Introduction
مقاومة مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة يشكل تهديدا خطيرا للإنتاج العالمي من المواد الغذائية والألياف 1،2. حاليا، الآلاف من السكان مقاومة وbiotypes من أكثر من مائة أنواع الأعشاب في جميع أنحاء العالم وقد تم توثيق ودراسة 3. آلية الكبرى التي تمنح مقاومة مبيدات الأعشاب في النباتات هي تغيير مبيدات الأعشاب الجينات والبروتينات الموقع المستهدف، بما في ذلك الطفرات الوراثية التي تؤثر على حركية ملزمة مبيدات الأعشاب البروتين أو التضخيم من الجينات الموقع المستهدف 2. إزالة السموم الأيضية عبر الأنشطة مرتفعة من أكسيجيناز أحادية السيتوكروم P450 (P450) أو الجلوتاثيون S -transferase (GST) الإنزيمات هو آلية أخرى الذي يمنح مقاومة مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة، والذي يختلف بعدة طرق من الآليات القائمة على الموقع المستهدف-2. المقاومة القائم على التمثيل الغذائي لها تداعيات كبيرة على ما إذا كانت تكاليف اللياقة البدنية النبات (ويعرف أيضا باسم عقوبات اللياقة البدنية) قد تنجم عن mechanis مبيدات الأعشاب المقاومةم، وكذلك بشأن احتمال وجود آلية إزالة السموم واحدة للتشاور المقاومة العابرة أو متعددة مبيدات الأعشاب في السكان الاعشاب 1،2،4. عموما، يمكن تقسيم عملية التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في النباتات إلى ثلاث مراحل متميزة 5. وتشمل المرحلة الأولى تحويل مبيدات الأعشاب أو تفعيل مثل الهيدروكسيل P450 بوساطة من الحلقات العطرية أو مجموعات الألكيل، أو N - أو ردود فعل dealkylation O-، مما يؤدي إلى زيادة الاستقطاب ومبيدات الأعشاب الجزئي إزالة السموم 5،6. أدخلت حديثا المجموعات الوظيفية في المرحلة الأولى يمكن أن توفر مواقع الربط لاقتران إلى انخفاض الجلوتاثيون التي كتبها GSTs أو إلى جلوكوز عن طريق glycosyltransferases UDP التي تعتمد في المرحلة الثانية 5،7. على سبيل المثال، والأيض الأولي الرئيسي للprimisulfuron-الميثيل في الذرة هو هيدروكسي primisulfuron ميثيل 8، والتي يمكن استقلاب أيضا على هيدروكسي primisulfuron-جلوكوسيدي (المرحلة الثانية) ومن ثم نقلها إلى فجوة للتخزين طويل الأجل أو زيادة الأيض المؤيدcessing 5،6 (المرحلة الثالثة).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) هي التي يصعب السيطرة عليها، dicot الأنواع السنوية الاعشاب التي تعيق إنتاج الذرة (ذرة شامية) وفول الصويا (جليكاين ماكس)، والقطن (الكرسف أزغب) في الولايات المتحدة. ومما يسهل على درجة عالية من التنوع الجيني للwaterhemp التي لها البيولوجيا ثنائي الجنس والمسافات الطويلة تلقيح الرياح، ومحطة waterhemp أنثى واحدة يمكن أن تنتج ما يصل إلى مليون البذور 9. هذه البذور صغيرة وتنتشر بسهولة، والتي تمنح بشكل طبيعي waterhemp مع آلية تشتت فعالة. Waterhemp يعرض إنبات مستمرة طوال موسم النمو 9، وبذوره قادرة على الإنبات بعد عدة سنوات من السكون. Waterhemp هو نبات C 4 التي تمتلك معدل نمو أعلى من معظم الأعشاب ذات الأوراق العريضة في النظم الزراعية الصالحة للزراعة 10. بالإضافة إلى ذلك، العديد من السكان waterhemp مقاومة لفام متعددةilies مبيدات الأعشاب 3.
عدد سكانها waterhemp (المعين MCR) عن ولاية إلينوي مقاوم لل4-هيدروكسي-فينيل بيروفات دي أكسيجيناز (HPPD) -inhibiting مبيدات الأعشاب 11، مثل mesotrione، فضلا عن الأترازين وسينسيز acetolactate (ALS) -inhibiting مبيدات الأعشاب، بما في ذلك primisulfuron ميثيل ، نظرا لعدم استهداف الموقع الآليات القائمة 12،13. عدد السكان مختلفة من waterhemp المعينة ACR 14، وهو primisulfuron مقاومة للالميثيل (بسبب طفرة في جين ALS)، ولكن حساسية لmesotrione مقاومة للالأترازين، ويبلغ عدد سكانها waterhemp المعينة WCS 14 التي تعتبر حساسة لprimisulfuron ميثيل، استخدمت mesotrione، والأترازين بالمقارنة مع MCR في بحث سابق لدينا 12 والتجارب الحالية (ملخصة في الجدول 1). لم الدراسات الأولية لم يكشف تغييرات في مستويات التسلسل الجيني HPPD أو التعبير، أو انخفاض امتصاص mesotrione، في MCRالسكان بالمقارنة مع السكان الحساسة mesotrione 12. ومع ذلك، دراسات التمثيل الغذائي مع النباتات الكاملة أظهروا مستويات أقل بكثير من mesotrione الأم مبيدات الأعشاب في MCR مقارنة مع ACR وWCS، التي ترتبط مع ردود المظهري السابقة لmesotrione 11،12.
