Introduction
Herbicidresistens i ukrudt udgør en alvorlig trussel mod den globale produktion af fødevarer og fibre 1,2. I øjeblikket tusindvis af resistente populationer og biotyper fra over hundrede ukrudtsarter verdensplan er blevet dokumenteret og studeret 3. En væsentlig mekanisme, der giver herbicidresistens i planter er ændringen af herbicid target-site gener og proteiner, herunder genetiske mutationer, der påvirker herbicid-proteinbindende kinetik eller amplifikation af target-site-gen 2. Metabolisk afgiftning via forhøjede aktiviteter af cytochrom P450 monooxygenase (P450) eller glutathion S transferase (GST) enzymer er en anden mekanisme, som giver herbicidresistens i ukrudt, som er forskellig på flere måder fra target-site-mekanismer 2. Metabolisk-baserede modstand har betydelige konsekvenser for, om planter fitness omkostninger (aka fitness sanktioner) kan resultere fra herbicid-resistens mechanism, samt om potentialet for en enkelt afgiftning mekanisme til at bibringe tvær- eller flere herbicidresistens i ukrudt populationer 1,2,4. Generelt kan herbicid metabolisme i planter opdeles i tre særskilte faser 5. Fase I involverer herbicid konvertering eller aktivering, såsom P450-medieret hydroxylering af aromatiske ringe eller alkylgrupper, eller ved N - eller O- dealkyleringsprodukter reaktioner, der fører til øget polaritet og delvis herbicid afgiftning 5,6. Nyligt indførte funktionelle grupper i fase I kan give sammenkædning websteder for konjugering til reduceret glutathion ved GST'er eller glucose ved UDP-afhængige glycosyltransferaser i fase II 5,7. For eksempel, de store oprindelige metabolit primisulfuronmethyl i majs er hydroxy-primisulfuronmethyl 8, som yderligere kan metaboliseres til hydroxy-primisulfuron-glucosid (fase II) og derefter transporteres til vacuolen til opbevaring langvarig eller yderligere metabolisk probejdning 5,6 (fase III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) er en vanskelige at kontrol, tokimbladede årlige ukrudtsarter, der hindrer produktionen af majs (Zea mays), sojabønne (Glycine max), og bomuld (Gossypium hirsutum) i USA. Den høje grad af genetisk diversitet waterhemp lettes ved sin tvebo biologi og langdistance-vind bestøvning, og en enkelt kvindelig waterhemp plante kan producere op til en million frø 9. Disse frø er små og let spredes, hvilket naturligvis udstyre waterhemp med en effektiv spredningsmekanisme. Waterhemp viser løbende spiring hele vækstsæsonen 9, og dens frø er i stand til at spire efter flere års dvale. Waterhemp er en C4 plante, der har en højere vækstrate end de fleste bredbladet ukrudt i dyrkede dyrkningssystemer 10. Desuden har mange waterhemp populationer er resistente over for multiple families af herbicider 3.
En population af waterhemp (betegnet MCR) fra Illinois er resistent over for 4-hydroxy-phenylpyruvate dioxygenase (HPPD) hæmmende herbicider 11, såsom mesotrion, samt atrazin og acetolactatsyntase (ALS) hæmmende herbicider, herunder primisulfuronmethyl på grund af ikke-mål-site mekanismer 12,13. En anden population af waterhemp betegnet ACR 14, som er primisulfuronmethyl-resistente (som følge af en mutation i ALS-genet) og atrazin-resistente, men følsomt over for mesotrion, og en waterhemp population udpeget WCS 14, der er følsom over for primisulfuronmethyl, mesotrion, og atrazin blev anvendt i sammenligning med MCR i vores tidligere forskning 12 og aktuelle forsøg (opsummeret i tabel 1). Indledende undersøgelser ikke påvise ændringer i HPPD gen sekvens eller ekspressionsniveauerne eller reduceret mesotrion optagelse i MCRbefolkning sammenlignet med mesotrion følsomme befolkningsgrupper 12. Men metabolisme med hele planter viste signifikant lavere niveauer af forældre mesotrion herbicid i MCR i forhold til ACR og WCS, som korreleret med tidligere fænotypiske svar til mesotrion 11,12.
