Introduction
Устойчивости к гербицидам сорняков в представляет серьезную угрозу для мирового производства продовольствия и волокон 1,2. В настоящее время тысячи устойчивых популяций и биотипов из более чем ста видов сорняков во всем мире были задокументированы и изучены 3. Основным механизмом, который придает устойчивость к гербициду в растениях является изменение гербицидов генов и белков-мишеней, в том числе сайта генетических мутаций, которые влияют на гербицид-белка кинетики связывания или амплификацию гена-мишени сайте 2. Метаболический детоксикации с помощью повышенных деятельности цитохрома P450 P450 (монооксигеназы) или глутатион S -transferase (GST) ферментов является еще одним механизмом, который придает устойчивость к гербициду в сорняков, которая отличается несколькими способами от целевой сайт на основе механизмов 2. Метаболический основе сопротивления имеет значительные последствия для того, завод фитнес расходы (ака фитнес штрафов) может привести от mechanis гербицидам сопротивлениям, а также в отношении возможности для единого механизма детоксикации придания поперечного или нескольких гербицидам в сорняков населения 1,2,4. Как правило, к гербициду растений обмен веществ в можно разделить на три фазы 5. Этап I включает превращение гербицидам или активации такого как Р450 опосредованного гидроксилирования ароматических колец или алкильных групп, или путем N - O- или реакций деалкилирования, что приводит к увеличению полярности и частичное гербицида детоксикации 5,6. Недавно введены функциональные группы в фазе я могу предоставить сайтов сцепления для сопряжения с восстановленного глутатиона по GSTS или глюкозы UDP-зависимых гликозилтрансфераз в фазе II 5,7. Например, основная первоначальная метаболит примисульфурон-метил кукурузы представляет собой гидрокси-примисульфурон-метил 8, которые могут быть дополнительно метаболизируется гидрокси-примисульфурон-глюкозид (этап II), а затем транспортируется в вакуоль для длительного хранения или дальнейшей метаболических заботки 5,6 (Фаза III).
Waterhemp (амарант tuberculatus) является трудной к контролю, двудольные однолетние виды сорняков, что препятствует производство кукурузы (Zea Mays), соевое (Глицин макс), и хлопок (хлопчатник обыкновенный) в Соединенных Штатах. Высокая степень генетического разнообразия waterhemp способствует его двудомное биологии и междугородной ветра опыления, и один женский waterhemp завод может производить до миллиона семян 9. Эти семена мелкие и легко распространяться, что, естественно, наделить waterhemp эффективным механизмом разгона. Waterhemp отображает непрерывную прорастание всей вегетации 9, и его семена могут прорасти через несколько лет покоя. Waterhemp является С 4 растение, обладает более высокой скоростью роста, чем большинство широколиственных сорняков в сельскохозяйственных системах земледелия 10. Кроме того, многочисленные популяции waterhemp устойчивы к многократному семИлиеш гербицидов 3.
Популяция waterhemp (обозначенной MCR) из Иллинойс устойчив к 4-гидрокси-phenylpyruvate диоксигеназой (HPPD) -inhibiting гербициды 11, такие как мезотрионом, а также атразина и ацетолактатсинтазу (ALS) -inhibiting гербициды, в том числе примисульфурон-метил , из-за механизмов, основанных 12,13 нецелевых-сайта. Другой население waterhemp обозначены ACR 14, который примисульфурон-метил-стойкие (из-за мутации в гене АЛС) и атразина устойчивостью, но чувствительны к мезотрионом и населением waterhemp назначенного WCS 14, чувствительного к примисульфурон-метил, мезотрион и атразин были использованы в сравнении с MCR в нашем исследовании 12 предварительного и текущего экспериментов (приведены в таблице 1). Первоначальные исследования не обнаружили изменений в уровнях последовательность гена HPPD или выражение или уменьшается поглощение мезотриона, в MCRНаселение по сравнению с Мезотрион чувствительных популяций 12. Тем не менее, исследования метаболизма с целыми растениями показали, значительно более низкие уровни родительского мезотриона гербицида в MCR по сравнению с ACR и WCS, который коррелирует с предыдущих ответах фенотипических к Мезотрион 11,12.
