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एक excised पत्ता परख के साथ dicot मातम में शाक चयापचय की दर को मापने

Published: September 7, 2015 doi: 10.3791/53236
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Crop Sciences, University of Illinois

Introduction

मातम में शाक प्रतिरोध भोजन और फाइबर 1,2 के वैश्विक उत्पादन के लिए एक गंभीर खतरा प्रस्तुत करता है। वर्तमान में, एक सौ से अधिक खरपतवार प्रजातियों से प्रतिरोधी आबादी और biotypes की दुनिया भर में हजारों दस्तावेज और 3 अध्ययन किया गया है। पौधों में शाक प्रतिरोध प्रदान कि एक प्रमुख तंत्र शाक-प्रोटीन बाध्यकारी कैनेटीक्स या लक्ष्य-साइट जीन 2 के प्रवर्धन को प्रभावित करने वाले आनुवंशिक परिवर्तन सहित शाक लक्ष्य-साइट जीन और प्रोटीन की परिवर्तन है। साइटोक्रोम P450 monooxygenase (P450) या glutathione एस -transferase (जीएसटी) एंजाइमों का ऊंचा गतिविधियों के माध्यम से मेटाबोलिक विषहरण लक्ष्य-साइट-आधारित तंत्र 2 से कई मायनों में अलग है जो मातम में शाक प्रतिरोध, प्रदान कि एक और तंत्र है। मेटाबोलिक-आधारित प्रतिरोध (फिटनेस दंड उर्फ) संयंत्र रखरखाव लागत शाक-प्रतिरोध mechanis से हो सकता है कि क्या के लिए महत्वपूर्ण असर हैमीटर, साथ ही खरपतवार आबादी 1,2,4 में पार या एकाधिक-शाक प्रतिरोध प्रदान करने के लिए एक एकल विषहरण तंत्र के लिए क्षमता के बारे में। आम तौर पर, पौधों में शाक चयापचय तीन अलग चरणों 5 में विभाजित किया जा सकता है। बढ़ी हुई polarity और आंशिक शाक विषहरण 5,6 करने के लिए अग्रणी, या हे dealkylation प्रतिक्रियाओं - चरण मैं इस तरह के खुशबूदार छल्ले या एल्काइल समूहों के पी 450 की मध्यस्थता hydroxylation, या एन द्वारा के रूप में शाक रूपांतरण या सक्रियण शामिल है। नवनियुक्त मैं GSTs द्वारा कम glutathione करने के विकार के लिए लिंकेज साइटों प्रदान कर सकते हैं या द्वितीय चरण 5,7 में यूडीपी-निर्भर glycosyltransferases द्वारा ग्लूकोज के लिए पहले चरण में कार्य समूहों की शुरुआत की। उदाहरण के लिए, मक्का में primisulfuron मिथाइल के प्रमुख प्रारंभिक मेटाबोलाइट आगे हाइड्रोक्सी primisulfuron-glucoside करने के लिए (द्वितीय चरण) metabolized और फिर लंबी अवधि के भंडारण या आगे चयापचय के लिए रिक्तिका के लिए ले जाया जा सकता है, जो हाइड्रोक्सी primisulfuron मिथाइल 8, है समर्थकcessing 5,6 (तीसरे चरण)।

Waterhemp (चौलाई tuberculatus) संयुक्त राज्य अमेरिका में मक्का का उत्पादन (Zea mays), सोयाबीन (ग्लाइसिन मैक्स), और कपास (Gossypium hirsutum) hinders कि एक मुश्किल-नियंत्रण, dicot वार्षिक खरपतवार प्रजाति है। waterhemp की आनुवंशिक विविधता के उच्च स्तर के अपने डायोसिअस जीव विज्ञान और लंबी दूरी की हवा परागण से मदद की है, और एक भी महिला waterhemp संयंत्र एक लाख बीज 9 तक का उत्पादन कर सकते हैं। इन बीजों को स्वाभाविक रूप से एक प्रभावी प्रसार तंत्र के साथ waterhemp प्रदान करना है, जो छोटे और आसानी से फैल रहे हैं। Waterhemp बढ़ती मौसम 9 के दौरान निरंतर अंकुरण को प्रदर्शित करता है, और उसके बीज निद्रा के कई वर्षों के बाद अंकुरित करने के लिए सक्षम हैं। Waterhemp कृषि योग्य फसल प्रणाली 10 में सबसे चौड़े मातम की तुलना में उच्च विकास दर के पास है कि एक सी 4 संयंत्र है। इसके अलावा, कई waterhemp आबादी कई परिवार के लिए प्रतिरोधी रहेशाक 3 की ilies।

इलिनोइस से waterhemp (एमसीआर नामित) की आबादी 4-हाइड्रोक्सी phenylpyruvate dioxygenase (ह्प्प्द) ऐसे mesotrione रूप -inhibiting शाक 11, साथ ही atrazine और acetolactate सिन्थेज़ (ए एल एस) के लिए, शाक -inhibiting primisulfuron मिथाइल सहित के लिए प्रतिरोधी है , गैर लक्ष्य ठहरते आधारित तंत्र 12,13 के कारण। और atrazine प्रतिरोधी लेकिन mesotrione के प्रति संवेदनशील है, और primisulfuron मिथाइल के प्रति संवेदनशील है कि WCS 14 नामित एक waterhemp आबादी (कारण एक ए एल एस जीन में उत्परिवर्तन के लिए) primisulfuron मिथाइल-प्रतिरोधी है जो एसीआर 14 नामित waterhemp का एक अलग आबादी, mesotrione, और atrazine हमारे पूर्व अनुसंधान 12 और वर्तमान प्रयोगों में एमसीआर के साथ तुलना में इस्तेमाल किया गया (तालिका 1 में संक्षेप)। प्रारंभिक अध्ययन एमसीआर में, ह्प्प्द जीन अनुक्रम या अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन, या कम mesotrione तेज का पता नहीं चलाजनसंख्या जब mesotrione के प्रति संवेदनशील आबादी 12 के साथ तुलना में। हालांकि, पूरे पौधों के साथ चयापचय के अध्ययन 11,12 mesotrione करने के लिए पिछले प्ररूपी प्रतिक्रियाओं के साथ सहसंबद्ध जो एसीआर और WCS, के साथ तुलना में एमसीआर में माता-पिता mesotrione शाक की काफी निचले स्तर का प्रदर्शन किया।

