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摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します

Published: September 7, 2015 doi: 10.3791/53236

Introduction

雑草除草剤抵抗性は食料や繊維1,2のグローバル生産に深刻な脅威を提示します。現在、世界中で百以上の雑草種から耐性個体群と生物型の何千もの文書化され、3を検討されています。植物に除草剤耐性を付与する主要なメカニズムは、ターゲットサイトの遺伝子2の除草剤-タンパク質結合動態または増幅に影響を与える遺伝子変異を含む除草剤の標的部位の遺伝子やタンパク質の変化です。シトクロムP450モノオキシゲナーゼ(P450)またはグルタチオン Sトランスフェラーゼ(GST)酵素の上昇活動を介した代謝解毒は、ターゲット・サイトベースのメカニズム2からいくつかの点で異なっているれ、雑草に除草剤耐性を付与する別のメカニズムです。代謝系の抵抗は(フィットネス罰則別名 )植物の適応度コストは除草剤耐性mechanisから生じ得るかどうかに大きな影響を持っていますメートルだけでなく、雑草集団1,2,4におけるクロスまたは複数の除草剤耐性を付与するための単一の解毒メカニズムの可能性について。一般に、植物における除草剤の代謝は、3つの異なるフェーズ5に分割することができます。増加の極性と部分除草剤解毒5,6につながる、またはO-脱アルキル化反応-第I相は、芳香環またはアルキル基のP450媒介ヒドロキシル化、 または Nなどによる除草剤の変換や活性化を含みます。フェーズで新たに導入された官能基私のGSTによって還元型グルタチオンとの結合のための結合部位を提供することができますまたはフェーズII 5,7にUDP依存の糖転移酵素によってグルコースに。例えば、トウモロコシにおけるプリミスルフロンメチルの主要な初期の代謝物は、さらにヒドロキシプリミスルフロングルコシドする(フェーズII)を代謝して、長期保存またはさらなる代謝のための液胞に輸送することができるヒドロキシプリミスルフロンメチル8であり、プロcessing 5,6(フェーズIII)。

Waterhemp( アマランサスのtuberculatus)は、米国で( チョウ目害虫抵抗性ワタ )難コントロールトウモロコシの生産( トウモロコシ)を妨げ、双子葉植物の年間雑草種、大豆( ダイズ )、綿です。 waterhempの遺伝的多様性の高度は、雌雄異株の生物学と長距離風受粉によって促進され、1つの女性waterhemp工場は百万種子9まで生成することができます。これらの種子は、自然に効果的な分散機構をwaterhempを付与する、小型で容易に広がります。 Waterhempは生育期9を通して連続発芽が表示され、その種子は休眠の数年後に発芽することができます。 Waterhempは耕地作付体系10の中で最も広葉雑草よりも高い成長率を有しているC 4植物です。加えて、多数のwaterhemp集団は、複数のFAMに耐性であります除草剤3のilies。

イリノイ州からwaterhemp(MCR指定)の人口は、4-ヒドロキシフェニルピルジオキシゲナーゼ(HPPD)などメソトリオンなど-inhibiting除草剤11、だけでなく、アトラジン及びアセト乳酸合成酵素(ALS)に、除草剤を-inhibitingプリミスルフロンメチルを含むことに耐性があります、非標的サイトベースのメカニズム12,13に起因します。アトラジン耐性が、メソトリオンに敏感であり、プリミスルフロンメチルをに敏感である、WCS 14指定waterhemp人口(によるALS遺伝子の変異に)プリミスルフロンメチル抵抗性があるACR 14指定waterhempの異なる人口、メソトリオン、及びアトラジンは、事前の研究12と現在の実験におけるMCRとの比較に使用した( 表1に要約 )。初期の研究は、MCRに、HPPD遺伝子配列または発現レベル、または減少しメソトリオンの取り込みの変化を検出しませんでしたメソトリオンに敏感な集団12と比較して人口。しかし、植物全体での代謝試験は、11,12メソトリオンするために、前の表現型応答と相関ACRおよびWCS、と比較してMCRの親メソトリオンの除草剤の有意に低いレベルを示しました。

