Summary
Detta protokoll replikerar fysiologiska eller patologiska blodflödet in vitro för att underlätta bestämning av cellsvar i sjukdoms patologier. Genom att införa en tryckdämpningskammare nedströms om en blodpump, kan blodflöde tvärs vaskulaturen dets förlopp och införas på ett monoskikt av kärlendotel eller en mimetisk samodling.
Abstract
Vascular sjukdom är en vanlig dödsorsak i USA. Häri presenterar vi en metod för att undersöka bidraget från flödesdynamik mot vaskulära sjukdomar sjukdom. Ohälsosamma artärer ofta förekommer med väggstelhet, ärrbildning eller delvis stenos som alla kan påverka vätskeflödeshastigheter, och storleken på pulserande flöde, eller pulsatilitet index. Replikation av olika strömningsförhållanden är resultatet av avstämning av en flödestryckdämpningskammare nedströms om en blodpump. Införande av luft i ett slutet flöde möjliggör en komprimer medium för att absorbera pulserande trycket från pumpen, och därför varierar pulsatiliteten index. Metoden som beskrivs häri enkelt reproduceras, med mycket kontrollerbar ingång, och lätt mätbara resultat. Vissa begränsningar är återskapande av den komplexa fysiologiska pulsvågform, som endast approximeras av systemet. Endotelceller, glatta muskelceller, och fibroblaster påverkas av blodflödet thrgrundlig artären. Den dynamiska komponenten av blodflöde bestäms av hjärtminutvolym och artärväggen efterlevnad. Vaskulär cellmekanisk transduktion av flödesdynamik kan utlösa cytokinfrisättning och överhörning mellan celltyper inuti artären. Co-kultur av vaskulära celler är en mer rättvisande bild reflekterande cell-cellinteraktion på blodkärlsväggen och kärl svar på mekanisk signalering. Bidrag från flödesdynamik, inklusive cell svar på de dynamiska och medel (eller stadig) komponenter i flödet, är därför ett viktigt mått för att bestämma sjukdomspatologi och behandling effektivitet. Genom att införa ett in vitro co-kultur-modellen och tryckdämpning nedströms blodpump som producerar simulerad hjärtminutvolym, kan olika arteriella patologier sjukdoms undersökas.
Introduction
Sjuklighet för hjärt- och kärlsjukdomar är den största i Amerika, med många till följd av ohälsosamma kärl. Friska artärer består av elastisk vävnad, med mjuk luminala ytan belagd med en endotelcell (EC) monoskikt. Arteriell flöde kan modelleras som en oscillerande våg funktion med positiv genomsnittlig flödeshastighet. Pulsatiliteten Index (PI) är kvoten av svängnings magnitud och genomsnittlig flödes (PI = (Max -.. Min) / medelvärde), 1 och har modellerats in vitro med variabel kärl elasticitet 2 Arteriell elasticitet är viktig vid lagring av flödet. energi från hjärta sammandragningar, utvidga enligt systoliskt tryck, och spelar en viktig roll i att modulera blodflödet PI. Eftersom hjärtat upprätthåller en konsekvent, pulserande, volumetriska flödet ökar arteriell expansionstvärsnittsarea, öka stabiliteten flödet genom att minska flödeshastigheten, skjuvspänning, och PI. Ofta ohälsosamma artärer presentera förändringar elasticiteteller efterlevnad, visar styv från kärlremodellering, ärrvävnad eller förkalkning 3, 4. Dessutom kan andra vaskulära sjukdomar, såsom neointimal hyperplasi (NIH), 5 aneurysm och hypertoni 6 och vaskulär fibros 4, tygla fartyg diameter. Men nuvarande läkemedelsbehandling och enhets behandling av kärlsjukdomar ofta försummar betydelsen av kärlväggen efterlevnad eller blod flödesdynamik i vaskulär sjukdom som ofta kompliceras av förändringar i fartyg morfologi och egenskaper. Varken ballongvidgning eller stent besvara komplikation av vägg elasticitet 7. Därför in vitro modellering av blod flöden till följd av arteriell sjukdom och behandling är viktigt att utreda sjukdoms sjukdomar och framtida effekt av behandlingen. Häri