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Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf

Published: September 7, 2015 doi: 10.3791/53236

Introduction

Resistencia a los herbicidas en las malezas presenta una seria amenaza para la producción mundial de alimentos y fibras 1,2. Actualmente, miles de poblaciones y biotipos resistentes de más de un centenar de especies de malas hierbas en todo el mundo se han documentado y estudiado 3. Un mecanismo importante que confiere resistencia a los herbicidas en las plantas es la alteración de los herbicidas genes y las proteínas diana del sitio, incluyendo mutaciones genéticas que afectan a la cinética de unión de la proteína herbicida o la amplificación del gen diana del sitio 2. Desintoxicación metabólica a través de actividades elevadas de monooxigenasa citocromo P450 (P450) o glutatión S transferasa (GST) enzimas es otro mecanismo que confiere resistencia a herbicidas en las malas hierbas, que es distinta de varias formas de mecanismos basados ​​target-site-2. Resistencia basada en metabólico tiene ramificaciones importantes para si los costos de acondicionamiento físico planta (también conocido como la aptitud sanciones) pueden ser el resultado de las mechanis herbicida de resistenciam, así como sobre la posibilidad de un único mecanismo de desintoxicación para conferir resistencia cruzada o múltiples herbicidas en las poblaciones de malezas 1,2,4. Generalmente, el metabolismo de los herbicidas en las plantas se puede dividir en tres fases distintas 5. Fase I implica la conversión herbicida o de activación, tales como hidroxilación mediada por P450 de anillos aromáticos o grupos alquilo, o por N - o reacciones de desalquilación O-, lo que aumenta la polaridad y herbicida parcial desintoxicación 5,6. De reciente introducción de grupos funcionales en la fase I pueden proporcionar sitios de enlace para la conjugación de glutatión reducido por GST o glucosa por glicosiltransferasas UDP-dependientes en la Fase II de 5,7. Por ejemplo, el principal metabolito inicial de primisulfuron-metil en el maíz es hidroxi-primisulfuron-metil 8, que puede ser metabolizado adicionalmente a hidroxi-primisulfuron-glucósido (Fase II) y luego transportado a la vacuola para el almacenamiento a largo plazo o más metabólica proprocesamiento 5,6 (Fase III).

Rudis (Amaranthus tuberculatus) es una especie anual dicotiledóneas de difícil control de malezas que dificulta la producción de maíz (Zea mays), soja (Glycine max) y el algodón (Gossypium hirsutum) en los Estados Unidos. El alto grado de diversidad genética de rudis se ve facilitada por su biología dioica y de larga distancia polinización por el viento, y una sola planta rudis hembra puede producir hasta un millón de semillas 9. Estas semillas son pequeñas y de fácil propagación, lo que naturalmente dotar rudis con un mecanismo de dispersión efectiva. Rudis muestra germinación continua durante todo el ciclo de cultivo 9, y sus semillas son capaces de germinar después de varios años de inactividad. Rudis es una planta C 4 que posee una tasa de crecimiento superior a la mayoría de las malezas de hoja ancha en los sistemas de cultivo de cultivo 10. Además, numerosas poblaciones rudis son resistentes a múltiples families de herbicidas 3.

Una población de rudis (designado MCR) de Illinois es resistente a la 4-hidroxi-fenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) herbicidas -inhibiting 11, tales como mesotriona, así como a la atrazina y la acetolactato sintasa (ALS) herbicidas inhibidores, incluyendo primisulfuron-metil , debido a los mecanismos no basados ​​en meta-sitio 12,13. Una población diferente de rudis designada ACR 14, que es primisulfuron-metil-resistente (debido a una mutación en el gen ALS) y la atrazina resistentes pero sensibles a la mesotriona, y una población rudis designado WCS 14 que es sensible a primisulfuron-metil, mesotriona y atrazina se utilizaron en comparación con MCR en nuestra investigación previa 12 y los experimentos actuales (resumen en la Tabla 1). Los estudios iniciales no detectaron alteraciones en la secuencia del gen HPPD o niveles de expresión, o reducción de la absorción mesotriona, en el MCRpoblación, en comparación con las poblaciones-mesotriona sensibles 12. Sin embargo, los estudios de metabolismo con plantas enteras demostraron niveles significativamente más bajos de herbicida mesotriona padres en MCR en comparación con el ACR y WCS, que se correlacionaban con las respuestas fenotípicas anteriores para mesotriona 11,12.

