Introduction
Herbizidresistenz in Unkraut stellt eine ernsthafte Bedrohung für die globale Produktion von Nahrungsmitteln und Faser 1,2. Derzeit Tausende von resistenten Populationen und Biotypen von über hundert Unkrautarten weltweit sind dokumentiert und untersucht 3. Ein Hauptmechanismus, Herbizid-Resistenz verleiht, in Pflanzen ist die Veränderung der Ziel Herbizid-site-Gene und Proteine, einschließlich genetischer Mutationen, herbizid Proteinbindungskinetiken oder Amplifikation der Ziel-Ort-Gen 2 beeinflussen. Metabolische Entgiftung über erhöhte Aktivitäten der Cytochrom P450 Monooxygenase (P450) oder Glutathion-S-Transferase (GST) Enzyme ist ein weiterer Mechanismus, der Herbizid-Resistenz in Unkräutern, die verschiedene in mehrfacher Hinsicht vom Ziel-Ort basierten Mechanismen 2 verleiht. Metabolic-basierten Widerstand hat erhebliche Auswirkungen auf, ob Pflanzen Fitness-Kosten (auch bekannt als Fitness-Strafen) können aus den Herbizidresistenz mechanis führenm, sowie in Bezug auf das Potential für einen einzigen Entgiftungsmechanismus zum Verleihen kreuz- oder mehreren Herbizid-Resistenz in Unkrautpopulationen 1,2,4. Allgemeiner kann Herbizid-Metabolismus in Pflanzen in drei Phasen 5 geteilt werden. Phase I beinhaltet Herbizidumwandlung oder Aktivierung wie P450 Hydroxylierung von aromatischen Ringen oder Alkylgruppen, oder N - oder O- Dealkylierungsreaktionen, was zu erhöhter Polarität und partiellen Entgiftung Herbizid 5,6. Neu eingeführten funktionellen Gruppen in Phase I können Verknüpfungsstellen für die Konjugation an reduziertem Glutathion von GSTs bereitzustellen oder durch UDP-abhängige Glycosyltransferasen in Phase II 5,7 Glucose. Beispielsweise ist die große Anfangs Metabolit Primisulfuron-methyl in Mais hydroxy-Primisulfuron-Methyl 8, die weiter metabolisiert werden können, zu Hydroxy-Primisulfuron-glucosid (Phase II) und dann in der Vakuole zur langfristigen Lagerung oder weitere metabolische transportiert Profibeitung 5,6 (Phase III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) ist ein schwer zu Kontrolle, dicot Jahresunkrautarten, die die Produktion von Mais (Zea mays), Sojabohne (Glycine max) und Baumwolle (Gossypium hirsutum) in den Vereinigten Staaten behindert. Der hohe Grad der genetischen Vielfalt der waterhemp sich durch seine zweihäusig Biologie und Fernwindbestäubung ermöglicht, und eine einzelne weibliche waterhemp Pflanze kann bis zu eine Million Samen 9 zu erzeugen. Diese Samen sind klein und leicht verbreiten, was natürlich zu verleihen waterhemp mit einer effektiven Streuvorrichtung. Waterhemp zeigt kontinuierliche Keimung in der gesamten Vegetationsperiode 9, und ihre Samen sind in der Lage, nach mehreren Jahren der Ruhe keimen. Waterhemp ein C 4 Pflanze, die eine höhere Wachstumsrate als die meisten breitblättrigen Unkräutern in Ackeranbausystemen 10 besitzt. Darüber hinaus sind zahlreiche waterhemp Populationen gegen mehrere families von Herbiziden 3.
Eine Population von waterhemp (bezeichnet MCR) aus Illinois ist beständig gegen 4-Hydroxy-Dioxygenase (HPPD) inhibierende Herbizide 11, wie Mesotrion, sowie Atrazin und Acetolactatsynthase (ALS) inhibierende Herbizide, einschließlich Primisulfuron-methyl wegen Nichtziel-Website basierten Mechanismen 12,13. Eine andere Population von waterhemp bezeichnet ACR 14, die Primisulfuron-methyl-resistente (aufgrund einer Mutation in dem ALS-Gen) und Atrazin-resistente aber empfindlich gegen Mesotrion und einem waterhemp Population bezeichnet WCS 14, die Primisulfuron-methyl empfindlich ist, Mesotrion und Atrazin wurden im Vergleich zu MCR in unserer früheren Forschung 12 und aktuelle Experimente verwendet (in Tabelle 1 zusammengefasst). Erste Studien keine Veränderungen in den HPPD-Gen-Sequenz oder Expressionsniveaus oder verringert Mesotrion Aufnahme zu erfassen, in der MCR-Bevölkerung im Vergleich mit Mesotrion-empfindliche Bevölkerungsgruppen 12. Allerdings Metabolismus-Untersuchungen mit ganzen Pflanzen zeigten eine signifikant niedrigere Mutter Mesotrion Herbizid in MCR Vergleich ACR und WCS, die mit früheren phänotypische Reaktionen korreliert, um Mesotrion 11,12.