beskriver vi en metod att replikera fysiologisk och patologisk blodflöde utformad för att bestämma cellsvar i vaskulär sjukdom Pathologies. Vätskeflöde orsakar skjuvspänning på kärlväggen, vilket är en viktig mekanisk signal i kärlet hälsa, som påverkar alla celler i kärlsystemet. Flera mekaniska sensorer på kärlendotelet för fluidfriktions har identifierats, inklusive primär cilium visas i nya studier för endotel mechanosensing 8. Endotelial cellaktivitet och morfologi påverkas av flödeshastighet, riktning och pulsatilitet. Dessutom kan glatta muskelceller (SMC) migrering påverkas av mekaniska-signaler av låg hastighet flöde genom interstitiell vätska 9, och kan också vara genom den parakrina signalering från endotelceller genom deras respons att flyta och mekano-transduktion av flödessignaler via cytokin släppa 10. Den "dos" beroende av medel skjuvning, PI och parakrin signalering kan också vara beroende av varandra. För detta ändamål bestämning av vaskulär cellsvar på fluidfriktions med varierad "dosering" i monoskiktkultureller co-kultur in vitro kan ge mekanistiska insikter i kärlremodellering och förbättra sjukdom och behandling förutsägelse. Flödes system som används i detta experiment består av en blodpump, en uppströms flödesdämpningsluftreservoar, en nedströms flödesmätare endast används under experimentuppställning, en nedströms cellodling, parallella plattor flödeskammare, och mediebehållaren. Kontroll av vaskulära flödesvariabler såsom detta flödeshastighet, takter per minut, och PI kan åstadkommas genom att styra flödeshastigheten, pulsfrekvens, och införande av tryckdämpning. Pulserande blodpumpar finns med variabel slagvolym, vid kontrollerad slagfrekvens, som direkt betyda volymflödeshastighet och pulsfrekvens. Införande av en luftbehållare i flödeskretsen möjliggör tryck dämpning, minskar svängning flödes storlek. Media är en inkompressibel vätska, medan luft inuti dämpningskammaren är kompressibel, så att övertrycket från flödesvågen att varaabsorberas av luftkomprimering. Luften förhållande mellan medie möjliggör kontroll över hur mycket dämpning uppträder. En anpassad cellodlingsflödeskammare 75 mm i längd och 50 mm i bredd skapades från akryl. Flödes inträder genom inloppsöppningen, och expanderar genom insugningsröret, vilket ger konsekvent flöde över helheten av flödeskammaren. Liknande flöde och strukturer är närvarande vid kammarens utlopp. Celler sås på funktionaliserade bilder, och därefter knuten till flödeskammaren. Detta möjliggör för stora populationer, lätt hämtas efter studien. Co-kultur experiment kan använda ett poröst polykarbonatmembran för att eliminera cell till cell kontakt mellan kulturer samtidigt som transport cytokin / flöde. Detta system har tidigare använts för att modellera hög PI flöde och dess effekt på endothelial monolager kultur och EG / SMC co-kultur 1, 10, för att undersöka cellsvar mot patologiskt hög PI sjukdom. Genom att beskriva det protokoll som används för att modellera dessa flödes conförhållanden, hoppas vi kunna hjälpa andra i att bestämma flödessignal bidrag till cellsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. silaniseringen och Biomolecule funktionalisering av Slide eller polykarbonatmembran
Obs: Många av de kemikalier och lösningar inom detta protokoll har höga avdunstningshastigheter (etanol (EtOH), aceton, etc.). Andra åtgärder innebär långa inkubationstider för låga avdunstningshastigheter. Paraffin film rekommenderas att täta behållare. Varning: Många av de kemikalier (inklusive: svavelsyra, aceton, (3-aminopropyl) trietoxisilan, glutaraldehyd, EtOH) anses vara farliga, eller flyktig. Rådgör säkerhetsdatablad (SDB) för varje material för korrekt lagring, hantering och bortskaffande före användning.