| Waterhemp Население | Сокращение | Фенотип Мезотрион | Мезотрион Сопротивление Механизм | Фенотип примисульфурон | Примисульфурон Сопротивление Механизм |
| Маклин Каунти устойчивостью | MCR | Стойкий | Метаболизм * | Стойкий | Метаболизм |
| Адамс Каунти устойчивостью | ACR | SensitIve | - | Стойкий | Целевая-сайт мутация в ALS 14 |
| Уэйн Каунти-Чувствительный | WCS | Чувствительный | - | Чувствительный | - |
* Механизмы сопротивления Номера целевой сайт, чем другие расширения метаболизма, также может придавать устойчивость мезотриона в популяции MCR 12.
Таблица 1: Описание waterhemp населения от Иллинойса, используемых в данном исследовании.
В дополнение к определению ставки гербицидов метаболизма в интактных проростков waterhemp, другая экспериментальный подход был разработан и использован в нашем предыдущем исследовании, чтобы исследовать метаболизм с помощью вырезали waterhemp лист теста 12, а также различные ингибиторы P450 (например, tetcyclacis и Малатион). Этот метод был адаптирован специально для waterhemp из previПодразделения исследование примисульфурон-метил метаболизма в вырезанной кукурузы оставляет 15, так как Иссеченную лист анализ еще не поступало проведения гербицид метаболизм исследования в двудольных растений. Organophophosate инсектицид малатион был часто используется для ин виво и ин витро исследований гербицидам метаболизм указывают на вовлечение P450 16. Например, толерантность и быстрый метаболизм мезотрионом кукурузы обусловлены Р450-катализируемой кольцо гидроксилирования, которая была проверена при малатион повышенная чувствительность к кукурузы мезотрионом 17. Точно так же, малатион ингибирует метаболизм АЛС ингибитор примисульфурон-метил в вырезанной кукурузы оставляет 15. Основным преимуществом вырезанной техники является то, что лист данные, полученные не зависят от целого растительных узоров транслокации, важным фактором при оценке метаболизма системных гербицидов, послевсходовой в растениях. Следовательно, этот метод позволяет количественный иКачественный метаболический анализы сосредоточиться на одной обработанной листа 12.
Растительный стратегией клонирования, в сочетании с протоколом вырезанной листьев, ранее использовались в waterhemp проводить исследования метаболизма 12. Из-за скрещивания природы waterhemp (отдельный мужской и женских растений), и большой степенью генетического разнообразия внутри вида двудомных амаранта 9, этот протокол гарантировал, что генетически идентичные саженцы waterhemp были проанализированы в экспериментах времени курса. Эта статья демонстрирует полезность вырезали методом листьев для измерения скорости метаболизма гербицида в двудольных сорняков (waterhemp). Количество родительского гербицида остальные определяли в каждой временной точке (рис 1) с помощью нелинейной регрессии наименьших квадратов анализа, и согласуется с простой кривой первого порядка для того, чтобы оценить время для 50% поглощенной гербицида деградировать ( DT 50). Представительныйхроматограммы из обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) показаны на АЛС-стойкие и, чувствительными к популяции waterhemp, которые указывают на исчезновение головной гербицида и сопутствующим образованием метаболита полярной (ов) во время исследования блюд (рис 2). В центре внимания нашей статьи является описание и продемонстрировать полезность вырезанной листьев анализа в сочетании с растительным методом клонирования для определения точных и воспроизводимых ставки гербицидов метаболизма в двудольных растений, используя единообразно кольцо меченных (url- 14 С) гербициды в три популяции waterhemp, которые отличаются по их реакции целого растительных HPPD- и ALS-гербицидов, ингибирующих (Таблица 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Материал завод, условия роста, и растительное Клонирование
Примечание: Три населения waterhemp были исследованы в этом исследовании: MCR (от McLean Каунти, IL), ACR (с округе Адамс, штат Иллинойс), и WCS (Уэйн Каунти, штат Иллинойс) (Таблица 1).