Rudis Población Abreviatura Fenotipo de Mesotriona Mecanismo de resistencia mesotriona Fenotipo de primisulfuron Mecanismo de resistencia primisulfuron
McLean County-resistente MCR Resistente Metabolismo * Resistente Metabolismo
Adams County-resistente ACR Sensithe - Resistente Mutación de destino de las instalaciones en la ELA 14
Wayne County-Sensible WCS Sensible - Sensible -

* Mecanismos de resistencia no-objetivo del sitio, excepto el metabolismo mejorado, también pueden conferir resistencia mesotriona en la población MCR 12.

Tabla 1: Descripción de la población rudis de Illinois utilizados en este estudio.

Además de determinar las tasas de metabolismo de los herbicidas en las plantas de semillero rudis intactas, un enfoque experimental diferente fue desarrollado y empleado en nuestra investigación anterior para investigar el metabolismo mediante el uso de un ensayo extirpado rudis hoja 12, así como diversos inhibidores de P450 (por ejemplo, tetcyclacis y malatión). Este método fue adaptado específicamente para rudis de un Previous investigación del metabolismo primisulfuron-metil en el maíz extirpado hojas 15, puesto que el ensayo de la hoja extirpada aún no había sido reportado para la realización de investigaciones metabolismo de los herbicidas en una planta dicotiledónea. El insecticida malatión organophophosate se ha utilizado con frecuencia para in vivo y en la investigación herbicida metabolismo vitro para indicar la participación P450 16. Por ejemplo, la tolerancia y el rápido metabolismo de mesotriona en el maíz se deben a la hidroxilación del anillo catalizado-P450, que se verifica cuando el malatión aumento de la sensibilidad de maíz a la mesotriona 17. Del mismo modo, el malatión inhibe el metabolismo del inhibidor primisulfuron-metil ALS en el maíz extirpado deja 15. Una ventaja importante de la técnica de hoja extirpada es que los datos generados son independientes de los patrones de translocación planta entera, un factor importante a considerar al evaluar el metabolismo de los herbicidas de postemergencia, sistémicas en las plantas. Por consiguiente, este método permite cuantitativa ymetabólica análisis cualitativos para centrarse en una sola hoja tratada 12.

Una estrategia de clonación vegetativa, en combinación con el protocolo de hoja extirpada, se utilizó previamente en rudis para llevar a cabo estudios de metabolismo 12. Debido a la naturaleza cruzamiento de rudis (varón separado y plantas femeninas), y en gran medida de la diversidad genética dentro de las especies de Amaranthus dioicas 9, este protocolo garantiza que se analizaron las plántulas rudis genéticamente idénticos dentro de los experimentos de tiempo-por supuesto. Este artículo demuestra la utilidad del método de la hoja extirpada para medir las tasas de metabolismo de los herbicidas en una mala hierba dicotiledónea (rudis). La cantidad de herbicida matriz restante se determinó en cada punto de tiempo (Figura 1) por análisis de regresión de mínimos cuadrados no lineal, y se ajuste con una curva de primer orden sencillo con el fin de estimar el tiempo para 50% de herbicida absorbido para degradar ( DT 50). Representativocromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) se muestran para ALS-resistentes y poblaciones rudis -sensibles, que indican la desaparición de los herbicidas de los padres y la formación concomitante de metabolito polar (s) durante un estudio de evolución temporal (Figura 2). El objetivo de nuestro artículo es describir y demostrar la utilidad de la prueba de la hoja extirpado en combinación con un método de clonación vegetativa para la determinación de las tasas precisas y reproducibles del metabolismo de los herbicidas en plantas dicotiledóneas, utilizando el anillo marcado (URL- 14 C) herbicidas uniformemente en tres poblaciones rudis que difieren en sus respuestas a la planta entera HPPD- y herbicidas inhibidores de ALS (Tabla 1).

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Protocol

1. Material Vegetal, condiciones de crecimiento, y vegetativo Clonación

Nota: Tres poblaciones rudis fueron investigados en esta investigación: MCR (del condado de McLean, IL), ACR (de Adams County, IL), y WCS (de Wayne County, IL) (Tabla 1).