| Waterhemp Befolkning | Forkortelse | Fænotype mesotrion | Mesotrion Resistance Mechanism | Fænotype primisulfuron | Primisulfuron Resistance Mechanism |
| McLean County-Resistant | MCR | Resistent | Metabolisme * | Resistent | Metabolisme |
| Adams County-Resistant | ACR | SenSitive | - | Resistent | Target-site mutation i ALS 14 |
| Wayne County-Sensitive | WCS | Følsomme | - | Følsomme | - |
* Ikke-target-site resistensmekanismer, bortset forbedret stofskifte, kan også bibringe mesotrion modstand i MCR befolkning 12.
Tabel 1: Beskrivelse af waterhemp populationer fra Illinois anvendt i denne undersøgelse.
Ud over at bestemme satserne for herbicid metabolisme i intakte waterhemp kimplanter, blev en anden eksperimenterende tilgang udviklet og anvendt i vores tidligere forskning for at undersøge metabolisme ved hjælp af en udskåret waterhemp blad assay 12 samt forskellige P450-hæmmere (f.eks tetcyclacis og malathion). Denne fremgangsmåde blev tilpasset specielt til waterhemp fra en tidli-skellige undersøgelse af primisulfuronmethyl metabolisme i udskåret majs blade 15, da det udskårne blade assay endnu ikke var blevet rapporteret for udførelse herbicid metabolisme forskning i en tokimbladet plante. Den organophophosate insekticid malathion er ofte blevet brugt til in vivo og in vitro herbicid-metabolisme forskning for at angive P450 engagement 16. For eksempel, tolerance og hurtig metabolisme af mesotrion i majs skyldes P450-katalyseret ring hydroxylering, som blev kontrolleret, når malathion øget følsomhed over for majs mesotrion 17. Tilsvarende malathion hæmmede metabolisme af ALS-hæmmer primisulfuron-methyl i udtaget majs blade 15. En stor fordel ved den udskårne blade teknik er, at data, der genereres er uafhængige af hel-plante translokation mønstre, at en vigtig faktor at overveje ved vurderingen metabolisme af systemiske, postemergente herbicider i planter. Derfor er denne metode tillader kvantitativ ogkvalitative metaboliske analyser til at fokusere på en enkelt behandlet blad 12.
En vegetativ kloning strategi, i kombination med det udskårne blade protokollen, er tidligere anvendt i waterhemp at gennemføre metabolismeundersøgelser 12. På grund krydsningspotentiale natur waterhemp (separat mandlige og kvindelige planter), og høj grad af den genetiske mangfoldighed inden for tvebo Amaranthus arter 9, denne protokol sikres, at genetisk identiske waterhemp kimplanter blev analyseret inden for tidsforløbet eksperimenter. Denne artikel viser nytten af det udskårne blade metode til måling satser herbicid metabolisme i en tokimbladet ukrudt (waterhemp). Mængden af forælder herbicid resterende blev bestemt ved hvert tidspunkt (figur 1) ved ikke-lineær mindste kvadraters regressionsanalyse, og er udstyret med et simpelt første ordens kurve med henblik på at estimere tiden for 50% af det absorberede herbicid til at nedbryde ( DT 50). Repræsentantkromatogrammer fra omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) vises for ALS-resistente og -følsom waterhemp populationer, der angiver forsvinden forælder herbicid og samtidig dannelse af polære metabolit (ter) i en tidsforløbet undersøgelse (figur 2). Fokus i vores artikel er at beskrive og demonstrere anvendeligheden af det udskårne blade analysen i kombination med en vegetativ kloning metode til bestemmelse præcise og reproducerbare satser for herbicid metabolisme i tokimbladede planter, ved hjælp af ensartet ring-mærket (URL- 14C) herbicider i tre waterhemp befolkninger, der adskiller sig i deres hel-plante reaktioner på HPPD- og ALS-hæmmende herbicider (tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plant Materiale, vækstbetingelser, og vegetativt Kloning
Bemærk: Tre waterhemp populationer blev undersøgt i denne forskning: MCR (fra McLean County, IL), ACR (fra Adams County, IL), og WCS (fra Wayne County, IL) (Tabel 1).