| Waterhemp السكان | الاختصار | النمط الظاهري لMesotrione | آلية Mesotrione المقاومة | النمط الظاهري لPrimisulfuron | آلية Primisulfuron المقاومة |
| ماكلين مقاطعة مقاومة لل | MCR | مقاوم | التمثيل الغذائي* | مقاوم | التمثيل الغذائي |
| آدامز مقاطعة مقاومة لل | ACR | Sensitإيف | - | مقاوم | طفرة في الموقع المستهدف في ALS 14 |
| مقاطعة وين-حساس | WCS | حساس | - | حساس | - |
* آليات المقاومة غير المستهدفة الموقع، بخلاف تعزيز عملية التمثيل الغذائي، ويمكن أيضا أن تمنح المقاومة mesotrione في عدد السكان MCR 12.
الجدول 1: وصف السكان waterhemp عن ولاية إلينوي المستخدمة في هذه الدراسة.
بالإضافة إلى تحديد معدلات الأيض مبيدات الأعشاب في الشتلات waterhemp سليمة، تم وضع المنهج التجريبي مختلفة ويعملون في بحثنا السابق للتحقيق في عملية التمثيل الغذائي باستخدام waterhemp رفعه ورقة فحص 12 فضلا عن مختلف مثبطات P450 (على سبيل المثال، tetcyclacis والملاثيون). وقد تم تكييف هذه الطريقة على وجه التحديد لwaterhemp من PREVIالتحقيق الأوس الأيض-primisulfuron الميثيل في الذرة رفعه يترك 15، منذ لم يتم إبلاغ ورقة فحص المستأصل لإجراء البحوث الأيض مبيدات الأعشاب في مصنع dicot. تم الحشرات الملاثيون organophophosate كثيرا ما تستخدم في الجسم الحي في المختبر البحوث مبيدات الأعشاب الأيض تشير إلى تورط P450 16. على سبيل المثال، والتسامح، والتمثيل الغذائي السريع لmesotrione في الذرة ومن المقرر أن P450 المحفزة الهيدروكسيل الحلبة، والتي تم التحقق عندما الملاثيون زيادة الحساسية الذرة إلى mesotrione 17. وبالمثل، تحول دون الملاثيون التمثيل الغذائي للALS المانع primisulfuron-الميثيل في الذرة رفعه يترك 15. والميزة الرئيسية لهذه التقنية ورقة رفعه هو أن البيانات التي تم إنشاؤها مستقلة عن أنماط النبات كامل النبات، عاملا هاما في الاعتبار عند تقييم التمثيل الغذائي للالنظامية ومبيدات الأعشاب مبيد في النباتات. ونتيجة لذلك، وهذا الأسلوب يسمح الكمي ويحلل التمثيل الغذائي النوعي للتركيز على ورقة واحدة تعالج 12.
استراتيجية استنساخ الخضري، في تركيبة مع بروتوكول رقة المستأصل، استخدمت سابقا في waterhemp لإجراء دراسات عملية التمثيل الغذائي 12. ونظرا لطبيعة التهجين من waterhemp (منفصلة للذكور والإناث النباتات)، ودرجة كبيرة من التنوع الجيني داخل الأنواع Amaranthus ثنائي الجنس 9، يضمن هذا البروتوكول الذي تم تحليل الشتلات waterhemp وراثيا متطابقة ضمن التجارب وقتا بالطبع. توضح هذه المقالة الأداة المساعدة للأسلوب ورقة رفعه لقياس معدلات التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في الأعشاب الضارة dicot (waterhemp). تم تحديد كمية المبيدات الأم تبقى في كل نقطة زمنية (الشكل 1) من غير الخطية أقل التحليل الساحات الانحدار، وكان مناسبا مع منحنى الدرجة الأولى بسيطة لتقدير الوقت ل50٪ من مبيدات الأعشاب استيعابها لتتحلل ( DT 50). ممثليتم عرض الاستشرابية من عكس المرحلة العالية الاداء اللوني السائل (RP-HPLC) للALS-المقاومة والسكان waterhemp -sensitive، التي تشير إلى اختفاء مبيدات الأعشاب الأم وتشكيل يصاحب ذلك من المستقلب القطبي (الصورة) خلال دراسة وقتا بالطبع (الشكل 2). محور مقالنا هو وصف وإثبات فائدة من ورقة فحص المستأصل في تركيبة مع طريقة الاستنساخ النباتي لتحديد معدلات دقيقة وقابلة للتكرار في استقلاب مبيدات الأعشاب في محطات dicot، وذلك باستخدام بشكل موحد وصفت حلقة (URL- 14 C) مبيدات الأعشاب في ثلاثة السكان waterhemp التي تختلف في ردود كامل مصنع لHPPD- ومبيدات الأعشاب تثبيط ALS (الجدول 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. المواد النباتية شروط النمو، والخضري الاستنساخ
ملاحظة: تم التحقيق ثلاثة السكان waterhemp في هذا البحث: MCR (من مقاطعة ماكلين، IL)، ACR (من مقاطعة آدمز، IL)، وجمعية حماية الحياة البرية (من مقاطعة وين، IL) (الجدول 1).
