller, glatte muskelceller, og fibroblaster påvirkes av blodstrømmen through arterien. Den dynamiske komponent av blodstrøm bestemmes av hjertets minuttvolum og arterievegg compliance. Vascular cell mekanisk-transduksjon av strømningsdynamikk kan utløse cytokinfrigjøring og krysstale mellom celletyper i arterien. Ko-kultur av vaskulære celler er et mer nøyaktig bilde reflekterende celle-celle-interaksjon i blodkarveggen, og vaskulær respons på mekanisk signalering. Bidrag av strømningsdynamikken, inkludert celleresponsen til de dynamiske og midlere (eller jevn) komponenter av strømningen, er derfor et viktig metrisk å bestemme sykdomspatologien og behandlingseffekt. Ved å innføre en in vitro-ko-kulturmodell og trykk demping nedstrøms av blodpumpe som frembringer simulerte blodsirkulasjon, kan forskjellige arteriell sykdom patologier undersøkes.
Introduction
Sykelighet for hjerte- og karsykdommer er den største i Amerika, med mange som følge av usunn blodkar. Sunn arterier bestå av elastisk vev, med myk luminal overflaten belagt med en endotelceller (EF) enkeltlag. Arteriell strøm kan modelleres som en oscillerende bølgefunksjon med positiv middelstrømningshastighet. Den pulsatility indeks (PI) er kvotienten for pendling magnitude og mener flow (PI = (Max -.. Min) / Mean), 1 og har blitt modellert in vitro med variabel fartøy elastisitet to arteriell elastisitet er viktig for lagring av flyt. energi fra hjerte sammentrekninger, strekke henhold systoliske trykket, og spiller en viktig rolle i modulerblodstrømmen PI. Fordi hjertet opprettholder en jevn, pulsatile, volumetrisk strømning, øker arteriell utvidelse tverrsnittsarealet, øke strømningsstabilitet ved å redusere strømningshastighet, skjærspenning, og PI. Ofte, usunn arterier presentere endringer i elastisiteteller etterlevelse, viser stivne fra vaskulær remodellering, arrvev eller forkalkninger tre, fire. I tillegg kan andre vaskulære forstyrrelser, slik som neointimal hyperplasi (NIH), aneurisme 5 og 6 hypertensjon og vaskulær fibrose 4, innsnevre fartøy diameter. Men dagens behandling og enhets behandling av vaskulære sykdommer ofte overse betydningen av åreveggen etterlevelse eller blodstrøm dynamikk i vaskulær sykdom som ofte komplisert av endringer i fartøy morfologi og egenskaper. Verken ballong angioplastikk eller stenting besvare komplikasjon av veggen elastisitet 7. Derfor strømmer in vitro modellering av blod som følge av arteriell sykdom og behandling er viktig i å undersøke sykdoms patologi og fremtidig effekt av behandlingen. Heri beskrives en fremgangsmåte for å replikere fysiologiske og patologiske blodstrøm utformet for å bestemme cellerespons i vaskulær sykdom Pathologies. Fluidstrøm forårsaker skjærspenning ved beholderveggen, noe som er et viktig mekanisk signal i kar helse, påvirker alle celler i vaskulaturen. Flere mekaniske sensorer på blodåreendotelets for væske skjær har blitt identifisert, inkludert primær cilium vist i nyere studier for endothelial mechanosensing 8. Endotelceller aktivitet og morfologi påvirkes av strømningshastighet, retning og pulsatility. I tillegg kan glatt muskelcelle (SMC) migrering bli påvirket av mekanisk-signaler med lav strømningshastighet gjennom interstitiell væske 9, og kan også være gjennom parakrin signalering fra endotelceller gjennom deres respons på strømning og mekanisk-transduksjon av strømningssignaler via cytokin frigjøre 10. Den "dose" avhengighet av midlere skjær, PI, og parakrine signale kan også være avhengige av hverandre. For å oppnå dette, bestemmelse av vaskulære celle-respons til fluidskjær med variert «dosering» i monolagskultureller co-kultur in vitro kunne gi mekanistiske innsikt i vaskulær remodellering og forbedre sykdom og behandling prediksjon. Strømningssystemet som brukes i dette eksperimentet består av en blodpumpe, en oppstrøms strømnings demping luftbeholder, en nedstrøms strømningsmåler kun brukes under eksperimentelle