- Indsamle og suspendere waterhemp frø i 0,1 g L -1 agar: vandopløsning ved 4 ° C i mindst 30 dage til at øge spiring. Bemærk: Nogle waterhemp populationer er i dvale, men dette skridt hjælper til at overvinde vækstdvale og gøre frø spire mere ensartet.
- Spire frø af hver waterhemp population (som i tabel 1) i 12 x 12 cm bakker indeholdende en pottemedium i drivhuset.
- Bevar drivhus betingelser ved 28/22 ° C dag / nat temperaturer inden for en 16/8 timers fotoperiode 12.
- Supplement naturligt lys i drivhuset med lys fra kviksølv halogenlamper til at give mindst 500 pmol m -2 -1 fotonflux på fabrikken canopy niveau.
- Transplant opstod kimplanter, når de er 2 cm høj i 80 cm 3 potter i drivhuset.
- Stiklingerne udplantes i 950 cm 3 potter indeholdende et 3: 1: 1: 1 blanding af pottemuld mix: jord: tørv: sand, når planter er 4 cm høj. Tilsæt 5 g langsom frigivelse gødning granulat til hver potte og blandes med denne jordblanding.
- Skær og fjern skyde apikale meristem indeholder de tre yngste blade fra 7 cm høje planter til at fjerne apikal dominans.
Bemærk: Dette trin sikrer, at hver plante vil vokse nok 3 cm aksil skud at klone. - Punktafgifter fem aksillær skud (3 cm i længden), når frøplanter er omkring 14 cm høj fra hver waterhemp befolkning (som i tabel 1). Fjern hovedparten af bladene på disse armhulen skyder for at mindske vandtab ved yderligere håndtering, men bevarer de to yngste blade for at tillade yderligere vækst ved transplantation.
- Transplant axillær skyder ind 80 cm3 potter (én kimplante per potte) i pottemedium, som er det samme medium, der anvendes til spiring. Pottemedium bør være mættet først indtil rødder form vækstkammeret, derefter opretholde konstant fugtighed og sted potter i kammeret vækst i 7 dage for at etablere rødder.
Bemærk: Planter er meget følsomme på dette tidspunkt og bør ikke understreges.- Bevar vækst kammer forhold på 28/22 ° C dag / nat temperaturer inden for en 16/8 timers fotoperiode 12.
- En kombination af glødelamper og lysstofrør kan anvendes til at give lys i kammeret vækst og bør levere mindst 550 pmol m -2 sek -1 fotonflux på planter canopy level 12.
- Transplant igen i 950 cm 3 potter (én kimplante per potte) containing en 3: 1: 1: 1 blanding af pottemuld mix: jord: tørv: sand (også omfatte 5 g langsom frigivelse gødning granulater), når klonede planter er 4 cm høj, og derefter overføre tilbage til drivhuset.
- Klon planterne en gang ved at bruge den samme metode beskrevet ovenfor (dvs. Gentag trin 1,5-1,8, og derefter gå videre til trin 2.1). For en typisk tidsforløb undersøgelse, generere kloner fra mindst seks uafhængige planter fra hver waterhemp befolkning og registrere dem som linjer MCR 1-6, ACR 1-6 og WCS 1-6.
- Etablere mindst seks distinkte "forældre" klonale linjer med henblik på at gentage eksperimentet og tilstrækkeligt repræsenterer den genetiske variabilitet inden for hver waterhemp population.
- Afhængigt af hvor mange tidspunkter vil blive analyseret, generere nok sub-kloner fra hver "forælder" klonal linje at gennemføre en tidsforløbet undersøgelse.
2. Gennemførelse af en Metabolisme Undersøgelse med udskårne Waterhemp Blade
- Punktafgifter den tredje yngste blade (2 til 3 cm i længden; omfatter 0,5 cm af vedlagte stilk), når klonede waterhemp planter er 10 til 12 cm høj til herbicid metabolisme og DT 50 analyse.
- Cut blad stilke fra hver waterhemp plante en anden gang (at sikre, at 0,3 cm af stilk forbliver) under vand, og placere disse afskårne ender i 1,5 ml plastik hætteglas (ét blad per hætteglas) 15.