- Placera ny glasskiva som mäter 75 mm x 50 mm x 1 mm, i rent, glasskiva färgskål utan hänsyn till orientering, vilket garanterar full nedsänkning. Använd behållare för steg 1.1-1.12.
Obs! För co-kultur, innefattar polykarbonat (PC) membran med 0,4 mikron porstorlek, tillskuret av 75 mm med 50 mm, för alla efterföljande steps för PC funktionalisering och EG sådd. - Doppa glida i svavelsyra (20%), O / N.
Varning: Rådfråga säkerhetsdatablad för svavelsyra före användning. - Tvätta objektglaset genom nedsänkning i avjoniserat vatten (DI) under 5 minuter, tre gånger, ändra DI varje gång.
- Doppa objektglaset i aceton under 30 minuter.
Varning: Rådfråga säkerhetsdatablad för aceton före användning. - Doppa bild i 6% (3-aminopropyl) trietoxisilan / acetonlösning O / N.
Varning: Rådfråga säkerhetsdatablad för (3-aminopropyl) trietoxisilan och aceton före användning. - Doppa objektglaset i aceton under 5 minuter, tre gånger, ändra aceton varje gång.
Varning: Rådfråga säkerhetsdatablad för aceton före användning. - Tvätta objektglaset genom nedsänkning i DI för 5 min, tre gånger, ändra DI varje gång.
- Doppa bild i 1,5% glutaraldehyd / DI-lösning under 60 min.
Varning: Rådfråga säkerhetsdatablad för glutaraldehyd före användning. - Tvätta objektglaset genom nedsänkning i DI för 5 minuter, två gånger, ändra DI varje gång.
- Placera objektglasets in 70% etanol (EtOH) för 30 minuter i sterila, laminärt flöde huva.
- Ta bort EtOH och låt återstående resten avdunsta. Doppa objektglasen i steril DI och avlopp för att rehydrera bilderna.
Obs: Slides eller PC-membran kan förseglas i glasobjektglashållaren och lagrades vid 4 ° C upp till en vecka. Vid användning för cellodling, upprepa steg 1.10 och 1.11. - Ta bilden från diapositivhållaren och placera den i en 100 mm x 100 mm kvadrat petriskål i laminärt flöde huva.
Obs: Denna behållare kommer att användas för alla återstående steg.- Förbered bild eller PC för endotelceller sådd för monokulturer experiment.
- Coat den funktionaliserade objektglas eller PC (steg 1.11) med en ml fibronektin lösning (25 mikrogram / ml), å ena sidan, som täcker den ungefärliga område som utsätts för cellodlingskammaren.
- Inkubera objektglasen eller PC i steril inkubator inställd på 37 ° C under 1-2 timmar.
- Efter inkubation, aspirera återstående lösningen med en glass aspirator pipett ansluten till ett vakuum.
Obs: Objektglasen kan nu lagras O / N vid 4 ° C för framtida användning.
- Följ 1.12.2 steg endast för framställning av EG / SMC co-kultur. Förbered och utsäde glatta muskelceller (SMC) kultur för samarbete kultur experiment.
- Placera silikon packning ovanpå bilden (steg 1,11), med måtten 75 mm x 50 mm ytterdiameter, innerdiameter 50 mm med 30 mm, tjocklek på 0,5 mm, och perforeringar som anpassar med flödeskammaren vakuum.
- Förbered en ml SMC i 10% FBS / DMEM suspension. Neutralisera 1 ml lösning av 2 mg / ml kollagen typ-I med 7% NaHCOs 3 och 0,1 M NaOH-lösning till pH-värde av 7,4, och blanda med SMC-suspension med slutlig celldensitet av 2 x 10 6 celler / ml.
- Sprid SMC lösning inom packning och inkubera glider vid 37 ° C och 5% CO2 under 30 minuter.
- Efter inkubation täcker sliden med 25 ml 0,1% fetalt bovint serum (FBS) blandades i Dulbeccos modifieradeEagle-medium (DMEM) för 72 timmar.
- Förbered bild eller PC för endotelceller sådd för monokulturer experiment.
- Kultur endotelceller (ECS) på glasplatta / polykarbonatmembran.