- جمع وتعليق بذور waterhemp في 0.1 ز L -1 أجار: المحلول المائي في 4 درجة مئوية لمدة 30 يوما على الأقل لتعزيز الإنبات. ملاحظة: بعض السكان waterhemp هي نائمة، ولكن هذه الخطوة تساعد على التغلب على السكون وجعل البذور تنبت بشكل موحد.
- تنبت بذور كل السكان waterhemp (كما في الجدول رقم 1) في 12 × 12 سم الصواني التي تحتوي على وسيلة بوتينغ في الاحتباس الحراري.
- الحفاظ على الظروف المسببة للاحتباس الحراري في 28/22 ° C درجات الحرارة اليوم / ليلة خلال الفترة الضوئية 16/8 الساعة 12.
- تكملة الضوء الطبيعي في الاحتباس الحراري مع الضوء من مصابيح هالوجين الزئبق لتوفير الحد الأدنى من 500 ميكرومول م -2 -1 الفوتون على مستوى مظلة النبات.
- ظهرت زرع الشتلات عندما تكون 2 سم إلى 80 سم 3 الأواني في الاحتباس الحراري.
- شتلات الزرع إلى 950 سم 3 الأواني التي تحتوي على 3: خليط 1 من مزيج بوتينغ: 1: 1 التربة: الخث: الرمال عندما الشتلات هي 4 سم. إضافة 5 غرام من حبيبات الأسمدة بطيئة الافراج على كل وعاء وتخلط مع هذا الخليط التربة.
- قطع وإزالة تبادل لاطلاق النار النسيج الإنشائي القمي الذي يحتوي على أصغر الأوراق ثلاثة من 7 سم النباتات طويل القامة للقضاء على هيمنة قمي.
ملاحظة: هذه الخطوة يضمن أن كل محطة سوف تنمو ما يكفي من يطلق النار على 3 سم إبطي لاستنساخ. - المكوس خمسة براعم الإبطية (3 سم في الطول) عندما الشتلات هي حوالي 14 سم من كل السكان waterhemp (كما في الجدول رقم 1). إزالة غالبية الأوراق على هذه البراعم الإبطية لتقليل فقدان الماء على مزيد من التعامل معها، ولكن الإبقاء على أصغر اثنين من يترك للسماح للمزيد من النمو على زرع.
- زرع إبطي يطلق النار في 80 سم 3 قدور (الشتلات واحدة في وعاء) في بوتينغ المتوسطة، وهو نفس الوسيلة المستخدمة للإنبات. يجب أن تكون مشبعة بوتينغ المتوسطة في البداية حتى شكل جذور في غرفة النمو، ثم الحفاظ على رطوبة ثابتة ومكان الأواني في غرفة النمو لمدة 7 أيام لإقامة الجذور.
ملاحظة: النباتات هي حساسة جدا في هذه المرحلة، وينبغي ألا أكدت.- الحفاظ على ظروف غرفة نمو في 28/22 ° C درجات الحرارة اليوم / ليلة خلال الفترة الضوئية 16/8 الساعة 12.
- مزيج من هاج والفلورية المصابيح يمكن استخدامها لتوفير الضوء في غرفة النمو وأن يحقق ما لا يقل عن 550 ميكرومول م -2 ثانية -1 تدفق الفوتون في مصنع مستوى المظلة 12.
- زراعة مرة أخرى إلى 950 سم 3 قدور (الشتلات واحدة في وعاء) جontaining 3: خليط 1 من مزيج بوتينغ: 1: 1 التربة: الخث: الرمال (تشمل أيضا 5 ز بطيئة الافراج عن حبيبات الأسمدة) عند محطات المستنسخة هي 4 سم، ثم نقل مرة أخرى إلى المسببة للاحتباس الحراري.
- استنساخ النباتات مرة ثانية باستخدام نفس الأسلوب هو موضح أعلاه (أي، كرر الخطوات 1،5-1،8، ومن ثم الانتقال إلى الخطوة 2.1). لدراسة وقتا بالطبع النموذجية، وتوليد الحيوانات المستنسخة من لا يقل عن ستة محطات مستقلة عن بعضها السكان waterhemp وتسجيلها على شكل خطوط MCR 1-6 و1-6 وACR WCS 1-6.
- إنشاء ستة على الأقل "الأم" خطوط نسيلي متميزة من أجل تكرار التجربة وكاف تمثل التنوع الوراثي داخل كل السكان waterhemp.
- اعتمادا على عدد النقاط الزمنية سيتم تحليلها، وتوليد ما يكفي من الحيوانات المستنسخة فرعية من كل "الأم" خط نسيلي لإجراء دراسة وقتا بالطبع.