  1. Recoger y suspender semillas rudis en 0,1 g de agar L -1: solución de agua a 4 ° C durante al menos 30 días para mejorar la germinación. Nota: Algunas poblaciones rudis están latentes, pero este paso ayuda a superar la latencia y hacer germinar la semilla de manera más uniforme.
  2. Germinar semillas de cada población rudis (como en la Tabla 1) en 12 x 12 cm bandejas que contienen un medio para macetas en el invernadero.
    1. Mantener condiciones de invernadero a 28/22 ° C temperatura día / noche en un fotoperiodo de 16/8 h 12.
    2. Suplemento luz natural en el invernadero con la luz de las lámparas de haluro de mercurio para proporcionar un mínimo de 500 mol m -2 -1 fotones a nivel del dosel vegetal.
  3. Trasplante surgió plántulas cuando son 2 cm de altura en 80 cm 3 ollas en el invernadero.
  4. Trasplantar las plántulas en 950 cm 3 ollas que contienen una mezcla 3: 1 de mezcla para macetas:: 1: 1 de suelo: turba: arena cuando las plántulas son de 4 cm de altura. Añadir 5 g de gránulos de fertilizante de liberación lenta a cada maceta y mezclar con esta mezcla de suelo.
  5. Corte y retire el meristemo apical contiene las tres hojas más jóvenes a partir de 7 cm plantas altas para eliminar la dominancia apical.
    Nota: Este paso asegura que cada planta crecerá suficientes brotes axilares 3 cm de clonar.
  6. Impuestos Especiales cinco brotes axilares (3 cm de longitud) cuando las plántulas son unos 14 cm de altura de cada población rudis (como en la Tabla 1). Eliminar la mayoría de las hojas de estos brotes axilares para disminuir la pérdida de agua a su posterior manipulación, pero conservan las dos hojas más jóvenes para permitir un mayor crecimiento en el trasplante.
  7. Axilar Transplant dispara en 80 cm 3 macetas (una plántula por maceta) en medio de la maceta, que es el mismo medio usado para la germinación. Medio de la maceta debe ser saturada inicialmente hasta que se formen raíces en la cámara de crecimiento, a continuación, mantener constantes de humedad y colocar macetas en la cámara de crecimiento durante 7 días para establecer raíces.
    Nota: Las plantas son muy sensibles en este punto y no hay que destacar.
    1. Mantener las condiciones de cámara de crecimiento a 28/22 ° C temperatura día / noche en un fotoperiodo de 16/8 h 12.
    2. Una combinación de las bombillas incandescentes y fluorescentes puede ser utilizado para proporcionar luz en la cámara de crecimiento y debe entregar al menos 550 mol m -2 s -1 flujo de fotones a nivel de copa de la planta 12.
  8. Trasplante de nuevo en 950 cm 3 macetas (una plántula por maceta) containing una mezcla 3: 1 de mezcla para macetas:: 1: 1 de suelo: la turba: arena (también incluirá 5 g de liberación lenta gránulos de fertilizante) cuando las plantas clonadas son 4 cm de altura, a continuación, transferir de nuevo al invernadero.
  9. Clonar las plantas segunda vez utilizando el mismo método descrito anteriormente (es decir, repita los pasos 1,5 a 1,8, y luego vaya al paso 2.1). Para un estudio de tiempo-curso típico, generar clones de al menos seis plantas independientes de cada población rudis y grabarlos como líneas MCR 1-6, 1-6 y ACR WCS 1-6.
    1. Establecer al menos seis distintas "padres" líneas clonales con el fin de repetir el experimento y adecuadamente representar la variabilidad genética dentro de cada población rudis.
    2. Dependiendo del número de puntos de tiempo se analizará, generar suficientes sub-clones de cada línea clonal "padre" para llevar a cabo un estudio del curso del tiempo.