oppsettet, en nedstrøms cellekultur, parallell-plate strømningskammeret, og media reservoaret. Kontroll av vaskulære strømnings variabler som betyr strømningshastighet, slag per minutt, og PI kan oppnås ved å kontrollere strømningshastighet, pulsfrekvens, og innføring av trykk demping. Pulserende blodpumper er utstyrt med variabel slaglengde fortrengning, ved kontrollert slag frekvens, knyttet direkte til bety volumetrisk strømningshastighet, og pulsfrekvensen. Innføring av et luftreservoar inne i strømningskretsen gir mulighet for trykk demping, noe som reduserer strømnings oscillasjon størrelsesorden. Media er en inkompressibel væske, mens luft inne i dempekammeret er sammentrykkbart, slik at overtrykket fra strømnings bølgen å væreabsorbert av komprimert luft. Luften i media forhold tillater kontroll over hvor mye demping oppstår. En tilpasset cellekultur strømningskamret 75 mm i lengde med 50 mm i bredden ble opprettet fra akryl. Strømning kommer inn gjennom innløpsåpningen, og ekspanderer gjennom innløpsmanifolden, og gir konsistent strømning over helheten av strømningskammeret. Lignende flyt og strukturer er til stede ved kammerutløpet. Cellene blir sådd ut på funksjonaliserte objektglass, og deretter festet til strømningskammeret. Dette åpner for store bestander, lett hentes etter at studien. Co-kultur eksperimenter kan bruke en porøs polykarbonatmembran for å fjerne celle-til-celle-kontakt mellom kulturer samtidig som den tillater cytokin / fasetransport. Dette systemet har tidligere vært brukt til å modellere høy PI strømning og dens virkning på endoteliale monolagskultur og EC / SMC ko-kultur 1, 10, for å undersøke celleresponsen på patologisk høy PI sykdom. Ved å beskrive den protokollen som brukes til å modellere disse flyt conforhold, håper vi å hjelpe andre med å bestemme flyten signal bidrag til celle respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. silanisering og biomolekyl funksjon av Slide eller polykarbonat Membran
Merk: Mange av kjemikaliene og løsninger innenfor denne protokollen har høye fordampingshastigheter (etanol (EtOH), aceton, osv). Andre tiltak medfører lange inkuberingstider for lave fordampning priser. Parafin film anbefales for å forsegle beholderne. Forsiktig: Mange av de kjemikalier (inkludert: svovelsyre, aceton, (3-aminopropyl) trietoksysilan, glutaraldehyd, EtOH) betraktes som farlig, eller flyktig. Konsultere sikkerhetsdatablad (HMS) for hvert materiale for forsvarlig oppbevaring, håndtering og disponering før bruk.
- Plassere nye glass lysbilde som måler 75 mm med 50 mm med 1 mm, i ren, glass lysbilde flekker rett uten hensyn til orientering, sikrer full neddykking. Bruk beholder for trinn 1.1-1.12.
Merk: For co-kultur, inkluderer polykarbonat (PC) membran med 0,4 mikron porestørrelse, kuttet til størrelse på 75 mm med 50 mm, for all senere steps for PC funksjon og EC seeding. - Fordyp raset i svovelsyre (20%), O / N.
Forsiktig: Consult datablad for svovelsyre før bruk. - Vask lysbilde ved neddykking i deionisert vann (DI) i 5 minutter, tre ganger, endring DI hver gang.
- Fordyp raset i aceton i 30 min.
Forsiktig: Consult datablad for aceton før bruk. - Fordyp raset i 6% (3-aminopropyl) triethoxysilane / aceton løsning O / N.
Forsiktig: Consult datablad for (3-aminopropyl) triethoxysilane og aceton før bruk. - Dyppe lysbilde i aceton i 5 min, tre ganger, endring aceton hver gang.
Forsiktig: Consult datablad for aceton før bruk. - Vask lysbilde ved neddykking i DI i 5 min, tre ganger, endring DI hver gang.
- Fordyp raset i 1,5% glutaraldehyd / DI-løsning for 60 min.
Forsiktig: Consult datablad for glutaraldehyd før bruk. - Vask lysbilde ved neddykking i DI i 5 min, to ganger, endring DI hver gang.
- Place lysbildes inn i 70% etanol (EtOH) i 30 min i sterile, laminær hette.
- Fjerne EtOH og tillate gjenværende resten for å fordampe. Fordype lysbilder i sterile DI og avløp for å rehydrere lysbildene.