- Собирают семена и приостановить waterhemp в 0,1 г L-1 агара: водном растворе при 4 ° С в течение не менее 30 дней, чтобы повысить всхожесть. Примечание: Некоторые популяции waterhemp находятся в состоянии покоя, но этот шаг поможет преодолеть дремоту и сделать семена прорастают более равномерно.
- Прорастают семена каждой популяции waterhemp (как в таблице 1) в 12 х 12 см лотками, содержащих заливки среды в теплице.
- Поддержание тепличные условия на 28/22 ° C температурах день / ночь в пределах 16/8 ч фотопериода 12.
- Дополнение естественного света в теплице с света из ртути ламп, чтобы обеспечить минимум 500 мкмоль м -2 с -1 на уровне растительного покрова.
- Пересадка рассады появились, когда они 2 см высотой в 80 см 3 кастрюли в теплице.
- Пересадка рассады в 950 см 3 кастрюли, содержащие 3: 1: 1: 1 смесь заливки смеси: почва: торфяные: песок, когда рассада 4 см в высоту. Добавить 5 г гранул с медленным высвобождением удобрений для каждого банка и смешать с этой почвенной смеси.
- Отрежьте апикальной меристемы побега, содержащий три молодые листья от 7 см высотой растений, чтобы устранить доминирования верхушки.
Примечание: Этот шаг гарантирует, что каждое растение будет расти достаточно 3 см подмышечные побеги, чтобы клонировать. - Акцизные пять подмышечные побеги (3 см в длину), когда рассада около 14 см высотой с каждой популяции waterhemp (как в таблице 1). Удалить большинство листьев на этих подмышечных побегов, чтобы уменьшить потери воды при дальнейшем обращении, но сохраняют два молодых листьев, чтобы дальнейший рост на пересадки.
- Пересадка подмышечных стреляет в 80 см 3 горшках (один горшок рассады в) в заливки среды, который является тем же среда, используемая для прорастания. Герметичные среда должна быть насыщенной, первоначально, пока корни образуют в камере роста, затем поддерживать постоянную влажность и место горшки в ростовой камере в течение 7 дней, чтобы установить корни.
Примечание: Растения очень чувствительны в этой точке и не следует подчеркнуть.- Поддержание роста условия в камере при 28/22 ° C температурах день / ночь в пределах 16/8 ч фотопериода 12.
- Сочетание ламп накаливания и люминесцентных может быть использован для обеспечения свет в камере роста и должны доставить по крайней мере, 550 мкмоль м -2 с -1 поток фотонов на заводе навеса уровне 12.
- Пересадка снова в 950 см 3 горшках (один саженец на горшок) сontaining 3: 1: 1: 1 смесь заливки смеси: почва: торфяная: песок (также 5 г медленно релиз гранулы удобрений), когда клонированные растения 4 см высотой, а затем перенести обратно в теплицу.
- Клонировать растения второй раз, используя тот же метод, описанный выше (то есть, повторить шаги от 1,5 до 1,8, а затем перейдите к шагу 2.1). Для типичного исследования времени, конечно, генерировать клоны, по крайней мере шесть независимых заводов из каждой популяции waterhemp и записывать их как линии MCR 1-6, 1-6 и ACR WCS 1-6.
- Установите по крайней мере шесть различных "родитель" клоновых линий для того, чтобы повторить эксперимент и адекватно представлять генетическую изменчивость внутри каждой популяции waterhemp.
- В зависимости от того, сколько раз пункты будут проанализированы, генерировать достаточно суб-клонов от каждого "родительской" клонального линии провести исследование времени курс.
2. Проведение метаболизм исследования с акцизных Waterhemр Листья
- Акцизный третьим самым молодым листья (от 2 до 3 см в длину, включать 0,5 см прикрепленного черешках), когда клонированные waterhemp растения от 10 до 12 см высотой для гербицидов метаболизма и ДТ 50 анализа.