2. La realización de un estudio del metabolismo con extirpados WaterhemHojas p

  1. Extirpar las terceras más jóvenes hojas (de 2 a 3 cm de longitud; incluir 0,5 cm de peciolo adjunta) cuando las plantas rudis clonados son de 10 a 12 cm de altura para el metabolismo de los herbicidas y DT 50 análisis.
  2. Pecíolos Cortar la hoja de cada planta rudis por segunda vez (asegurando que 0,3 cm de pecíolo permanece) bajo el agua, y colocar estos extremos cortados en 1,5 ml viales de plástico (una hoja por vial) 15.
    Nota: Cortar una segunda vez bajo el agua evita que las burbujas de aire que se formen y tapar los vasos del xilema.
    1. En primer lugar, sumerja parcialmente hojas cortadas con el corte del peciolo en tampón de pre-incubación (200 l) de 0,1 M Tris-HCl (pH 6) durante 1 hora.
    2. En segundo lugar, mover cada hoja a un nuevo 1,5 ml vial que contiene un tampón de incubación (200 l) de 0,1 M Tris-HCl (pH 6), además de 150 mM [14 URL- C] herbicida, y se incuba a 28 ° C durante 1 hr a permitir la absorción del herbicida en las hojas.
      Nota: Tanto la 14 C-mesotriona y -1. Tanto la difusión y la absorción a través de la corriente de transpiración xilema contribuyen a la cantidad de herbicida tomado por hoja.
      Nota: El efecto de los inhibidores metabólicos sobre el metabolismo de los herbicidas se puede determinar mediante la modificación de los pasos 2.2.1 y 2.2.2 anteriormente. Añadir 100 mM del inhibidor a la memoria intermedia pre-incubación y dejar incubar durante 2 hr, luego se transfieren a tampón de incubación con el herbicida y otra vez Añadir 100 mM inhibidor. Por ejemplo, malatión y tetcyclacis inhiben ciertas actividades del citocromo P450 en plantas 15-17.
    3. Lave la parte sumergida de hojas cortadas con agua desionizada y transferir hojas cortadas a un cuarto de la fuerza de Murashige y Skoog (MS) solución de sales (500 l) durante 0 horas, 5 horas, 11 horas, 23 horas o 35 horas, respectivamente, en la cámara de crecimiento para el estudio del metabolismo curso temporal.
  3. Cosecha quitando la licencias de la solución de incubación en el punto de tiempo apropiado y moler manualmente cada tejido de la hoja en nitrógeno líquido usando un tubo de polipropileno (15 ml) y una maja de vidrio.
  4. Extraer herbicida radiomarcado y sus metabolitos a partir de cada hoja con 7 ml de 90% de acetona con un homogeneizador de tejidos de laboratorio en el mismo tubo de polipropileno como anteriormente. Enjuague homogeneizador de tejidos con un adicional de 7 ml de 90% de acetona, y continuar para homogeneizar hasta que el tejido se pulveriza a fondo (generalmente alrededor de 2 min). Nota: 90% de acetona se puede utilizar para la extracción de la mayoría de los herbicidas de los tejidos vegetales. Sin embargo, si este método es incapaz de extraer más de 90% de los compuestos radiomarcados absorbidos, a continuación, 90% de metanol o acetonitrilo al 90% pueden estar sustituidos como el disolvente de extracción.
  5. Label 90% extractos de acetona (14 ml en total) y se almacena a 4 ° C durante 16 horas para permitir que se produzca la extracción adicional.
    Nota: Después de esta extracción de hojas tratadas, la cantidad de rad extraíbleioactivity es típicamente al menos 98% de compuestos radiomarcados absorbidos por la hoja tratada. Radiactividad no extraíble (residuos ligados) en las hojas cortadas en promedio sólo el 0,3% en todos los puntos de tiempo en nuestro estudio anterior 12, pero esta cantidad puede variar de acuerdo con el herbicida utilizado y el punto de tiempo examinado.
  6. Se obtuvieron muestras de centrifugar a 5000 xg durante 10 min y el concentrado de sobrenadantes a 40 ° C con un evaporador giratorio hasta un volumen final de 0,5 ml. Transferencia este volumen a un tubo de plástico 2,0 ml.
  7. Añadir acetonitrilo: agua (1: 1, en volumen) para ajustar el volumen final de la planta extrae a 1,25 ml y volver a centrifugar a 10.000 xg durante 10 minutos para eliminar cualquier partícula.
  8. Medir la radioactividad total en una alícuota tomada de cada muestra (dpm l -1) por espectroscopía de centelleo líquido (LSS) 12 y normalizar cantidades de [14 C-etiquetados] compuestos inyectados para el análisis HPLC (por ejemplo, 10,000 total dpm / muestra / run) para y-ejes será uniforme entre las muestras al graficar los resultados.

3. Análisis de HPLC Herbicida Metabolismo en hojas extirpados

Nota: Resolver total de radiactividad extraíble en herbicidas padres y herbicidas metabolitos utilizando las siguientes condiciones de RP-HPLC 12.

