Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Måling Utbredelsen av ugressmiddel Metabolism i dicot Weeds med et utskåret Leaf analysen

Published: September 7, 2015 doi: 10.3791/53236

Introduction

Herbicidresistens i ugress presenterer en alvorlig trussel mot den globale produksjonen av mat og fiber 1,2. Foreløpig tusenvis av resistente populasjoner og biotypes fra over hundre plantearter over hele verden har blitt dokumentert og studert tre. En viktig mekanisme som overfører herbicidresistens i planter er endring av herbicid target-site gener og proteiner, inkludert genetiske mutasjoner som påvirker ugressmiddel-proteinbindingskinetikken eller amplifikasjon av target-området gen 2. Metabolsk avgiftning via forhøyede aktiviteter av cytokrom P450 monooksygenase (P450) eller glutation S -transferase (GST) enzymer er en annen mekanisme som overfører herbicidresistens i ugress, som er forskjellig på flere måter fra target-site-baserte mekanismer 2. Metabolsk basert motstand har betydelige konsekvenser for hvorvidt anlegget fitness kostnader (aka fitness straffer) kan resultere fra ugressmiddel-motstands mechanism, så vel som med hensyn til muligheten for en enkelt avgiftning mekanisme til å meddele tverr- eller flere herbicid resistens i plantepopulasjoner 1,2,4. Vanligvis kan herbicid metabolisme hos planter deles i tre distinkte faser 5. Fase I innebærer omdannelse herbicid eller aktivering, slik som P450 hydroksylering av aromatiske ringer eller alkylgrupper, eller med N - eller O- dealkyleringsreaksjoner, som fører til øket polaritet og delvis herbicid avgiftning 5,6. Nylig innført funksjonelle grupper i fase kan jeg gi ledd nettsteder for konjugering til redusert glutation ved GST eller til glukose av UDP-avhengige glycosyltransferases i fase II 5,7. For eksempel er den store første metabolitt av primisulfuron-methyl i mais hydroksy-primisulfuron-methyl 8, som kan videre metaboliseres til hydroksy-primisulfuron-glukosid (fase II), og deretter transportert til vakuolen for langtidslagring eller videre metabolsk proling 5,6 (fase III).

Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) er en vanskelig å kontroll, dicot årlige plantearter som hindrer produksjonen av mais (Zea mays), soyabønner (Glycine max), og bomull (Gossypium hirsutum) i USA. Den høye graden av genetisk mangfold av waterhemp er tilrettelagt av sin dioecious biologi og langdistanse vind pollinering, og en enkelt kvinne waterhemp plante kan produsere opp til en million frø 9. Disse frøene er liten og lett spre seg, som naturligvis gi gave waterhemp med en effektiv spredning mekanisme. Waterhemp viser kontinuerlig spiring gjennom hele vekstsesongen 9, og dens frø er i stand til å spire etter flere år med dvalen. Waterhemp er en C 4 plante som besitter en høyere vekst enn de fleste bredbladet ugress i dyrkbar beskjæring systemer 10. I tillegg en rekke waterhemp bestander er resistente mot flere famlige fundament av ugressmidler 3.

En populasjon av waterhemp (betegnet MCR) fra Illinois er resistent overfor 4-hydroksy-fenylpyruvat dioksygenase (HPPD) hemmende herbicider 11, slik som mesotrion, så vel som til atrazin og acetolaktat-syntase (ALS) hemmende herbicider, inkludert primisulfuron-methyl På grunn av non-target-språk baserte mekanismer 12,13. En annen populasjon av waterhemp betegnet ACR 14, som er primisulfuron-methyl-resistente (på grunn av en mutasjon i ALS-genet) og atrazin-motstandsdyktig, men følsomme for mesotrion, og en waterhemp populasjon betegnet WCS 14 som er følsom for primisulfuron-methyl, mesotrion, og atrazine ble anvendt i forhold til MCR på vår tidligere forskning 12 og aktuelle eksperimenter (oppsummert i tabell 1). Innledende studier ikke oppdage endringer i HPPD gensekvens eller uttrykk nivåer, eller redusert mesotrion opptak, i MCRbefolkningen sammenlignet med mesotrion-sensitive populasjoner 12. Men metabolismestudier med hele planter viste signifikant lavere nivåer av foreldre mesotrion ugressmiddel i MCR sammenlignet med ACR og WCS, som korrelert med tidligere fenotypiske responser til mesotrion 11,12.