Bemærk: Cutting en anden gang under vand forhindrer luftbobler fra formning og tilslutte xylem fartøjer.- For det første delvist nedsænkes udskårne blade med cut stilk i præinkubation buffer (200 pi) i 0,1 M Tris-HCI (pH 6) i 1 time.
- For det andet, flytte hvert blad i et nyt 1,5 ml hætteglas indeholdende en inkubationspuffer (200 pi) i 0,1 M Tris-HCI (pH 6) plus 150 uM [URL- 14C] herbicid, og inkuberes ved 28 ° C i 1 time til mulighed for herbicid absorption i bladene.
Bemærk: Både 14 C-mesotrion og
Bemærk: Virkningen af metaboliske inhibitorer på herbicid metabolisme kan bestemmes ved at ændre trin 2.2.1 og 2.2.2 ovenfor. Tilføj 100 uM af inhibitoren til præinkubation buffer og lad inkuberes i 2 timer, derefter overføre til inkubationsbuffer med herbicid og igen tilsættes 100 pM inhibitor. For eksempel, malathion og tetcyclacis hæmmer visse cytokrom P450 aktiviteter i planter 15-17. - Vask nedsænket del af udskårne blade med deioniseret vand og overføre udskårne blade til en kvart styrke Murashige og Skoog (MS) salte opløsning (500 ul) til 0 timer, 5 timer, 11 timer, 23 timer eller 35 timer, henholdsvis i kammeret for tidsforløbet stofskifte undersøgelse vækst.
- Høst ved at fjerne orlovs fra inkubationsopløsning på et passende tidspunkt og manuelt male hvert blad væv i flydende nitrogen under anvendelse af et polypropylenrør (15 ml) og glas pistil.
- Uddrag radiomærket herbicid og dets metabolitter fra hvert blad med 7 ml 90% acetone med et laboratorium vævshomogenisator i samme rør som ovenfor polypropylen. Skyl vævshomogenisator med yderligere 7 ml 90% acetone, og fortsætte med at homogenisere, indtil vævet er grundigt pulveriseret (sædvanligvis ca. 2 minutter). Bemærk: 90% acetone kan anvendes til udvinding af de fleste herbicider fra plantevæv. Men hvis denne metode er i stand til at udtrække mere end 90% af de radioaktivt mærkede forbindelser absorberes, så 90% methanol eller 90% acetonitril kan være substitueret som ekstraktionsmiddel.
- Label 90% acetoneekstrakter (14 ml i alt) og opbevares ved -4 ° C i 16 timer for at muliggøre yderligere ekstraktion at forekomme.
Bemærk: Efter denne udvinding af behandlede blade, mængden af ekstraherbare radioactivity er typisk mindst 98% af radioaktivt mærkede forbindelser absorberes af det behandlede blad. Ikke-ekstraherbare radioaktivitet (bundne rester) i udskårne blade gennemsnit kun 0,3% på tværs af alle tidspunkter i vores tidligere undersøgelse 12, men dette beløb kan variere afhængig af den anvendte herbicid og undersøgte tidspunkt. - Centrifuger prøverne ved 5000 xg i 10 minutter og koncentreres supernatanter ved 40 ° C med en rotationsfordamper, indtil et slutvolumen på 0,5 ml er opnået. Overfør dette volumen til et 2,0 ml plastrør.
- Tilføj acetonitril: vand (1: 1 med hensyn til volumen) for at justere den endelige volumen af planteekstrakter til 1,25 ml og re-centrifugeres ved 10.000 xg i 10 minutter for at fjerne eventuelle partikler.
- Måling af total radioaktivitet i en prøve taget fra hver prøve (dpm pi -1) ved væskescintillationsspektroskopi (LSS) 12 og normalisere mængder af [14C-mærket] forbindelser injiceret til HPLC-analyse (for eksempel 10,000 total dpm / prøve / køre) så y-akserne vil være ensartet blandt prøver, når graftegning resultater.
3. HPLC analyse af Ukrudtsmiddel Metabolisme i Udskårne Blade
Bemærk: Løs total ekstraherbare radioaktivitet i forælder herbicider og herbicid metabolitter ved hjælp af følgende RP-HPLC-betingelser 12.