Waterhemp人口 略語 メソトリオンの表現型 メソトリオン耐性機構 プリミスルフロンの表現型 プリミスルフロン抵抗性機構
マクリーン郡耐性 MCR 耐性代謝* 耐性代謝作用
アダムズ郡耐性 ACR Sensitアイブ - 耐性 ALS 14における標的部位の突然変異
ウェイン郡感受性 WCS 敏感 - 敏感 -

*強化代謝以外の非標的部位の耐性機構は、また、MCR集団12メソトリオン耐性を付与することができます。

表1:本研究で用いたイリノイ州からwaterhemp集団の説明。

そのままwaterhemp苗に除草剤の代謝の速度を決定することに加えて、別の実験的なアプローチを切除waterhemp葉アッセイ12だけでなく、様々なP450 阻害剤(例えば、tetcyclacisとマラチオン)を使用して代謝を調査するために私たちのこれまでの研究で開発し、採用しました。この方法は、previからwaterhempのために特別に適応されました切除した葉のアッセイは、まだ双子葉植物に除草剤の代謝研究を行うために報告されていなかったため、切除したトウモロコシにおけるプリミスルフロンメチル代謝のOUの調査は、15を残します。 organophophosate殺虫剤マラチオンはしばしばP450の関与16を示すために 、インビボおよびインビトロ除草剤代謝研究に使用されてきました。例えば、トウモロコシにおける寛容とメソトリオンの急速な代謝がマラチオンがメソトリオン17にトウモロコシの感度を増加させた際に確認されたP450-触媒リングヒドロキシル化、によるものです。同様に、マラチオンは15を残し切除したトウモロコシにALS阻害プリミスルフロンメチルの代謝を阻害しました。切除した葉の技術の主な利点は、生成されたデータは、植物における全身、発芽後除草剤の代謝を評価する際に考慮すべき重要な要因全植物転パターンとは無関係であるということです。したがって、この方法は、定量可能と定性的な代謝は、単一の処理した葉12に注力して分析します。

栄養クローニング戦略は、切除された葉のプロトコルと組み合わせて、以前に代謝試験12を実施する waterhemp利用しました。他殖のwaterhemp(男女別の植物)の性質、および雌雄異株アマランサスの種内の遺伝的多様性の大幅9に、このプロトコルは、遺伝的に同一waterhempの苗は、時間経過実験内で分析されたことを確実にしました。この記事では、双子葉雑草(waterhemp)で除草剤代謝の速度を測定するための切除した葉の方法の有用性を示します。親の除草剤の量は、(吸収された除草剤の50%が分解する時間を推定するために、単純な一次曲線でフィッティングし、非線形最小二乗回帰分析によって、各時点( 図1)で決定し、そして残りましたDT 50)。代表的な逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)のクロマトグラムは、親の除草剤及び経時試験中の極性代謝物(単数または複数)の同時形成( の消失を示すALS耐性および感受性waterhemp集団のために表示されています2)。私たちの記事の焦点は中に均一にリング標識(URL-14 C)除草剤を使用し、説明し、双子葉植物における除草剤の代謝の正確で再現率を決定するための栄養クローニング法との組み合わせで切除された葉のアッセイの有用性を実証することです彼らの全体のプラントHPPD-への対応と、ALS阻害除草剤( 表1)が異なる3 waterhemp集団。

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Protocol

1.植物材料、成長条件、および栄養クローニング

注意:三waterhemp集団は、本研究で調査した。MCR(アダムス郡、イリノイ州から)、ACR、およびWCS(マクリーン郡、イリノイ州)から( 表1)(ウェイン郡、イリノイ州から)。