- Вырезать черешки листьев с каждого растения waterhemp второй раз (обеспечение, что 0,3 см черешка остается) под водой, и разместить их обрезанными концами в 1,5 мл пластиковые флаконы (один лист на флакон) 15.
Примечание: Резка второй раз под водой предотвращает образование пузырьков воздуха от формирования и подключения ксилемы суда.- Во-первых, частично погрузить вырезали листья с вырезом черешка в предварительно инкубационном буфере (200 мкл) в 0,1 М Трис-HCl (рН 6) в течение 1 ч.
- Во-вторых, каждый лист двигаться к новому 1,5 мл пробирку, содержащую инкубационном буфере (200 мкл) в 0,1 М Трис-HCl (рН 6) плюс 150 мкм [url- 14 C] гербицида, и инкубируют при 28 ° С в течение 1 часа к позволяют поглощения гербицида в листья.
Примечание: Оба 14 C-мезотрион и
Примечание: Эффект метаболическими ингибиторами метаболизма гербицида на можно определить путем модификации шаги 2.2.1, 2.2.2 выше. Добавить 100 мкм ингибитора в буфере предварительной инкубации и пусть инкубировать в течение 2 ч, а затем перенести в инкубационном буфере с гербицидом и снова добавить 100 мкм ингибитор. Например, малатион и tetcyclacis подавляют определенные виды деятельности цитохрома P450 в растениях 15-17. - Промыть погруженной части вырезанных листьев с деионизированной водой и передавать вырезанные листья на четверть силы Мурашига и Скуга (МС) соли раствор (500 мкл) при 0 ч, 5 ч, 11 ч, 23 ч, или 35 ч, соответственно, в камере роста для времени курс обмена исследования.
- Урожай путем удаления отпускс от инкубационный раствор в соответствующий момент времени и вручную измельчить Каждый лист ткани в жидком азоте с использованием полипропиленовой трубки (15 мл) и пестик стекла.
- Экстракт меченного радиоактивным изотопом гербицид и его метаболитов из каждого листа 7 мл 90% ацетона с лабораторной ткани гомогенизатора в том же полипропиленовую пробирку, как описано выше. Промыть ткани гомогенизатора с дополнительными 7 мл 90% ацетона и продолжают гомогенизации до ткани полностью не измельчают (обычно около 2 мин). Примечание: 90% ацетона можно использовать для извлечения большинстве гербицидов из растительных тканей. Однако, если этот способ не может извлечь больше, чем 90% меченых соединений, поглощаемых, то 90% метанол или 90% ацетонитрил может быть замещен, как экстракционного растворителя.
- Этикетка 90% ацетон экстракты (14 мл всего) и хранят при температуре 4 ° С в течение 16 часов, чтобы позволить дополнительное извлечение происходит.
Примечание: После этого извлечения обработанных листьев, количество экстрагируемого радioactivity обычно составляет по меньшей мере 98% от меченных радиоактивным изотопом соединений, поглощаемых обработанный лист. Неэкстрагируемых радиоактивность (связанные остатки) в вырезанных листьев в среднем лишь 0,3% во всех временных точках в нашем предыдущем исследовании 12, но это количество может варьироваться в зависимости от используемого гербицида и момент времени рассматривается. - Центрифуга образцов при 5000 х г в течение 10 мин и концентрируют супернатанты при 40 ° С с помощью роторного испарителя до конечного объема 0,5 мл получается. Перевести этот объем до 2,0 мл пластиковую трубку.
- Добавить смеси ацетонитрил: вода (1: 1, по объему), чтобы отрегулировать конечный объем растительных экстрактов 1,25 мл и повторно центрифугируют при 10000 х г в течение 10 мин, чтобы удалить любые твердые частицы.
- Измерение общей радиоактивности в аликвоте, взятой из каждого образца (распадов в минуту мкл -1) с помощью жидкостной сцинтилляционной спектроскопии (LSS) 12 и нормализовать количество [14 С-меченого] соединения вводили в ВЭЖХ-анализа (например, 10,000 всего DPM / образец / Run), так у-оси будет равномерным среди образцов, когда графический результатов.