2. إجراء دراسة الأيض مع رفعه Waterhemأوراق ص
- استئصال الثالثة وأصغر الأوراق (2-3 سم في الطول، وتشمل 0.5 سم من سويقات المرفقة) عندما النباتات waterhemp المستنسخة هي 10-12 سم لعملية التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب وDT 50 تحليلها.
- أعناق قطع ورقة من كل مصنع waterhemp مرة ثانية (ضمان 0،3 سم من سويقات تبقى) تحت سطح الماء، ووضع هذه القطع ينتهي إلى 1.5 مل قارورة بلاستيكية (ورقة واحدة في قارورة) 15.
ملاحظة: القطع مرة ثانية تحت الماء يمنع فقاعات الهواء من تشكيل ويسد الأوعية الخشب.- أولا، تزج جزئيا أوراق رفعه مع قطع سويقات العازلة في مرحلة ما قبل الحضانة (200 ميكرولتر) من 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6) لمدة 1 ساعة.
- ثانيا، نقل كل ورقة إلى 1.5 جديد مل قارورة تحتوي على وجود مخزن مؤقت الحضانة (200 ميكرولتر) من 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6)، بالإضافة إلى 150 ميكرومتر [URL- 14 C] مبيدات الأعشاب، واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ل السماح لامتصاص مبيدات الأعشاب إلى الأوراق.
ملاحظة: كل 14 C-mesotrione و-1. كل من نشر وامتصاص من خلال مجرى الخشب النتح تساهم في كمية المبيدات تناولها لكل ورقة.
ملاحظة: تأثير مثبطات الأيض على عملية التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب يمكن تحديدها عن طريق تعديل الخطوات 2.2.1 و2.2.2 أعلاه. إضافة 100 ميكرومتر المانع إلى المخزن المؤقت مرحلة ما قبل الحضانة والسماح احتضان لمدة 2 ساعة، ثم نقل إلى عازلة الحضانة مع مبيدات الأعشاب، ومرة أخرى إضافة 100 ميكرومتر المانع. على سبيل المثال، الملاثيون وtetcyclacis تمنع بعض الأنشطة السيتوكروم P450 في النباتات 15-17. - غسل جزء مغمورة من أوراق رفعه مع الماء منزوع الأيونات ونقل أوراق رفعه إلى ربع قوة Murashige وسكوغ (MS) أملاح الحل (500 ميكرولتر) ل0 ساعة، 5 ساعة، 11 ساعة، 23 ساعة، أو 35 ساعة، على التوالي، في غرفة النمو لدراسة التمثيل الغذائي وقتا بالطبع.
- الحصاد عن طريق إزالة إجازةالصورة من حل الحضانة في نقطة زمنية مناسبة ويدويا طحن كل الأنسجة ورقة في النيتروجين السائل باستخدام أنبوب البولي بروبلين (15 مل)، والزجاج مدقة.
- استخراج مبيدات الأعشاب رديولبلد وعناصره من كل ورقة مع 7 مل من 90٪ الأسيتون مع الخالط الأنسجة مختبر في نفس أنبوب البولي بروبلين على النحو الوارد أعلاه. شطف الخالط الأنسجة مع 7 مل إضافية من 90٪ الأسيتون، ومواصلة التجانس حتى يتم حطمت الأنسجة تماما (عادة حوالي 2 دقيقة). ملاحظة: 90٪ الأسيتون يمكن أن تستخدم لاستخراج معظم الأعشاب من الأنسجة النباتية. ومع ذلك، إذا كان هذا الأسلوب غير قادر على استخراج أكثر من 90٪ من المركبات رديولبلد استيعابها، ثم 90٪ الميثانول أو 90٪ الأسيتونتريل يمكن أن تكون بديلا مثل المذيبات الاستخراج.
- تسمية 90٪ مقتطفات الأسيتون (14 مل الكل) وتخزينها في -4 درجة مئوية لمدة 16 ساعة للسماح لاستخراج إضافية تحدث.
ملاحظة: بعد هذه استخراج أوراق المعالجة، ومقدار راد المستخلصioactivity عادة لا يقل عن 98٪ من المركبات رديولبلد تستوعبها ورقة المعالجة. النشاط الإشعاعي غير القابل للاستخراج (بقايا ملزمة) في أوراق رفعه متوسط 0.3٪ فقط في كل نقطة زمنية في دراستنا السابقة 12، ولكن يمكن أن تختلف هذه الكمية وفقا لمبيدات الأعشاب المستخدمة ونقطة زمنية فحصها. - يتم الحصول على عينات الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 10 دقيقة والتركيز supernatants عند 40 درجة مئوية مع المبخر الدوار حتى الحجم النهائي من 0.5 مل. نقل هذا الحجم إلى أنبوب بلاستيكي 2.0 مل.
- إضافة الأسيتونتريل: الماء (1: 1، من حيث الحجم) لضبط الحجم النهائي من المستخلصات النباتية إلى 1.25 مل وإعادة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 10 دقيقة لإزالة أي الجسيمات.