  1. Realizar RP-HPLC con una columna C 18 (4,6 x 250 mm, 5 micras de tamaño de partícula para HPLC analítica) a una velocidad de flujo de 1 ml min -1 para la mayoría de los herbicidas no polares.
    Nota: columnas C 4 o C 12 de RP-HPLC también se pueden utilizar para optimizar la separación del herbicida padre de sus metabolitos. Un filtro de pre-columna y / o columna de seguridad también se pueden usar para proteger y prolongar la vida de la columna de RP.
    1. Utilice la siguiente fase móvil para RP-HPLC: Eluyente A, 0,1% de ácido fórmico (v / v) en agua, y Eluyente B acetonitrilo de grado HPLC 100%.
      Nota: metanol grado HPLC también se puede utilizar como Eluente B para la resolución de los compuestos más polares y metabolitos, pero tenga en cuenta que los tiempos de retención también pueden cambiar.
      Nota: El perfil de elución se utiliza para resolver mesotriona o primisulfuron-metil de sus metabolitos polares en nuestra investigación 12 es: Paso 1, A: B (4: 1, v / v) a A: B (3: 2, v / v ) en un gradiente lineal (12 min); Paso 2, A: B (3: 2, v / v) a A: B (3: 7, v / v) en un gradiente lineal (5 min); Paso 3, A: B (3: 7, v / v) a A: B (1: 9, v / v) en un gradiente lineal de 2 min (que comprende un total de 19 min).
      Nota: Los degradados y pasos isocráticas pueden necesitar ser ajustado en base a las propiedades físicas del material original con el fin de optimizar la resolución.
    2. Siga los pasos gradiente lineal anteriores con A: B (1: 9, v / v) a A: B (4: 1, v / v) en un gradiente lineal (3 min) y A: B (4: 1, v / v) etapa isocrática (por lo menos durante 2 min) para volver a equilibrar la columna de la RP antes de inyectar la próxima extracto de 12.
  2. Detectar y visualizar compuestos radiomarcados con un Scinti Flowlación Analizador. Registrar la cantidad de herbicida matriz restante en cada muestra como un porcentaje de la radiactividad total en cada muestra (detectado y cuantificado por el flujo Analizador de Centelleo de acuerdo con las instrucciones del fabricante) para determinar las tasas de metabolismo de los herbicidas en cada población rudis durante el curso del tiempo.

4. Procedimientos estadísticos

  1. Organizar tratamientos en un diseño completamente al azar (u otro dispositivo adecuado para el análisis estadístico).
  2. Realice dos experimentos independientes con cada tratamiento, compuesto de tres réplicas biológicas para cada experimento. Los dos experimentos independientes incluyen seis repeticiones biológicos en total. Si el efecto experimento es no significativa (α = 0,05), combinar y analizar los datos de cada experimento independiente. Si el efecto experimento es significativo, luego analizar cada experimento separado.
    Nota: Incluir los primeros tres repeticiones biológica in Experimento 1 y los próximos tres repeticiones biológica en el Experimento 2. Cada réplica biológica representa un "padre" clara línea clonal derivada de cada población (MCR 1-6, 1-6 ACR, y WCS 1-6) para que cada tiempo- análisis curso utiliza plantas genéticamente idénticas. Los dos experimentos independientes incluyen seis repeticiones biológicos en total, lo que permite una adecuada representación de la variabilidad genética y la determinación de una mediana DT 50 para cada población rudis.
  3. Analizar los datos con el análisis no lineal de mínimos cuadrados de regresión y ajuste con una curva de primer orden sencilla con el fin de estimar DT 50 s. La ecuación siguiente se describe el modelo:
    Ecuación 1
  4. donde en este modelo y representa el porcentaje del herbicida matriz restante en el tiempo t, μ i es el DT 50 para cadarudis población i, y el parámetro C 0 es la cantidad estimada de padres herbicida presente en t = 0 12.

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Representative Results

Se detectaron grandes diferencias en las tasas de metabolismo mesotriona entre cualquiera WCS o ACR y MCR (Figura 1). En cada punto de tiempo, MCR había metabolizado mesotriona más rápidamente que las dos poblaciones-mesotriona sensible, WCS y ACR, que se correlaciona con las respuestas fenotípicas planta entera anteriores 11. Por clonación suficientes plantas desde una única planta parental de cada población, los análisis tiempo-por supuesto metabolismo herbicida son uniformes y reproducibles debido a la falta de variabilidad genética dentro de cada curso temporal 12. Por ejemplo, el curso de tiempo para el metabolismo de mesotriona en la línea clonal 5 12 se muestra en la Figura 1. Un total de seis líneas clonales diferentes, derivado de seis plantas parentales individuales, fueron analizados de cada población (Tabla 1) para determinar una mediana global DT 50 valor, lo que indica que el metabolismo mesotriona en MCR fue significativamente más rápida ( 50 valor más corto) que los ACR o WCS 12. Además, nuestro estudio anterior con hojas extirpados mostró que los inhibidores de P450 disminuyeron significativamente el metabolismo de mesotriona en MCR y el maíz, pero no en ACR, y el principal metabolito inicial detectado en MCR se identificó como 4-hidroxi-mesotriona, lo que indica que el aumento de las tasas de P450 metabolismo mediado están asociados con la resistencia en MCR 12.