| Waterhemp Bevölkerung | Abkürzung | Phänotyp zu Mesotrion | Mesotrion Resistenzmechanismus | Phänotyp Primisulfuron | Primisulfuron Resistenzmechanismus |
| McLean Grafschaft-Resistant | MCR | Widerstandsfähig | Metabolism * | Widerstandsfähig | Stoffwechsel |
| Adams County-Resistant | ACR | Sensitive | - | Widerstandsfähig | Ziel-Ort Mutation in ALS 14 |
| Wayne County-Sensitive | WCS | Sensitive | - | Sensitive | - |
* Non-Target-Ort-Resistenzmechanismen, andere als verbessert den Stoffwechsel, können ebenfalls zu verleihen Mesotrion Widerstand in der Bevölkerung MCR 12.
Tabelle 1: Beschreibung der waterhemp Populationen aus Illinois in dieser Studie verwendet.
Neben der Bestimmung Raten von Herbizidmetabolismus in intakten waterhemp Sämlinge, wurde ein anderer experimenteller Ansatz entwickelt und in unserer früheren Forschung eingesetzt, um den Stoffwechsel, indem ein herausgeschnitten waterhemp Blatt Assay 12 sowie verschiedene P450-Inhibitoren (zB tetcyclacis und Malathion) zu untersuchen. Dieses Verfahren wurde speziell für waterhemp aus einem Previ angepaßtous Untersuchung Primisulfuron-methyl-Stoffwechsel in geschnitten Maisblätter 15, da die herausgeschnittenen Blatt Test noch nicht für die Durchführung von Herbizidstoffwechselforschung in einer dikotylen Pflanze berichtet. Die organophophosate Insektizid Malathion wurde häufig für in vivo und in vitro herbizidStoffWechselForschung, um P450 Beteiligung 16 anzugeben. Zum Beispiel, Toleranz und schnellen Metabolismus von Mesotrion bei Mais sind auf P450-katalysierte Ring Hydroxylierung, die überprüft wurde, als Malathion erhöhten Mais Empfindlichkeit auf Mesotrion 17. In ähnlicher Weise gehemmt Malathion Stoffwechsel der ALS-Hemmer Primisulfuron-methyl in geschnitten Maisblätter 15. Ein Hauptvorteil der entnommenen Blatt Technik ist, dass Daten erzeugt werden, unabhängig von Ganzpflanzen Translokation Muster, ein wichtiger Faktor in die Abwägung Metabolismus von systemischen Nachauflaufherbizide in Pflanzen. Folglich ermöglicht dieses Verfahren die quantitative undqualitative metabolischen Analysen auf einer einzigen behandelte Blatt 12 zu fokussieren.
Eine vegetative Klonierungsstrategie, in Verbindung mit dem ausgeschnittenen Blatt Protokoll wurde vorher in waterhemp verwendet, um Stoffwechselstudien 12 durchzuführen. Aufgrund der Natur der Auskreuzung waterhemp (getrennte männliche und weibliche Pflanzen) und hohes Maß an genetischer Vielfalt innerhalb zweihäusig Amaranthus Arten 9, dieses Protokoll gewährleistet, dass genetisch identische waterhemp Sämlinge wurden in den Zeitverlaufsexperimenten untersucht. Dieser Artikel beschreibt den Nutzen der herausgeschnittenen Blatt Verfahren zur Messung der Raten der Herbizidmetabolismus in einer dikotylen Unkraut (waterhemp). Die Menge der Mutter Herbizid verblieben war, zu jedem Zeitpunkt (1) durch nichtlineare Kleinste-Quadrate-Regressionsanalyse Sitz mit einer einfachen ersten Ordnung Kurve, um die Zeit für die 50% der absorbierten Herbizids zu erniedrigen Schätzung (bestimmt und wurde DT 50). RepräsentativChromatogramme von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) für ALS-resistente und -sensitive waterhemp Populationen, die das Verschwinden der Mutter Herbizid und gleichzeitiger Bildung von polaren Metaboliten (s) während einer Zeitverlaufsstudie anzuzeigen (Abbildung angezeigten 2). Der Schwerpunkt unseres Artikels ist zu beschreiben und zeigen die Nützlichkeit des herausgeschnittenen Blatt Assay in Kombination mit einem vegetativen Klonen Methode zur Bestimmung präzise und reproduzierbare Raten von Herbizidmetabolismus in dicot Pflanzen, mit gleichmäßig Ring-markierten (URL- 14 C) Herbizide in drei waterhemp Populationen, die in ihrer Ganzpflanzenantworten zu unterscheiden HPPD- und ALS-inhibierenden Herbiziden (Tabelle 1).
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Protocol
1. Pflanzenmaterial, Wachstumsbedingungen und Vegetative Cloning
Hinweis: Drei waterhemp Populationen wurden in dieser Forschung untersucht: MCR (von McLean County, IL), ACR (von Adams County, IL) und WCS (von Wayne County, IL) (Tabelle 1).