Merk: Slides eller PC membranen kan bli beseglet i glass lysbildeholderen og lagret ved 4 ° C opp til en uke. Ved bruk for cellekultur, gjenta trinn 1.10 og 1.11. - Fjern lysbildet fra lysbildeholderen og legg den i en 100 mm med 100 mm firkantet petriskål i laminær hette.
Merk: Denne container vil bli brukt for alle gjenværende trinnene.- Forbered lysbilde eller PC for endotelceller seeding for monokultur eksperiment.
- Belegge den funksjon lysbilde eller PC (trinn 1.11) med 1 ml oppløsning fibronektin (25 ug / ml), på den ene side, som dekker det omtrentlige området er utsatt for cellekultur kammer.
- Inkuber sleider eller PC i steril inkubator innstilt på 37 ° C i 1-2 timer.
- Etter inkubering aspireres den gjenværende oppløsning ved hjelp av et glass aspirator pipette koplet til et vakuum.
Merk: Objektglassene kan nå lagres O / N ved 4 ° C for fremtidig bruk.
- Følg 1.12.2 skritt bare for å forberede EC / SMC co-kultur. Forberede og frø glatt muskelcelle (SMC) kultur for co-kultur eksperiment.
- Plasser silikonpakning på toppen av sleiden (trinn 1.11), med dimensjoner på 75 mm x 50 mm ytre diameter, indre diameter på 50 mm av 30 mm, tykkelse 0,5 mm, samt gjennomgående hull som er i tråd med strømnings-kammeret vakuum.
- Forberede en ml SMC i 10% FBS / DMEM suspensjon. Nøytraliser 1 ml oppløsning av 2 mg / ml kollagen type-I med 7% NaHCO3 og 0,1 M NaOH-løsning til pH 7,4, og blandes med SMC suspensjon med endelig celletetthet på 2 x 10 6 celler / ml.
- Spre løsningen i løpet av SMC pakning og inkuberes lysbilder ved 37 ° C og 5% CO2 i 30 minutter.
- Etter inkubasjon dekke glide med 25 ml 0,1% føtalt bovint serum (FBS) blandet i Dulbeccos modifiserteEagle Medium (DMEM) i 72 timer.
- Forbered lysbilde eller PC for endotelceller seeding for monokultur eksperiment.
- Kultur endotelceller (ECS) på glass lysbilde / polykarbonat membran.
- Seed 1 ml EKB i 10% FBS / DMEM, med utgangskonsentrasjon på 6,0 x 10 5 celler / ml, på fibronektin overflater av glass-slide eller polykarbonatmembran.
- Inkuber cellene i en inkubator ved 37 ° C, 5% CO2 og 10% FBS i 120 minutter.
- Cover lysbilder som inneholder celler med ytterligere 10% FBS / DMEM, og plass i inkubator i 37 ° C, 5% CO 2 O / N, inntil 70% -80% sammenflytende.
2. Fastsettelse av Fluid Viskositet og volumetriske strømningshastighet
Merk: Roterende viscometers er sensitivt utstyr, og viskosimeteret bruksanvisningen bør konsulteres før kalibrering, nullstilling, eller utføre målinger.
- Bestem ønsket væske skjær (τ) fra litteratur av forsøket målrettede blodkar.
- Målte 1% FBS / DMEM-viskositet (μ), ved hjelp av et rotasjonsviskosimeter.
- Bestem nødvendig volumetrisk strømningsrate (Q) fra Poiseuille ligning:
,
hvor τ = fluid skjær, μ = viskositet, Q = vol. strømningshastighet, w = bredde kammeret, og h = kammer høyde). - Satt pumpen til strømningshastighet utledet i trinn 2.3, og bruke for alle påfølgende trinn.
, 3. Fastsettelse av Pulsatility Index
Merk: Alle tilkoblingsporter innenfor systemet skal kobles med riktig størrelse lock-ring-til-brodd, eller kvinnelige luer-til-brodd tilkoblinger. Koble PVC rør kan da kobles til brodd beslag, og kretsen fullført.
- Koble strømningskrets som på figur 2, med dempekammeret (figur 3) og ultralydstrømningsmåler i riktig strømningsretningen.