Waterhemp Befolkning Forkortelse Fenotype til mesotrion Mesotrion Resistance Mechanism Fenotype til Primisulfuron Primisulfuron Resistance Mechanism
McLean fylke-Resistant MCR Resistent Metabolisme * Resistent Metabolisme
Adams fylke-Resistant ACR SensITive - Resistent Target-site mutasjon i ALS 14
Wayne County-Sensitive WCS Sensitive - Sensitive -

* Ikke-target-språk resistensmekanismer, annet enn økt metabolisme, kan også gi mesotrion motstand i MCR befolkningen 12.

Tabell 1: Beskrivelse av waterhemp populasjoner fra Illinois brukt i denne studien.

I tillegg til å bestemme priser av ugressmiddel metabolisme i intakte waterhemp frøplanter, ble en annen eksperimentell tilnærming utviklet og anvendt i vår tidligere forskning for å undersøke stoffskifte ved hjelp av en spaltet waterhemp blad analysen 12 samt ulike P450-hemmere (f.eks tetcyclacis og malathion). Denne metoden ble tilpasset spesielt for waterhemp fra en PreviOUS etterforskning av primisulfuron-metyl metabolisme i skåret mais blader 15, siden utskåret blad analysen ennå ikke hadde blitt rapportert for å gjennomføre ugressmiddel metabolisme forskning i et dicot plante. Den organophophosate insektmiddel malathion har vært hyppig brukt for in vivo og in vitro ugressmiddel-metabolisme forskning for å indikere P450 involvering 16. For eksempel, toleranse og hurtig metabolisme av mesotrion i mais skyldes P450-katalysert ring hydroksylering, som ble bekreftet ved malathion øket følsomhet for mais mesotrion 17. Tilsvarende, malathion hemmet metabolisme av ALS inhibitor primisulfuron-methyl utskåret i mais blader 15. En stor fordel med den utskårede blad teknikken er at data som er generert er uavhengige av hel-anlegget trans mønstre, for å vurdere en viktig faktor når man vurderer metabolismen av systemiske herbicider, postemergence i planter. Derfor tillater denne metoden kvantitative ogkvalitativ metabolsk analyser for å fokusere på en enkelt behandlet blad 12.

En vegetative kloning strategi, i kombinasjon med utskåret blad protokollen, ble tidligere benyttet i waterhemp å gjennomføre metabolismestudier 12. På grunn av den outcrossing natur waterhemp (separate mannlige og kvinnelige planter), og stor grad av genetisk mangfold innenfor dioecious Amaranthus arter 9, denne protokollen sørget for at genetisk identiske waterhemp frøplanter ble analysert innenfor tidskurs eksperimenter. Denne artikkelen viser nytten av det utskårede blad metode for å måle forekomst av herbicid metabolisme i en tofrøbladet ugress (waterhemp). Mengden av basis herbicid gjenværende ble bestemt på hvert tidspunkt (figur 1) ved ikke-lineær minste kvadraters regresjonsanalyse, og er i form med en enkelt første-ordens kurve for å beregne tiden for 50% av absorbert herbicid å degradere ( DT 50). RepresentantKromatogrammene fra reversfase-væskekromatografi med høy yteevne (RP-HPLC) vises for ALS-resistente og -sensitive waterhemp populasjoner, som viser forsvinningen av moder herbicid og samtidig dannelse av polar metabolitt (er) i løpet av en tidsstudium (figur 2). Fokus for vår artikkelen er å beskrive og demonstrere nytten av utskåret blad analyse i kombinasjon med en vegetativ klonings fremgangsmåte for å bestemme nøyaktige og reproduserbare forekomst av herbicid metabolisme i tofrøbladet planter, ved hjelp av jevnt ring-merkede (URL- 14 C) i herbicider tre waterhemp populasjoner som varierer i deres hel-anlegget svar på HPPD- og ALS-hemmer ugressmidler (tabell 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. plantemateriale, vekstvilkår, og Vegetativ Cloning

Merk: Tre waterhemp populasjoner ble undersøkt i denne forskningen: MCR (fra McLean County, IL), ACR (fra Adams County, IL), og WCS (fra Wayne County, IL) (tabell 1).