  1. 0.1グラムのL -1の寒天でwaterhempの種子を収集し、一時停止:発芽を強化するために、少なくとも30日間4℃の水溶液を。注:一部のwaterhemp集団が休止しているが、このステップは休眠を克服し、種子がより均一に発芽するために役立ちます。
  2. 温室内のポッティング培地を含む12×12センチメートルトレイに( 表1のように)各waterhemp集団の種子を発芽。
    1. 16/8時間の光周期12内に 22分の28℃の昼/夜の温度で温室条件を維持します。
    2. 500マイクロモルmの最小値を提供するためにハロゲン化水銀ランプからの光が温室内で自然光を補足-2 秒 -1プラントキャノピーレベルでの光子束。
  3. 彼らは温室では80 cm 3のポットに2センチメートル背が高いときには、移植苗を浮上しました。
  4. 1:1:ポッティングミックスの1:1混合土:ピート:砂の苗を4センチある950センチメートル3を含む3ポットに移植苗。各ポットに徐放性肥料顆粒5gのを追加し、この土壌の混合物と混合。
  5. 頂芽優勢を排除は7センチの植物からの3つの最も若い葉を含む茎頂分裂組織をカットし、削除します。
    注:この手順は、各植物がクローンするのに十分な3センチメートル腋窩の芽を育てることが保証されます。
  6. 消費税5腋窩の芽(長さ3センチ)苗は、( 表1のように)各waterhemp集団から約14センチです。さらに取り扱い時に水分の損失を低減するために、これらの腋窩の芽の葉の大部分を削除したが、移植時にさらなる成長を可能にするために2つの最も若い葉を保持しています。
  7. 移植腋窩は、発芽のために使用されるのと同じ媒体であるポッティング媒体に80センチメートル3ポット(1ポット当たり1苗)に撮影します。ポッティング媒体は、最初に飽和成長チャンバ内の根が形成されるまで、その根を確立するために、7日間成長チャンバー内の一定の水分と場所ポットを維持する必要があります。
    注意:植物はこの時点で非常に敏感であり、強調されるべきではありません。
    1. 16/8時間の光周期12内に 22分の28℃の昼/夜の温度で成長チャンバ条件を維持します。
    2. 白熱灯や蛍光灯の組み合わせは、成長チャンバ内の光を提供するために使用することができ、少なくとも550マイクロモルのM -2プラントキャノピーレベル12 -1光子束を実現する必要があります。
  8. 950センチメートル3ポット(1ポット当たり1苗)のCに再び移植1:1:ポッティングミックスの1:1混合土:ピート:3 ontainingクローン化された植物を4センチあるときに砂を戻し、温室に移し、(また、5グラムの徐放性肥料顆粒を含みます)。
  9. すなわち、1.5から1.8までの手順を繰り返し、その後、2.1に進み)上記と同様の方法を用いて植物をもう一度複製します。典型的な時間経過の研究のために、各waterhemp集団から少なくとも6つの独立した植物からクローンを作製し、ラインMCR 1-6、1-6 ACRおよびWCS 1-6としてそれらを記録します。
    1. 実験を繰り返し、十分に各waterhemp集団内の遺伝的多様性を表現するために、少なくとも6つの異なる「親」クローン株を確立します。
    2. 分析されますどのように多くの時間のポイントに応じて、経時的研究を行うために、各「親」クローン株から十分なサブクローンを生成します。