Merk: Ultralyd strømningsmåler er en følsom del av utstyret, ogbruksanvisningen bør konsulteres før bruk. - Fyll flyt krets og reservoar med DI vann, ved å sikre reservoar utløpsrør (pumpe) er under vann innen reservoarvolum. Visual flyt bølgeform ved hjelp av en strømningsmåler.
- Friluft utløsningsventilen på dempekammeret for å skifte olje / luftvolum ratio. Lukk lufteventilen på ulike væskenivå intervaller og beregne pulsatility indeks (PI = (V Max - V Min) / V Mean) ved hjelp av flyten bølgeform peak (V Max), trau (V Min), og mener (V Mean). Rekord PI verdier i bærbare.
- Mark resulterende væskenivå og PI på dempekammeret, ved hjelp av en filt tippet, permanent penn for fremtidig bruk. Bestem ønskede PI nivåer fra patologi litteratur 11.
- Silicon Tube formasjons Valgfritt, mer avansert metode for å kontrollere pulsatility
- Bland silikon elastomer base og herder ved forskjellige forhold (for eksempel en base-til-tverrbindingsmiddel-forhold fra 10: 1 til 36:. 1) for varierte målrettet elastisitetsmoduler, som vist tidligere 2
- Fremstille silikon rør ved gjentatt dip-herdeprosess, kort dypping stål kanylen (14 G) i silikon prepolymerblandingen med en forutbestemt basis-til-tverrbindingsgrad.
- Plasser prepolymer-belagte kanyle inn i en ovn innstilt på 60 ° C i 4 timer for å herde polymerbelegget på kanylen, bytter retning i midten av herdeprosessen.
- Gjenta dipping prosessen med den samme silikon elastomer blandingen og legg tilbake i ovnen i ytterligere 4 timer, noe som resulterer i ~ 0,3 mm tykke rør.
- Ta av ultratynne silikon tube fra rustfritt stål kanyle.
- Koble rørene til å strømme krets i stedet for dempekammeret, og for hver test PI som i 3.3.
4. Pump Sterilisering
- Dyppe strømningskammeret (figur 2), PVC-rør, og pakninger i ett0% hydrogenperoksid (H 2 O 2). Vask med sterile DI før trinn 4.
- Plasser pumpen blod på en ledig inkubator hylle.
Merk: Inkubator hyllene skal være av rustfritt stål, og være i stand til å tåle vekten av hele flyten krets. - Fyll strømningskrets og reservoar med 10% H 2O 2 ved å sikre at reservoar utløpsrør (pumpe) er neddykket i reservoaret volum. Sirkulere H 2 O 2 ved å pumpe gjennom kretsen i 20 min i laminær hette med UV-lys på.
- Aspirer alle H 2 O 2 fra slangen, og vask med sterilt PBS ved å pumpe gjennom strømningskrets.
5. Flow Chamber Assembly
Merk: Strømningskammeret består av en akryl, skreddersydde plate, med vakuumåpningene og innløp og utløp-strømningsåpninger (se figur 2). Chamber forsamlingen består av å plassere strømningskamret og pakninger på toppen av kultur lysbilder, proPerly justert, og er beskrevet nedenfor.
- Varm opp 1% FBS / DMEM i en 37 ° C vannbad og forberede flyt kammer.
- Ta EF gli ut av media (fra trinn 1.13) og plasser pakning på toppen med mobilsiden opp.
- (Valgfritt) Ta PC membran av media (fra trinn 1.13) og plasser pakning på toppen med mobilsiden opp. Plasser co-kultur lysbilde med seeded SMC (trinn 1.12.2) under PC membran.
- Justere vakuumkanal av strømningskammeret med hullene i pakningen (figur 2).
- Fest vakuumrør til vakuum porter (figur 2) som sikrer ingen lekkasjer i media til vakuum.
- Sted polykarbonatplaten under glassplate og klemme strømningskammeranordning med klemfjærer, en på hver side av strømningskammeret (figur 2 og 5).
- Sted flow system i inkubator ved 37 ° C og 5% CO2, og fyll krets med media ved pumping fra reservoaret fylles ved lav pulsatility.Opprettholde denne flyten i 4 timer for prekondisjonering celler.