- Udfør RP-HPLC med en C18-søjle (4,6 x 250 mm, 5 um partikelstørrelse for analytisk HPLC) ved en strømningshastighed på 1 ml min-1 for de fleste ikke-polære herbicider.
Bemærk: C 4 eller C 12 RP-HPLC-søjler kan også anvendes til at optimere adskillelsen af moder- herbicid fra dets metabolitter. En forkolonne filter og / eller beskyttelseskolonne kan også anvendes til at beskytte og forlænge levetiden af RP kolonne.- Brug følgende mobile fase for RP-HPLC: eluent A, 0,1% myresyre (v / v) i vand, og eluent B 100% HPLC-kvalitet acetonitril.
Bemærk: HPLC-grade methanol kan også anvendes som Elgelige B for at løse mere polære forbindelser og metabolitter, men vær opmærksom på, at retentionstider også kan ændre sig.
Bemærk: Elueringsprofilen bruges til at løse mesotrion eller primisulfuronmethyl fra deres polære metabolitter i vores forskning 12: Trin 1, A: B (4: 1, vol / vol) til A: B (3: 2, vol / vol ) i en lineær gradient (12 min); Trin 2, A: B (3: 2, vol / vol) til A: B (3: 7, v / v) i en lineær gradient (5 min); Trin 3, A: B (3: 7, vol / vol) til A: B (1: 9, v / v) i en lineær gradient i 2 minutter (omfattende en total på 19 min).
Bemærk: Farveforløb og isokratiske trin kan være nødvendigt at justere baseret på de fysiske egenskaber af grundmaterialet for at optimere opløsning. - Følge ovenstående lineær gradient trin med A: B (1: 9, vol / vol) til A: B (4: 1, v / v) i en lineær gradient (3 min) og A: B (4: 1, v / v) isokratisk trin (i mindst 2 minutter) for at re-ækvilibrering af RP-søjle før injektion næste ekstrakt 12.
- Brug følgende mobile fase for RP-HPLC: eluent A, 0,1% myresyre (v / v) i vand, og eluent B 100% HPLC-kvalitet acetonitril.
- Find og visualisere radioaktivt mærkede forbindelser med en Flow Scintillation Analyzer. Optag mængden af forældre herbicid tilbage i hver prøve som en procentdel af total radioaktivitet i hver prøve (påvises og kvantificeres ved Flow Scintillation Analyzer ifølge fabrikantens anvisninger) for at bestemme satserne for herbicid metabolisme i hvert waterhemp population under tidsforløbet.
4. Statistiske Procedurer
- Arranger behandlinger i et helt randomiseret design (eller andet egnet arrangement til statistisk analyse).
- Udføre to uafhængige forsøg med hver behandling, som består af tre biologiske gentagelser for hvert eksperiment. De to uafhængige forsøg omfatter seks biologiske replikater i alt. Hvis forsøget effekten er ikke-signifikant (α = 0,05), analysere data fra hver uafhængigt forsøg kombinere og. Hvis forsøget effekten er betydelig, derefter analysere hvert eksperiment separat.