Además de estudiar los mecanismos de resistencia mesotriona en MCR, un objetivo relacionado fue determinar el mecanismo de resistencia a los inhibidores de ALS en MCR. Antes de investigación demostró que una sub-población derivada de MCR era ALS resistente, pero no poseen una mutación en el gen ALS sitio diana, lo que indica un mecanismo basado no diana del sitio 13. Esto está en contraste con ACR, que es ALS resistente debido a una mutación sitio diana que confiere un menos sensible a la enzima ALS 14. Con el fin de test esta hipótesis, el ensayo de la hoja extirpado se realizó con [URL- 14 C] primisulfurón-metilo, un herbicida inhibidor de ALS de la familia sulfonilurea. El área del pico de 14 C-primisulfuron-metil en un cromatograma de HPLC representativo (tiempo de retención de aproximadamente 21,6 min) fue significativamente menor en MCR que en ACR y WCS en 12 HAT (Figura 2). Además, se detectaron dos metabolitos polares con tiempos de retención más cortos que primisulfuron-metilo en extractos de hojas extirpados de las tres poblaciones (Figura 2). Aunque las estructuras de estos dos metabolitos polares no se determinaron en este estudio, su formación rápida es coherente con la hidroxilación del anillo de primisulfuron-metil 8 (metabolismo de fase I), seguido por la glucosa conjugación 5 (metabolismo de Fase II).

En combinación con los análisis cualitativos del metabolismo primisulfuron en MCR, ACR, y WCS (Figura 2), la cantidaddel padre herbicida restante en cada momento se cuantificó y se utiliza para determinar los valores de DT 50 para primisulfuron-metilo en MCR (13,6 horas), ACR (> 24 h), y WCS (> 24 h) (Figura 3). El significativamente más corto DT 50 valor en MCR es consistente con el aumento del metabolismo como el principal mecanismo para la resistencia a ALS en esta población, de acuerdo con investigaciones anteriores de toda la planta 13. Curiosamente, sin embargo, los valores DT 50 para primisulfuron en ACR y WCS son similares todavía significativamente más largo que en MCR (Figura 3), a pesar de tanto MCR y ACR se presentan fenotipos resistentes a ALS-inhibidor (Tabla 1). La relativamente larga DT 50 en ACR es posiblemente debido a que no es necesario para metabolizar rápidamente primisulfuron, ya ACR tiene una enzima ALS menos sensible como su principal mecanismo de resistencia 14. En resumen, el ensayo de la hoja rudis extirpado utilizado en nuestra investigación dio valiosa quadatos y litative y cuantitativos proporcionan nuevos conocimientos sobre los mecanismos de resistencia a base de metabolismo hacia dos herbicidas diferentes en MCR, ACR, y WCS.

Figura 1
Figura 1:. Evolución temporal del metabolismo mesotriona en rudis extirpado deja de poblaciones vegetativamente clonados hojas extirpados (hoja tercero más joven; de 2 a 3 cm de longitud) de plántulas rudis (10 a 12 cm) fueron clonados vegetativamente para que cada vez platos estudio para cada línea consistía en plantas genéticamente idénticas. Hojas cortadas se colocaron en 0,1 M de tampón Tris-HCl (pH 6) durante 1 hora, seguido de 0,1 M Tris-HCl (pH 6), además de 150 mM mesotriona radiomarcado durante 1 hora ("pulso"), a continuación, de un cuarto de la fuerza de Murashige y Skoog (MS) solución de sales ('chase') para 0 horas, 5 horas, 11 horas, 23 horas y 35 horas para permitir que el metabolismo ocurra. Data se analizaron mediante análisis no lineal de mínimos cuadrados de regresión y encaja con una curva de primer orden sencillo para estimar un DT 50 por separado para cada población rudis clonado 12 línea clonal .La MCR mesotriona metaboliza rápidamente, mientras que las líneas clonales ACR y WCS metabolizados mesotriona más lentamente. Los datos mostrados son cursos de tiempo de única línea clonal 5 para cada población rudis, que ha sido modificado desde nuestro anterior documento de 12 (Derechos de Autor por la Sociedad Americana de Biólogos de Plantas).

Figura 2
Figura 2:. Metabolismo primisulfuron-metilo en MCR, ACR, y WCS (12 HAT) Representante de fase inversa cromatogramas de HPLC de extractos extirpados rudis hojas (12 HAT) suministrados con 150 M radiomarcado primisulfuron-metilo (como se describe en el Protocolo) de Condado de McLean (MCR, A), el condado de Adams (ACR, B), unnd condado de Wayne-herbicida sensibles (WCS, C) poblaciones (Tabla 1). Pico radiactivo con un tiempo de retención de 21,6 min contiene primisulfuron-metil, tal como se determina por comparación con un estándar analítico auténtico. Los picos con tiempos de retención más cortos son posibles polares metabolitos, menos fitotóxicos de primisulfuron-metilo, tales como hidroxi-primisulfuron-metil 8 o formas glicosiladas de metabolitos hidroxilados 5,6. La población MCR muestra una disminución significativa en la cantidad de padres primisulfuron-metil relación con ACR y WCS, que se cuantifica como DT inferior 50 para MCR (Figura 3).