- قياس مجموع النشاط الإشعاعي في قسامة أخذت من كل عينة (DPM ميكرولتر -1) من خلال التلألؤ السائل الطيفي (LSS) 12 وتطبيع كميات من [14 C المسمى] مركبات حقن لتحليل HPLC (على سبيل المثال، 10،000 جميع DPM / عينة / المدى) حتى ص محاور، سوف تكون موحدة بين عينات عندما الرسوم البيانية النتائج.
3. تحليل HPLC من مبيدات الأعشاب التمثيل الغذائي في أوراق رفعه
ملاحظة: حل مجموع النشاط الإشعاعي استخراجها إلى مبيدات الأعشاب ومبيدات الأعشاب الأم الأيض باستخدام الظروف RP-HPLC التالية 12.
- أداء RP-HPLC مع C 18 عمود (4.6 × 250 ملم، 5 ميكرون حجم الجسيمات لHPLC التحليلي) بمعدل تدفق 1 مل دقيقة -1 بالنسبة لمعظم الأعشاب غير القطبية.
ملاحظة: يمكن أيضا أعمدة C 4 أو C 12 RP-HPLC أن تستخدم لتحسين فصل مبيدات الأعشاب الأم من عناصره. مرشح ما قبل العمود و / أو عمود الحرس يمكن أيضا أن تستخدم لحماية وإطالة عمر العمود RP.- استخدام الطور المتحرك التالية لRP-HPLC: شاطف A، حمض الفورميك 0.1٪ (ت / ت) في الماء، وشاطف B 100٪ HPLC الصف الأسيتونتريل.
ملاحظة: يمكن أيضا HPLC الصف الميثانول أن تستخدم شركةuent B لحل مركبات أكثر القطبية والأيض، ولكن كن على علم بأن قد تتغير أيضا الاحتفاظ مرات.
ملاحظة: الملف الشخصي شطف استخدامها لحل mesotrione أو primisulfuron ميثيل من نواتج الأيض القطبية في بحثنا 12 غير: الخطوة 1، A: B (4: 1، V / V) لA: B (3: 2، ت / ت ) في الانحدار الخطي (12 دقيقة). الخطوة 2، A: B (3: 2، ت / ت) لA: B (3: 7، ت / ت) في الانحدار الخطي (5 دقائق)؛ الخطوة 3، A: B (3: 7، ت / ت) لA: B (1: 9، ت / ت) في الانحدار الخطي لمدة 2 دقيقة (التي تضم ما مجموعه 19 دقيقة).
ملاحظة: قد تحتاج التدرجات والخطوات isocratic إلى تعديل بناء على الخصائص الفيزيائية للمواد الأم من أجل تحسين دقة. - اتبع الخطوات الانحدار الخطي أعلاه مع A: B (1: 9، ت / ت) لA: B (4: 1، V / V) في الانحدار الخطي (3 دقائق) وA: B (4: 1، V / V) خطوة isocratic (لمدة 2 دقيقة على الأقل) لإعادة توازن العمود RP-من قبل حقن مستخلص المقبل 12.
- استخدام الطور المتحرك التالية لRP-HPLC: شاطف A، حمض الفورميك 0.1٪ (ت / ت) في الماء، وشاطف B 100٪ HPLC الصف الأسيتونتريل.
- كشف وتصور المركبات رديولبلد مع تدفق Scintillation محلل. تسجيل كمية من مبيدات الأعشاب الأم المتبقية في كل عينة كنسبة مئوية من إجمالي النشاط الإشعاعي في كل عينة (الكشف عن وكميا من التلألؤ محلل تدفق وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) لتحديد معدلات الأيض مبيدات الأعشاب في كل السكان waterhemp أثناء الوقت.
4. الإجراءات الإحصائية
- ترتيب العلاجات في تصميم عشوائية تماما (أو ترتيب آخر مناسب للتحليل الإحصائي).
- أداء تجربتين مستقلة مع كل معاملة، تتألف من ثلاثة مكررات البيولوجية لكل تجربة. وتشمل التجارب المستقلتين ستة مكررات البيولوجية في المجموع. إذا كان تأثير التجربة هو غير هام (α = 0.05)، والجمع بين وتحليل البيانات من كل تجربة مستقلة. إذا كان تأثير التجربة هو كبير، ثم تحليل كل تجربة على حدة.