Waterhemp जनसंख्या संक्षिप्त Mesotrione को phenotype Mesotrione प्रतिरोध तंत्र Primisulfuron को phenotype Primisulfuron प्रतिरोध तंत्र
मैकलीन काउंटी प्रतिरोधी एमसीआर प्रतिरोधी चयापचय * प्रतिरोधी चयापचय
एडम्स काउंटी प्रतिरोधी एसीआर Sensitमैंने - प्रतिरोधी ए एल एस 14 में लक्ष्य-साइट उत्परिवर्तन
वेन काउंटी के प्रति संवेदनशील WCS संवेदनशील - संवेदनशील -

* बढ़ाया चयापचय के अलावा अन्य गैर लक्ष्य-साइट प्रतिरोध तंत्र ने भी एमसीआर आबादी 12 में mesotrione प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं।

तालिका 1: इस अध्ययन में इस्तेमाल इलिनोइस से waterhemp आबादी का विवरण।

बरकरार waterhemp पौध में शाक चयापचय की दर का निर्धारण करने के अलावा, एक अलग प्रयोगात्मक दृष्टिकोण विकसित किया गया था और एक excised waterhemp पत्ती परख 12 के साथ ही विभिन्न P450 अवरोधकों (जैसे, tetcyclacis और मेलाथियान) का उपयोग करके चयापचय जांच करने के लिए हमारे पिछले अनुसंधान के क्षेत्र में कार्यरत हैं। इस पद्धति का एक previ से waterhemp के लिए विशेष रूप से अनुकूलित किया गया थाexcised पत्ती परख अभी तक एक dicot संयंत्र में शाक चयापचय अनुसंधान के संचालन के लिए सूचना नहीं किया गया था के बाद से excised मक्का में primisulfuron मिथाइल चयापचय के ous जांच, 15 को छोड़ देता है। organophophosate कीटनाशक मेलाथियान अक्सर इन विवो के लिए इस्तेमाल किया गया है और इन विट्रो शाक-चयापचय अनुसंधान में P450 भागीदारी 16 से संकेत मिलता है। उदाहरण के लिए, सहिष्णुता और मक्का में mesotrione का तेजी से चयापचय मेलाथियान mesotrione 17 को मक्का संवेदनशीलता में वृद्धि हुई जब सत्यापित किया गया था जो P450 उत्प्रेरित अंगूठी hydroxylation, के कारण हैं। इसी तरह, मेलाथियान excised मक्का में ए एल एस अवरोध करनेवाला primisulfuron मिथाइल 15 के पत्तों की चयापचय हिचकते। पौधों में प्रणालीगत, postemergence herbicides के चयापचय का आकलन करते समय excised पत्ती तकनीक का एक प्रमुख लाभ उत्पन्न डेटा पूरे संयंत्र translocation पैटर्न से सम्बंधित है, एक महत्वपूर्ण पहलू पर विचार करने के लिए। नतीजतन, इस विधि मात्रात्मक अनुमति देता है औरगुणात्मक चयापचय एक भी इलाज किया पत्ती 12 पर ध्यान केंद्रित करने का विश्लेषण करती है।

एक वनस्पति क्लोनिंग रणनीति, excised पत्ती प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में, पहले से चयापचय के अध्ययन 12 का संचालन करने के waterhemp में उपयोग किया गया था। कारण waterhemp (अलग नर और मादा पौधों), और डायोसिअस चौलाई प्रजातियों 9 के भीतर आनुवंशिक विविधता की बड़ी डिग्री के outcrossing प्रकृति के कारण, इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से समान waterhemp पौध समय पाठ्यक्रम प्रयोगों के भीतर का विश्लेषण किया गया है कि यह सुनिश्चित किया। यह लेख एक dicot निराना (waterhemp) में शाक चयापचय की दर को मापने के लिए excised पत्ती विधि की उपयोगिता को दर्शाता है। माता-पिता शाक की मात्रा (अवशोषित शाक का 50% नीचा करने के लिए समय का अनुमान लगाने के क्रम में एक साधारण पहली आदेश की अवस्था के साथ फिट किया गया था गैर रेखीय कम से कम वर्गों प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा हर समय बिंदु (चित्रा 1) में निर्धारित किया गया था और शेष डीटी 50)। प्रतिनिधिउलट चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (आरपी-एचपीएलसी) से chromatograms प्रतिरोधी ए एल एस-और एक समय पाठ्यक्रम के अध्ययन के दौरान माता-पिता शाक और ध्रुवीय मेटाबोलाइट (एस) के सहवर्ती गठन के लापता होने का संकेत मिलता है, जो संवेदनशील waterhemp आबादी, (चित्रा के लिए प्रदर्शित कर रहे हैं 2)। हमारे लेख के ध्यान में समान रूप से अंगूठी लेबल (URL- 14 सी) herbicides का उपयोग कर, का वर्णन है और dicot पौधों में शाक चयापचय की सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दरों के निर्धारण के लिए एक वनस्पति क्लोनिंग विधि के साथ संयोजन में excised पत्ती परख की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए है उनके पूरे संयंत्र प्रतिक्रियाओं में मतभेद है कि तीन waterhemp आबादी HPPD- और करने के लिए ए एल एस-बाधा शाक (1 टेबल)।

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Protocol

1. संयंत्र सामग्री, विकास की स्थिति, और वनस्पति क्लोनिंग

नोट: तीन waterhemp आबादी इस शोध में जांच की गई: एमसीआर (एडम्स काउंटी, आईएल से), एसीआर, और WCS (मैकलीन काउंटी, आईएल से) (तालिका 1) (वेन काउंटी, आईएल से)।