Figura 3
Figura 3:. Evolución temporal del metabolismo primisulfuron-metilo en hojas rudis extirpados hojas rudis extirpados (third-hoja más joven; De 2 a 3 cm) fueron tratados como se describe en la Figura 1 y nuestra investigación previa con mesotriona 12, excepto que 150 mM primisulfuron radiomarcado fue incluido como el "pulso" y las hojas se incubaron en la solución de MS sales ('chase') para 0 hr , 3 horas y 11 horas. Los datos fueron analizados por análisis de regresión de mínimos cuadrados no lineal como se describió anteriormente para el metabolismo de mesotriona (Figura 1) 12. La población MCR metaboliza rápidamente primisulfuron-metilo (DT 50 = 13,6 horas), mientras que la ACR y WCS metabolizan primisulfuron-metil más lentamente (DT 50> 24 h).

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Discussion

El método de hoja extirpada descrito en este documento se ha utilizado anteriormente en la investigación del metabolismo primisulfuron en hojas de maíz 15, pero nuestros resultados demuestran que este protocolo también es eficaz, preciso y reproducible para medir el metabolismo de los herbicidas en una especie de maleza dicotiledóneas 12. Una ventaja importante de la técnica de hoja extirpada en comparación con los estudios de la planta entera es que una hoja extirpada es independiente de los patrones de translocación planta entera de postemergencia, los herbicidas sistémicos o diferencias en la absorción de herbicida entre las plantas o de las poblaciones. Además, la variabilidad ambiental se reduce ya que los ensayos de hojas cortadas se llevan a cabo en una cámara de crecimiento, con una sola hoja colocada en un tubo, en comparación con el estudio de plantas enteras cultivadas bajo condiciones de invernadero. Una estrategia de clonación vegetativo también se incluyó en nuestro método para el estudio de mecanismos de resistencia a la mesotriona en MCR 12 para minimizar el gran grado de variación genética dentro y estarpoblaciones entre Amaranthus 9. La diversidad genética dentro de las poblaciones de maleza Amaranthus se ilustra por la cantidad de variabilidad en las respuestas documentado la planta entera a varias familias de herbicidas de postemergencia 18. Al llevar a cabo estudios de tiempo-por supuesto para determinar precisos DT 50 s y para detectar diferencias significativas al comparar DT 50 valores entre las poblaciones rudis 12, estos pasos (como se indica en nuestra hoja extirpado y el protocolo de clonación vegetativa) son fundamentales para eliminar o reducir la genética y el medio ambiente variabilidad.

Existen diferentes mecanismos en plantas para conferir resistencia a los herbicidas 1,2. Por ejemplo, la resistencia a los herbicidas rudis inhibidores de ALS puede ser objetivo-sitio basado 14 o no objetivo-sitio basado 13. Tasas metabólicas de primisulfuron-metilo (Figura 3) muestran claramente estas diferencias entre waterh dos ALS resistentepoblaciones emp, MCR y ACR (Tabla 1). En combinación con la amplificación por PCR y análisis de secuencias de herbicidas genes diana de sitio, el ensayo de la hoja extirpada será de gran ayuda en la identificación de si la resistencia a herbicidas en rudis u otras malezas dicotiledóneas es conferida por sitio de destino o no objetivo del sitio mecanismos 2.

Las limitaciones de nuestro método de hoja extirpado incluyen la incapacidad de visualizar o medir los patrones de translocación del herbicida a través de toda la planta, o para determinar si existen mecanismos de secuestro de celulares o subcelulares que confieren resistencia basada no diana-sitio en malezas 2. Como se mencionó anteriormente, este aspecto también se consideró una ventaja cuando la determinación de las tasas de metabolismo herbicidas precisas en las poblaciones de malezas mesotriona resistente 12, pero por el contrario podría considerarse un inconveniente en el estudio de herbicidas sistémicos que no se metabolizan de manera significativa en las plantas (es decir, de hierbas no selectivoicides), tales como glifosato 2, o de contacto herbicidas que son no selectivo en las poblaciones de malezas naturales, tales como paraquat o glufosinato 19. Sin embargo, si los mecanismos objetivo del sitio no se revelan inicialmente luego mejoradas tasas de metabolismo de los herbicidas suelen investigarse próxima 1,4, sobre todo en el estudio de resistencia de las malezas a los herbicidas inhibidores de HPPD como mesotriona 12, herbicidas inhibidores de ALS como primisulfuron-metil 13 , fotosistema II-inhibición de herbicidas tales como la atrazina 1,12, o herbicidas 4 acetil-CoA-inhibición.