3. Анализ ВЭЖХ гербицида обмена веществ в листьях вырезали
Примечание: Решение общей радиоактивности в экстрагируемого из родителей к гербицидам и к гербицидам метаболитов в следующих условиях ОФ-ВЭЖХ 12.
- Выполнение RP-HPLC на колонке с C 18 (4,6 х 250 мм, 5 мкм размер частиц для аналитической ВЭЖХ) при скорости потока 1 мл мин -1 для большинства неполярных гербицидов.
Примечание: Столбцы С 4 или С 12 ОФ-ВЭЖХ также может быть использован для оптимизации разделение родительского гербицида из его метаболитов. Фильтр предварительной колонки и / или защитная колонка также может быть использован для защиты и продлить срок службы колонки RP.- Используйте следующий состав подвижной фазы для ВЭЖХ с обращенной фазой: элюент А, 0,1% муравьиной кислоты (объем / объем) в воде, и элюент В 100% ВЭЖХ-сорт ацетонитрила.
Примечание: ВЭЖХ-сорт метанол также могут быть использованы как Эльuent В для решения более полярные соединения и метаболитов, но знать, что время удержания также может меняться.
Примечание: Профиль элюции, используемый для разрешения мезотрион или примисульфурон-метил от их полярных метаболитов в нашем исследовании 12, Шаг 1, A: B (4: 1, об / об), A: B (3: 2, об / об ) в линейном градиенте (12 мин); Шаг 2, A: B (3: 2, об / об) с A: B (3: 7, об / об) в линейном градиенте (5 мин); Шаг 3, A: B (3: 7, об / об) с A: B (1: 9, об / об) в линейном градиенте в течение 2 мин (включающий в общей сложности 19 мин).
Примечание: Градиенты и изократические шаги, возможно, потребуется отрегулировать на основе физических свойств исходного материала в целях оптимизации разрешения. - Выполните описанные выше линейные шаги градиент A: B (1: 9, об / об), A: B (4: 1, об / об) в линейном градиенте (3 мин) и A: B (4: 1, об / объем) изократическая шаг (по крайней мере 2 мин) повторно уравновешивают колонку RP перед инъекцией следующего экстракт 12.
- Используйте следующий состав подвижной фазы для ВЭЖХ с обращенной фазой: элюент А, 0,1% муравьиной кислоты (объем / объем) в воде, и элюент В 100% ВЭЖХ-сорт ацетонитрила.
- Обнаружение и визуализировать радиоактивную метку соединений с Scinti Flowllation анализатор. Запишите количество родительского гербицида оставшихся в каждом образце в процентах от общей радиоактивности в каждом образце (обнаружены и количественно с помощью потока сцинтилляционного анализатора в соответствии с инструкциями завода-изготовителя), чтобы определить темпы гербицидов метаболизма в каждой популяции waterhemp за время курса.
4. Статистические процедуры
- Упорядочить процедуры в совершенно произвольном порядке (или другого подходящего устройства для статистического анализа).
- Выполнение двух независимых экспериментов с каждой обработки, состоящей из трех повторностей для биологических каждого эксперимента. Два независимых экспериментов включает в себя шесть биологических повторяет в целом. Если эксперимент эффект не является значимым (α = 0,05), комбинировать и анализировать данные из каждой независимой эксперимента. Если эксперимент эффект будет значительным, а затем проанализировать каждый эксперимент по отдельности.