2.摘出Waterhemで代謝研究を実施p個の葉

  1. クローン化されたwaterhempの植物は除草剤の代謝及びDT 50分析のための背の高い10〜12センチメートルである場合には、サード最も若い葉(添付葉柄の0.5cmに含まれる長さ2〜3センチ)を切り出します。
  2. 水の下で(葉柄0.3 CMが残っていることを保証する)は、第2回ずつwaterhemp植物から葉の葉柄をカットし、これらのカットは1.5ミリリットルにプラスチックバイアル(1バイアルあたり1枚の葉)15を終了置きます。
    注意:水中で二時間をカットすると、形成し、木部血管を塞ぐから気泡を防ぐことができます。
    1. まず、部分的に1時間、0.1MのTris-HCl(pHが6)のプレインキュベーション緩衝液(200μL)にカット葉柄で切除した葉を浸します。
    2. 第二に、0.1 Mトリス塩酸(pHが6)に加えて、150μM[URL-14 C]除草剤のインキュベーション緩衝液(200μl)を含む新しい1.5ミリリットルバイアルに各リーフを移動し、1時間に28℃でインキュベート葉への除草剤の吸収を可能にします。
      注:両方の14 C-メソトリオンと-1。拡散と木部蒸散ストリームを介して取り込みの両方が葉ごとに取り上げ除草剤の量に寄与する。
      注:除草剤代謝に対する代謝阻害剤の効果は、ステップ2.2.1および2.2.2上記を変更することによって決定することができます。プレインキュベーション緩衝液に阻害剤の、100μMを添加し、2時間インキュベートさせ、その後、除草剤とのインキュベーションバッファに転送して、再度、100μMの阻害剤を追加します。例えば、マラチオンとtetcyclacisは、植物15-17で特定のシトクロムP450活性を阻害します。
    3. 脱イオン水で切除された葉の浸漬部分を洗浄し、四分の一強ムラシゲ・スクーグ(MS)塩溶液(500μl)をそれぞれ0時間、5時間、11時間、23時間、または35時間、のために切除した葉を転送し、時間経過代謝研究のための成長室インチ
  3. 休暇を除去することにより、収穫手動で適切な時点で、インキュベーション溶液からのSとは、ポリプロピレンチューブ(15 mL)およびガラス乳棒を用いて液体窒素中で各葉組織を挽きます。
  4. 上記と同じポリプロピレンチューブ中の実験室の組織ホモジナイザーで90%のアセトンの7ミリリットルを各葉から放射性標識された除草剤とその代謝物を抽出します。 90%のアセトンをさらに7 mlの組織ホモジナイザーをすすぎ、そして組織が完全に粉砕されるまで均質化を続ける(通常約2分)。注:90%アセトンは、植物組織から、ほとんどの除草剤の抽出のために使用することができます。この方法は、吸収された放射性標識化合物の90%以上を取り出すことができない場合には、その後、90%メタノール、または90%のアセトニトリルを抽出溶媒として置換することができます。
  5. 発生する追加の抽出を可能にするために、16時間で-4℃のラベル90%のアセトン(合計14ミリリットル)を抽出して保存します。
    注:処理された葉のこの抽出後、抽出RADの量ioactivityは、処理した葉に吸収さ放射性標識化合物の少なくとも98%、典型的です。切除した葉の非抽出放射能(バインドされた残基)は、私たちの以前の研究12で全ての時点全体のわずか0.3%で平均が、この量を調べ使用除草剤および時刻に応じて変化することができます。
  6. 遠心分離は10分間5000×gで試料を0.5 mlの最終容積が得られるまで、ロータリーエバポレーターを用いて40℃、上清を濃縮します。 2.0ミリリットルのプラスチックチューブにこのボリュームを転送します。
  7. 植物の最終容量が1.25ミリリットルに抽出調整し、再遠心10,000×gで10分間、任意の微粒子を除去するために:(体積で1、1)水:アセトニトリルを追加します。
  8. (DPMμL-1)、液体シンチレーション分光法(LSS)12によって、各サンプルから採取したアリコート中の総放射能を測定し、量を正規化する(例えば、HPLC分析のために注入された化合物、10,00 [14 C標識]結果をグラフ時0総DPM /サンプル/ラン)ので、y軸は、サンプル間で均一になります。