Bemærk: Medtag de første tre biologiske gentagelser in forsøg 1 og de næste tre biologiske gentagelser i Eksperiment 2. Hver biologisk gentagelse repræsenterer en distinkt "forælder" klonal linje stammer fra hver population (MCR 1-6, ACR 1-6, og WCS 1-6), således at hver gang- Selvfølgelig analyse benytter genetisk identiske planter. De to uafhængige forsøg omfatter seks biologiske replikater i alt, hvilket giver mulighed for en passende repræsentation af genetisk variation og bestemmelse af en median DT 50 for hver waterhemp befolkning. - Analysere data med ikke-lineær mindste kvadraters regressionsanalyse og passe dem med en simpel første ordens kurve for at estimere DT 50 s. Ligningen nedenfor beskriver modellen:
- hvor i denne model y repræsenterer procentdelen af det oprindelige herbicid tilbage ved tidspunktet t, μ i er DT 50 for hverwaterhemp befolkning i, og parameteren C 0 er det anslåede beløb for forældre herbicid stede ved t = 0 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Blev påvist store forskelle i satserne for mesotrion stofskifte mellem enten WCS eller ACR og MCR (figur 1). På hvert tidspunkt, havde MCR metaboliseret mesotrion hurtigere end de to mesotrion følsomme befolkningsgrupper, WCS og ACR, som korrelerer med tidligere hel-plante fænotypiske responser 11. Ved kloning nok planter fra en enkelt parental plante fra hver population, herbicid metabolisme tidsforløb analyser er ensartede og reproducerbare på grund af mangel på genetisk variabilitet inden for hver tidsforløbet 12. For eksempel er tidsforløbet for mesotrion metabolisme i klonal linie 5 12 vises i figur 1. I alt seks forskellige klonale linjer, afledt af seks individuelle moderplanter, blev analyseret ud fra hver population (tabel 1) for at bestemme en samlet median DT 50 værdi, hvilket indikerede, at mesotrion metabolisme i MCR var betydeligt hurtigere (
Ud over at studere mekanismerne til mesotrion resistens i MCR, en relateret mål var at bestemme mekanismen for resistens over for ALS-hæmmere i MCR. Tidligere forskning vist, at en delpopulation stammer fra MCR var ALS resistent, men ikke havde en mutation i ALS målområdet gen, hvilket indikerer en ikke-target-site mekanisme 13. Dette er i modsætning til ACR, som er ALS resistente på grund et målsted mutation, der giver en mindre følsom ALS enzym 14. For at TESt denne hypotese, blev den udskårne blade assay udført med [URL- 14C] primisulfuronmethyl, en ALS-inhiberende herbicid af sulfonylurinstof familie. Toparealet af 14C-primisulfuronmethyl i et repræsentativt HPLC-kromatogram (retentionstid på ca. 21,6 minutter) var signifikant mindre i MCR end i ACR og WCS ved 12 HAT (figur 2). Derudover blev to polære metabolitter med kortere retentionstider end primisulfuronmethyl påvist i udskårne bladekstrakter fra alle tre populationer (figur 2). Selv om strukturer af disse to polære metabolitter ikke blev bestemt i denne undersøgelse, deres hurtig dannelse er i overensstemmelse med ring hydroxylering af primisulfuronmethyl 8 (fase I-metabolisme) efterfulgt af konjugation glucose 5 (fase II metabolisme).
I kombination med de kvalitative analyser af primisulfuron metabolisme i MCR, ACR, og WCS (figur 2), mængdenaf forældre herbicid tilbage ved hvert tidspunkt blev kvantificeret og anvendes til bestemmelse af DT 50 værdier for primisulfuronmethyl i MCR (13,6 timer), ACR (> 24 timer), og WCS (> 24 timer) (figur 3). Den betydeligt kortere DT 50 værdi i MCR er i overensstemmelse med øget metabolisme som den vigtigste mekanisme til ALS modstand i denne population, i overensstemmelse med tidligere hel-planten forskning 13. Men interessant nok, DT 50 værdier for primisulfuron i ACR og WCS ligner endnu betydeligt længere end i MCR (figur 3), på trods af både MCR og ACR visning ALS-inhibitor-resistente fænotyper (tabel 1). Den relativt lange DT 50 i ACR er muligvis fordi det ikke er nødvendigt hurtigt at metabolisere primisulfuron, da ACR har en mindre følsom ALS enzym som sin vigtigste resistensmekanisme 14. Sammenfattende det udskårne waterhemp blad assay udnyttes i vores forskning gav værdifulde qualitative og kvantitative data og forudsat ny indsigt i stofskifte-baserede resistensmekanismer mod to forskellige herbicider i MCR, ACR, og WCS.