  1. Samle og suspen waterhemp frø i 0,1 g L -1 agar: vannløsning ved 4 ° C i minst 30 dager for å forbedre spiring. Merk: Noen waterhemp bestander er sovende, men dette trinnet bidrar til å overvinne dvalen og lage frø spirer mer jevnt.
  2. Spire frø av hver waterhemp befolkningen (som i tabell 1) i 12 x 12 cm skuffer som inneholder en potting medium i drivhuset.
    1. Vedlikeholde klimaforholdene ved 28/22 ° C dag / natt temperaturer innenfor en 16/8 timers daglengde 12.
    2. Supplere naturlig lys i drivhuset med lys fra kvikksølv halogen lamper for å gi et minimum av 500 mikromol m -2 -1 foton flux ved anlegget baldakin nivå.
  3. Transplant dukket frøplanter når de er 2 cm inn 80 cm 3 potter i drivhuset.
  4. Transplant frøplanter til 950 cm 3 potter som inneholder en 3: 1: 1: 1 blanding av potting mix: jord: torv: sand når frøplantene er 4 cm høy. Tilsett 5 g av sakte frigivelse gjødselkorn i hver potte, og blande seg med denne jord blandingen.
  5. Kutt og fjern shoot apikale meristem som inneholder de tre yngste bladene fra 7 cm høye planter å eliminere apikal dominans.
    Merk: Dette trinnet sikrer at hver plante vil vokse nok 3 cm aksillære skudd for å klone.
  6. Avgifts fem aksillære skudd (3 cm i lengde) når spirene er ca 14 cm høye fra hver waterhemp befolkningen (som i tabell 1). Fjern de fleste av bladene på disse aksillære skudd for å redusere vanntapet ved videre behandling, men beholde de to yngste bladene til å tillate ytterligere vekst på transplantasjonen.
  7. Transplant aksillær skyter inn i 80 cm 3 potter (en frøplante potte) i pottejord, som er det samme medium som brukes for spiring. Potting medium bør være mettet først før røttene form i vekstkammeret, deretter opprettholde konstant fuktighet og plassere potter i vekstkammeret i 7 dager for å etablere røtter.
    Merk: Planter er svært følsomme ved dette punktet, og bør ikke bli stresset.
    1. Opprettholde vekstkammerforhold på 28/22 ° C dag / natt temperaturer innenfor en 16/8 timers daglengde 12.
    2. En kombinasjon av og gløde lysrør kan benyttes for å gi lys i vekstkammeret, og bør levere minst 550 umol m sek -2 -1 foton fluks på anlegget baldakin 12 nivå.
  8. Transplant igjen inn 950 cm 3 Potter (en frøplante per pott) containing en 3: 1: 1: 1 blanding av potting mix: jord: torv: sand (også inkluderer 5 g slow-release gjødselkorn) når klonede planter er 4 cm høy, og deretter overføre tilbake til drivhuset.
  9. Klone plantene en gang ved å bruke samme metode som er beskrevet ovenfor (dvs. gjenta skritt unna 1,5 til 1,8, og deretter videre til trinn 2.1). For en typisk tidsstudium, generere kloner fra minst seks selvstendige planter fra hver waterhemp befolkningen og ta dem som linjer MCR 1-6, ACR 1-6 og WCS 1-6.
    1. Etablere minst seks forskjellige "foreldre" klonale linjer for å gjenta eksperimentet og tilstrekkelig representere genetiske variasjonen innen hver waterhemp befolkningen.
    2. Avhengig av hvor mange tid poeng vil bli analysert, generere nok sub-kloner av hverandre "foreldre" klonal kø for å gjennomføre en tidsstudium.