- Seed 1 ml EC i 10% FBS / DMEM, med initial koncentration av 6,0 x 10 5 celler / ml, på fibronektin ytor av glasplatta eller polykarbonatmembran.
- Inkubera cellerna i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2, och 10% FBS under 120 minuter.
- Täckskivor innehållande celler med ytterligare 10% FBS / DMEM, och plats i inkubatorn i 37 ° C, 5% CO 2 O / N, tills 70% -80% konfluenta.
2. Fastställande av vätskans viskositet och volymflöde
Obs: Roterande viskosimetrar är känslig utrustning och viskometertemperaturen instruktionsbok bör konsulteras innan kalibrering, nollställning, eller utför mätningar.
- Bestäm önskad vätska skjuvning (τ) från litteratur av experimentet målinriktade kärl.
- Measure 1% FBS / DMEM viskositet (μ), med hjälp av en rotationsviskosimeter.
- Bestäm krävs volymetriska flödeshastigheten (Q) från Poiseuilles ekvation:
,
där τ = fluidfriktions, μ = viskositet, Q = vol. flödeshastighet, w = kammarbredd, och h = kammar höjd). - Ställ pumpen till flödeshastighet härletts i steg 2.3, och använda för alla efterföljande steg.
, 3. Fastställande av pulsatilitet Index
Obs: Alla anslutningsportar inom systemet ska anslutas med lämplig storlek lås-ring till hulling, eller kvinnliga luer-till-barb anslutningar. Anslutning PVC-slang kan sedan kopplas till hulling beslag, och fullbordas kretsen.
- Anslut flödeskrets som visas i figur 2, med dämpkammare (Figur 3) och ultraljud flödesmätare i rätt flödesriktning.
Obs: Ultraljud flödesmätare är en känslig del av utrustningen, ochinstruktionsboken bör konsulteras före användning. - Fyll kretsloppet och reservoar med avjoniserat vatten, genom att säkerställa reservoarutloppsröret (att pumpa) är nedsänkt i reservoarvolym. Visualisera flödes vågform med användning av en flödesmätare.
- Open air avlastningsventil på dämpkammare att ändra vätska / luft volymförhållande. Stäng luftningsventil vid olika vätskenivå mellanrum och beräkna pulsatilitet index (PI = (V Max - V Min) / V Mean) genom att använda flödesvågformen topp (V max), tråg (V Min), och menar (V Mean). PI-värden i anteckningsboken.
- Mark resulterande vätskenivån och PI på dämpkammare, med hjälp av en filt lutad, permanent bläckpenna för framtida bruk. Bestäm önskade PI nivåer från patologi litteratur 11.
- Silikonröret Formation- Valfritt, mer avancerad metod för att styra pulsatilitet
- Blanda silikonelastomerbas och härdare vid olika förhållanden (t.ex. en base-till-tvärbindare förhållande från 10: 1 till 36:. 1) för varie målinriktade elasticitetsmodul, såsom tidigare illustrerats 2
- Tillverka silikontuber genom upprepad dopphärdningsprocessen, under kort doppning stålkanyl (14 G) till silikon förpolymerblandningen med en förutbestämd bas-till-tvärbindare förhållande.
- Placera prepolymeren belagda kanyl i en ugn inställd på 60 ° C i 4 h för att härda polymerbeläggningen på kanylen, växling riktningen i mitten av härdningsprocessen.
- Upprepa doppningsprocess med samma silikonelastomerblandning och placera tillbaka i ugnen under ytterligare 4 h, vilket resulterar i ~ 0,3 mm tjock rör.
- Avlägsna den ultratunna silikonslang från kanylen av rostfritt stål.
- Anslut rör att flyta krets i stället för dämpkammare och testa PI för varje enligt 3.3.
4. Pump Sterilisering
- Sänk flödet kammaren (Figur 2), PVC-rör och packningar i en0% väteperoxid (H 2 O 2). Tvätta med steril DI före steg 4.
- Placera blodpump på en reserv inkubator hylla.