- Juster væskevolumet i dempekammeret til markert PI nivå, og kulturen til ønsket tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Opprettholdelse av strømningsforhold er avhengig av korrekt montering av strømningskretsen (figur 1). Tubing diameter er et viktig valg i sammenstillingen, med større diameter redusere strømningsmotstand og påfølgende trykkfall før og etter kulturen kammeret. For å sikre ment trykk og strømningshastighet, montere systemet med flow meter før forsøket med tiltenkt tubing. Justering av kultur kammer vakuum kanal (figur 2), med perforeringer på silisium pakningen (ikke avbildet), opprett forsegle i flyten kretsen. For å sikre tetning, kan fjærklemmene brukes for å påføre ytterligere press på pakningen. Objektglass bør beskyttes av polykarbonatplaten, skåret for å passe kammerområdet (figur 6). Ettersom strømningshastigheten kan i tillegg bidra til komplikasjoner i å opprettholde tetning, kan mediet endres ved tilsetning av dekstran for å øke viskositeten media. Gjennom økt viscosligheten, kan fluid skjærkraft opprettholdes ved lavere hastighet. Systemrespons og integritet kan kontrolleres i midten av eksperimentet ganske enkelt ved å observere væskenivåer og fluid farge innenfor dempekammeret og reservoaret (figur 3). Væskenivået bør opprettholde en konstant verdi. Initial væskenivå bør merkes på både reservoaret og demping kammer for checkup sammenligning. Justeringer kan gjøres ved tilsetning av media ved forsøket initiering, eller tillate inngang av luft til dempekammeret. Figur 4 illustrerer et representativt opptak av strømningshastigheten. Fenol rød farge bør avta i løpet av forsøket. Ved fullføring av forsøket, bør mediet tillates å renne fra kretsen, og lagret ved -80 ° C fryseren for fremtidige tiltak eller bruk. Media kan analyseres for metabolitt innhold eller sluppet cytokiner, eller brukes til å overvåke parakrine signale til cellulære responser ved å bruke det for celle kulture. Celler kan avbildes i henhold til fasekontrastmikroskopi for morfologi og konfluens (figur 5). Spindel som morfologi er observert i egenkapitalbevis etter HPF løpet 24 timer (figur 7).
Figur 1. Flytkretsdiagrammet. Strømningsmåleren som er merket i ordningen benyttes for å måle pulsatility indeksnivåer fastsatt av dempekammeret. Flow bølgeform bør måles med beregnet forbindelse slangediametre å sikre systemtrykket forblir fysiologisk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Flyt chamber utforming og målinger. ytre kanal er koblet til vakuum. Sentrum bilde viser fastspenning av kammeret. Bildet til høyre viser pakning design. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Flow Damping Chamber. Flow demping kammeret skjematisk indikerer ment strømningsretning og tilkobling. Luft utløsningsventilen er åpnet, utløpsventilen er lukket, og væsken fyller kammeret til ønsket nivå PI. Ved åpning av utløpsventilen og lukking av luftutløsningsventilen, strømnings CVer og væskenivåer i kammeret opprettholder nivåer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
. Høy Pulsatility Flow (Venstre) og lav Pulsatility Flow (Høyre). Figur 4. Sample strømnings bølger med ulike pulsatility indekser Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Co-kultur Flow Skjematisk. Co-kulturen viser pulserende strømning i løpet av endotelceller, med glatte muskelceller i kollagen-gel. Cytokinfrigjøring fra celler kan krysse gjennom den porøse polykarbonat membran. VennligstKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Endotelcelle morfologi Endringer med strømningsforhold. Confluent endotelceller kultur på funksjon polykarbonat membran. Vist er før flow (venstre) og etter flow (til høyre). Flow vist under ulike forhold, statiske (ingen hastighet), jevn (konstant hastighet), høy puls (høy pulsatility). Cellene er farget med 2% krystallfiolett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Glatt muskelCell Protein Expression Endrer med strømningsforhold. Glatt muskelceller uttrykk for α-glatt muskulatur aktin (SMA) og myosin tung kjede (SM-MHC) under ulike forhold, statisk (uten hastighets), jevn flyt (konstant hastighet), og høy puls. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for å gjengi pulserende strømning in vitro, og kan være medvirkende første trinnet i å bestemme bidraget av strømningsforholdene til sykdoms patologier. Tidligere studier som bruker denne protokollen har funnet strømningsforhold bidra til vaskulær betennelsesreaksjon. 