2. Gjennomføre en Metabolism Study med skåret Waterhemp Leaves

  1. Skjære det tredje yngste bladene (2 til 3 cm i lengde, inkludert 0,5 cm av festet petiole) når klonede waterhemp plantene er 10 til 12 cm høye for ugressmiddel metabolisme og DT 50 analyse.
  2. Cut blad petioles fra hver waterhemp plante en andre gang (slik at 0,3 cm av bladstilken fortsatt) under vann, og plassere disse kutt ender i 1,5 ml plasthetteglass (ett blad per hetteglass) 15.
    Merk: Klippe en gang under vann hindrer luftbobler fra forming og plugge Xylem fartøy.
    1. For det første, delvis dyppes utskårende blader med snitt bladstilken i pre-inkubering buffer (200 pl) i 0,1 M Tris-HCl (pH 6) i 1 time.
    2. Dernest beveger hvert blad til et nytt 1,5 ml rør inneholdende en inkubasjonsbuffer (200 ul) i 0,1 M Tris-HCl (pH 6) pluss 150 pM [URL- 14 C] herbicid, og inkuber ved 28 ° C i 1 time for å gir mulighet for ugressmiddel absorpsjon i bladene.
      Merk: Både 14 C-mesotrion og -1. Både diffusjon og opptak gjennom Margen transpira strøm bidra til mengden av ugressmiddel opptas pr blad.
      Merk: Effekten av metabolske hemmere på ugressmiddel stoffskifte kan bestemmes ved å endre trinn 2.2.1 og 2.2.2 ovenfor. Tilsett 100 uM av inhibitoren til pre-inkubering buffer og la inkuber i 2 timer, og deretter overføre til inkuberingsbuffer med herbicid og igjen legge til 100 uM inhibitor. For eksempel malathion og tetcyclacis hemme visse cytokrom P450 aktiviteter i planter 15-17.
    3. Vask den neddykkede del av skåret blader med avionisert vann og overføre skåret bladene til en kvart styrke Murashige og Skoog (MS) salt-løsning (500 ul) i 0 timer, 5 timer, 11 timer, 23 timer eller 35 timer, henholdsvis, i vekstkammeret for tidsforløpet metabolisme studien.
  3. Høste ved å fjerne permisjons fra inkubering oppløsning på et passende tidspunkt og manuelt male hvert blad vev i flytende nitrogen ved anvendelse av en polypropylen-rør (15 ml) og glass pistill.
  4. Ekstraher radiomerkede herbicid og dets metabolitter fra hvert blad med 7 ml 90% aceton med en laboratorie-vevshomogenisator i samme polypropylenrør som ovenfor. Skyll vevshomogenisator med ytterligere 7 ml 90% aceton, og fortsetter å homogenisere til vev er grundig pulverisert (vanligvis ca. 2 minutter). Merk: 90% aceton kan anvendes for utvinning av de fleste herbicider fra plantevev. Men hvis denne metoden er i stand til å ekstrahere mer enn 90% av de radiomerkede forbindelser absorberes, og deretter 90% metanol og 90% acetonitril kan være substituert som ekstraksjonsløsningsmidlet.
  5. Etikett 90% aceton-ekstrakter (14 ml totalt) og oppbevares ved -4 ° C i 16 timer for å tillate ytterligere ekstraksjon å finne sted.
    Merk: Etter denne ekstraksjon av behandlede blad, mengden av ekstraherbare radioactivity er typisk minst 98% av radioaktivt merkede forbindelser som absorberes av det behandlede bladet. Ikke-ekstraherbart radioaktivitet (bundet residuer) i skåret bladene i gjennomsnitt bare 0,3% i alle tidspunkter i vår tidligere studie 12, men denne mengde kan variere avhengig av ugressmiddel som brukes og tidspunkt undersøkes.
  6. Sentrifuger prøvene ved 5000 xg i 10 min og supernatantene konsentreres ved 40 ° C med en rotasjonsfordamper inntil et sluttvolum på 0,5 ml er oppnådd. Overfør dette volum til et 2,0 ml plastrør.
  7. Legg acetonitril: vann (1: 1, i volum) for å justere det endelige volum av plante-ekstrakter til 1,25 ml og re-sentrifuge ved 10 000 xg i 10 minutter for å fjerne eventuelle partikler.
  8. Måle den totale radioaktiviteten i en alikvot tatt fra hver prøve (dpm ul -1) ved væske-scintillasjons-spektroskopi (LSS) 12 og normalisere mengder av [14C-merket]-forbindelser injiseres til HPLC-analyse (for eksempel 10,000 total dpm / sample / løp) så y-aksen vil være ensartet blant prøvene når grafer resultater.

3. HPLC Analyse av ugressmiddel Metabolism i eksisert Løv

Merk: Løse total utvinnbar radioaktivitet inn forelder ugressmiddel og ugressmiddel metabolitter ved hjelp av følgende RP-HPLC-betingelser 12.