ملاحظة: تضمين أول ثلاث مكررات البيولوجية طن التجربة 1 ومكررات البيولوجية الثلاثة المقبلة في تجربة 2. كل تكرار البيولوجي يمثل "الأم" متميزة خط نسيلي المستمدة من كل السكان (MCR 1-6 و1-6 ACR، وWCS 1-6) بحيث يكون لكل زمنيا تحليل بالطبع يستخدم النباتات وراثيا متطابقة. وتشمل التجارب المستقلتين ستة مكررات البيولوجية في المجموع، والذي يسمح للتمثيل كاف من التباين الوراثي والاصرار لمتوسط DT 50 لكل السكان waterhemp. - تحليل البيانات مع غير الخطية تحليل الأقل الساحات الانحدار ويصلح لهم مع منحنى الدرجة الأولى بسيطة لتقدير DT 50 ق. توضح المعادلة أدناه نموذج:
- حيث في هذا النموذج ذ يمثل النسبة المئوية للمبيدات الأعشاب الأم المتبقية في الزمن t، μ ط هو DT 50 لكلwaterhemp السكان ط، والمعلمة C 0 هو المبلغ المقدر من الأم مبيدات الأعشاب الحاضر في تي = 0 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم الكشف عن اختلافات كبيرة في معدلات الأيض mesotrione بين إما WCS أو ACR وMCR (الشكل 1). في كل نقطة زمنية، قد MCR استقلاب mesotrione بسرعة أكبر من اثنين من السكان الحساسة mesotrione، WCS وACR، الذي يرتبط مع الردود السابقة المظهرية كامل النبات 11. عن طريق الاستنساخ ما يكفي من النباتات من محطة الوالدين واحد من كل مجموعة من السكان، والتمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب التحليلات وقتا بالطبع موحدة وقابلة للتكرار بسبب عدم وجود التباين الوراثي داخل كل دورة زمنية 12. على سبيل المثال، يتم عرض دوام لعملية التمثيل الغذائي mesotrione في خط نسيلي 5 12 في الشكل 1. ما مجموعه ستة خطوط نسيلي مختلفة، والمستمدة من ست محطات الأم الفردية، وقد تم تحليل من كل السكان (الجدول 1) لتحديد متوسط العام DT وكانت قيمة 50، التي أشارت إلى أن عملية التمثيل الغذائي mesotrione في MCR بشكل أسرع (
بالإضافة إلى دراسة آليات المقاومة mesotrione في MCR، وكان الهدف ذي الصلة لتحديد آلية لمقاومة ALS مثبطات في MCR. أظهر بحث سابق أن عدد سكان الفرعي المستمدة من MCR كان ALS مقاومة ولكن لم يكن يمتلك طفرة في ALS الموقع المستهدف الجيني، مما يشير إلى آلية غير المستهدفة الموقع استنادا 13. هذا هو على النقيض مع ACR، وهو ALS مقاومة بسبب طفرة موقع الهدف الذي يضفي على الاقل حساسية ALS انزيم 14. من أجل قسم التدريب والامتحاناتر هذه الفرضية، أجري فحص أوراق المستأصل مع [URL- 14 C] primisulfuron ميثيل، ومبيدات الأعشاب ALS المثبط للأسرة السلفونيل يوريا. وكانت منطقة ذروة 14 C-primisulfuron-الميثيل في HPLC اللوني ممثل (الوقت الاحتفاظ بحوالي 21.6 دقيقة) أصغر بكثير في MCR مما كانت عليه في ACR وWCS في 12 HAT (الشكل 2). بالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن أيضين القطبية مع الاحتفاظ مرات أقصر من primisulfuron-الميثيل في مستخلصات أوراق رفعه من جميع السكان الثلاثة (الشكل 2). على الرغم من أن هياكل هذه المركبات القطبية اثنين لم تحدد في هذه الدراسة، تكونها السريع يتسق مع عصابة الهيدروكسيل من primisulfuron ميثيل 8 (المرحلة الأولى الأيض)، يليه الجلوكوز الاقتران 5 (المرحلة الثانية الأيض).
في تركيبة مع التحليلات النوعية من عملية التمثيل الغذائي primisulfuron في MCR، ACR، وجمعية حماية الحياة البرية (الشكل 2)، والمبلغوكميا من الأم المبيدات المتبقية في كل نقطة زمنية وتستخدم لتحديد القيم DT 50 لprimisulfuron-الميثيل في MCR (13.6 ساعة)، ACR (> 24 ساعة)، وجمعية حماية الحياة البرية (> 24 ساعة) (الشكل 3). أقصر بكثير DT 50 قيمة في MCR يتسق مع زيادة التمثيل الغذائي باعتباره الآلية الرئيسية لمقاومة المرض في هذه الفئة من السكان، بما يتوافق مع الأبحاث السابقة كامل النبات 13. ومن المثير للاهتمام، ومع ذلك، فإن القيم DT 50 لprimisulfuron في ACR وWCS هي مماثلة حتى الآن لفترة أطول كثيرا مما كان عليه في MCR (الشكل 3)، على الرغم من كل من MCR وACR عرض ALS-المانع الظواهر المقاومة (الجدول 1). وDT طويلة نسبيا 50 في ACR هو ربما لأنه ليس من الضروري أن يتفاعل بسرعة primisulfuron، منذ ACR لديه انزيم ALS الاقل حساسية كما آليتها المقاومة الرئيسي 14. وباختصار، فإن رفعه فحص أوراق waterhemp تستخدم في أبحاثنا أسفرت عنه قيمةقدمت البيانات وlitative والكمية رؤية جديدة في آليات المقاومة القائم على التمثيل الغذائي نحو اثنين مبيدات الأعشاب المختلفة في MCR، ACR، وجمعية حماية الحياة البرية.