Figur 1:. Tidsforløb af mesotrion metabolisme i udskåret waterhemp blade fra vegetativt klonede populationer Udskårne blade (tredje yngste blad, 2 til 3 cm i længde) fra waterhemp kimplanter (10 til 12 cm) blev vegetativt klonet, så hver gang-kursus undersøgelse for hver linje bestod af genetisk identiske planter. Udskårne blade blev placeret i 0,1 M Tris-HCI-buffer (pH 6) i 1 time, efterfulgt af 0,1 M Tris-HCI (pH 6) plus 150 uM radioaktivt mærket mesotrion i 1 time ("Pulse"), derefter kvart styrke Murashige og Skoog (MS) salte løsning ("chase ') til 0 timer, 5 timer, 11 timer, 23 timer, og 35 timer for at tillade stofskiftet at forekomme. Data blev analyseret ved ikke-lineær mindste kvadraters regressionsanalyse og passer med en simpel første ordens kurve at estimere et DT 50 separat for hver klonet waterhemp population 12 .Den MCR klonal linje metaboliseres hurtigt mesotrion, mens ACR og WCS klonale linjer metaboliseres mesotrion langsommere. De viste data er tidsforløb fra kun klonal linie 5 for hvert waterhemp befolkning, der er blevet modificeret fra vores tidligere papir 12 (Copyright af American Society of Plant Biologer).
Figur 2:. Primisulfuronmethyl metabolisme i MCR, ACR og WCS (12 HAT) repræsentant omvendt fase HPLC-kromatogrammer for udskårne waterhemp bladekstrakter (12 HAT), som leveres med 150 uM radiomærket primisulfuronmethyl (som beskrevet i protokollen) fra McLean County (MCR, A), Adams County (ACR, B), ennd Wayne County herbicid-følsom (WCS, C) populationer (tabel 1). Radioaktivt top med en retentionstid på 21,6 min indeholder primisulfuronmethyl, som bestemt ved sammenligning med en autentisk analytisk standard. Toppe med kortere retentionstider er sandsynlige polære, mindre fytotoksiske metabolitter af primisulfuronmethyl, såsom hydroxy-primisulfuronmethyl 8 eller glycosylerede former af hydroxylerede metabolitter 5,6. MCR population viste et signifikant fald i mængden af forældre primisulfuronmethyl forhold til ACR og WCS, der er kvantificeret som en nedre DT 50 for MCR (figur 3).
Figur 3:. Tidsforløb for primisulfuronmethyl metabolisme i udskårne waterhemp blade Udskårne waterhemp blade (third-yngste blade; 2 til 3 cm) blev behandlet som beskrevet i figur 1, og vores tidligere forskning med mesotrion 12, bortset fra at 150 pM radioaktivt mærket primisulfuron blev inkluderet som 'puls' og blade blev inkuberet i MS salte løsning ("chase ') til 0 timer , 3 timer og 11 timer. Data blev analyseret ved ikke-lineær mindste kvadraters regressionsanalyse som beskrevet tidligere for mesotrion metabolisme (figur 1) 12. MCR population metaboliseres hurtigt primisulfuronmethyl (DT 50 = 13,6 timer), mens ACR og WCS metaboliseres primisulfuronmethyl langsommere (DT 50> 24 timer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den heri beskrevne udskåret-blad metode er blevet anvendt tidligere i forskning primisulfuron metabolisme i majs blade 15, men vores resultater viser, at denne protokol er også effektiv, nøjagtig og reproducerbar til måling herbicid metabolisme i en tokimbladede ukrudtsarter 12. En stor fordel ved den udskårne blade teknik i forhold til hel-plante undersøgelser er, at en udskåret blad er uafhængig af hel-plante translokation mønstre af postemergent, systemiske herbicider eller forskelle i herbicid-optagelse blandt planter eller populationer. Desuden er variabiliteten miljømæssige reduceret, da de udskårne blad assays udføres i et vækstkammer med et enkelt blad anbragt i et rør, sammenlignet med at studere hele planter dyrket under drivhusbetingelser. En vegetativ kloningsstrategi var også inkluderet i vores fremgangsmåde til at studere mesotrion-resistensmekanismer i MCR 12 for at minimere den høje grad af genetisk variation inden for og væreTween Amaranthus befolkninger 9. Genetiske mangfoldighed inden for skvattet Amaranthus populationer illustreres af mængden af variabilitet dokumenteret i hel-plante svar til flere familier af postemergente herbicider 18. Når der udføres tid-retters undersøgelser for at fastslå nøjagtige DT 50 s, og til påvisning af signifikante forskelle, når man sammenligner DT 50 værdier mellem waterhemp befolkninger 12, disse trin (som beskrevet i vores udskårne blade og vegetativt kloning protokol) er kritiske for at fjerne eller reducere genetiske og miljømæssige variabilitet.