  1. लीजिए और 0.1 ग्राम एल -1 अगर में waterhemp बीज निलंबित: अंकुरण को बढ़ाने के लिए कम से कम 30 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पानी के घोल। नोट: कुछ waterhemp आबादी निष्क्रिय कर रहे हैं, लेकिन इस कदम निद्रा को दूर करने और बीज अधिक समान रूप से उगना बनाने के लिए मदद करता है।
  2. ग्रीन हाउस में एक potting मध्यम युक्त 12 x 12 सेमी ट्रे में (तालिका 1) के रूप में प्रत्येक waterhemp आबादी के बीज अंकुरित।
    1. एक 16/8 घंटा फोटो पीरियड 12 के भीतर 28/22 डिग्री सेल्सियस दिन / रात के तापमान में ग्रीन हाउस की स्थिति बनाए रखें।
    2. 500 μmol मीटर की एक न्यूनतम प्रदान करने के लिए पारा halide लैंप से रोशनी के साथ ग्रीन हाउस में प्राकृतिक प्रकाश के पूरक -2 -1 फोटॉन प्रवाह।
  3. वे 80 सेमी ग्रीन हाउस में 3 बर्तन में 2 सेमी लंबे हैं जब प्रत्यारोपण पौध उभरा।
  4. 1: 1: potting के मिश्रण का एक मिश्रण: मिट्टी: पीट: रेत पौध 4 सेमी लंबे हैं जब 950 सेमी एक 3 युक्त 3 बर्तन में प्रत्यारोपण अंकुर। प्रत्येक बर्तन को धीमी गति से जारी उर्वरक कणिकाओं के 5 ग्राम जोड़ें और इस मिट्टी का मिश्रण के साथ मिश्रण।
  5. शिखर प्रभुत्व को समाप्त करने के लिए कट और 7 सेमी लंबा पौधों से तीन सबसे कम उम्र के पत्ते युक्त शूट शिखर meristem हटा दें।
    नोट: यह कदम प्रत्येक संयंत्र क्लोन करने के लिए पर्याप्त 3 सेमी कक्षा गोली मारता बढ़ेगा सुनिश्चित करता है।
  6. पौध (तालिका 1) के रूप में प्रत्येक waterhemp आबादी से लंबा के बारे में 14 सेमी हैं जब आबकारी पांच कक्षा मार (लंबाई में 3 सेमी)। आगे से निपटने पर पानी की कमी को कम करने के लिए इन कक्षा शूटिंग पर पत्तियों का बहुमत निकालें, लेकिन रोपाई पर आगे के विकास की अनुमति देने के लिए दो सबसे कम उम्र के पत्ते बरकरार रहती है।
  7. प्रत्यारोपण कक्षा अंकुरण के लिए इस्तेमाल एक ही माध्यम है जो potting मध्यम, में 80 सेमी 3 बर्तन (बर्तन प्रति एक अंकुर) में गोली मारता है। पोटिंग मध्यम शुरू में संतृप्त विकास कक्ष में जड़ें फार्म तक, उसके बाद जड़ों की स्थापना के लिए 7 दिनों के लिए विकास कक्ष में लगातार नमी और जगह बर्तन बनाए रखने की जानी चाहिए।
    नोट: पौधों इस बिंदु पर बहुत संवेदनशील होते हैं और जोर दिया नहीं किया जाना चाहिए।
    1. एक 16/8 घंटा फोटो पीरियड 12 के भीतर 28/22 डिग्री सेल्सियस दिन / रात के तापमान में वृद्धि कक्ष की स्थिति बनाए रखें।
    2. गरमागरम और फ्लोरोसेंट बल्ब का एक संयोजन विकास कक्ष में प्रकाश प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और कम से कम 550 μmol -2 मीटर संयंत्र चंदवा स्तर पर 12 सेकंड -1 फोटॉन प्रवाह देने चाहिए।
  8. 950 सेमी 3 बर्तन में फिर प्रत्यारोपण (बर्तन प्रति एक अंकुर) ग1: 1: potting के मिश्रण का एक मिश्रण: मिट्टी: पीट: एक 3 ontaining को क्लोन पौधों 4 सेमी लंबे हैं जब रेत फिर वापस ग्रीनहाउस के लिए स्थानांतरण, (भी 5 ग्राम धीमी गति से जारी उर्वरक कणिकाओं शामिल हैं)।
  9. ऊपर वर्णित एक ही विधि का उपयोग कर पौधों को दूसरी बार क्लोन (यानी, दोहराने कदम तो 1.8 1.5, और 2.1 से कदम आगे बढ़ना)। एक ठेठ समय पाठ्यक्रम के अध्ययन के लिए, प्रत्येक waterhemp आबादी से कम से कम छह स्वतंत्र पौधों से क्लोन पैदा करते हैं और लाइनों एमसीआर 1-6, एसीआर 1-6 और WCS 1-6 के रूप में उन्हें रिकॉर्ड।
    1. प्रयोग को दोहराने और पर्याप्त रूप से प्रत्येक waterhemp आबादी के भीतर आनुवंशिक परिवर्तनशीलता का प्रतिनिधित्व करने के लिए कम से कम छह अलग "माता-पिता" प्रतिरूप लाइनों की स्थापना।
    2. विश्लेषण किया जाएगा कि कितने समय बिंदुओं के आधार पर, एक समय पाठ्यक्रम अध्ययन का संचालन करने के लिए प्रत्येक "माता-पिता" प्रतिरूप लाइन से पर्याप्त उप क्लोन उत्पन्न करते हैं।