الشكل 1: بالطبع وقت الأيض mesotrione في waterhemp رفعه يترك من السكان المستنسخة نباتيا أوراق رفعه (أصغر الثالثة ورقة، 2-3 سم في الطول) من الشتلات waterhemp (10-12 سم) تم استنساخ نباتيا بحيث يكون لكل بالطبع الوقت تكونت الدراسة لكل خط من النباتات وراثيا متطابقة. وضعت أوراق رفعه في 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك العازلة (درجة الحموضة 6) لمدة 1 ساعة، تليها 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 6)، بالإضافة إلى 150 ميكرومتر mesotrione رديولبلد لمدة 1 ساعة ('النبض')، ثم ربع قوة Murashige و سكوغ (MS) حل الأملاح ('مطاردة') ل0 ساعة، 5 ساعة، 11 ساعة، 23 ساعة، و 35 ساعة للسماح التمثيل الغذائي للتحدث. داوقد تم تحليل تا التي كتبها غير الخطية تحليل الأقل الساحات الانحدار وتناسب مع منحنى الدرجة الأولى بسيطة لتقدير DT 50 بشكل منفصل لكل السكان waterhemp المستنسخة. و12 MCR خط نسيلي استقلاب بسرعة mesotrione، في حين أن خطوط نسيلي ACR وWCS استقلاب mesotrione أكثر ببطء. البيانات المعروضة هي الدورات الوقت فقط من خط نسيلي 5 لكل السكان waterhemp، والتي تم تعديلها من رسائلنا السابقة ورقة 12 (حقوق الطبع والنشر من قبل الجمعية الأمريكية لعلماء الأحياء النباتية).
الشكل 2: التمثيل الغذائي Primisulfuron ميثيل في MCR، ACR، وجمعية حماية الحياة البرية (12 HAT) عكس المرحلة الممثل الاستشرابية HPLC لرفعه مستخلصات أوراق waterhemp (12 HAT) المرفق مع 150 ميكرومتر رديولبلد primisulfuron ميثيل (كما هو موضح في البروتوكول) من ماكلين مقاطعة (MCR، A)، مقاطعة آدامز (ACR، B)، وهوالثانية مقاطعة وين حساسة للمبيدات الأعشاب (WCS، C) السكان (الجدول 1). ذروة المشعة مع الوقت الاحتفاظ 21.6 دقيقة تحتوي primisulfuron-الميثيل، على النحو الذي يحدده مقارنة مع مستوى التحليلي أصيلة. قمم مع الاحتفاظ مرات أقصر من المرجح القطبية، الأيض أقل السمية النباتية من primisulfuron ميثيل، مثل هيدروكسي primisulfuron ميثيل 8 أو أشكال الغليكوزيلاتي الأيض الهيدروكسيلية 5،6. عرض السكان MCR انخفاض كبير في كمية الأم primisulfuron ميثيل نسبة إلى ACR وWCS، التي وكميا في انخفاض DT 50 لMCR (الشكل 3).
الرقم 3: بالطبع وقت الأيض primisulfuron-الميثيل في أوراق waterhemp رفعه أوراق waterhemp رفعه (حجابهند-أصغر ورقة؛ 2-3 سم) يعاملون كما هو موضح في الشكل رقم 1 والأبحاث السابقة لدينا مع mesotrione 12، إلا أدرج أن 150 ميكرومتر primisulfuron رديولبلد باسم "نبض" وحضنت يترك في أملاح حل MS ('مطاردة') ل0 ساعة 3 ساعة و 11 ساعة. وقد تم تحليل البيانات غير الخطية تحليل الأقل الساحات الانحدار كما هو موضح سابقا لعملية التمثيل الغذائي mesotrione (الشكل 1) 12. السكان MCR استقلاب بسرعة primisulfuron ميثيل (DT 50 = 13.6 ساعة)، في حين استقلاب ACR وWCS primisulfuron ميثيل أكثر ببطء (DT 50> 24 ساعة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة رفعه ورقة الموصوفة هنا تم استخدامها سابقا في البحث الأيض primisulfuron في الذرة يترك 15، ولكن تظهر نتائجنا أن هذا البروتوكول هو أيضا فعالة ودقيقة، وقابلة للتكرار لقياس التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في أنواع الأعشاب dicot 12. والميزة الرئيسية لهذه التقنية ورقة رفعه مقارنة مع الدراسات كامل النبات هي أن ورقة رفعه مستقلة عن أنماط النبات كامل النبات مبيد ومبيدات الأعشاب النظامية أو الاختلافات في امتصاص مبيدات الأعشاب بين النباتات أو السكان. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تقليل التباين البيئي منذ تجرى فحوصات ورقة رفعه في غرفة النمو، مع ورقة واحدة وضعت في أنبوب، مقارنة مع دراسة النباتات كلها نمت في ظل الظروف المسببة للاحتباس الحراري. وأدرج استراتيجية استنساخ الخضري أيضا في طريقتنا لدراسة آليات mesotrione المقاومة في MCR 12 لتقليل درجة كبيرة من التباين الوراثي داخل ويكونالسكان توين Amaranthus 9. ويتضح التنوع الوراثي داخل السكان Amaranthus الأعشاب الضارة بمقدار تقلب موثقة في ردود كامل النبات إلى عدة عائلات من مبيدات الأعشاب مبيد 18. عند إجراء الدراسات وقتا بالطبع إلى تحديد دقيق DT 50 ق وللكشف عن اختلافات كبيرة عند مقارنة DT 50 القيم بين السكان waterhemp 12، الخطوات التالية (كما هو مبين في منطقتنا ورقة رفعه وبروتوكول الاستنساخ النباتي) حاسمة للقضاء أو الحد الوراثية والبيئية التباين.