Der findes forskellige mekanismer i planter til at bibringe herbicidresistens 1,2. For eksempel kan waterhemp resistens over for ALS-hæmmende herbicider være target-site baseret 14 eller ikke-target-site baseret 13. Stofskifte af primisulfuronmethyl (figur 3) viser klart disse forskelle mellem to ALS-resistent waterhemp befolkninger, MCR og ACR (tabel 1). I kombination med PCR-amplifikation og sekvensanalyse af herbicid target-site-gener, vil det udskårne blad analysen i høj grad medvirke til at identificere, om herbicidresistens i waterhemp eller andre tokimbladede ukrudtsplanter er tillagt ved target websted eller ikke-target-site mekanismer 2.
Begrænsninger af vores udskårne blad metode omfatter den manglende evne til at visualisere eller måle herbicid translokation mønstre i hele planten, eller afgøre, om cellulære eller sub-cellulære binding mekanismer findes, der giver ikke-mål-site baseret resistens i ukrudt 2. Som tidligere nævnt er dette aspekt også betragtes som en fordel, når det bestemmes præcise herbicid metabolisme satser i Mesotrion-resistent ukrudtspopulation 12, men omvendt kan betragtes som en ulempe, når man undersøger systemiske herbicider, der ikke metaboliseres væsentligt i planter (dvs. ikke-selektive urticides), såsom glyphosat 2, eller kontakt herbicider, som er ikke-selektive i naturlige ukrudtspopulation, såsom paraquat eller glufosinat 19. Men hvis mål-site mekanismer ikke afsløres oprindeligt derefter forbedrede satser for herbicid metabolisme er typisk undersøgt næste 1,4, især når man studerer ukrudt resistens over for HPPD-inhiberende herbicider, såsom mesotrion 12, ALS-inhiberende herbicider, såsom primisulfuronmethyl 13 , fotosystem II-inhiberende herbicider, såsom atrazin 1,12 eller acetyl-CoA-inhiberende herbicider 4.
P450 har været forbundet med ALS resistens i en population Echinochloa 20, en skvattet græsarter, samt med mesotrion og ALS resistens i MCR 12,13. En tvebo, tokimbladet ukrudt relateret til waterhemp, Palmer amarant (A. palmeri), er også tilbøjelige til at udvikle herbicidresistens via flere forskellige mekanismer 1-3. Efterhånden som flere herbicidresistente ukrudtspopulation og arter er dokumenteret i hele verden 3, vil behovet for en hurtig behandling af herbicid metabolisme som en potentiel mekanisme resistens fortsætte med at stige. Det udskårne blade tilgang, som er forskellig, men relateret til hel-plante undersøgelser typisk anvendes til at undersøge herbicid resistensmekanismer, er en præcis og værdifuldt redskab til at vurdere og kvantificere herbicid metabolisme i planter. Som et resultat, at evnen udføre disse analyser med nøjagtige, reproducerbare metoder, herunder det udskårne blad analysen vil i høj grad hjælpe forskerne til at bestemme ikke-mål-site resistensmekanismer i både græs 4 og tokimbladet 12 ukrudt.
Fremtidige anvendelser af denne fremgangsmåde kan også indbefatte bestemmelse satser herbicid metabolisme i tokimbladede afgrøder såsom sojabønne og bomuld. Igangværende forskning i vores laboratorium med herbicidtolerante sojabønner sorter har også udnyttet den udskårne leaf tilgang. Men da sojabønner er en bælgplante afgrøde med trebladede blade, en 'skåret stilk' teknik er blevet tilpasset og udviklet, så hver trifoliolate blad kan absorbere radioaktivt mærket herbicid via optagelse gennem de vigtigste stilk (Skelton, Lygin og Riechers, upubliceret data).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 ml tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 ml tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
- Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
- Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
- Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
- Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
- Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
- Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
- Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
- Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
- Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
- Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
- Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
- Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
- Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).
- Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
- Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
- Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).