Obs: inkubator hyllorna bör vara av rostfritt stål, och kunna stödja vikten av hela kretsloppet. - Fyll flödeskretsen och reservoar med 10% H2O 2 genom att säkerställa reservoarutloppsröret (för att pumpa) är nedsänkt inuti reservoarvolym. Cirkulera H2O 2 genom pumpning genom krets för 20 min i huv med laminärt flöde med UV-ljus på.
- Aspirera all H2O 2 från slangen och tvätta med steril PBS genom att pumpa genom flödeskrets.
5. Flödeskammarenheten
Obs! Flödeskammare består av en akryl, skräddarsydd platta, med vakuumportar och inlopp och utlopp flödesportar (se figur 2). Kammarenhet består av att placera flödet kammaren och packningar ovanpå kultur diabilder, proPerly linje, och beskrivs nedan.
- Värm upp 1% FBS / DMEM i en 37 ° C vattenbad och förbereda flödeskammare.
- Ta EG glida ut av media (från steg 1,13) och plats packning ovanpå med cellsidan uppåt.
- (Tillval) Ta PC membran av media (från steg 1,13) och plats packning ovanpå med cellsidan uppåt. Placera samodling glida med seedade SMC (steg 1.12.2) under PC membran.
- Rikta vakuumkanalen av flödet kammaren mot hålen i packningen (Figur 2).
- Bifoga sugrör till vakuumportar (Figur 2) garanterar inga medieläckor till vakuum.
- Placera polykarbonatskiva under glasplatta och klämflödeskammarenheten med fjäderklämmor, en på varje sida av strömningskammare (fig 2 och 5).
- Placera flödessystem i inkubator vid 37 ° C och 5% CO2, och fylla kretsen med media genom pumpning från fyllda reservoaren vid lågt pulsatilitet.Behåll detta flöde under 4 timmar för prekonditionering celler.
- Justera vätskevolymen i dämpningskammaren till påtaglig PI nivå och kultur för önskad tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Underhåll av flödesförhållanden är beroende av korrekt montering av flödeskretsen (fig 1). Slangar diameter är en viktig selektion i montering, med större diametrar minskar strömningsmotståndet och efterföljande tryckfall före och efter odlingskammare. För att säkerställa avsedd tryck och flödeshastighet, montera systemet med flödesmätaren före experimentet med avsedd slang. Inriktning av odlingskammare vakuumkanalen (Figur 2), med perforeringarna på silikonpackning (ej visad), bibehåller förseglingen inne i flödeskretsen. För att säkerställa tätning, kan fjäderklämmor användas för att applicera ytterligare press på packningen. Glas bör skyddas av polykarbonatskiva, kapas för att passa kammarområdet (Bild 6). Eftersom flödeshastigheten kan dessutom bidra till komplikationer i upprätthålla tätningar, kan media förändras genom tillsats av dextran för att öka medie viskositet. Genom ökade Viscostet, kan fluidfriktions hållas vid lägre hastighet. Systemets responstid och integritet kan kontrolleras i mitten av experimentet genom att helt enkelt observera vätskenivåer och vätska färg i dämpningskammaren och reservoaren (Figur 3). Vätskenivån bör hålla ett konstant värde. Initial Vätskenivån bör märkas på både behållaren och dämpkammare för checkup jämförelse. Justeringar kan göras genom tillsats av medier vid experimentets inledning, eller tillåta ingång av luft till dämpningskammaren. Figur 4 visar en representativ registrering av flödeshastigheten. Fenol röd färg bör minska under loppet av experimentet. Vid fullbordande av försöket bör medier tillåtas rinna ut ur kretsen, och lagrades vid -80 ° C frys för framtida åtgärd eller användning. Media kan analyseras för metabolit innehåll eller frigjort cytokiner, eller användas för att övervaka parakrin signalering till cellulära svar genom att använda den för cellkultURE. Celler kan avbildas enligt faskontrastmikroskopi för morfologi och confluency (Figur 5). Spindel morfologi observeras i EC efter HPF över 24 timmar (Figur 7).