2. excised Waterhem साथ एक चयापचय अध्ययन का आयोजनपी पत्तियां

  1. क्लोन किया waterhemp पौधों शाक चयापचय और डीटी 50 विश्लेषण के लिए लंबा 10 से 12 सेमी कर रहे हैं, तीसरे सबसे कम उम्र के पत्ते (संलग्न डंठल की 0.5 सेमी शामिल लंबाई में 2 से 3 सेमी) आबकारी।
  2. प्रत्येक waterhemp संयंत्र से कट पत्ता डंठल एक दूसरी बार पानी के नीचे (डंठल के 0.3 सेमी बनी हुई है कि यह सुनिश्चित करने के लिए), और इन कटौती 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक शीशियों (शीशी प्रति एक पत्ती) 15 में समाप्त हो जाती है जगह है।
    नोट: पानी के नीचे एक दूसरे समय काटने के गठन और जाइलम वाहिकाओं plugging से हवा के बुलबुले से बचाता है।
    1. सबसे पहले, आंशिक रूप से 1 घंटे के लिए 0.1 एम Tris एचसीएल (पीएच 6) के पूर्व ऊष्मायन बफर (200 μl) में कटौती डंठल के साथ excised पत्तियों को विसर्जित कर दिया।
    2. दूसरे, एक नया 1.5 मिलीलीटर शीशी 0.1 एम Tris एचसीएल (पीएच 6) के साथ साथ 150 माइक्रोन [URL- 14 सी] शाक की (200 μl) एक ऊष्मायन बफर युक्त करने के लिए प्रत्येक पत्ती ले जाते हैं, और करने के लिए 1 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते पत्तियों में शाक अवशोषण के लिए अनुमति देते हैं।
      नोट: दोनों 14 सी-mesotrione और -1। जाइलम स्वेद धारा के माध्यम से दोनों प्रसार और तेज पत्ता प्रति हाथ में लिया शाक की राशि के लिए योगदान करते हैं।
      नोट: शाक चयापचय पर चयापचय अवरोधकों के प्रभाव कदम 2.2.1 और बाद के संस्करण 2.2.2 संशोधित करके निर्धारित किया जा सकता है। पूर्व ऊष्मायन बफर करने के लिए अवरोध करनेवाला के 100 माइक्रोन जोड़ें और फिर शाक के साथ ऊष्मायन बफर को हस्तांतरण और फिर से 100 माइक्रोन के अवरोध करनेवाला जोड़ने के लिए, 2 घंटे के लिए सेते हैं। उदाहरण के लिए, मेलाथियान और tetcyclacis पौधों 15-17 में कुछ साइटोक्रोम P450 गतिविधियों को रोकती हैं।
    3. विआयनीकृत पानी के साथ excised पत्तियों का डूबे भाग को धो लें और एक चौथाई ताकत Murashige और Skoog (एमएस) लवण समाधान (500 μl) क्रमश: 0 घंटा, 5 घंटा, 11 घंटे, 23 घंटे, या 35 घंटे के लिए करने के लिए excised पत्ते हस्तांतरण, समय पाठ्यक्रम चयापचय के अध्ययन के लिए विकास कक्ष में।
  3. छुट्टी को हटाने के द्वारा हार्वेस्टमैन्युअल ऊष्मायन उचित समय बिंदु पर समाधान और से एक polypropylene ट्यूब (15 एमएल) और कांच मूसल का उपयोग तरल नाइट्रोजन में प्रत्येक पत्ता ऊतक पीस।
  4. Radiolabeled शाक और ऊपर के रूप में एक ही polypropylene ट्यूब में एक प्रयोगशाला ऊतक homogenizer के साथ 90% एसीटोन के 7 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक पत्ती से इसके चयापचयों निकालें। 90% एसीटोन का एक अतिरिक्त 7 मिलीलीटर के साथ ऊतक homogenizer कुल्ला, और ऊतकों को अच्छी तरह से (आमतौर पर के बारे में 2 मिनट) चूर्णित है जब तक homogenize जारी है। नोट: 90% एसीटोन संयंत्र के ऊतकों से सबसे शाक की निकासी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि से अवशोषित radiolabeled यौगिकों के 90% से अधिक निकालने में असमर्थ है हालांकि, अगर, तो 90% मेथनॉल या 90% acetonitrile निष्कर्षण विलायक के रूप में प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
  5. अतिरिक्त निकासी होने के लिए लेबल 90% एसीटोन अर्क (14 मिलीलीटर कुल) और दुकान पर -4 16 घंटे के लिए सी अनुमति देने के लिए °।
    नोट: इलाज किया पत्तों की इस निकासी के बाद, निष्कर्षण रेड की राशिioactivity इलाज किया पत्ती द्वारा अवशोषित radiolabeled यौगिकों के कम से कम 98% आम तौर पर है। Excised पत्तियों में गैर-निष्कर्षण रेडियोधर्मिता (बाध्य अवशेषों) हमारे पिछले अध्ययन के 12 में हर समय अंक भर में केवल 0.3% औसत है, लेकिन इस राशि की जांच के लिए इस्तेमाल किया शाक और समय बिंदु के अनुसार अलग-अलग हो सकते हैं।
  6. 0.5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा तक अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 5000 XG पर नमूने और एक रोटरी बाष्पीकरण के साथ 40 डिग्री सेल्सियस पर ध्यान केंद्रित supernatants प्राप्त की है। एक 2.0 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब को यह मात्रा स्थानांतरण।
  7. संयंत्र के अंतिम मात्रा 1.25 मिलीग्राम के अर्क को समायोजित करने और फिर से सेंट्रीफ्यूज 10,000 XG पर 10 मिनट के लिए किसी भी विविक्त को दूर करने के लिए: (मात्रा से 1, 1) पानी: acetonitrile जोड़ें।
  8. (DPM μl -1) तरल जगमगाहट स्पेक्ट्रोस्कोपी (LSS) 12 से प्रत्येक नमूने से लिया एक विभाज्य में कुल रेडियोधर्मिता मापने के लिए और की मात्रा को सामान्य (उदाहरण के लिए एचपीएलसी विश्लेषण के लिए इंजेक्शन यौगिकों, 10,00 [14 सी लेबल]परिणाम रेखांकन जब 0 कुल DPM / नमूना / रन) तो Y-कुल्हाड़ियों नमूनों के बीच एक समान हो जाएगा।

Excised पत्तियां में herbicide चयापचय 3. HPLC विश्लेषण

नोट: निम्न आरपी-एचपीएलसी की स्थिति में 12 का उपयोग करते हुए माता-पिता शाक और शाक चयापचयों में कुल निष्कर्षण रेडियोधर्मिता का समाधान करें।