Примечание: Включите первые три биологические повторяет ян эксперимент 1 и в ближайшие три биологических повторяет в эксперименте 2. Каждый биологический повторной представляет собой отличный "родителя" клональный линия получена из каждой популяции (MCR 1-6, 1-6 ACR, и WCS 1-6), так что каждый по времени Анализ Конечно использует генетически идентичных растений. Два независимых экспериментов включает в себя шесть биологических повторяет в общей сложности, что позволяет для адекватного представления генетической изменчивости и определения медианы DT 50 для каждой популяции waterhemp. - Анализ данных с нелинейной наименьших квадратов регрессионного анализа и соответствовать им с простой кривой первого порядка для того, чтобы оценить DT 50 с. Уравнение ниже описывается модель:
- где в этой модели у представляет процент материнской гербицида, остающейся в момент времени Т, μ I является DT 50 для каждогоwaterhemp населения я, а параметр С 0 представляет собой оценку суммы материнского гербицидов настоящее при Т = 0 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Большие различия в темпах мезотриона метаболизма были обнаружены между любом WCS или ACR и MCR (рисунок 1). В каждый момент времени, MCR были быстрее, чем двух Мезотрион чувствительных групп населения, WCS и ACR, что коррелирует с предыдущими ответами фенотипических целого растений 11 метаболизируется мезотрион. Клонированием достаточно растений из одного родительского растения из каждой популяции, анализ времени курс обмена гербицида являются однородными и воспроизводимыми из-за отсутствия генетической изменчивости в пределах каждого временного хода 12. Например, временной ход для мезотриона метаболизма в клональной линии 5 12 отображается на рисунке 1. В общей сложности шесть различных клоновых линий, полученных от шести отдельных родительских растений, были проанализированы с каждой популяции (таблица 1), чтобы определить общее медиану DT 50 значение, которое указано, что мезотриона метаболизм в MCR был значительно быстрее (
В дополнение к изучению механизмов сопротивления мезотриона в MCR, связанной целью было определить механизм резистентности к ингибиторам АЛС в MCR. Предыдущие исследования показали, что к югу от населения получены из MCR был БАС устойчивы, но не обладают мутацию в гене целевой сайт ALS, указывая на основе нецелевых-сайт механизма 13. Это в отличие от ACR, который устойчив АЛС из-за мутации сайта-мишени, который придает менее-АЛС фермента 14. Для того, чтобы TESт этой гипотезе, Иссеченную лист анализ проводили с [url- 14 C] примисульфурон-метил, в БАС-ингибирующего гербицида сульфонилмочевины семьи. Площадь пика 14 С-примисульфурон-метил в представительном хроматограмме ВЭЖХ (время удерживания 21,6 мин примерно) был значительно меньше, чем в MCR в ACR и WCS в 12 HAT (Рис.2). Кроме того, полярные метаболиты два с более коротким временем удерживания, чем примисульфурон-метил были обнаружены в отделенных листьев экстрактов из всех трех групп (рисунок 2). Хотя структуры этих двух полярные метаболиты не были определены в данном исследовании, их быстрое образование соответствует кольцевой гидроксилирования примисульфурон-метил 8 (этап I метаболизм) с последующим глюкозы конъюгации 5 (этап II) метаболизма.
В сочетании с качественными анализов примисульфурон метаболизма в MCR, ACR, и WCS (Рисунок 2), количествородителя гербицид остальные в каждый момент времени количественно и использовать для определения ДТ 50 значений примисульфурон-метил в MCR (13,6 ч), ACR (> 24 ч), и WCS (> 24 ч) (Рисунок 3). Значительно короче DT 50 значение MCR согласуется с повышенной метаболизма в качестве основного механизма для ALS сопротивления в этой популяции, в соответствии с исследованиями предыдущая целого завода 13. Интересно, однако, DT 50 для примисульфурон в ACR и WCS похожи, но значительно больше, чем в MCR (рис 3), несмотря на обоих MCR и ACR отображения АЛС-ингибиторов, устойчивые фенотипы (Таблица 1). Относительно длинные DT 50 в ACR, возможно потому, что нет необходимости, чтобы быстро усваивать примисульфурон, так ACR имеет менее АЛС фермента в качестве основного механизма сопротивления 14. В целом, вырезали waterhemp лист анализе использовали в нашем исследовании дали ценную кваlitative и количественные данные и при условии, новое понимание метаболизма на основе механизмов резистентности к двум различным гербицидов в MCR, ACR, и WCS.