切除した葉における除草剤代謝の3 HPLC分析

注:以下のRP-HPLC条件12を使用して親除草剤や除草剤の代謝物に総抽出放射能を解決します。

  1. 1ミリリットル分の流速で、C 18カラム (4.6×250ミリメートル、分析用HPLCのための5μmの粒子サイズ)で、RP-HPLCを行い-1ほとんどの非極性除草剤のために。
    注:C 4またはC 12 RP-HPLCカラムは、その代謝物から親除草剤の分離を最適化するために使用することができます。プレカラムフィルターおよび/またはガードカラムも保護し、RPカラムの寿命を延ばすために使用されてもよいです。
    1. 溶離液A、水中0.1%ギ酸(v / v)であり、溶離液B 100%HPLCグレードのアセトニトリル:RP-HPLCは、以下の移動相を使用してください。
      注:HPLCグレードのメタノールはエルとして使用することができuentのより極性の化合物および代謝産物を解決するためのBが、保持時間も変更される可能性があることに注意してください。
      注:私たちの研究12での極性代謝物からメソトリオンまたはプリミスルフロンメチルを解決するために使用される溶出プロファイルは、次のとおりです。ステップ1、A:B(4:1、V / V)に:B(3:2、V / V )の直線勾配(12分)で、ステップ2、A:B(3:2、v / v)にする:B(3:7、v / v)の直線勾配(5分)で、ステップ3、A:B(3:7、v / v)での:B(1:9、v / v)の(19分の合計を含む)、2分間の線形勾配。
      注:勾配とアイソクラチックステップは、解像度を最適化するために、母材の物理的特性に基づいて調整する必要があります。
    2. B(1:9、v / v)での:直線勾配(3分)であり、A:B(1、V / V 4):B(4:1、vで上記の線形勾配の手順に従ってください/ v)を少なくとも2分間のイソクラティック段階()次のエキス12を注入する前にRPカラムを再平衡化します。
  2. フローシンチで放射性標識化合物を検出し、視覚化しますllationアナライザ。時間経過中に各waterhemp集団における除草剤の代謝の速度を決定するために、(製造業者の説明書に従って、フローシンチレーションアナライザによって検出および定量)各試料中の全放射能の割合として各サンプルに残っている親除草剤の量を記録します。

4.統計処理

  1. 完全にランダム化された設計(または統計分析のための他の適切な配置)で治療を配置します。
  2. 各実験のための3つの生物学的複製物から成る各処置、2つの独立した実験を行います。 2つの独立した実験では、合計で6生物学的複製が含まれています。実験の効果は有意でない(α= 0.05)である場合、それぞれの独立した実験からのデータを組み合わせて解析します。実験の効果が顕著である場合には、個別の実験を分析します。
    注:私は最初の3つの生物学的複製物を含みますnは実験1と実験2の次の3つの生物学的複製物はそれぞれの生物学的複製は(MCR 1-6、ACR 1-6、およびWCS 1-6)各集団由来クローン株となるよう明確な「親」を表し、各タイムコー​​スの分析は、遺伝的に同一の植物を利用しています。 2つの独立した実験では、各waterhemp人口の中央値DT 50の遺伝的変異性と決意を十分に表現することが可能合計6生物学的複製が含まれます。
  3. 非線形最小二乗回帰分析を用いてデータを分析し、DT 50を推定するために、単純な一次曲線でそれらをフィット。以下の式は、モデルについて説明します。
    式(1)
  4. このモデル yに時刻 tの残りの親除草剤の割合を表し、μiがそれぞれのために、DT 50ですwaterhempの人口は、I、およびパラメータC 0は、T = 0〜12で、親除草剤存在の推定量です。

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Representative Results

メソトリオン代謝率の大きな違いは、WCSまたはACRとMCR(図1)のいずれかとの間で検出されました。各時点で、MCRはより迅速に、以前の全植物の表現型応答11と相関する2メソトリオンに敏感な集団、WCSおよびACR、よりメソトリオンを代謝していました。各集団からの単一の親植物から十分な植物をクローニングすることによって、除草剤代謝の経時的分析は、原因で、各時間コース12内の遺伝的多様性の欠如に均一で再現可能です。例えば、クローン株5 12でメソトリオン代謝の時間経過図1に表示されます。6異なるクローン株の合計を、6つの個別の親植物由来、各集団( 表1)から分析した全体の中央値DTを決定するために、 MCRにそのメソトリオン代謝を示した50値は、大幅に高速化しました( 12よりも短く、DT 50値)を有していました。また、切除した葉を持つ我々の以前の研究では、P450阻害剤が大幅にMCRとトウモロコシではなく、ACRでメソトリオン代謝を減少させたことを示した、とMCRで検出された主要な初期代謝産物はP450-の増強したこと率を示す、4-ヒドロキシメソトリオンと同定されました媒介代謝はMCR 12に抵抗性と関連しています。