  1. Utføre RP-HPLC med en C-18 kolonne (4,6 x 250 mm, 5 um partikkelstørrelse for analytisk HPLC) ved en strømningshastighet på 1 ml min-1 for de fleste ikke-polare herbicider.
    Note: C 4 eller C-12 RP-HPLC-kolonner kan også benyttes for å optimalisere separeringen av moder herbicid fra dets metabolitter. Et filter pre-kolonne og / eller beskyttelseskolonne kan også brukes for å beskytte og forlenge levetiden til RP-kolonne.
    1. Bruk følgende mobile fasen for RP-HPLC: Eluent A, 0,1% maursyre (v / v) i vann, og elueringsmiddel B, 100% HPLC-kvalitet acetonitril.
      Merk: HPLC grad metanol kan også brukes som Eluent B for å løse mer polare forbindelser og metabolitter, men vær oppmerksom på at tilbakeholdelsestider kan også endres.
      Merk: Elueringsprofilen som brukes til å løse mesotrion eller primisulfuron-methyl fra sine polare metabolitter i vår forskning 12 er: Trinn 1, A: B (4: 1, v / v) til A: B (3: 2, v / v ) i en lineær gradient (12 min); Trinn 2, A: B (3: 2, v / v) til A: B (3: 7, v / v) i en lineær gradient (5 min); Trinn 3, A: B (3: 7, v / v) til A: B (1: 9, v / v) i en lineær gradient i 2 min (bestående av totalt 19 min).
      Merk: Stigninger og isokratiske skritt må kanskje justeres basert på de fysiske egenskapene til grunnmaterialet for å optimalisere oppløsning.
    2. Følge de ovennevnte lineære gradient trinnene med A: B (1: 9, v / v) til A: B (4: 1, v / v) i en lineær gradient (3 min) og A: B (4: 1, v / v) isokratisk trinn (i minst 2 min) til å re-likevekt RP kolonne før injisering av den neste 12 ekstrakt.
  2. Oppdage og visualisere radiomerkede forbindelser med en Flow Scintillation Analyzer. Registrere hvor mye foreldre ugressmiddel igjen i hver prøve som andel av total radioaktivitet i hvert utvalg (oppdaget og kvantifisert ved Flow Scintillation Analyzer i henhold til produsentens instruksjoner) for å fastslå utbredelsen av ugressmiddel metabolismen i hvert waterhemp befolkningen i den tiden kurset.

4. statistiske prosedyrer

  1. Ordne behandlinger i en fullstendig randomisert konstruksjon (eller en annen egnet anordning for statistisk analyse).
  2. Utføre to uavhengige eksperimenter med hver behandling, som består av tre biologiske replikater for hvert eksperiment. De to uavhengige eksperimenter inkluderer seks biologiske replikater totalt. Hvis forsøket effekten er ikke-signifikant (α = 0,05), kombinere og analysere data fra hver uavhengig forsøk. Hvis forsøket effekten er betydelig, og deretter analysere hvert eksperiment for seg.
    Merk: Ta de første tre biologiske replikater jegn Eksperimenter 1 og de ​​neste tre biologiske replikater i Eksperiment 2. Hver biologisk replikere representerer en distinkt "foreldre" klonal linje avledet fra hver populasjon (MCR 1-6, ACR 1-6, og WCS 1-6) slik at hver gang- Kurset analyse benytter genetisk identiske planter. De to uavhengige eksperimenter inkluderer seks biologiske replikater totalt, noe som gir mulighet for tilstrekkelig representasjon av genetisk variasjon og fastsettelse av en median DT 50 for hver waterhemp befolkningen.
  3. Analysere dataene med ikke-lineær minste kvadraters regresjonsanalyse og passer dem med en enkel første orden kurve for å anslå DT 50 s. Ligningen nedenfor beskriver modellen:
    Ligning 1
  4. hvor i denne modellen y representerer prosentandelen av gjenværende moder herbicidet ved tiden t, μ i er DT 50 for hvertwaterhemp befolkningen i, og parameteren C 0 er det estimerte beløpet av foreldre ugressmiddel til stede ved t = 0 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Store forskjeller i forekomst av mesotrion stoffskifte ble påvist mellom enten WCS eller ACR og MCR (figur 1). På hvert tidspunkt, hadde MCR metaboliseres mesotrion raskere enn de to mesotrion-sensitive populasjoner, WCS og ACR, som korrelerer med tidligere hel-anlegget fenotypiske responser 11. Ved kloning av nok planter fra en enkel foreldre plante fra hver populasjon, herbicid metabolisme tidsforløpet analyser er ensartet og reproduserbar på grunn av mangel av genetisk variabilitet innen hver gang 12 kurs. For eksempel er tidsforløpet for mesotrion metabolisme i klonal linje 5 12 vist i figur 1. En total av seks forskjellige klonale linjer, avledet fra seks separate foreldreplanter, ble analysert fra hver populasjon (tabell 1) for å bestemme en samlet median DT 50 verdi, noe som indikerte at mesotrion metabolisme i MCR var betydelig raskere ( 50 verdi) enn ACR eller WCS 12. I tillegg vår tidligere studie med skåret blader viste at P450-inhibitorer vesentlig reduserte mesotrion metabolisme i MCR og mais, men ikke i ACR, og den store initielle metabolitten detektert i MCR ble identifisert som 4-hydroksy-mesotrion, noe som indikerer at forbedret utbredelsen av P450- mediert metabolisme er assosiert med resistens i MCR 12.