Figur 1. Flödeskopplingsschemat. Flödesmätaren märkt inom systemet används för att mäta pulsatility indexnivåerna i dämpningskammaren. Flödesvågformen bör mätas med avsedda anslutnings rördiametrar att säkerställa systemtrycket förblir fysiologisk. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Flödes chamber utformning och mått. Yttre kanal är ansluten till vakuum. Center bild visar fastklämning av kammaren. Bilden till höger visar packning design. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Flow Damping avdelningen. Flow dämpkammare schematiskt indikerar avsedda flödesriktningen och anslutning. Luftningsventilen öppnas, utloppsventilen är stängd, och vätska fyller kammaren till önskad PI nivå. Vid öppnandet av utloppsventil och stängning av luftningsventil, flödes meritförteckningar och vätskenivåer i kammaren upprätthåller nivåer. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 4. Exempel på flödes vågor med olika pulsatilitet index. Hög pulsatilitet Flow (vänster) och låg pulsatilitet Flow (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Co-kultur flödesschema. Co-kultur visar pulserande flöde över endotelceller, med glatta muskelceller i kollagengel. Cytokinfrisättning från celler kan passera genom det porösa polykarbonatmembran. VänligenKlicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Endothelial Cell Morphology Förändringar med strömningsförhållanden. Confluent endotelceller kultur på funktionaliserat polykarbonatmembran. Här visas före flöde (vänster) och efter flöde (höger). Flöde visas under olika förhållanden, statisk (ingen hastighet), stadig (konstant hastighet), hög puls (högt pulsatilitet). Celler färgades med 2% kristallviolett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Glatt muskulaturCell Protein Expression Ändringar med strömningsförhållandena. Glatta muskelceller uttryck av α-glattmuskelaktin (SMA) och myosin tung kedja (SM-MHC) under olika förhållanden, statisk (ingen hastighet), jämn ström (konstant hastighet), och hög puls. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att reproducera pulserande flöde in vitro och kan vara ett medel första steg vid bestämning bidrag flödesförhållanden till sjukdoms patologier. Tidigare studier med detta protokoll har hittat flödesförhållanden bidrar till vaskulär inflammatorisk respons. 1, 10 Dessutom, detta protokoll är avsedd för erfarna laboratorier. Som sådan, varken djupgående strömningsmekanik, eller biokemisk analys beskrivs här. För mer avancerade fluiddynamik, 1 och avancerad teknik, rådfråga litteratur 2 Kritiska i odling celler under vätske skjuvning under långa perioder. 1) upprätthålla en förseglad flödeskrets, utom behållaren, och 2) förebygga förorening genom hela experimentet. Tätning av flödeskretsen är viktigt att upprätthålla medievolymen och korrigera PI nivåer, med införandet av oavsiktlig luft påverkar önskade flödesparametrar. Ytterligare luft i systemet kan partially hindra flödet i ån, stör flödesbana och förbättra efterlevnaden av det totala systemet. Medan volymetriska flödeshastigheter skulle bibehållas, minskad tvärsektionsarea från denna partiell obstruktion skulle leda till lokaliserade ökningar i hastighet och ytavbrott. Både flödeshastigheten variation och ytojämnheter skulle bidra till flödes destabilisering, och möjligen turbulens. Slutligen skulle varje instängd luft i den trycksatta flödessystemet fungera som en kompressibel dämpning av flödet, vilket därigenom minskar PI från dess önskade nivå. Som strömningskretsen är av konstant volym, innesluten luft även skulle orsaka läckage av media som kan inverka negativt på celler, vilket ökar metabolit koncentration över tiden. Blodpump tätande och funktion är beroende av temperatur, därför placeringen av pumpen i inkubatorn får införa tätnings komplikationer. Både ökad närvaro av luft i flödeskretsen och förlust av media genom pumpförsegling eller malfunction kan öka variationen i cellmiljön, och leda till felaktiga resultat. Förebyggande av föroreningar under försöket är viktigt i alla cellkultur. Tätning av flödeskretsen måste återigen betonas att förhindra att föroreningar liksom. Flödes media ger många av de näringsämnen och socker som är nödvändiga för mikroorganismtillväxt, därför rengöring av kretsen omedelbart efter användning är nödvändig. Dessutom kan ett opakt pumplocket, minskar effektiviteten av UV-strålning i sterilisering av den totala pumpen. Detta, tillsammans med den oförenlighet akryl kolven med etanol, kräver full sterilisering av kretsen med användning av väteperoxid (H 2 O 2). Förebyggande av förorening tillväxt när systemet inte används, användning av steriliseringslösning, och upprätthålla en steril miljö alla får införa komplikationer