MCRのメソトリオン耐性のメカニズムを研究することに加えて、関連した目的は、MCRのALS阻害剤に対する抵抗性のためのメカニズムを決定することでした。先行研究では、MCRに由来する亜集団は、ALS耐性であったが、非標的部位ベースの機構 13 を示す 、ALS標的部位の遺伝子に変異を有していなかったことを実証しました。これは、あまり敏感ALS酵素14を付与する標的部位への変異ALS耐性であるACRとは対照的です。 TESするためにはこの仮説T、切除した葉のアッセイは、[URL-14 C]プリミスルフロンメチル、スルホニル尿素家族のALS阻害除草剤を用いて行きました。代表的なHPLCクロマトグラム(約21.6分の保持時間)14 C-プリミスルフロンメチルのピーク面積は、12 HAT( 図2)でのACRとWCSよりもMCRで有意に小さかったです。また、プリミスルフロンメチルより短い保持時間を有する2つの極性の代謝産物は、全ての3つの集団( 図2)から切除された葉抽出物中に検出されました。これらの二つの極性代謝物の構造は、本研究では測定されなかったが、彼 ​​らの迅速な形成は、グルコース抱合5(第II相代謝)に続くプリミスルフロンメチル8(第I相代謝)のリング水酸化と一致しています。

MCR、ACR、およびWCSのプリミスルフロン代謝の定性分析との組み合わせで( 図2)、量各時点で残っている親の除草剤を定量し、MCR(13.6時間)、ACR(> 24時間)にプリミスルフロンメチルのためのDT 50値を決定するために用い、WCS(> 24時間)( 図3)。 MCRの有意に短いDT 50値は、前の全植物の研究13にあったこの集団におけるALSの抵抗のための主要なメカニズムとして、増加した代謝と一致しています。しかしながら、興味深いことに、ACRとWCSのプリミスルフロンのためのDT 50値は、MCRとACRの両方がALS阻害剤耐性の表現型( 表1)を表示するにもかかわらず、まだかなり長いMCRよりも( 図3)に類似しています。 ACRは、その主な耐性機構14としてはあまり敏感なALS酵素を持っているので、それは、急速にプリミスルフロンを代謝する必要がないため、ACRで比較的長いDT 50は、おそらくです。要約すると、私たちの研究に利用切除しwaterhempの葉のアッセイは、貴重な資格が得られましたlitativeと定量的データとMCR、ACR、およびWCS内の2つの異なる除草剤に向けた代謝ベースの耐性機構に新たな洞察を提供しました。

図1
。図1:摘出したwaterhempでメソトリオン代謝の時間経過は、栄養クローン化された集団から離れる切除した葉(サード最年少の葉、長さ2〜3センチ)waterhempの苗(10〜12センチ)からは、栄養となるよう各時間経過クローニングしました各ラインの研究では、遺伝的に同一の植物で構成されていました。切除された葉は(「パルス」)、1時間、0.1 MのTris-HCl(pHを6)プラス150μM放射性標識メソトリオン続いて、1時間、0.1 MのTris-HCl緩衝液(pH 6)中に入れ、次に四分の一強ムラシゲとスクーグ(MS)塩溶液を0時間、5時間、11時間、23時間、および35時間のために( 'チェイス')は代謝が生じることを可能にします。ダTA非線形最小二乗回帰分析によって分析し、ACRおよびWCSクローン株は、メソトリオンを代謝しながら、それぞれのクローン化されたwaterhemp集団について個別に12【選択MCRクローン株速やかに代謝メソトリオンをDT 50を推定するために 、単純な一次曲線でフィットさせましたもっとゆっくり。示したデータは、(植物生物学者のアメリカの社会によって著作権)前報12から変更されている各waterhemp集団のための唯一のクローンライン5からの時間のコースです。

図2
図2:150μMの放射性標識されたプリミスルフロンメチル付属のMCR、ACR、およびWCS(12 HAT)におけるプリミスルフロンメチル代謝切り出したwaterhemp葉抽出物のための代表的な逆相HPLCクロマトグラム(12 HAT)(議定書に記載されている)からマクリーン郡(MCR、A)、アダムズ郡(ACR、B)、NDウェイン郡除草剤感受性(WCS、C)集団( 表1)。本格的な分析標準との比較によって決定されるように21.6分の保持時間を有する放射性ピークが、プリミスルフロンメチルが含まれています。短い保持時間のピークは、このようなヒドロキシプリミスルフロンメチル8またはヒドロキシル化代謝物5,6のグリコシル化形態としてプリミスルフロンメチルの可能性が高い極性、少ない植物毒性代謝物です。 MCRの人口は、MCRの下限DT 50( 図3)として定量化され、ACRおよびWCS、親プリミスルフロンメチルの量の有意な減少を示しました。