  1. 1 मिलीलीटर मिनट के प्रवाह की दर पर एक सी 18 कॉलम (4.6 x 250 मिमी, विश्लेषणात्मक एचपीएलसी के लिए 5 माइक्रोन कण आकार के) के साथ आरपी-एचपीएलसी प्रदर्शन करना -1 सबसे गैर-ध्रुवीय herbicides के लिए।
    नोट: सी 4 या सी 12 आरपी-एचपीएलसी कॉलम भी इसके चयापचयों से माता-पिता शाक की जुदाई अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक पूर्व स्तंभ फिल्टर और / या गार्ड स्तंभ भी रक्षा और आरपी स्तंभ के जीवन का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. Eluent ए, पानी में 0.1% फार्मिक एसिड (वी / वी), और eluent बी 100% एचपीएलसी ग्रेड acetonitrile: आरपी-एचपीएलसी निम्नलिखित मोबाइल चरण का प्रयोग करें।
      नोट: एचपीएलसी ग्रेड मेथनॉल भी एल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकताuent अधिक ध्रुवीय यौगिकों और चयापचयों को हल करने के लिए बी, लेकिन प्रतिधारण समय भी बदल सकता है कि बारे में पता होना।
      नोट: हमारे अनुसंधान 12 में अपने ध्रुवीय चयापचयों से mesotrione या primisulfuron मिथाइल को हल करने के लिए इस्तेमाल क्षालन प्रोफ़ाइल है: चरण 1, एक: बी (4: 1, वी / वी): बी (3: एक करने के लिए 2, वी / वी ) एक रेखीय ढाल में (12 मिनट); बी: एक करने के लिए: (2, वी / वी 3): चरण 2, ए बी (3: 7, वी / वी) एक रेखीय ढाल में (5 मिनट); चरण 3, एक: बी: एक करने के लिए: (7, वी / वी 3) बी: 2 मिनट के लिए एक रेखीय ढाल में (1 9 वी / वी) (19 मिनट की कुल शामिल)।
      नोट: ढ़ाल और isocratic कदम संकल्प का अनुकूलन करने के क्रम में माता पिता की सामग्री के भौतिक गुणों के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    2. बी (4: 1, वी / वी) एक रेखीय ढाल में (3 मिनट) और एक: एक करने के लिए: (9, वी / वी 1) बी: एक साथ ऊपर रैखिक ढाल चरणों का पालन बी (4: 1, वी / वी) में कम से कम 2 मिनट के लिए isocratic कदम () अगले निकालने 12 इंजेक्शन लगाने से पहले आरपी स्तंभ को फिर से संतुलित करने के लिए।
  2. का पता लगाने और एक प्रवाह Scinti साथ radiolabeled यौगिकों कल्पनाllation विश्लेषक। प्रत्येक नमूने में कुल रेडियोधर्मिता का एक प्रतिशत के रूप में प्रत्येक नमूने में शेष माता पिता शाक की राशि रिकॉर्ड (पता लगाया है और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रवाह जगमगाहट विश्लेषक द्वारा मात्रा) समय के पाठ्यक्रम के दौरान प्रत्येक waterhemp आबादी में शाक चयापचय की दर निर्धारित करने के लिए।

4. सांख्यिकीय प्रक्रियाओं

  1. एक पूरी तरह बेतरतीब डिजाइन (या सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अन्य उपयुक्त व्यवस्था) में उपचार की व्यवस्था।
  2. एक प्रयोग के लिए तीन जैविक प्रतिकृति के शामिल प्रत्येक उपचार के साथ दो स्वतंत्र प्रयोगों प्रदर्शन करना। दो स्वतंत्र प्रयोगों में कुल छह जैविक प्रतिकृति शामिल हैं। प्रयोग प्रभाव (α = 0.05) गैर-महत्वपूर्ण है, तो प्रत्येक स्वतंत्र प्रयोग से डेटा गठबंधन और विश्लेषण। प्रयोग के प्रभाव महत्वपूर्ण है, तो फिर अलग से एक प्रयोग के विश्लेषण।
    नोट: पहले तीन जैविक प्रतिकृति शामिल मैं: 1 प्रयोग और प्रयोग 2 में अगले तीन जैविक प्रतिकृति प्रत्येक जैविक को दोहराने (एमसीआर 1-6, एसीआर 1-6, और WCS 1-6) प्रत्येक जनसंख्या से निकाली गई प्रतिरूप लाइन इतनी है कि एक विशिष्ट "माता-पिता" का प्रतिनिधित्व प्रत्येक समय- पाठ्यक्रम विश्लेषण आनुवंशिक रूप से समान पौधों का इस्तेमाल करता है। दो स्वतंत्र प्रयोगों प्रत्येक waterhemp आबादी के लिए एक मंझला डीटी 50 के आनुवंशिक परिवर्तनशीलता और दृढ़ संकल्प के पर्याप्त प्रतिनिधित्व के लिए अनुमति देता है जो कुल में छह जैविक प्रतिकृति, शामिल हैं।
  3. गैर रेखीय कम से कम वर्गों प्रतिगमन विश्लेषण के साथ डेटा का विश्लेषण और डीटी 50 S अनुमान लगाने के क्रम में एक साधारण पहली आदेश की अवस्था के साथ उन्हें फिट। नीचे समीकरण मॉडल का वर्णन करता है:
    1 समीकरण
  4. जहां इस मॉडल y में समय टी में शेष माता पिता शाक का प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है, μ मैं प्रत्येक के लिए डीटी 50 हैwaterhemp आबादी मैं और पैरामीटर सी 0 = 0 टी 12 में माता-पिता शाक वर्तमान की अनुमानित राशि है।

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Representative Results

Mesotrione चयापचय की दर में भारी अंतर WCS या एसीआर और एमसीआर (चित्रा 1) या तो बीच पाया गया। हर समय बिंदु पर, एमसीआर अधिक तेजी से पिछले पूरे संयंत्र प्ररूपी प्रतिक्रियाएं 11 के साथ संबद्ध है, जो दो mesotrione के प्रति संवेदनशील आबादी, WCS और एसीआर, से mesotrione metabolized था। प्रत्येक आबादी में से एक भी माता पिता का संयंत्र से पर्याप्त पौधों क्लोनिंग करके, शाक चयापचय समय पाठ्यक्रम विश्लेषण की वजह से हर बार पाठ्यक्रम 12 के भीतर आनुवंशिक परिवर्तनशीलता की कमी के कारण वर्दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, प्रतिरूप लाइन 5 से 12 में mesotrione चयापचय के लिए समय बेशक चित्र 1 में दिखाया जाता है। छह अलग प्रतिरूप लाइनों की कुल छह व्यक्ति के माता पिता के पौधों से प्राप्त, प्रत्येक आबादी (तालिका 1) से विश्लेषण किया गया एक समग्र मंझला डीटी निर्धारित करने के लिए एमसीआर में है कि mesotrione चयापचय जो संकेत 50 मूल्य, काफी तेज था ( 12 से एक छोटी डीटी 50 मूल्य) था। इसके अतिरिक्त, excised के पत्तों के साथ हमारे पिछले अध्ययन P450 अवरोधकों काफी एसीआर में एमसीआर और मक्का में mesotrione चयापचय में कमी आई है, लेकिन नहीं पता चला है कि, और एमसीआर में पता चला प्रमुख प्रारंभिक मेटाबोलाइट का संकेत है, 4-हाइड्रोक्सी mesotrione के रूप में पहचान की थी कि P450- की बढ़ी दरों मध्यस्थता चयापचय एमसीआर 12 में प्रतिरोध के साथ जुड़े रहे हैं।