- Sammeln und waterhemp Samen in 0,1 g L -1 Agar auszusetzen: Wasser-Lösung bei 4 ° C für mindestens 30 Tage, um die Keimung zu verbessern. Hinweis: Einige waterhemp Populationen sind ruhend, aber dieser Schritt hilft, Keimruhe zu überwinden und Samen keimen gleichmäßiger.
- Samen keimen jedes waterhemp Population (wie in Tabelle 1) in 12 x 12 cm Schalen, enthaltend ein Einbettungsmedium im Gewächshaus.
- Pflegen Gewächshausbedingungen bei 28/22 ° C Tag / Nacht-Temperaturen in einem 16/8 h Photoperiode 12.
- Ergänzung natürliches Licht im Gewächshaus mit Licht von Quecksilberdampflampen, ein Minimum von 500 & mgr; mol m -2 liefern sec -1 Photonenfluss im Pflanzenbestand Ebene.
- Transplantation hervor Sämlinge, wenn sie 2 cm hoch in 80 cm 3 Töpfe im Gewächshaus.
- Sämlinge in 950 cm 3 Töpfe mit einem 3: 1: 1: 1-Mischung aus Blumenerde mischen: Boden: Torf: Sand, wenn Sämlinge sind 4 cm hoch. In 5 g Langzeitdünger Granulat zu jedem Topf und mit diesem Bodenmischung mischen.
- Schneiden Sie und entfernen Sie die Sprossapikalmeristem mit den drei jüngsten Blätter von 7 cm hohen Pflanzen zu Apikaldominanz beseitigen.
Hinweis: Dieser Schritt stellt sicher, dass jede Anlage wird genug 3 cm Achselsprossen zu klonen wachsen. - Verbrauch fünf Achseltriebe (3 cm Länge), wenn Sämlinge sind ca. 14 cm groß aus jeder waterhemp Bevölkerung (wie in Tabelle 1). Entfernen der Mehrzahl der Blätter auf diesen axilläre Knospen um den Wasserverlust bei der weiteren Handhabung zu verringern, behalten aber die zwei jüngsten Blätter zu weiterem Wachstum bei Transplantation ermöglichen.
- Transplant Achsel schießt in 80 cm 3 Töpfen (eine Keimling pro Topf) in Blumenerde Medium, das das gleiche Medium zum Keimen verwendet wird. Potting-Medium sollte zunächst gesättigt, bis Wurzeln Form in der Wachstumskammer, dann konstant zu halten Feuchtigkeit und Ort Töpfen in der Wachstumskammer für 7 Tage, um Wurzeln zu etablieren.
Hinweis: Pflanzen sind an diesem Punkt sehr empfindlich und sollte nicht betont werden.- Pflegen Wachstumskammer Bedingungen bei 28/22 ° C Tag / Nacht-Temperaturen in einem 16/8 h Photoperiode 12.
- Eine Kombination von Glühlampen und Leuchtstoffröhren können verwendet werden, um Licht in die Wachstumskammer zur Verfügung zu stellen und sollte mindestens 550 & mgr; mol m -2 s -1 Photonenfluss bei Pflanzendach Level 12 zu liefern.
- Transplantation wieder in 950 cm 3 Töpfen (eine Keimling pro Topf) containing einen 3: 1: 1: 1-Mischung aus Blumenerde mischen: Boden: Torf: Sand (auch 5 g Langzeitdünger Granulat) bei geklonten Pflanzen sind 4 cm groß, dann zurück in das Gewächshaus übergeben.
- Klonen Sie die Pflanzen ein zweites Mal mit dem gleichen oben beschriebenen Verfahren (dh wiederholen Sie die Schritte 1,5 bis 1,8, und dann gehen Sie zu Schritt 2.1). Für einen typischen zeitlichen Verlauf Studie zu generieren Klone aus mindestens sechs unabhängige Pflanzen aus jeder waterhemp Bevölkerung und speichert sie als Linien MCR 1-6, 1-6 und ACR WCS 1-6.
- Stellen Sie mindestens sechs verschiedene "Eltern" klonalen Linien, um das Experiment zu wiederholen und angemessen vertreten genetische Variabilität innerhalb der einzelnen waterhemp Bevölkerung.
- Je nachdem, wie viele Zeitpunkten analysiert werden, erzeugen genügend Unter Klone aus jeder "Eltern" klonalen Linie, um eine Zeitverlaufsstudie durchzuführen.
2. Die Durchführung einer Stoffwechselstudie mit herausgeschnitten Waterhemp Leaves
- Verbrauchsteuern Das Dritt jüngsten Blätter (2 bis 3 cm in der Länge, sind 0,5 cm befestigt Blattstiel), wenn geklont waterhemp Pflanzen sind 10 bis 12 cm hoch Herbizid-Stoffwechsel und DT 50 Analyse.