I tillegg til å studere mekanismene for mesotrion motstand i MCR, et beslektet formål var å bestemme mekanismen for resistens mot ALS-inhibitorer i MCR. Tidligere forskning har vist at en sub-populasjon avledet fra MCR var ALS motstandsdyktig, men ikke har en mutasjon i ALS målstedet genet, noe som indikerer en ikke-target-området basert mekanisme 13. Dette er i kontrast med ACR, som er ALS resistent på grunn av et målområde mutasjon som overfører et mindre følsom ALS enzym 14. For å test denne hypotese, ble utskåret blad assay utført med [URL- 14 C] primisulfuron-methyl, en ALS-inhiberende herbicid av sulfonylurea familien. Den toppområdet til 14 C-primisulfuron-methyl i et representativt HPLC-kromatogram (retensjonstid på omtrent 21,6 min) var signifikant mindre i MCR enn i ACR og WCS 12 HAT (figur 2). I tillegg ble to polare metabolitter med kortere oppholdstider enn primisulfuron-methyl påvist i utskårende blad ekstrakter fra alle tre populasjoner (figur 2). Selv om strukturene av disse to polare metabolitter ikke ble bestemt i denne studien, er deres raske formasjon i samsvar med ring hydroksylering av primisulfuron-methyl 8 (fase I metabolisme), etterfulgt av glukose konjugasjon 5 (fase II metabolisme).

I kombinasjon med de kvalitative analyser av primisulfuron metabolisme i MCR, ACR, og WCS (figur 2), mengdenav moder herbicid værende på hvert tidspunkt ble kvantifisert og anvendt for å bestemme DT 50 verdiene for primisulfuron-methyl i MCR (13,6 timer), ACR (> 24 timer), og WCS (> 24 timer) (figur 3). Den betydelig kortere DT 50 verdi i MCR er forenlig med økt metabolisme som den viktigste mekanismen for ALS motstand i denne populasjonen, i tråd med tidligere hel-anlegget forskning 13. Interessant, imidlertid DT 50 verdiene for primisulfuron i ACR og WCS er lik ennå vesentlig lengre enn i MCR (figur 3), til tross for både MCR og ACR viser ALS-inhibitor-resistente fenotyper (tabell 1). Den relativt lange DT 50 i ACR er muligens fordi det ikke er nødvendig å raskt forbrenne primisulfuron, ettersom ACR har en mindre følsom ALS enzym som hovedresistensmekanismen 14. I sammendraget, skåret waterhemp blad analysen benyttes i vår forskning gitt verdifull qualitative og kvantitative data og gitt ny innsikt i metabolismebaserte resistensmekanismer mot to ulike plantevernmidler i MCR, ACR, og WCS.

Figur 1
Figur 1:. Tid løpet av mesotrion metabolisme i skåret waterhemp går fra vegetativt klonede populasjoner skåret blader (tredje yngste blad, 2 til 3 cm i lengde) fra waterhemp planter (10 til 12 cm) ble vegetativt klonet slik at hver gang-kurs studie for hver linje besto av genetisk identiske planter. Skåret ut bladene ble plassert i 0,1 M Tris-HCl-buffer (pH 6) i 1 time, etterfulgt av 0,1 M Tris-HCl (pH 6) pluss 150 mM radioaktivt merket mesotrion i 1 time ("Pulse"), og deretter kvart styrke Murashige og Skoog (MS) salt-løsning ("chase") for 0 timer, 5 timer, 11 timer, 23 timer og 35 timer for å la forbrenningen skje. DaTA ble analysert ved ikke-lineær minste kvadraters regresjonsanalyse, og passe med en enkelt første-ordens kurve for å estimere en DT 50 separat for hver klonet waterhemp populasjon 12 sikret MCR klonal linje raskt metabolisert mesotrion, mens ACR og WCS klonale linjer metabolisert mesotrion saktere. Data vises er tids kurs fra kun klonal linje 5 for hvert waterhemp befolkningen, noe som har blitt forandret fra vår forrige papir 12 (Copyright av American Society of Plant Biologer).

Figur 2
Fig. 2: Primisulfuron-metyl metabolisme i MCR, ACR, og WCS (12 HAT) Representative revers-fase HPLC-kromatogrammer for skåret waterhemp blad ekstrakter (12 HAT) som følger med 150 mM radioaktivt merket primisulfuron-metyl (som beskrevet i protokollen) fra McLean fylke (MCR, A), Adams County (ACR, B), ennd Wayne County ugressmiddel følsomme (WCS, C) populasjoner (tabell 1). Radioaktiv topp med en retensjonstid på 21,6 min inneholder primisulfuron-methyl, som bestemt ved sammenligning med en autentisk analytisk standard. Topper med kortere oppholdstider er sannsynlige polare, mindre fytotoksiske metabolitter av primisulfuron-methyl, slik som hydroksy-primisulfuron-methyl 8 eller glykosylerte former av hydroksylerte metabolitter 5,6. MCR-populasjonen viste en betydelig reduksjon i mengden av moder primisulfuron-methyl i forhold til ACR og WCS, som er kvantifisert som en lavere DT 50 for MCR (figur 3).