図3
図3:摘出しwaterhemp葉で切除したwaterhemp葉プリミスルフロンメチル代謝の時間経過 (THIRD-最年少葉。 図1及びメソトリオン12とのこれまでの研究で説明したように「パルス」と葉が0時間のためのMS塩溶液(「チェイス」)中でインキュベートしたように、その150μMの放射性標識されたプリミスルフロンが含まれたことを除いて2)cmの3には、処理しました、3時間、および11時間。メソトリオン代謝( 1)12 について前述したように、データは、非線形最小二乗回帰分析によって分析しました。 ACRとWCSはよりゆっくりと(DT 50> 24時間)プリミスルフロンメチルを代謝しながら、MCRの人口は急速に、プリミスルフロンメチル(DT 50 = 13.6時間)代謝します。

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Discussion

本明細書中に記載の切除した葉の方法は、トウモロコシが15を残すにプリミスルフロン代謝の研究で以前に使用されてきたが、我々の結果は、このプロトコルはまた、双子葉雑草種12に除草剤の代謝を測定するための、効果的かつ正確で再現性があることを示しています。全植物の研究と比較して、切除した葉の技術の主な利点は、切除された葉が発芽後の全植物転パターン、全身の除草剤または植物または集団間の除草剤の取り込みの違いとは無関係であることです。切除した葉のアッセイは、温室条件下で成長させた植物全体を研究と比較して、試験管に入れ、単一の葉に、成長チャンバー内で実施されるのでさらに、環境変動が低減されます。栄養クローニング戦略も内の遺伝的分散の大きな度合いを最小限にし、なるようにMCR 12にメソトリオン耐性メカニズムを研究するための私達の方法に含まれていましたトゥイーンアマランサス集団 9。雑草アマランサス集団内の遺伝的多様性は、発芽後除草剤18のいくつかの家族に、全プラントの応答に記載さ変動の量によって示されています。正確なDT 50を決定するために、経時的研究を行い、有意差を検出するときwaterhemp集団12間のDT 50値を比較する場合、これらの手順は、(私たちの切除された葉と栄養クローニングプロトコルで概説されるように)、遺伝的および環境的に除去または減少させるために重要です変動。

異なるメカニズムは、除草剤抵抗性を付与するために1,2植物に存在します。例えば、waterhemp抵抗にALS阻害除草剤は、14または13ベースの非標的サイトをベースターゲット部位であり得ます。プリミスルフロンメチル( 図3)の代謝速度は明らかに2 ALS耐性waterhの間にこれらの違いを示していますEMP集団、MCRやACR( 表1)。 PCR増幅および除草剤標的部位の遺伝子の配列分析と組み合わせて、切除した葉のアッセイは、非常にwaterhempまたは他の双子葉雑草における除草剤抵抗性は、標的部位または非標的部位の機構2によって付与されているかどうかを識別するに向け支援します。

私たちの切除された葉の方法の制限は、可視化や計測除草剤の移行パターンをプラント全体を通じて、またはセルラーまたはサブセルラー隔離機構がそれが雑草2に、非標的サイトベースの耐性を付与存在するかどうかを判断することができないことがあります。前述したように、この態様はまた、メソトリオン耐性雑草集団12に正確な除草剤の代謝速度を決定する利点と考えられたが、植物において有意に代謝されない全身性の除草剤を学ぶときに、逆( すなわち、非選択的なハーブの欠点を考慮することができますicides)は、パラコートやグルホシネート19などの自然雑草集団、非選択的であるグリホサート2、または接触除草剤など。ターゲットサイトのメカニズムが最初に明らかにされていない場合は、その後の除草剤代謝の強化率は、一般的には、そのようなプリミスルフロンメチル13などのALS阻害型除草剤などメソトリオン12などのHPPD阻害除草剤に対する雑草の抵抗性を研究するとき、次の1,4を検討していますこのようアトラジン1,12、またはアセチルCoA阻害除草剤4として、光化学系II阻害除草剤。