- Cut Blattstielen von jedem waterhemp Werk ein zweites Mal (um sicherzustellen, dass 0,3 cm des Blattstiels bleibt) unter Wasser, und legen Sie diese Schnittenden in 1,5 ml-Kunststoffröhrchen (ein Blatt pro Fläschchen) 15.
Hinweis: Schneiden ein zweites Mal unter Wasser verhindert Bildung von Luftblasen und Verstopfen Xylemgefäße.- Zum einen teilweise ausgeschnittenen Blättern mit geschnittenen Blattstiel in Vorinkubation Puffer (200 ul) von 0,1 M Tris-HCl (pH 6) eintauchen für 1 Stunde.
- Zweitens bewegt jedes Blatt in ein neues 1,5-ml-Ampulle, enthaltend eine Inkubations-Puffer (200 ul) von 0,1 M Tris-HCl (pH 6) plus 150 & mgr; M [URL- 14 C] Herbizid, und Inkubieren bei 28 ° C für 1 Stunde, um ermöglichen eine Herbizidabsorption in die Blätter.
Hinweis: Die beiden 14 C-Mesotrion und
Anmerkung: Die Wirkung von metabolischen Inhibitoren auf Herbizid-Metabolismus durch Modifizieren Schritten 2.2.1 und 2.2.2 ermittelt werden. Je 100 & mgr; M des Inhibitors in die Pre-Inkubationspuffer und lassen Inkubation für 2 Stunden, dann auf Inkubationspuffer Transfer mit Herbizid und erneut hinzufügen 100 & mgr; M Inhibitor. Zum Beispiel, Malathion und tetcyclacis hemmen bestimmten Cytochrom-P450-Aktivitäten in Pflanzen 15-17. - Waschen Sie den eingetauchten Teil des ausgeschnittenen Blättern mit VE-Wasser und übertragen geschnitten Blätter zu einem Viertel festen Murashige und Skoog (MS) Salzlösung (500 ul) für 0 h, 5 h, 11 h, 23 h oder 35 h zugeführt, in der Wachstumskammer für den Zeitverlauf Stoffwechsel Studie.
- Ernte durch Entfernen Urlaubs aus Inkubationslösung bei der geeigneten Zeitpunkt manuell schleifen jedes Blattgewebe in flüssigem Stickstoff mit einem Polypropylen-Röhrchen (15 ml) und Glaspistill.
- Extrahieren radiomarkierten Herbizid und seiner Metaboliten, die jedes Blatt mit 7 ml 90% Aceton mit einem Labor Gewebehomogenisator in der gleichen Polypropylen-Röhrchen wie oben. Spülen Gewebehomogenisator mit zusätzlichen 7 ml 90% igem Aceton und weiter zu homogenisieren, bis die Gewebe wird gründlich pulverisiert (üblicherweise etwa 2 min). Anmerkung: 90% Aceton zur Extraktion der meisten Herbizide aus Pflanzengeweben verwendet werden. Wenn jedoch diese Methode nicht mehr als 90% der aufgenommenen radiomarkierten Verbindungen zu extrahieren, dann 90% Methanol oder 90% Acetonitril als Extraktionslösungsmittel ersetzt werden.
- Label 90% Acetonextrakte (14 ml insgesamt) und lagern bei 4 ° C für 16 Stunden, damit für zusätzliche Extraktion auftreten.
Anmerkung: Nach dieser Extraktion der behandelten Blätter, die Menge an extrahierbarem radioactivity beträgt typischerweise mindestens 98% des durch das behandelte Blatt aufgenommen radiomarkierten Verbindungen. Nichtextrahierbare Radioaktivität (gebundene Reste) in Blätter ausgeschnitten gemittelt 0,3% über alle Zeitpunkte in unserer früheren Studie 12, aber diese Menge kann entsprechend dem verwendeten Herbizids Zeitpunkt geprüft variieren. - Zentrifuge Proben bei 5000 g für 10 min und Konzentratüberstände auf 40 ° C mit einem Rotationsverdampfer bis zu einem Endvolumen von 0,5 ml erhalten wird. Übertragen Sie diese Lautstärke auf ein 2,0 ml Kunststoffröhrchen.
- Hinzufügen Acetonitril: Wasser (1: 1, auf das Volumen) verstellen das Endvolumen der Pflanzenextrakte und 1,25 ml und Wiederzentrifuge bei 10.000 × g für 10 Minuten, um alle Partikel zu entfernen.
- Messen Gesamtradioaktivität in einem Aliquot von jeder Probe (dpm ul -1) durch Flüssigszintillationsspektroskopie (LSS) 12 aufgenommen und zu normalisieren Mengen an [14 C-markiertem] Verbindungen, HPLC injiziert (zum Beispiel 10,000 Gesamt dpm / sample / run) so y-Achse wird zwischen den Proben einheitlich sein, wenn die grafische Ergebnisse.