antingen genom att tillåta kontaminering eller sterilisering cellodling. Begränsningar av denna teknik inkluderar oförmåga att rättaly modellera komplexa flödesvågen i fysiologisk blodflödet. Medan systemet flödes erbjuder en nära approximation, kan olika aspekter av den komplexa vågformen sett i fysiologisk flöde inte styras eller ändras. Dessutom backning skjuvspänning i fram- och återgående flöde är en komplikation ses i vissa artärsjukdom, och får inte på replikeras med denna flödessystem. Dessutom kan långtidsstudie av cellsvar vara mer komplicerat och utmanande, främst på grund av utförandet av pumpen. Att minska nedströms motståndet är viktigt att behålla integriteten i flödessystem och pumpeffektivitet. Slutligen använder systemet ovan glasskivor och polykarbonatmembran, vilka inte fysiologiskt modellera vaskulaturen, och tar inte hänsyn till mekanisk signalering som resulterar från arteriell sträckningen eller basalmembran styvhet. Tidigare har en studie använt ett pulserande systemet kan återge pulserande flöde med hjälp av sprutpumpar 1 2. Effekten av systemet reproducing hög PI kan påverkas av begränsningar i varvtal och tätning. Metoden för dämpkammare är dessutom enklare i sin ansökan, som inte kräver pump programmering. Framtida tillämpningar av flödessystemet skulle möjliggöra mekanisk signalering till följd av arteriell sträcka genom inkorporering av elastisk slang för att ersätta flödeskammaren och bild. Genom denna förbättring kan inkompatibla efterlevnad och luminala ytdiskontinuiteter ytterligare studeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna finansieringskällor, inklusive AHA (13GRNT16990019 till WT) och NHLBI (HL097246 och HL119371 till WT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| Glutaraldehyde Solution | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Glass Slide (70 mm x 50 mm) | Sigma-Aldrich | CLS294775X50 | |
| Polycarbonate Membrane | Millipore Corp. | HTTP09030 | |
| Silicone Gasket | Grace Bio-Labs | RD 475464 | |
| Fibronectin (25 μg/ml) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagen Type-I | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| NaHCO3 | Fluka | 36486 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Damping Chamber | This chamber is custom made, and may be requested using the engineering drawing of Figure 3. | ||
| Blood Pump | Harvard Apparatus | 529552 | |
| Poly-Vinyl Carbonate Tubing | US Plastic | 65066, 65063, 65062 | Various sizes may be required |
| Luer Connections | Nordson Medical | Various | Various sizes will be required, and a number of parts should be purchased for replacement use. |
| Culture Chamber | Machined in-house | Custom | Acrylic may be purchased in sheets and machined for intended use. The engineering drawing shown in Figure 2 may be used to recreate this chamber. |
| Square Petri Dish | Cole-Parmer | EW-14007-10 | |
| Glass Slide Holder | Capitol Scientific | WHE-900303 | |
| Fetal Bovine Serum | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Mediatech, Inc. | 10-013-CV | |
| Flow Meter | Sonotec, GmbH | Sonoflow co.55/060 | |
| Sylgard Elastomer Kit | Sigma-Aldrich | 761036-5EA | |
| 14 G Steel Cannula | General Laboratory Supply | S8365-1 |
References
- Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves. Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).
- Tan, Y., et al. Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway. PLoS ONE. 9 (7), e102195 (2014).
- Wexler, L., et al. Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association. Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).
- Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M. Vascular fibrosis in atherosclerosis. Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).
- Lee, C. H., et al. Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents. Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis. Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).
- Greil, O., et al. Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry. J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).
- Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function. Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).
- Liu, S. Q., Goldman, J. Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration. IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).
- Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression. AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).
- Panaritis, V., et al. Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients. Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).
- Miao, H., et al. Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations. J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).