1, 10 tillegg denne protokollen er ment for erfarne laboratorier. Som sådan, hverken i dybdefluidmekanikk, eller biokjemiske analyser er beskrevet heri. For mer avanserte væskedynamikk, 1 og avanserte teknikker, konsultere litteraturen to Kritisk i dyrking celler i henhold væske skjær over lengre perioder er:. 1) opprettholde en forseglet flyt krets, med unntak av reservoaret, og 2) hindre forurensning gjennom hele forsøket. Tetting av strømningskretsen er essensielt for å opprettholde medievolumet og korrigere PI nivåer, med innføring av uønsket luft påvirker de ønskede strømningsparametre. Ekstra luft i systemet, kan partially hindrer strømning i strømmen, forstyrre strømningsbane og forbedre overholdelse av det totale systemet. Mens volumetriske strømningshastigheter vil bli opprettholdt, redusert tverrsnittsareal fra dette delvise hindring ville føre til lokale økninger i hastighet og karakter fra diskontinuiteter. Begge strømningshastighet og overflatevariasjon diskontinuiteter vil bidra til å flyte destabilisering, og eventuelt turbulens. Til slutt, vil enhver luft som er fanget inn i den trykksatte strømningssystemet virke som en kompressibel demping av strømmen, og dermed redusere PI fra sitt ønskede nivå. Som flyten kretsen er konstant volum, innestengt luft også ville føre til lekkasje av media som kan ha negativ innvirkning cellene, øker metabolitt konsentrasjon over tid. Blodpumpe forsegling og funksjon er avhengig av temperatur, og derfor plassering av pumpen i kuvøsen kan innføre forsegling komplikasjoner. Både økt tilstedeværelse av luft i flyten kretsen og tap av media gjennom pumpe forsegling eller sviktesjon kan øke variasjonen i cellemiljøet, og føre til unøyaktige resultater. Forhindring av forurensning under forsøket er viktig i alle cellekultur. Tetting av strømningskretsen må igjen understrekes for å hindre inngangen av forurensninger i tillegg. Flow medier gir mange av næringsstoffer og sukker som er nødvendige for mikroorganisme vekst, derfor rengjøring av kretsen umiddelbart etter bruk er nødvendig. I tillegg er en ugjennomsiktig pumpedekselet, reduserer effekten av UV-bestråling i sterilisering av den totale pumpe. Dette, kombinert med uforlikelighet av akryl stempel med etanol, krever full sterilisering av kretsen ved hjelp av hydrogenperoksyd (H 2 O 2). Forhindring av forurensning vekst når systemet ikke er i bruk, anvendelse av steriliseringsløsning, og å opprettholde et sterilt miljø alle kan innføre komplikasjoner, enten ved at forurensning eller steriliserende cellekultur. Begrensninger av denne teknikken omfatte manglende evne til forsvarligly modellere komplekse flyt bølge i fysiologisk blodstrømmen. Mens flow system tilbyr en tett tilnærming, kan ulike aspekter av den komplekse bølgeform sett i fysiologisk strømmen ikke kontrolleres eller endres. Også reversering skjærspenning i frem- og tilbakestrømningen er en komplikasjon sett i noen arteriell sykdom, og kan ikke dupliseres ved denne strømningssystem. I tillegg kan langtidsstudie av celleresponsen være mer komplisert og krevende, hovedsakelig på grunn av ytelsen av pumpen. Reduksjon av nedstrøms motstand er avgjørende for å opprettholde integriteten av strømningssystemet og pumpeeffektivitet. Til slutt, bruker systemet ovenfor glass og polykarbonat membraner, som ikke fysiologisk modellerer blodkar, og tar ikke hensyn til mekanisk signale skyldes arteriell strekk eller basalmembran stivhet. Tidligere har en studie brukte et pulserende system stand til å reprodusere pulserende strømning ved hjelp av sprøyte pumper 1 2. Effekt av systemet i karsoducing høy PI kan bli påvirket av begrensninger av pumpehastigheten og forsegling. Metoden for dempekammeret er i tillegg enklere i sin anvendelse, som ikke krever programmering pumpe. Fremtidige anvendelser av strømningssystemet ville tillate for mekanisk signalering som et resultat av arteriell strekning ved inkorporering av elastisk slange for å erstatte strømningskammeret og lysbilde. Gjennom denne forbedringen kan ikke samsvarer etterlevelse og luminale overflate diskontinuiteter bli ytterligere undersøkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne finansieringskilder, inkludert AHA (13GRNT16990019 til WT) og NHLBI (HL097246 og HL119371 til WT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber. |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