3. HPLC-Analyse der Herbizid Metabolism in Abgeschnittene Blätter
Hinweis: Resolve insgesamt extrahierbare Radioaktivität in die Mutter Herbizid und Herbizid-Metaboliten unter Verwendung der folgenden RP-HPLC-Bedingungen 12.
- Zuführen RP-HPLC mit einer C18-Säule (4,6 x 250 mm, 5 um Teilchengrße für analytische HPLC) mit einer Flussrate von 1 ml min -1 für die meisten nicht-polaren Herbizide.
Anmerkung: C 4 oder C 12 RP-HPLC-Säulen kann auch verwendet werden, um die Trennung der Mutter Herbizid aus seiner Metaboliten zu optimieren. Eine Vorsäule Filter und / oder Schutzsäule können ebenfalls zum Schutz und zur Verlängerung der Lebensdauer der RP-Säule werden.- Verwenden Sie den folgenden mobilen Phase für die RP-HPLC: Eluent A, 0,1% Ameisensäure (v / v) in Wasser und Eluent B 100% HPLC-Qualität Acetonitril.
Hinweis: HPLC-grade Methanol kann auch als El verwendet werdenießend B für die Lösung mehrere polare Verbindungen und Metaboliten, aber beachten Sie, dass die Retentionszeiten können auch geändert werden.
Hinweis: Das Elutionsprofil verwendet, um Mesotrion oder Primisulfuron-methyl ihrer polaren Metaboliten in unserer Forschung 12 zu lösen ist: Schritt 1, A: B (4: 1, v / v) bis A: B (3: 2, v / v ) in einem linearen Gradienten (12 min); Schritt 2, A: B (3: 2, v / v) bis A: B (3: 7, v / v) in einem linearen Gradienten (5 min); Schritt 3 A: B (3: 7, v / v) bis A: B (1: 9, v / v) in einem linearen Gradienten für 2 Minuten (insgesamt 19 Minuten).
Hinweis: Farbverläufe und isokratische Schritte müssen möglicherweise auf der Grundlage der physikalischen Eigenschaften des Grundmaterials, um die Auflösung zu optimieren eingestellt werden. - Den oben genannten linearen Gradienten Stufen A: B (1: 9, v / v) bis A: B (4: 1, v / v) in einem linearen Gradienten (3 min) und A: B (4: 1, v / v) isokratisch Schritt (mindestens 2 Minuten) neu äquilibrieren die RP-Säule vor dem Einspritzen des nächsten 12-Extrakt.
- Verwenden Sie den folgenden mobilen Phase für die RP-HPLC: Eluent A, 0,1% Ameisensäure (v / v) in Wasser und Eluent B 100% HPLC-Qualität Acetonitril.
- Erkennen und visualisieren radiomarkierten Verbindungen mit einer Durchfluss Scintillation Analyzer. Aufzeichnung der Menge an in jeder Probe als Prozentsatz der Gesamtradioaktivität in jeder Probe verbleibenden Mutter Herbizid (ermittelt und vom Durchfluss-Szintillations-Analysator gemäß den Anweisungen des Herstellers quantifiziert), Rate des Herbizids Stoffwechsel in jedem waterhemp Population während des Zeitverlaufs zu bestimmen.
4. Statistische Verfahren
- Vereinbaren Behandlungen in einer vollständig randomisierten Design (oder andere geeignete Anordnung für die statistische Analyse).
- Führen zwei unabhängigen Experimenten mit jeder Behandlung drei biologischen Wiederholungen für jedes Experiment enthalten. Die zwei unabhängigen Experimenten sind sechs biologischen Replikaten in insgesamt. Wenn das Experiment Effekt ist nicht signifikant (α = 0,05), zu kombinieren und zu analysieren, Daten von jedem unabhängigen Experiment. Wenn das Experiment Effekt wesentlich ist, dann analysieren jedes Experiment gesondert.
Hinweis: Fügen Sie die ersten drei biologischen Replikaten in Experiment 1 und die nächsten drei biologischen Replikaten in Experiment 2. Die biologische Replikation stellt eine andere "Eltern" klonalen Linie von jeder Population abgeleitet (MCR 1-6, 1-6 ACR und WCS 1-6), so daß jeder Zeit Natürlich Analyse nutzt genetisch identische Pflanzen. Die zwei unabhängigen Experimenten sind sechs biologischen Replikaten in insgesamt, die für eine angemessene Darstellung der genetischen Variabilität und Ermittlung eines Median DT 50 für jeden waterhemp Bevölkerung ermöglicht. - Analysieren Sie die Daten mit nicht-linearen Regressionsanalyse der kleinsten Quadrate und passen sie mit einer einfachen erster Ordnung Kurve, um abzuschätzen, DT 50 s. Die folgende Gleichung beschreibt das Modell:
- wobei in diesem Modell y den Prozentsatz des zum Zeitpunkt t verbleibenden Mutter Herbizid, μ i der DT 50 für jedenwaterhemp Bevölkerung i, und der Parameter C 0 ist der geschätzte Betrag der Mutter Herbizid vorhanden bei t = 0 12.