P450s se han asociado con la resistencia a ALS en una población Echinochloa 20, una especie de malezas de pastos, así como con mesotriona y la resistencia ALS en MCR 12,13. A dioico, de malezas dicotiledóneas relacionada con rudis, Palmer amaranto (A. palmeri), también es propenso a desarrollar resistencia a los herbicidas a través de varios mecanismos diferentes 1-3. A medida que más poblaciones y especies de malezas resistentes a los herbicidas están documentados en todo el mundo 3, la necesidad de examinar rápidamente el metabolismo del herbicida como un mecanismo de resistencia potencial seguirá aumentando. El enfoque de la hoja extirpada, que es distinto pero relacionado con los estudios de la planta entera típicamente utilizados para investigar los mecanismos de resistencia a los herbicidas, es una herramienta precisa y valiosa para evaluar y cuantificar el metabolismo de los herbicidas en las plantas. Como resultado, la capacidad de realizar estos análisis con métodos precisos y reproducibles incluyendo el ensayo de hoja extirpada será de gran ayuda en la determinación de los investigadores mecanismos de resistencia no diana de sitio en ambos hierba 4 y 12 dicotiledónea malas hierbas.

Las futuras aplicaciones de este método también puede incluir la determinación de las tasas de metabolismo de herbicidas en cultivos de dicotiledóneas tales como soja y algodón. La investigación en curso en nuestro laboratorio con variedades de soja tolerantes a herbicidas también ha utilizado el l extirpadoenfoque EAF. Sin embargo, desde la soja es una leguminosa con hojas trifoliadas, una técnica de 'peciolo extirpado' se ha adaptado y desarrollado para que cada hoja trifoliada puede absorber el herbicida radiomarcado a través de la captación a través del pecíolo principal (Skelton, Lygin y Riechers, datos no publicados).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Sigma-Aldrich A1296 for pre-germinating seeds
Potting medium Sun Gro Horticulture 49040233 for plant growth
Nutricote Agrivert  TOTAL BLEND 13-13-13 T100 slow-release fertilizer
Growth chamber E15 Controlled Environments Limited 20207 plant culturing
Tris base Fisher Scientific BP152-500 buffer for excised leaves
HCl (concentrated) Fisher Scientific A144500 adjust pH of buffer
Murashige and Skoog (MS) salts  Sigma-Aldrich M0404 incubation of excised leaves
Methanol Fisher Scientific A452-4 leaf washes after incubation
Acetone Sigma-Aldrich 179124 plant extractions
Acetonitrile (HPLC grade) Macron Fine Chemicals MKH07610 HPLC mobile phase
Formic acid  Mallinckrodt Analytical MK259205 acidify mobile phase pH
Micro-centrifuge Eppendorf 5417R 1.5 or 2.0 ml tubes
Centrifuge (temperature controlled) Eppendorf 5810R 15 or 50 ml tubes
Polypropylene centrifuge tube Corning Inc. 430790 15 ml, sterile
Rotary evaporator BÜCHI R200 concentrate plant samples
Liquid scintillation spectrometry (LSS) Packard Instruments 104470 quantify 14C
High-performance liquid chromatography Perkin Elmer N2910401 resolve herbicide metabolites
Flow scintillation analyzer  LabLogic System 1103303 for HPLC analysis of 14C
Hypersil Gold C18 column  Thermo-Scientific 03-050-522  reversed phase
Ultima-Flo M cocktail Perkin Elmer 6013579 for Flow-scintillation analyzer
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) Fisher Scientific SX18 for LSS; biodegradable
Laboratory homogenizer Kinematica CH-6010  homogenize leaf samples

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References

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Ciencias Ambientales Número 103 del metabolismo de los herbicidas desintoxicación de xenobióticos citocromo P450 el glutatión la vida media inhibidor de la sintasa acetolactato herbicidas tricetona bioquímica vegetal, La degradación del herbicida la cromatografía líquida de alta resolución
Medición de Precios de los herbicidas Metabolismo en Dicot malas hierbas con un ensayo extirpados Leaf
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Ma, R., Skelton, J. J., Riechers, D. More

Ma, R., Skelton, J. J., Riechers, D. E. Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay. J. Vis. Exp. (103), e53236, doi:10.3791/53236 (2015).

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