Рисунок 1:. Время курс мезотриона метаболизма в вырезанной waterhemp выходит из вегетативно клонированных популяций Вырезанные листья (третья молодой лист; 2 до 3 см в длину) из waterhemp рассады (от 10 до 12 см) были вегетативно клонировали, так что каждый раз, когда курс Исследование для каждой линии состояли из генетически идентичных растений. Вырезанные листья помещали в 0,1 М Трис-HCl-буфера (рН 6) в течение 1 ч, а затем 0,1 М Трис-HCl (рН 6), а также 150 мкМ радиоактивно мезотриона в течение 1 часа ("импульсный"), то четверть силы Мурасиге и Скоог (МС) соли раствор ('Chase') при 0 ч, 5 ч, 11 ч, 23 ч и 35 ч, чтобы позволить обмен происходит. Дата были проанализированы с помощью нелинейного наименьших квадратов регрессионного анализа и согласуется с простой кривой первого порядка, чтобы оценить DT 50 отдельно для каждого клонированного населения waterhemp 12 .Отель MCR клональный линия быстро метаболизируется мезотрион, в то время как клоновых линий ACR и WCS метаболизируется мезотрион медленнее. Данные, приведенные в время курсы от всего клонального линии 5 для каждой популяции waterhemp, который был модифицирован с нашей предыдущей работе (12 Copyright Американского общества биологов растений).
Рисунок 2:. Примисульфурон-метил метаболизма в MCR, ACR и WCS (12 HAT) представитель обращенно-фазовой ВЭЖХ хроматограммы для вырезанных waterhemp экстракты листьев (12 HAT), снабжены 150 мкм с радиоактивной меткой примисульфурон-метил (как описано в Протоколе) из Маклин Каунти (MCR, А), Адамс Каунти (ACR, В), Ай Вэйн Каунти гербицид чувствительных (WCS, С) населения (Таблица 1). Радиоактивный пик с временем удерживания 21,6 мин в примисульфурон содержит-метил, как определено по сравнению с аутентичным аналитического стандарта. Пики с более короткими временами удерживания вероятные полярные, менее фитотоксическом метаболиты примисульфурон-метил, такие как гидрокси-примисульфурон-метил 8 или гликозилированных форм гидроксилированных метаболитов 5,6. Население MCR отображается значительное снижение количества исходного примисульфурон-метил отношению к ACR и WCS, который количественно в качестве нижнего DT 50 для MCR (рисунок 3).
Рисунок 3:. Время курс примисульфурон-метил метаболизма в подакцизных waterhemp листьев вырезали waterhemp листьев (thirд-младший лист; От 2 до 3 см) обрабатывают, как описано на фиг.1 и нашей предыдущей исследований с мезотрионом 12, за исключением того, что 150 мкМ радиоактивно примисульфурон был включен как "импульсный" и листья инкубировали в соли раствора MS ("чейза") при 0 ч 3 ч, и 11 ч. Данные были проанализированы с помощью нелинейного наименьших квадратов регрессионного анализа, как описано ранее для мезотриона метаболизма (рис 1) 12. Население MCR быстро метаболизируется примисульфурон-метил (DT 50 = 13,6 ч), в то время как ACR и WCS метаболизируется примисульфурон-метил медленнее (DT 50> 24 ч).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод вырезали лист описано ранее использовался в исследовании примисульфурон метаболизм в листьях кукурузы 15, но наши результаты показывают, что этот протокол является также эффективным, точным и воспроизводимым для измерения гербицид обмен веществ в двудольных видов сорняков 12. Основным преимуществом метода вырезанной листьев по сравнению с исследований целого растения является то, что Иссеченную лист не зависит от целого растительных транслокации форм послевсходовой системных гербицидов или различий в поглощении между гербицидом растений или популяции. Кроме того, изменчивость окружающей среды уменьшается, поскольку Исключены лист анализы проводились в ростовой камере, при одном слое, помещенном в трубки, по сравнению с изучением целых растений, выращенных в тепличных условий. Растительный стратегия клонирования был также включен в наш метод для изучения механизмов мезотрион-сопротивления в MCR 12, чтобы минимизировать большую степень генетической дисперсии внутри и бытьанимации амаранта населения 9. Генетическое разнообразие в популяциях амаранта сорных показано на сумму документально изменчивости в ответах целого растительных нескольких семей послевсходовых гербицидов 18. При проведении времени курс исследования, чтобы определить точные DT 50 S и для обнаружения значимых различий при сравнении DT 50 значений между популяциями waterhemp 12, эти шаги (как указано в нашем вырезанной листьев и растительного протокола клонирования) имеют решающее значение для устранения или уменьшения генетического и экологического изменчивость.