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Representative Results
Entweder zwischen WCS oder ACR und MCR (Abbildung 1) wurden große Unterschiede in Raten von Mesotrion Stoffwechsel erkannt. Zu jedem Zeitpunkt, hatte MCR Mesotrion schneller als die beiden Mesotrion-empfindliche Bevölkerungsgruppen, WCS und ACR, die mit früheren Ganzpflanzen phänotypische Reaktionen 11 korreliert metabolisiert. Durch Klonen genug Pflanzen aus einer Elternpflanze aus jeder Population, sind herbizid Stoffwechsel Zeitverlauf Analysen gleichmäßige und reproduzierbare aufgrund des Fehlens der genetischen Variabilität innerhalb der einzelnen Zeitverlauf 12. Beispielsweise wird der Zeitverlauf für Mesotrion Metabolismus in Klonlinie 5 12 in Figur 1 angezeigt. Insgesamt sechs verschiedenen klonalen Linien von sechs einzelnen Elternpflanzen stammen, wurden aus jeder Population (Tabelle 1) analysiert, um eine Gesamtmedian DT zu bestimmen 50-Wert, der diese Mesotrion Stoffwechsel im MCR angegeben war deutlich schneller (
Neben der Erforschung der Mechanismen für Mesotrion Widerstand in MCR, war eine damit verbundene Ziel, den Mechanismus für die Resistenz gegen ALS-Inhibitoren in MCR zu bestimmen. Vor Forschung gezeigt, dass eine Subpopulation von MCR abgeleitet war ALS beständig, aber nicht eine Mutation in der ALS-Ziel-Site-Gen besitzen, was auf eine Nicht-Ziel-Ort-basierten Mechanismus 13. Dies steht im Gegensatz zu ACR, die ALS resistent ist auf eine Zielstelle Mutation, die eine weniger empfindliche Enzym ALS 14 verleiht. Um test dieser Hypothese wurde die herausgeschnittenen Blattassay mit [URL-14C] Primisulfuron-methyl, einer ALS-inhibierenden Herbizid der Sulfonylharnstoff-Familie durchgeführt. Die Peakfläche von 14 C-Primisulfuron-methyl in einer repräsentativen HPLC Chromatogramm (Retentionszeit etwa 21,6 min) wurde in MCR wesentlich geringer als im ACR und WCS auf 12 HAT (Abbildung 2). Zusätzlich wurden zwei polaren Metaboliten mit kürzeren Retentionszeiten als Primisulfuron-methyl in geschnittenen Blattextrakten von allen drei Populationen (Abbildung 2) detektiert. Obwohl die Strukturen dieser beiden polaren Metaboliten wurden in dieser Studie nicht bestimmt ist, ist ihre rasche Bildung konsistent mit Ringhydroxylierung von Primisulfuron-methyl 8 (Phase I-Metabolismus), gefolgt von Glucose Konjugation 5 (Phase II Metabolismus).
In Kombination mit den qualitativen Analysen der Primisulfuron Stoffwechsel im MCR, ACR und WCS (Abbildung 2), die Mengeder Mutter zu jedem Zeitpunkt verbleibenden Herbizid wurde quantifiziert und verwendet, um die DT 50 -Werte für Primisulfuron-methyl in MCR (13,6 h), ACR (> 24 h) bestimmen und WCS (> 24 h) (Abbildung 3). Die deutlich kürzeren DT 50-Wert im MCR ist konsistent mit erhöhten Stoffwechsel als Hauptmechanismus für ALS-Widerstand in dieser Population, in Übereinstimmung mit früheren Ganzpflanzenforschung 13. Interessant ist, dass jedoch die DT 50 -Werte für Primisulfuron in ACR und WCS ähneln noch deutlich länger als in MCR (Abbildung 3), obwohl beide MCR und ACR Anzeigen ALS-Inhibitor resistenten Phänotypen (Tabelle 1). Die relativ lange DT 50 in ACR ist möglicherweise, weil es nicht notwendig ist, schnell metabolisiert Primisulfuron, da ACR hat eine unempfindlichere ALS-Enzym als Hauptwiderstandsmechanismus 14. Zusammenfassend ist die in unserer Forschung verwendet exzidiert waterhemp Blattassay ergab wertvolle qualitative und quantitative Daten und lieferte neue Einblicke in den Stoffwechsel-basierte Resistenzmechanismen gegenüber zwei verschiedenen Herbiziden in MCR, ACR und WCS.