P450が雑草草種、 ヒエ人口 20にALS耐性に関連するだけでなく、MCR 12,13におけるメソトリオン及びALS抵抗とされています。 waterhempに関連する雌雄異株、双子葉雑草は、パーマーアマランス(A.のpalmeri)が 、また、いくつかの異なるメカニズムを介して、1 -除草剤耐性を開発する傾向がありますより多くの除草剤抵抗性雑草集団と種は世界3を通して文書化されていたよう3。、急速に潜在的な耐性機構として除草剤の代謝を調べる必要が増加していきます。異なるが、通常、除草剤抵抗性のメカニズムを調査するために使用される全植物の研究に関連して切除した葉のアプローチは、植物における除草剤の代謝を評価し、定量化するための正確で有益なツールです。その結果、切除した葉のアッセイを含む、正確で再現性のある方法でこれらの分析を実行する能力が大幅に草4および双子葉雑草12の両方に非標的部位の耐性メカニズムを決定する際に研究者を支援します。

この方法の将来のアプリケーションでも、大豆や綿などの双子葉作物で除草剤の代謝の速度を決定することを含むことができます。除草剤耐性ダイズ品種と私たちの研究室で進行中の研究を切除リットルをも利用していますEAFアプローチ。しかし、大豆は三つ葉の葉を持つマメ科作物であるため、「切り出し、葉柄」技術が採用されており、各三小葉の葉は主葉柄(スケルトン、Lygin、およびRiechers、未発表データ)を介して取り込みを経由して、放射性標識除草剤を吸収できるように開発し​​ました。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich A1296 for pre-germinating seeds
Potting medium Sun Gro Horticulture 49040233 for plant growth
Nutricote Agrivert  TOTAL BLEND 13-13-13 T100 slow-release fertilizer
Growth chamber E15 Controlled Environments Limited 20207 plant culturing
Tris base Fisher Scientific BP152-500 buffer for excised leaves
HCl (concentrated) Fisher Scientific A144500 adjust pH of buffer
Murashige and Skoog (MS) salts  Sigma-Aldrich M0404 incubation of excised leaves
Methanol Fisher Scientific A452-4 leaf washes after incubation
Acetone Sigma-Aldrich 179124 plant extractions
Acetonitrile (HPLC grade) Macron Fine Chemicals MKH07610 HPLC mobile phase
Formic acid  Mallinckrodt Analytical MK259205 acidify mobile phase pH
Micro-centrifuge Eppendorf 5417R 1.5 or 2.0 ml tubes
Centrifuge (temperature controlled) Eppendorf 5810R 15 or 50 ml tubes
Polypropylene centrifuge tube Corning Inc. 430790 15 ml, sterile
Rotary evaporator BÜCHI R200 concentrate plant samples
Liquid scintillation spectrometry (LSS) Packard Instruments 104470 quantify 14C
High-performance liquid chromatography Perkin Elmer N2910401 resolve herbicide metabolites
Flow scintillation analyzer  LabLogic System 1103303 for HPLC analysis of 14C
Hypersil Gold C18 column  Thermo-Scientific 03-050-522  reversed phase
Ultima-Flo M cocktail Perkin Elmer 6013579 for Flow-scintillation analyzer
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) Fisher Scientific SX18 for LSS; biodegradable
Laboratory homogenizer Kinematica CH-6010  homogenize leaf samples

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References

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環境科学、問題103、除草剤の代謝、生体異物解毒、チトクロームP450、グルタチオン
摘出葉のアッセイで双子葉雑草除草剤代謝の速度を測定します
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Ma, R., Skelton, J. J., Riechers, D. More

Ma, R., Skelton, J. J., Riechers, D. E. Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay. J. Vis. Exp. (103), e53236, doi:10.3791/53236 (2015).

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