एमसीआर में mesotrione प्रतिरोध के लिए तंत्र के अध्ययन के अलावा, एक संबंधित उद्देश्य एमसीआर में ए एल एस अवरोधकों के प्रतिरोध के लिए तंत्र निर्धारित करने के लिए किया गया था। पूर्व अनुसंधान एमसीआर से ली गई एक उप जनसंख्या ए एल एस प्रतिरोधी था, लेकिन एक गैर लक्ष्य ठहरते आधारित तंत्र 13 का संकेत है, ए एल एस लक्ष्य साइट जीन में उत्परिवर्तन के अधिकारी नहीं था कि प्रदर्शन किया। इस वजह से एक कम से संवेदनशील ए एल एस एंजाइम 14 प्रदान करता है कि एक लक्ष्य साइट उत्परिवर्तन के ए एल एस प्रतिरोधी है जो एसीआर, साथ विपरीत है। टीईएस करने के लिएटी इस परिकल्पना, excised पत्ती परख [URL- 14 सी] primisulfuron मिथाइल, सुल्फोनीलयूरिया परिवार का एक ए एल एस-बाधा शाक के साथ आयोजित किया गया। एक प्रतिनिधि एचपीएलसी वर्णलेख में 14 सी-primisulfuron मिथाइल के शिखर क्षेत्र (लगभग 21.6 मिनट की अवधारण समय) 12 Hat (चित्रा 2) पर एसीआर और WCS में से एमसीआर में काफी छोटा था। इसके अतिरिक्त, primisulfuron मिथाइल की तुलना में कम प्रतिधारण समय के साथ दो ध्रुवीय चयापचयों सभी तीन आबादी (चित्रा 2) से excised पत्ती निष्कर्षों में पाया गया। इन दो ध्रुवीय चयापचयों के ढांचे को इस अध्ययन में निर्धारित नहीं किया गया है, उनके तेजी से गठन ग्लूकोज विकार 5 (द्वितीय चरण चयापचय) द्वारा पीछा primisulfuron मिथाइल 8 (चरण मैं चयापचय) की अंगूठी hydroxylation के अनुरूप है।

एमसीआर, एसीआर, और WCS में primisulfuron चयापचय के गुणात्मक विश्लेषण के साथ संयोजन में (चित्रा 2), राशिहर समय बिंदु पर शेष माता-पिता का शाक मात्रा निर्धारित और एमसीआर (13.6 घंटा), एसीआर (> 24 घंटे) में primisulfuron मिथाइल के लिए डीटी 50 मूल्यों का निर्धारण किया गया था, और WCS (> 24 घंटा) (चित्रा 3)। एमसीआर में काफी कम डीटी 50 मूल्य पिछले पूरे संयंत्र अनुसंधान 13 के साथ समझौते में इस आबादी में ए एल एस प्रतिरोध के लिए प्रमुख तंत्र के रूप में वृद्धि की चयापचय के अनुरूप है। एमसीआर और एसीआर दोनों ए एल एस-अवरोध करनेवाला प्रतिरोधी phenotypes (तालिका 1) प्रदर्शित करने के बावजूद दिलचस्प है, हालांकि, एसीआर और WCS में primisulfuron के लिए डीटी 50 मूल्यों, काफी लंबे समय तक एमसीआर (चित्रा 3) की तुलना में अभी तक इसी तरह के हैं। एसीआर इसकी मुख्य प्रतिरोध तंत्र 14 के रूप में एक कम-संवेदनशील ए एल एस एंजाइम है, क्योंकि यह तेजी से primisulfuron metabolize करने के लिए आवश्यक नहीं है, क्योंकि एसीआर में अपेक्षाकृत लंबे डीटी 50 संभवतः है। सारांश में, हमारे शोध में उपयोग excised waterhemp पत्ती परख मूल्यवान योग्यता के रूप में सामने आएlitative और मात्रात्मक डेटा और एमसीआर, एसीआर, और WCS में दो अलग-अलग शाक की ओर चयापचय आधारित प्रतिरोध तंत्र में नए अंतर्दृष्टि प्रदान की है।

चित्र 1
चित्रा 1:। Excised waterhemp में mesotrione चयापचय के समय पाठ्यक्रम वनस्पति की तरह क्लोन किया आबादी से छोड़ देता Excised पत्तियों (तीसरे सबसे कम उम्र का पत्ता, लंबाई में 2 से 3 सेमी) waterhemp पौध (10 सेमी से 12) से वनस्पति की तरह क्लोन किया गया हर बार पाठ्यक्रम इतना है कि प्रत्येक पंक्ति के लिए अध्ययन आनुवंशिक रूप से समान पौधों के शामिल। Excised पत्तियों ('पल्स') 1 घंटे के लिए 0.1 एम Tris एचसीएल (पीएच 6) के साथ साथ 150 माइक्रोन radiolabeled mesotrione द्वारा पीछा किया, 1 घंटे के लिए 0.1 एम Tris एचसीएल बफर (पीएच 6) में रखा गया था, उसके बाद क्वार्टर ताकत Murashige और Skoog (एमएस) लवण समाधान 0 घंटा, 5 घंटा, 11 घंटे, 23 घंटे और 35 घंटे के लिए ('चेस') चयापचय घटित करने के लिए अनुमति देने के लिए। दाएसीआर और WCS प्रतिरूप लाइनों mesotrione metabolized जबकि टा, गैर रेखीय कम से कम वर्गों प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया है और 12 व्याप्ति एमसीआर प्रतिरूप लाइन तेजी से mesotrione metabolized प्रत्येक क्लोन किया waterhemp आबादी के लिए अलग से एक डीटी 50 अनुमान लगाने के लिए एक सरल पहले के आदेश की अवस्था के साथ फिट किया गया था और धीरे। दिखाया गया डेटा (प्लांट जीव के अमेरिकन सोसायटी द्वारा कॉपीराइट) हमारे पिछले पेपर 12 से संशोधित किया गया है, जो प्रत्येक waterhemp आबादी के लिए केवल प्रतिरूप लाइन 5 से समय पाठ्यक्रम हैं।