Abb. 1: Zeitverlauf der Mesotrion Stoffwechsel im geschnitten waterhemp Blätter von vegetativ geklont Populationen Abgeschnittene Blätter (Dritt jüngste Blatt; 2 bis 3 cm Länge) von waterhemp Setzlinge (10 bis 12 cm) wurden vegetativ kloniert, so dass jede Zeitverlauf Studie für jede Leitung bestand aus genetisch identische Pflanzen. Exzidiert Blätter wurden in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 6) für 1 h von 0,1 M Tris-HCl (pH 6) plus 150 uM radiomarkierten Mesotrion für 1 h gegeben, gefolgt ("pulse"), dann wird viertelstarken Murashige Skoog (MS) Salzlösung ('Chase') für 0 h, 5 h, 11 h, 23 h und 35 h, damit Stoffwechsel auftreten. Data wurden durch nicht-lineare Regression der kleinsten Quadrate analysiert und fit mit einem einfachen erster Ordnung Kurve, um einen DT 50 separat für jeden geklonten waterhemp Bevölkerung 12 .Die MCR klonalen Linie schnell metabolisiert Mesotrion zu schätzen, während die ACR und WCS Klonlinien metabolisiert Mesotrion langsamer. Die angegebenen Daten sind Zeitverläufe von nur klonalen Linie 5 für jeden waterhemp Bevölkerung, die von unseren bisherigen Papier 12 (Copyright by American Society of Pflanzenbiologen) modifiziert wurde.
Abbildung 2:. Primisulfuron-methyl-Stoffwechsel im MCR, ACR und WCS (12 HAT) Repräsentative Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramme für geschnitten waterhemp Blattextrakten (12 HAT) mit 150 & mgr; M radioaktiv markierten Primisulfuron-methyl (wie im Protokoll beschrieben) zugeführt von McLean County (MCR, A), Adams County (ACR, B), einnd Wayne County herbizidempfindlichen (WCS, C) Bevölkerung (Tabelle 1). Radioaktiven Peak mit einer Retentionszeit von 21,6 min enthält Primisulfuron-methyl, wie durch Vergleich mit einer authentischen analytischen Standard bestimmt. Peaks mit kürzeren Retentionszeiten wahrscheinlich polar, weniger phytotoxisch Metaboliten von Primisulfuron-methyl, wie Hydroxy-Primisulfuron-methyl 8 oder glykosylierten Formen von hydroxylierten Metaboliten 5,6. MCR Population zeigte eine signifikante Abnahme in der Menge des Grund Primisulfuron-methyl relativ zu ACR und WCS, die als untere DT 50 zur MCR (Abbildung 3) quantifiziert wird.
Abb. 3: Zeitlicher Verlauf der Primisulfuron-methyl-Stoffwechsel in geschnitten waterhemp Blättern Herausgeschnittene waterhemp Blätter (third-jüngste Blatt; 2 bis 3 cm) wurden behandelt, wie in Abbildung 1 und unsere bisherigen Forschung mit Mesotrion 12 beschrieben, mit der Ausnahme, dass 150 uM radioaktiv markierten Primisulfuron war im Preis inbegriffen, wie die "Impuls" und Blätter wurden in der MS-Salze-Lösung ('Chase') für 0 Stunden inkubiert , 3 h und 11 h. Daten wurden durch nicht-lineare Regressionsanalyse der kleinsten Quadrate, wie zuvor für Mesotrion Stoffwechsel (Figur 1) 12 beschrieben, analysiert. Die MCR Bevölkerung rasch metabolisiert Primisulfuron-methyl (DT 50 = 13,6 h), während ACR und WCS metabolisiert Primisulfuron-methyl langsamer (DT 50> 24 h).
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Discussion
Die hier beschriebene geschnitten Blatt-Verfahren wurde bereits in der Erforschung Primisulfuron Stoffwechsel in Maisblätter 15 verwendet worden, aber unsere Ergebnisse zeigen, dass dieses Protokoll ist auch wirkungsvoll, präzise und reproduzierbar zu messen Herbizidmetabolismus in einer dikotylen Unkrautarten 12. Ein Hauptvorteil der entnommenen Blatt Technik gegenüber Ganzpflanzen Studien ist, dass ein ausgeschnittener Blatt ist unabhängig von Ganzpflanzen Translokation Muster Nachauflauf, systemische Herbizide oder Herbizidaufnahme Unterschiede in den Pflanzen oder Populationen. Zusätzlich wird Umweltvariabilität reduziert, da die herausgeschnittenen Blatt Assays werden in einer Wachstumskammer durchgeführt wird, mit einem einzigen Blatt in ein Röhrchen gegeben, verglichen mit dem Studium ganze Pflanzen unter Gewächshausbedingungen angezogen. Eine vegetative Klonierungsstrategie wurde auch in unserer Methode zur Untersuchung Mesotrion-Resistenzmechanismen in MCR 12, um das große Maß an genetischer Varianz innerhalb verringern und enthaltenTween Amaranthus Populationen 9. Genetische Diversität innerhalb Unkraut Amaranthus Populationen wird durch die Menge an Variabilität in Ganzpflanzenreaktionen auf mehrere Familien von Nachauflaufherbizide 18 dokumentiert dargestellt. Bei der Durchführung von Zeitverlaufsstudien genaue DT 50 s zu bestimmen, und zum Erfassen von signifikanten Unterschiede beim Vergleich DT 50 Werte zwischen waterhemp Populationen 12. Diese Schritte sind (wie in unserem geschnittenen Blatt und vegetative Klonierungsprotokoll beschrieben) kritisch für die Beseitigung oder Verringerung der genetischen und Umwelt Variabilität.