Существуют различные механизмы в растениях для придания гербицид сопротивление 1,2. Например, waterhemp сопротивление БАС-гербицидов, ингибирующих может быть целевой сайт на основе 14 или нецелевых-сайт на основе 13. Метаболические темпы примисульфурон-метил (рис 3) ясно показывают, эти различия между двумя БАС-стойкой waterhнаселения ЭМИ, MCR и ACR (Таблица 1). В сочетании с ПЦР-амплификации и анализа последовательности генов к гербицидам целевой сайт, вырезали лист анализ будет в значительной степени способствовать выявлению ли к сопротивление гербицида в waterhemp или других двудольных сорняков присуждается цель сайта или нецелевых-сайта механизмов 2.
Ограничения нашей вырезанной методом листовой включают неспособность визуализировать или измерять образцы гербицид транслокация в течение всего завода, или определить, если сотовая или суб-клеточные механизмы существуют секвестрации, которые придают устойчивость основе нецелевых-сайта в сорняков 2. Как упоминалось ранее, этот аспект также считать преимуществом при определении точного ставки гербицид метаболизма в мезотрионом устойчивых популяций сорных 12, но, наоборот, можно считать недостатком при изучении системными гербицидами, которые существенно не метаболизируется в растениях (т.е. неселективный травыicides), такие как глифосат 2 или контактных гербицидов, которые не являются селективными в природных популяциях сорняков, таких как паракват или глюфозинатом 19. Тем не менее, если механизмы целевой сайт не выявлены изначально, то расширенные показатели метаболизма гербицидов, как правило, исследуется в следующем 1,4, в частности, при изучении сопротивления сорняков в HPPD ингибирования гербицидов, таких как мезотрионом 12, БАС-ингибирующие гербициды, такие как примисульфурон-метил 13 , фотосистемы II-ингибирующие гербициды, такие как атразин 1,12, или ацетил-СоА-гербицидов, ингибирующих 4.
Р450 были связаны с БАС сопротивления в популяции Echinochloa 20 сорными видами трав, а также с мезотрионом и сопротивления БАС в MCR 12,13. Двудомное, двудольным сорняков, связанные с waterhemp, Палмер амарант (А. Palmeri), также склонны к развитию устойчивости к гербицидам с помощью нескольких различных механизмов 1-3. Поскольку все больше устойчивые к гербицидам сорняков населения и видов документально по всему миру 3, потребность в быстро рассмотрении гербицид метаболизм в качестве потенциального механизма сопротивления будет продолжать расти. Вырезанную лист подход, который отличается, но относящиеся к исследованиям целого растений, обычно используемых для изучения механизмов на устойчивость к гербициду, является точным и ценным инструментом для оценки и количественного гербицид метаболизм растений. В результате, возможность выполнять эти анализы с точными, воспроизводимыми методами, включая вырезанной листа теста в значительной мере способствует исследователей в определении механизмов сопротивления нецелевых-сайт в обеих травы и двудольных 4 12 сорняков.
Будущие приложения этого метода могут также включать определение скорости метаболизма гербицида в двудольных культур, таких как соевые бобы и хлопок. Текущие исследования в нашей лаборатории к гербицидам сортов сои также использовали вырезали лДСП подход. Однако, поскольку соя бобовых культур с тройчатые листья, An 'вырезали черешок "методика была адаптирована и разработана таким образом, что каждый трехлепестный лист может поглотить радиоактивно гербицид с помощью поглощения через главный черешок (Скелтон, Лыгин и Riechers, неопубликованные данные).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 ml tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 ml tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
- Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
- Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
- Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
- Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
- Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
- Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
- Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
- Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
- Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
- Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
- Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
- Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
- Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).
- Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
- Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
- Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).