وتوجد آليات مختلفة في النباتات لمنح مقاومة مبيدات الأعشاب 1،2. على سبيل المثال، ومقاومة waterhemp لمبيدات الأعشاب ALS-تثبيط يمكن أن يكون الموقع الهدف على أساس 14 أو الموقع غير المستهدفة القائم (13). معدلات التمثيل الغذائي primisulfuron ميثيل (الشكل 3) تظهر بوضوح هذه الاختلافات بين waterh مقاومة للALS اثنينالسكان خطة الإدارة البيئية، MCR وACR (الجدول 1). في تركيبة مع PCR التضخيم وتحليل تسلسل مبيدات الأعشاب الجينات الموقع المستهدف، فإن ورقة فحص رفعه يساعد إلى حد كبير نحو تحديد ما إذا كان يمنح مقاومة مبيدات الأعشاب في waterhemp أو الأعشاب dicot غيرها من الموقع المستهدف أو غير المستهدفة الموقع الآليات 2.
وتشمل القيود المفروضة على طريقة ورقة المستأصل لدينا عدم القدرة على تصور أو قياس أنماط مبيدات الأعشاب النبات جميع أجزاء النبات بأكمله، أو تحديد ما إذا كانت توجد آليات امتصاص الخلوية أو شبه الخلوية التي تمنح المقاومة القائمة على غير المستهدفة الموقع في الأعشاب 2. كما ذكر سابقا، واعتبر هذا الجانب أيضا ميزة عند تحديد دقيق معدلات الأيض مبيدات الأعشاب في السكان الاعشاب المقاومة للmesotrione 12، ولكن على العكس يمكن اعتباره عيب عند دراسة الأعشاب النظامية التي لم يتم استقلابه بشكل ملحوظ في النباتات (أي عشب غير انتقائيicides) مثل جلايوفوسات 2، أو الاتصال مبيدات الأعشاب التي هي غير انتقائية في السكان الاعشاب الطبيعية، مثل الباراكوات أو غلوفوسنات 19. يتم التحقيق في معدلات ومع ذلك، إذا لم يتم الكشف عن آليات الموقع المستهدف في البداية ثم تعزيز عملية التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب عادة المقبل 1،4، وخاصة عند دراسة مقاومة الحشائش لمبيدات الأعشاب المثبط HPPD مثل mesotrione 12، ALS المثبط للمبيدات الأعشاب مثل primisulfuron ميثيل 13 ، الضوئي II-تثبيط مبيدات الأعشاب مثل الأترازين 1،12، أو مبيدات الأعشاب 4 أسيتيل التميم المثبط.
وقد ارتبطت P450s مع المقاومة ALS في السكان Echinochloa 20 عاما، وهو أنواع الأعشاب الأعشاب الضارة، وكذلك مع mesotrione والمقاومة ALS في MCR 12،13. A ثنائي الجنس، الاعشاب dicot المتعلقة waterhemp، بالمر قطيفة (A. palmeri)، هي أيضا عرضة لتطوير مقاومة مبيدات الأعشاب من خلال عدة آليات مختلفة 1-3. كما تم توثيق أكثر السكان الاعشاب مقاومة لمبيدات الأعشاب والأنواع في جميع أنحاء العالم 3، والحاجة لفحص بسرعة الأيض مبيدات الأعشاب كآلية مقاومة محتملة سوف تستمر في الزيادة. النهج رقة رفعه، والذي يختلف ولكنها ذات صلة بالدراسات كامل النباتية المستخدمة عادة للتحقيق في آليات مقاومة مبيدات الأعشاب، هو أداة قيمة ودقيقة لتقييم وقياس التمثيل الغذائي مبيدات الأعشاب في النباتات. ونتيجة لذلك، فإن القدرة على أداء هذه التحليلات مع دقيقة، وأساليب استنساخه بما في ذلك فحص أوراق رفعه سوف يساعد كثيرا الباحثون في تحديد آليات المقاومة غير المستهدفة الموقع في كل من العشب 4 و 12 dicot الأعشاب الضارة.
ويمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة أيضا تحديد معدلات الأيض المبيدات في المحاصيل dicot مثل فول الصويا والقطن. وقد استخدمت البحوث الجارية في مختبرنا مع أصناف فول الصويا التي تتحمل مبيدات الأعشاب أيضا ل رفعهنهج الأسماك. ومع ذلك، منذ فول الصويا والمحاصيل البقولية بأوراق ثلاثية الأوراق، وقد تم تكييف و"سويقات رفعه" تقنية وتطويرها بحيث كل ورقة trifoliolate يمكن أن تمتص المبيدات رديولبلد عن طريق امتصاص من خلال سويقات الرئيسية (سكيلتون، Lygin، وRiechers، بيانات غير منشورة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 ml tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 ml tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
- Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
- Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
- Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
- Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
- Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
- Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
- Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
- Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
- Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
- Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
- Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
- Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
- Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).
- Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
- Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
- Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).