चित्र 2
चित्रा 2:। एमसीआर, एसीआर, और WCS (12 टोपी) में Primisulfuron मिथाइल चयापचय प्रतिनिधि उलट चरण एचपीएलसी chromatograms 150 माइक्रोन (प्रोटोकॉल में वर्णित) radiolabeled primisulfuron मिथाइल से साथ आपूर्ति excised waterhemp पत्ता अर्क (12 टोपी) के लिए मैकलीन काउंटी (एमसीआर, ए), एडम्स काउंटी (एसीआर, बी), एकएन डी वेन काउंटी शाक-संवेदनशील (WCS, सी) आबादी (1 टेबल)। एक प्रामाणिक विश्लेषणात्मक मानक के साथ तुलना द्वारा निर्धारित रूप में 21.6 मिनट की एक अवधारण समय के साथ रेडियोधर्मी शिखर, primisulfuron मिथाइल शामिल हैं। कम प्रतिधारण समय के साथ चोटियों ऐसे हाइड्रोक्सी primisulfuron मिथाइल 8 या hydroxylated चयापचयों 5,6 के ग्लाइकोसिलेटेड रूपों के रूप में primisulfuron मिथाइल की संभावना ध्रुवीय, कम phytotoxic चयापचयों, कर रहे हैं। एमसीआर आबादी एमसीआर के लिए एक कम डीटी 50 (चित्रा 3) के रूप में मात्रा निर्धारित है जो एसीआर और WCS, माता पिता primisulfuron मिथाइल रिश्तेदार की राशि में एक महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Excised waterhemp पत्तियों में Excised waterhemp पत्ते primisulfuron मिथाइल चयापचय के समय कोर्स (thirडी-सबसे कम उम्र के पत्ते; चित्रा 1 और mesotrione 12 के साथ हमारे पिछले अनुसंधान के रूप में वर्णित 'पल्स' और पत्तियों 0 घंटे के लिए एमएस लवण समाधान ('चेस') में incubated रहे थे कि के रूप में 150 माइक्रोन radiolabeled primisulfuron शामिल किया गया था सिवाय 2) 3 सेमी करने के लिए, इलाज किया गया , 3 घंटा, और 11 घंटा। Mesotrione चयापचय (चित्रा 1) 12 के लिए पहले से वर्णित के रूप में डेटा गैर रेखीय कम से कम वर्गों प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया गया। एसीआर और WCS अधिक धीरे (डीटी 50> 24 घंटे) primisulfuron मिथाइल metabolized जबकि एमसीआर आबादी तेजी से, primisulfuron मिथाइल (डीटी 50 = 13.6 घंटा) metabolized।

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Discussion

यहाँ बताया excised की पत्ती विधि मक्का 15 के पत्तों में primisulfuron चयापचय शोध में पहले से इस्तेमाल किया गया है, लेकिन हमारे परिणाम इस प्रोटोकॉल भी एक dicot खरपतवार प्रजातियों 12 में शाक चयापचय को मापने के लिए, प्रभावी सही है, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि प्रदर्शित करता है। पूरे संयंत्र पढ़ाई के साथ तुलना excised पत्ती तकनीक का एक प्रमुख लाभ एक excised पत्ता पूरे संयंत्र translocation postemergence के पैटर्न, प्रणालीगत शाक या पौधों या आबादी के बीच शाक तेज में मतभेद की स्वतंत्र है। Excised पत्ती assays ग्रीनहाउस परिस्थितियों में विकसित पूरे पौधों का अध्ययन करने के साथ तुलना में एक ट्यूब में रखा एक भी पत्ता, साथ, एक विकास कक्ष में आयोजित की जाती हैं, क्योंकि इसके अलावा, पर्यावरण परिवर्तनशीलता कम हो जाता है। एक वनस्पति क्लोनिंग रणनीति भी भीतर आनुवंशिक विचरण की बड़ी डिग्री और कम से कम होने की एमसीआर 12 में mesotrione-प्रतिरोध तंत्र के अध्ययन के लिए हमारे विधि में शामिल किया गया थाबीच चौलाई आबादी 9। पतला चौलाई आबादी के भीतर आनुवंशिक विविधता postemergence शाक 18 के कई परिवारों के लिए पूरे संयंत्र प्रतिक्रियाओं में दस्तावेज परिवर्तनशीलता की राशि से यह साफ है। सटीक डीटी 50 एस निर्धारित करने के लिए समय पाठ्यक्रम के अध्ययन का आयोजन करते हैं और महत्वपूर्ण अंतर का पता लगाने के लिए waterhemp आबादी 12 के बीच डीटी 50 मूल्यों की तुलना करते समय, इन चरणों (हमारे excised पत्ती और वनस्पति क्लोनिंग प्रोटोकॉल में उल्लिखित के रूप में) को नष्ट करने या आनुवांशिक और पर्यावरणीय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण हैं परिवर्तनशीलता।

अलग तंत्र शाक प्रतिरोध 1,2 प्रदान करने के लिए पौधों में मौजूद हैं। उदाहरण के लिए, ए एल एस-बाधा herbicides के लिए waterhemp प्रतिरोध लक्ष्य-साइट हो सकता है 14 के आधार पर या 13 गैर लक्ष्य ठहरते आधारित है। Primisulfuron मिथाइल (चित्रा 3) की चयापचय दर स्पष्ट रूप से दो ए एल एस-प्रतिरोधी waterh के बीच इन मतभेदों को दिखानेईएमपी आबादी, एमसीआर और एसीआर (1 टेबल)। पीसीआर प्रवर्धन और शाक लक्ष्य-साइट जीन के अनुक्रम विश्लेषण के साथ संयोजन में, excised पत्ती परख बहुत waterhemp या अन्य dicot मातम में शाक प्रतिरोध लक्ष्य साइट या गैर लक्ष्य-साइट तंत्र 2 द्वारा प्रदत्त है कि क्या पहचान करने की दिशा में मदद करेंगे।