Figur 3
Figur 3:. Tid løpet av primisulfuron-metyl metabolisme i skåret waterhemp bladene skåret waterhemp blader (third-yngste blad; 2 til 3 cm) ble behandlet som beskrevet i figur 1, og vår tidligere forskning med mesotrion 12, bortsett fra at 150 uM radiomerket primisulfuron ble inkludert som "puls" og bladene ble inkubert i MS alter ("chase") for 0 hr , 3 timer og 11 timer. Data ble analysert ved ikke-lineær minste kvadraters regresjonsanalyse som beskrevet tidligere for mesotrion metabolisme (figur 1) 12. MCR befolkningen raskt metabolisert primisulfuron-metyl (DT 50 = 13,6 timer), mens ACR og WCS metaboliseres primisulfuron-metyl saktere (DT 50> 24 timer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det utskårede-blad metoden beskrevet her har tidligere vært brukt i forskning primisulfuron metabolisme i mais blader 15, men våre resultater viser at denne protokollen er også effektiv, nøyaktig og reproduserbar for måling av ugressmiddel metabolisme i en dicot ugrasarter 12. En stor fordel med den utskårede blad teknikk sammenlignet med hel-anlegget studier er at et utskåret blad er uavhengig av hel-anlegget trans mønstre av postemergence, systemiske herbicider eller forskjeller i opptak herbicid blant planter eller populasjoner. I tillegg er miljøvariasjoner redusert siden de utskårende blad analysene er utført i et vekstkammer, med et enkelt blad plassert i et rør, sammenlignet med å studere hele planter dyrket under drivhusforhold. En vegetative kloning strategi ble også inkludert i vår metode for å studere mesotrion-resistensmekanismer i MCR 12 for å minimere stor grad av genetisk variasjon innen og væretween Amaranthus populasjoner 9. Genetisk mangfold innen luftig Amaranthus populasjoner er illustrert av mengden variasjon dokumentert i hel-anlegget responser til flere familier av postemergence herbicides 18. Ved gjennomføring av tidsforløpet studier for å bestemme nøyaktige DT 50 s og for å detektere signifikante forskjeller ved sammenligning av DT-50-verdier mellom waterhemp populasjoner 12, denne fremgangsmåten (som beskrevet i vår utskåret blad og vegetative kloning protokoll) er kritiske for å eliminere eller redusere genetiske og miljømessige variabilitet.

Ulike mekanismer finnes i planter for overdragelse herbicidresistens 1,2. For eksempel kan waterhemp motstand mot ALS-hemmer ugressmidler være target-området basert 14 eller non-target-området basert 13. Metabolske priser av primisulfuron-metyl (figur 3) viser tydelig disse forskjellene mellom to ALS-resistente waterhEMP populasjoner, MCR og ACR (tabell 1). I kombinasjon med PCR forsterkning og sekvensanalyse av ugressmiddel target-site gener, vil det utskårede blad analysen i stor grad hjelpe mot å identifisere om herbicidresistens i waterhemp eller andre dicot ugress er gitt av target språk eller ikke-target-site mekanismer 2.

Begrensninger av vår utskåret blad metode omfatte manglende evne til å visualisere eller måle ugressmiddel transmønstre gjennom hele anlegget, eller finne ut om mobilnettet eller sub-cellulære beslaglegging mekanismer eksisterer som konferere non-target-site basert motstand i ugress 2. Som nevnt tidligere, var dette aspektet også ansett som en fordel når man skal avgjøre presise ugressmiddel forbrenningen i mesotrion bestandig weed populasjoner 12, men omvendt kan anses som en ulempe når studere systemiske ugressmidler som ikke metaboliseres vesentlig i planter (dvs. ikke-selektive urticides) såsom glyfosat 2 eller kontakt herbicider som er ikke-selektive i naturlige plantepopulasjoner, slik som paraquat eller glufosinate 19. Men hvis målet-site mekanismer ikke blir avslørt i utgangspunktet så forbedrede priser av ugressmiddel metabolismen er vanligvis etterforsket neste 1,4, spesielt når man studerer luke motstand mot HPPD hemmende ugressmidler som mesotrion 12, ALS-hemmer ugressmidler som primisulfuron-metyl 13 , photosystem II-hemme ugressmidler som atrazine 1,12, eller acetyl-CoA-hemme ugressmidler 4.