Verschiedene Mechanismen existieren in Anlagen zur Herbizidresistenz verleiht 1,2. Beispielsweise kann waterhemp Beständigkeit gegen ALS-inhibierenden Herbiziden Ziel Ort sein, anhand 14 oder Nicht-Ziel-Ort auf Basis 13. Stoffwechselraten der Primisulfuron-methyl (Abbildung 3), diese Unterschiede zwischen den beiden ALS-beständig waterh zeigen deutlich,emp Populationen, MCR und ACR (Tabelle 1). In Kombination mit PCR-Amplifikation und Sequenzanalyse von Herbizid Zielpark Genen wird die ausgeschnittene Blatt Assay große Hilfe zur Identifizierung, ob die Herbizidresistenz in waterhemp oder andere zweikeimblättrige Unkräuter durch Zielstelle oder Nichtziel-site Mechanismen 2 übertragen.
Grenzen unserer geschnittenen Blattverfahren gehören die Unfähigkeit, zu visualisieren oder zu messen Herbizid Translokation Muster in der gesamten Pflanze oder festzustellen, ob zelluläre oder subzelluläre Sequestrierung Mechanismen existieren, die zu verleihen Nicht-Ziel-Ort-basierten Widerstand in Unkraut 2. Wie bereits erwähnt, wurde dieser Aspekt auch als Vorteil bei der Bestimmung präziser Herbizid Stoffwechsel Preise in Mesotrion feste Unkrautpopulationen 12, sondern umgekehrt könnte als einen Nachteil, wenn das Studium systemischen Herbiziden, die nicht wesentlich in Pflanzen metabolisiert werden (dh nicht-selektiven Kräutericides) wie Glyphosat 2 oder Kontaktherbizide, die nicht-selektiven in natürlichen Unkrautpopulationen wie Paraquat oder Glufosinate, 19 sind. Allerdings, wenn Ziel-Ort-Mechanismen sind nicht ursprünglich offenbarte dann erhöhte Raten von Herbizidstoffwechsel sind in der Regel untersucht nächsten 1,4, vor allem, wenn das Studium Unkrautresistenz zu HPPD-Hemmer-Herbizide wie Mesotrion 12, ALS-inhibierenden Herbiziden wie Primisulfuron-methyl 13 , Photosystem II-inhibierende Herbizide wie Atrazin 1,12, oder Acetyl-CoA-inhibierenden Herbiziden 4.
P450 haben mit ALS Widerstand in einer Echinochloa Bevölkerung 20, ein weedy Gräser, als auch mit Mesotrion und ALS Widerstand in MCR 12,13 in Verbindung gebracht. Ein zweihäusig, zweikeimblättrige Unkraut zu waterhemp bezogen, ist auch Palmer Amaranth (A. palmeri), anfällig für die Entwicklung von Herbizidresistenz über mehrere unterschiedliche Mechanismen 1-3. Da mehr herbizidresistente Unkrautpopulationen und Arten werden weltweit 3 dokumentiert ist, wird der Bedarf an schnellen Prüfung Herbizid Stoffwechsel als potentielle Resistenzmechanismus weiter zunehmen. Die ausgeschnittene Blattansatz, der verschiedene, jedoch im Zusammenhang mit Ganzpflanzenstudien typischerweise zur Herbizidresistenzmechanismen zu untersuchen, ist eine genaue und wertvolles Werkzeug zur Bewertung und Quantifizierung der Herbizid-Metabolismus in Pflanzen. Als Ergebnis wird die Fähigkeit, diese Analysen mit genauen, reproduzierbaren Verfahren einschließlich der ausgeschnittenen Blatt Assay wird erheblich bei der Ermittlung nicht zu der Zielparkresistenzmechanismen in beiden Gras 4 und zweikeimblättrigen Unkräutern 12 unterstützen Forscher durchzuführen.
Zukünftige Anwendungen dieses Verfahrens kann auch der Bestimmung von Raten von Herbizid-Metabolismus in zweikeimblättrigen Kulturen wie Soja und Baumwolle. Kontinuierliche Forschung in unserem Labor mit herbizidtolerante Sojabohnensorten hat auch dazu verwendet die ausgeschnitten leaf Ansatz. Da Sojabohnen sind eine Hülsenfrucht-Ernte mit dreiblättrigen Blätter, ein "herausgeschnitten Blattstiel" Technik wurde angepasst und entwickelt, so dass jeder trifoliolate Blatt kann radioaktiv markiert Herbizid über die Aufnahme durch die Hauptblattstiel (Skelton, Lygin und Riechers, unveröffentlichte Daten) zu absorbieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 ml tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 ml tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
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