सेलुलर या उप सेलुलर ज़ब्ती तंत्र मातम है कि 2 में गैर लक्ष्य ठहरते आधारित प्रतिरोध प्रदान मौजूद अगर हमारे excised पत्ती विधि की सीमाओं कल्पना या पूरे संयंत्र भर शाक translocation पैटर्न को मापने के लिए, या निर्धारित करने के लिए असमर्थता शामिल हैं। जैसा कि पहले उल्लेख किया है, इस पहलू को भी mesotrione प्रतिरोधी खरपतवार आबादी 12 में सटीक शाक चयापचय दरों का निर्धारण करते समय एक फायदा माना जाता था, लेकिन पौधों में काफी metabolized नहीं कर रहे हैं कि प्रणालीगत शाक का अध्ययन करते समय विपरीत (यानी, गैर चयनात्मक जड़ी बूटी एक खामी माना जा सकता हैicides) ऐसे paraquat या glufosinate 19 के रूप में प्राकृतिक खरपतवार आबादी, में गैर चयनात्मक हैं कि ग्लाइफोसेट 2, या संपर्क herbicides के रूप में इस तरह के। शाक चयापचय के लक्ष्य-साइट तंत्र शुरू में खुलासा नहीं कर रहे हैं हालांकि, अगर उसके बाद बढ़ी दरों को आम तौर पर विशेष रूप से जब इस तरह के mesotrione रूप में 12 ह्प्प्द बाधा herbicides के लिए खरपतवार प्रतिरोध का अध्ययन, अगले 1,4 जांच कर रहे हैं, इस तरह के primisulfuron मिथाइल के रूप में 13 ए एल एस-बाधा herbicides , इस तरह के atrazine 1,12, या के रूप में द्वितीय Photosystem बाधा शाक शाक 4 एसिटाइल सीओए बाधा।

P450s एमसीआर 12,13 में ए एल एस एक Echinochloa आबादी 20 में प्रतिरोध, एक पतला घास की प्रजातियों, साथ ही साथ mesotrione और ए एल एस प्रतिरोध के साथ संबद्ध किया गया है। Waterhemp से संबंधित एक डायोसिअस, dicot घास, पामर चौलाई (ए palmeri), कई अलग तंत्र 1- के माध्यम से भी विकासशील शाक प्रतिरोध की संभावना हैअधिक शाक प्रतिरोधी खरपतवार आबादी और प्रजातियों दुनिया भर में 3 प्रलेखित रहे हैं के रूप में 3।, तेजी से एक संभावित प्रतिरोध तंत्र के रूप में शाक चयापचय की जांच के लिए की जरूरत को बढ़ाने के लिए जारी रहेगा। अलग लेकिन आम तौर पर शाक प्रतिरोध तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल पूरे संयंत्र के अध्ययन से संबंधित है जो excised पत्ती दृष्टिकोण, मूल्यांकन और पौधों में शाक चयापचय यों के लिए एक सटीक और महत्वपूर्ण उपकरण है। नतीजतन, क्षमता बहुत दोनों घास 4 और dicot 12 मातम में गैर लक्ष्य-साइट प्रतिरोध तंत्र का निर्धारण करने में शोधकर्ताओं की सहायता करेंगे excised पत्ती परख सहित सटीक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने के तरीकों के साथ इन विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए।

इस विधि का भविष्य आवेदन भी ऐसे सोयाबीन और कपास के रूप में dicot फसलों में शाक चयापचय की दर का निर्धारण शामिल हो सकते हैं। शाक-सहिष्णु सोयाबीन किस्मों के साथ हमारी प्रयोगशाला में चल रहे शोध भी excised एल उपयोग किया गया हैईएएफ दृष्टिकोण। हालांकि, सोयाबीन तिपतिया पत्तियों के साथ एक फली फसल रहे हैं के बाद से, एक 'excised डंठल' तकनीक अनुकूलित किया गया है और प्रत्येक trifoliolate पत्ती मुख्य डंठल (स्केलटन, Lygin, और Riechers, अप्रकाशित डेटा) के माध्यम से तेज के माध्यम से radiolabeled शाक को अवशोषित कर सकते हैं ताकि विकसित की है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich A1296 for pre-germinating seeds
Potting medium Sun Gro Horticulture 49040233 for plant growth
Nutricote Agrivert  TOTAL BLEND 13-13-13 T100 slow-release fertilizer
Growth chamber E15 Controlled Environments Limited 20207 plant culturing
Tris base Fisher Scientific BP152-500 buffer for excised leaves
HCl (concentrated) Fisher Scientific A144500 adjust pH of buffer
Murashige and Skoog (MS) salts  Sigma-Aldrich M0404 incubation of excised leaves
Methanol Fisher Scientific A452-4 leaf washes after incubation
Acetone Sigma-Aldrich 179124 plant extractions
Acetonitrile (HPLC grade) Macron Fine Chemicals MKH07610 HPLC mobile phase
Formic acid  Mallinckrodt Analytical MK259205 acidify mobile phase pH
Micro-centrifuge Eppendorf 5417R 1.5 or 2.0 ml tubes
Centrifuge (temperature controlled) Eppendorf 5810R 15 or 50 ml tubes
Polypropylene centrifuge tube Corning Inc. 430790 15 ml, sterile
Rotary evaporator BÜCHI R200 concentrate plant samples
Liquid scintillation spectrometry (LSS) Packard Instruments 104470 quantify 14C
High-performance liquid chromatography Perkin Elmer N2910401 resolve herbicide metabolites
Flow scintillation analyzer  LabLogic System 1103303 for HPLC analysis of 14C
Hypersil Gold C18 column  Thermo-Scientific 03-050-522  reversed phase
Ultima-Flo M cocktail Perkin Elmer 6013579 for Flow-scintillation analyzer
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) Fisher Scientific SX18 for LSS; biodegradable
Laboratory homogenizer Kinematica CH-6010  homogenize leaf samples

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 103 शाक चयापचय xenobiotic विषहरण साइटोक्रोम P450 glutathione आधा जीवन विश्लेषण acetolactate सिन्थेज़ अवरोध triketone शाक संयंत्र जैव रसायन, शाक गिरावट उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी
एक excised पत्ता परख के साथ dicot मातम में शाक चयापचय की दर को मापने
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Ma, R., Skelton, J. J., Riechers, D. … More

Ma, R., Skelton, J. J., Riechers, D. E. Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay. J. Vis. Exp. (103), e53236, doi:10.3791/53236 (2015).

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