P450s har vært forbundet med ALS motstand i en populasjon Echinochloa 20, en weedy grasarter, så vel som med mesotrion og ALS motstand i MCR 12,13. En dioecious, dicot luke relatert til waterhemp, er Palmer amaranth (A. Palmeri), også utsatt for å utvikle herbicidresistens via flere ulike mekanismer 1-3. Etter hvert som flere herbicid-resistente ugress populasjoner og arter er dokumentert i hele verden 3, vil behovet for raskt å undersøke herbicid metabolisme som en potensiell motstand mekanisme fortsetter å øke. Det utskårede blad tilnærming, som er forskjellig, men relatert til hel-anlegget studier som vanligvis brukes for å undersøke mekanismer for herbicidresistens, er et nøyaktig og verdifullt verktøy for å evaluere og kvantifisere herbicid metabolisme hos planter. Som et resultat av evnen til å utføre disse analysene med nøyaktige, reproduserbare metoder inkludert det utskårede blad analysen vil i stor grad hjelpe til med å bestemme forskere ikke-target-site resistensmekanismer i både gress 4 og tofrøbladet ugress 12.

Fremtidige anvendelser av denne metoden kan også inkludere å bestemme utbredelsen av ugressmiddel metabolisme i dicot avlinger som soyabønner og bomull. Pågående forskning i vårt laboratorium med herbicidtolerante soya varianter har også benyttet det utskårede lEAF tilnærming. Men siden soyabønner er en belgfrukt avling med trifoliate blader, en "skåret petiole" teknikken har blitt tilpasset og utviklet slik at hver trifoliolate blad kan absorbere radiomerket ugressmiddel via opptak gjennom hoved petiole (Skelton, Lygin, og Riechers, upublisert data).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich A1296 for pre-germinating seeds
Potting medium Sun Gro Horticulture 49040233 for plant growth
Nutricote Agrivert  TOTAL BLEND 13-13-13 T100 slow-release fertilizer
Growth chamber E15 Controlled Environments Limited 20207 plant culturing
Tris base Fisher Scientific BP152-500 buffer for excised leaves
HCl (concentrated) Fisher Scientific A144500 adjust pH of buffer
Murashige and Skoog (MS) salts  Sigma-Aldrich M0404 incubation of excised leaves
Methanol Fisher Scientific A452-4 leaf washes after incubation
Acetone Sigma-Aldrich 179124 plant extractions
Acetonitrile (HPLC grade) Macron Fine Chemicals MKH07610 HPLC mobile phase
Formic acid  Mallinckrodt Analytical MK259205 acidify mobile phase pH
Micro-centrifuge Eppendorf 5417R 1.5 or 2.0 ml tubes
Centrifuge (temperature controlled) Eppendorf 5810R 15 or 50 ml tubes
Polypropylene centrifuge tube Corning Inc. 430790 15 ml, sterile
Rotary evaporator BÜCHI R200 concentrate plant samples
Liquid scintillation spectrometry (LSS) Packard Instruments 104470 quantify 14C
High-performance liquid chromatography Perkin Elmer N2910401 resolve herbicide metabolites
Flow scintillation analyzer  LabLogic System 1103303 for HPLC analysis of 14C
Hypersil Gold C18 column  Thermo-Scientific 03-050-522  reversed phase
Ultima-Flo M cocktail Perkin Elmer 6013579 for Flow-scintillation analyzer
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) Fisher Scientific SX18 for LSS; biodegradable
Laboratory homogenizer Kinematica CH-6010  homogenize leaf samples

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
  2. Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
  3. Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
  4. Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
  5. Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
  6. Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
  7. Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
  8. Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
  9. Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
  10. Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
  11. Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
  12. Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
  13. Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
  14. Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
  15. Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
  16. Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).
  17. Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
  18. Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
  19. Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
  20. Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).

Tags

Environmental Sciences ugressmiddel metabolisme xenobiotisk avgiftning cytokrom P450 glutation halveringstid analyse acetolaktat syntasehemmer triketone ugressmiddel anlegg biokjemi, Ugressmiddel degradering væskekromatografi
Måling Utbredelsen av ugressmiddel Metabolism i dicot Weeds med et utskåret Leaf analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, R., Skelton, J. J., Riechers, D. More

Ma, R., Skelton, J. J., Riechers, D. E. Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay. J. Vis. Exp. (103), e53236, doi:10.3791/53236 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter