Introduction
התנגדות קוטל עשבים בעשבים מהווה איום רציני לייצור העולמי של 1,2 מזון והסיבים. נכון לעכשיו, אלפי אוכלוסיות וbiotypes עמידות מלמעלה ממאה מיני עשבים בעולם תועדו ולמד 3. מנגנון עיקרי שמקנה עמידות קוטל עשבים בצמחים הוא השינוי של גני קוטל עשבים יעד אתר וחלבונים, כוללים מוטציות גנטיות המשפיעות על קינטיקה מחייבת קוטל עשבים-חלבון או הגברה של גן מטרת אתר 2. ניקוי רעלים מטבוליים באמצעות פעילות מוגברת של monooxygenase ציטוכרום P450 (P450) או אנזימי -transferase S גלוטתיון (GST) הוא מנגנון אחר שמקנה עמידות קוטל עשבים בעשבים, שהוא נבדל במספר דרכים ממנגנונים מבוססי יעד אתר 2. יש התנגדות מבוססת חילוף חומרים השלכות משמעותיות עבור האם עלויות כושר צמח (aka עונשי כושר) יכולות לנבוע מmechanis קוטל עשבים-ההתנגדותמ ', כמו גם לגבי הפוטנציאל למנגנון ניקוי רעלים יחיד להקנות עמידות צולבת או מרובה-קוטל עשבים באוכלוסיות עשב 1,2,4. בדרך כלל, חילוף חומרים קוטלי עשבים בצמחים יכולים להיות מחולק לשלושה שלבים ברורים 5. שלב I כרוך המרת קוטל עשבים או הפעלה כגון hydroxylation תיווך P450 של טבעות ריחניות או קבוצות אלקיל, או על ידי N - או תגובות dealkylation O-, שהוביל לקוטביות גדלה ועשבים חלקיים גמילה 5,6. חדש הציג קבוצות פונקציונליות בשלב שאני יכול לספק אתרי הצמדה לנטייה לגלוטתיון מופחת על ידי GSTs או לגלוקוז על ידי glycosyltransferases UDP תלוי בשלב II 5,7. לדוגמא, המטבוליט הראשוני העיקרי של primisulfuron-מתיל בתירס הוא הידרוקסי-מתיל-primisulfuron 8, שבו ניתן מטבוליזם נוסף להידרוקסי-primisulfuron-glucoside (Phase II) ולאחר מכן הועבר לvacuole לאחסון לטווח ארוך או חילוף חומרים נוספים פרוcessing 5,6 (Phase III).
Waterhemp (tuberculatus Amaranthus) הוא מין קשה לשליטה, dicot שנתי עשב שמעכב את הייצור של תירס (Zea Mays), סויה (מקסימום גליצין), וכותנה (Gossypium hirsutum) בארצות הברית. הרמה הגבוהה של מגוון הגנטי של waterhemp היא הקלה על ידי האבקת רוח הביולוגיה dioecious ומרחקים ארוכים שלה, וצמח waterhemp נקבה אחת יכול לייצר עד מיליון זרעים 9. זרעים אלה הם קטנים ולהתפשט בקלות, אשר באופן טבעי להעניק waterhemp עם מנגנון פיזור יעיל. Waterhemp מציג נביטה רציפה לאורך כל עונת גידול 9, וזרעיו יכולים לנבוט לאחר מספר שנים של תרדמת. Waterhemp הוא צמח C 4 שבעל שיעור צמיחה גבוה מרוב עשבי broadleaf במערכות חיתוך לעיבוד 10. בנוסף, אוכלוסיות waterhemp רבות עמידים בפני Fam מרובהilies של קוטלי עשבים 3.
אוכלוסייה של waterhemp (מיועד MCR) מאילינוי היא עמידה ל4-הידרוקסי-phenylpyruvate dioxygenase (HPPD) קוטלי עשבים -inhibiting 11, כגון mesotrione, כמו גם לאטרזין וsynthase acetolactate (ALS) -inhibiting קוטלי עשבים, כולל primisulfuron-מתיל , בשל מנגנונים מבוססים היעד הלא-אתר 12,13. אוכלוסייה שונה של waterhemp המיועדת 14 ACR, שהוא primisulfuron-מתיל-עמיד (עקב מוטציה בגן ALS) ואטרזין עמיד אבל רגיש לmesotrione, ואוכלוסיית waterhemp המיועדת 14 WCS שהוא רגיש לprimisulfuron-מתיל, mesotrione, ואטרזין שמשו בהשוואה לMCR במחקר שלנו לפני 12 וניסויים הנוכחיים (מסוכם בטבלה 1). מחקרים ראשוניים לא לזהות שינויים ברמות רצף גן HPPD או ביטוי, או ספיגת mesotrione מופחתת, בMCRאוכלוסייה בהשוואה לאוכלוסיות mesotrione רגישה 12. עם זאת, מחקרי חילוף חומרים עם כל צמחים הפגינו רמות נמוכות יותר באופן משמעותי של קוטל העשבים mesotrione ההורה בMCR לעומת ACR וWCS, אשר מתואם עם תגובות פנוטיפי קודמות לmesotrione 11,12.
| Waterhemp אוכלוסייה | קיצור | הפנוטיפ לMesotrione | מנגנון Mesotrione התנגדות | הפנוטיפ לPrimisulfuron | מנגנון Primisulfuron התנגדות |
| מקלין קאונטי-עמיד | MCR | עמיד | חילוף חומרים * | עמיד | חילוף חומרים |
| אדמס קאונטי-עמיד | ACR | Sensitאייב | - | עמיד | מוטציה יעד אתר ב -14 ALS |
| וויין קאונטי-רגיש | WCS | רגיש | - | רגיש | - |
* מנגנונים ללא יעד אתר התנגדות, מלבד חילוף חומרים משופרים, עשויים גם להעניק התנגדות mesotrione באוכלוסיית MCR 12.
טבלת 1: תיאור של אוכלוסיות waterhemp מאילינוי השתמשו במחקר זה.
בנוסף לקביעת תעריפים של חילוף חומרים קוטלי עשבים בשתילי waterhemp שלמים, גישה ניסויית שונה פותחה ומועסק במחקר הקודם שלנו כדי לחקור את חילוף החומרים באמצעות assay נכרת waterhemp עלה 12 כמו גם מעכבי P450 שונים (לדוגמא, tetcyclacis ומלתיון). שיטה זו הותאמה במיוחד עבור waterhemp מpreviחקירת היחידות הארגוניות של חילוף חומרים primisulfuron-מתיל בתירס נכרת משאירה 15, מאז assay העלה נכרת עדיין לא דווח לביצוע מחקר חילוף חומרים קוטלי עשבים במפעל dicot. מלתיון החרקים organophophosate כבר משמש לעתים קרובות לin vivo ובמחקר קוטל עשבים-חילוף חומרים מבחנה כדי לציין את מעורבות P450 16. לדוגמא, סובלנות וחילוף חומרים מהירים של mesotrione בתירס נובעים hydroxylation טבעת זרז-P450, אשר אומת כאשר מלתיון רגישות מוגברת לתירס mesotrione 17. באופן דומה, מלתיון עכבות חילוף חומרים של מעכב primisulfuron-מתיל ALS בתירס נכרת משאיר 15. יתרון עיקרי של טכניקת העלה נכרתה הוא שהנתונים שנוצרו אינם תלויים בדפוסי טרנסלוקציה-שלם צמח, גורם חשוב להביא בחשבון כאשר בוחנים את חילוף החומרים של קוטלי עשבים מערכתיים, postemergence בצמחים. כתוצאה מכך, שיטה זו מאפשרת כמותיים וחילוף חומרים איכותיים מנתחים להתמקד בעלה טופל יחיד 12.
אסטרטגית שיבוט וגטטיבי, בשילוב עם פרוטוקול העלה הניכר, נוצלה בעבר בwaterhemp לבצע מחקרי חילוף חומרים 12. בשל אופי outcrossing של waterhemp (זכר נפרד וצמחי נקבה), ומידה רבה של שונות גנטיות בתוך מיני Amaranthus dioecious 9, פרוטוקול זה הבטיח כי שתילי waterhemp גנטי זהים נותחו בניסויים בזמן הקורס. מאמר זה מדגים את התועלת של שיטת העלה נכרת למדידת שיעורים של חילוף חומרים קוטלי עשבים בעשב dicot (waterhemp). כמות העשבים הורה שנותרה הייתה נחוש בכל נקודת זמן (איור 1) על ידי ניתוח רגרסיה ריבועים לפחות שאינו ליניארי, והייתה בכושר עם עקומה מסדר הראשון פשוט כדי להעריך את הזמן עבור 50% מקוטלי עשבים נקלטו להשפיל ( DT 50). נציגchromatograms מכרומטוגרפיה הפוך-שלב ביצועים גבוהים נוזלית (RP-HPLC) מוצגים לALS עמיד ואוכלוסיות waterhemp -sensitive, המצביעות על היעלמותו של קוטל עשבים הורה והיווצרות נלווית של המטבוליט קוטבי (ים) במהלך מחקר בזמן קורס (איור 2). המוקד של המאמר שלנו הוא לתאר ולהדגים את התועלת של assay העלה נכרת בשילוב עם שיטת שיבוט וגטטיבי לקביעת שיעורים מדויקים ושחזור של חילוף חומרים קוטלי עשבים בצמחי dicot, באמצעות קוטלי עשבים באופן אחיד שכותרתו טבעת (14 URL- C) ב שלוש אוכלוסיות waterhemp שונות בתגובות-הצמח כולם לHPPD- וקוטלי עשבים עיכוב ALS (טבלת 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. צמח חומר, תנאי גידול, וגטטיבי שיבוט
שים לב: שלוש אוכלוסיות waterhemp נחקרו במחקר זה: MCR (ממחוז מקלין, IL), ACR (ממחוז אדאמס, IL), וWCS (ממחוז ויין, IL) (טבלת 1).
- לאסוף ולהשעות זרעי waterhemp באגר 0.1 גרם -1 L: פתרון מים ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 ימים כדי לשפר את הנביטה. הערה: אוכלוסיות waterhemp חלקם רדומות, אך צעד זה עוזר להתגבר תרדמת ולעשות זרע לנבוט יותר אחיד.
- לנבוט זרעים של כל אוכלוסיית waterhemp (כמו בטבלה 1) ב -12 x 12 סנטימטר המכילים מגשים בינוני שתילה בחממה.
- לשמור על תנאי חממה בטמפרטורות 28/22 יום / לילה מעלות צלזיוס בתוך photoperiod 16/8 שעות 12.
- תוספת אור טבעי בחממה עם אור ממנורות הליד הכספית לספק מינימום של 500 מ 'μmol -2 -1 פוטון ברמת החופה צמח.
- השתלה צמחה שתילים כשהם 2 ס"מ לסנטימטר 80 3 סירים בחממה.
- שתילי השתלה לתוך 950 סנטימטר 3 סירים המכילים 3: תערובת 1 של תערובת שתילה:: 1: 1 אדמה: כבול: חול כאשר שתילי 4 ס"מ. הוסף 5 גרם של גרגרי דשן בשחרור איטי לכל סיר ולערבב עם תערובת אדמה זו.
- לחתוך ולהסיר לירות meristem הפסגה מכיל שלושה עלים הצעירים מצמחים גבוהים 7 סנטימטר לחסל את הדומיננטיות הפסגה.
הערה: צעד זה מבטיח כי כל צמח יגדל מספיק יורה 3 בבית השחי סנטימטר לשבט. - חמישה יורה הבלו בבית השחי (3 ס"מ אורך) כאשר שתילים הם כ -14 ס"מ מכל אוכלוסיית waterhemp (כמו בטבלה 1). הסר את רוב העלים על יורה בבית השחי אלה כדי להקטין אובדן מים על טיפול נוסף, אך נשמר שני עלים הצעירים, כדי לאפשר צמיחה נוספת על השתלה.
- בית השחי השתלות יורה ל80 סנטימטר 3 סירים (שתיל אחד לכל סיר) לתוך מדיום שתילה, שהוא אותו בינוני המשמש לנביטה. בינוני שתילה צריך להיות רווי בתחילה עד צורת שורשים בתא הצמיחה, אז לשמור על סירים קבועים לחות ומקום בתא הצמיחה למשך 7 ימים להקים שורשים.
הערה: הצמחים רגישים מאוד בשלב זה ולא צריך להיות לחוצים.- לשמור על תנאים קאמריים צמיחה בטמפרטורות 28/22 יום / לילה מעלות צלזיוס בתוך photoperiod 16/8 שעות 12.
- שילוב של נורות ליבון והניאון יכול לשמש כדי לספק אור בתא הצמיחה וצריך לספק לפחות 550 מטר μmol -2 שניות -1 שטף פוטונים ברמת החופה צמח 12.
- ג השתלות שוב לתוך 950 סנטימטר 3 סירים (שתיל אחד לכל סיר)ontaining 3: תערובת 1 של תערובת שתילה:: 1: 1 אדמה: כבול: חול (כולל גם גרגרי דשן בשחרור איטי 5 ז) כאשר צמחים משובטים הם 4 ס"מ, ולאחר מכן להעביר חזרה לחממה.
- לשכפל את הצמחים בפעם שנייה על ידי שימוש באותה השיטה שתוארה לעיל (כלומר, חזור על שלבים 1.5-1.8, ולאחר מכן המשיכו לשלב 2.1). למחקר בזמן קורס טיפוסי, ליצור שיבוטים מלפחות שישה צמחים עצמאיים מכל אוכלוסיית waterhemp ולהקליט אותם כקווי MCR 1-6, 1-6 ACR וWCS 1-6.
- להקים לפחות שישה קווים משובטים "הורה" ברורים כדי לחזור על הניסוי ומספק מייצג שונות גנטיות בתוך כל אוכלוסיית waterhemp.
- תלוי כמה זמן נקודות ינותח, לייצר מספיק תת-שיבוטים מכל שורה "הורה" משובט לערוך מחקר בזמן קורס.
2. מנהלת מחקר מטבוליזם עם נכרת Waterhemעלים עמ '
- בלו העלים שלישיים-הצעירים (2 עד 3 ס"מ אורך; כוללים 0.5 סנטימטר של פטוטרת המצורפת) כאשר צמחי waterhemp משובטים הם 10 עד 12 ס"מ לחילוף חומרי קוטלי עשבים וDT 50 ניתוח.
- פטוטרות עלים גזור מכל צמח waterhemp פעם שנייה (0.3 סנטימטרים להבטיח כי של הפטוטרת נשאר) מתחת למים, ומניח את הקיצוץ אלה מסתיים לתוך 1.5 מיליליטר בקבוקוני פלסטיק (עלה אחד בכל בקבוקון) 15.
הערה: חיתוך בפעם שנייה מתחת למים מונע בועות אוויר מיצירה וחיבור כלי עצה.- ראשית, באופן חלקי לטבול עלים ניכרים עם פטוטרת חתך חיץ מראש דגירה (200 μl) של 0.1 מ 'טריס-HCl (pH 6) במשך שעה 1.
- שנית, להעביר כל עלה ל1.5 חדשים מיליליטר בקבוקון המכיל מאגר דגירה (200 μl) של 0.1 מ 'טריס-HCl (pH 6) בתוספת 150 מיקרומטר [URL- 14 C] קוטל עשבים, ולדגור על 28 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ל לאפשר לקליטת קוטל עשבים לעלים.
הערה: שני 14 C-mesotrione ו
הערה: ההשפעה של מעכבי חילוף חומרים בחילוף חומרי קוטלי עשבים יכולה להיקבע על ידי שינוי 2.2.1 צעדים ו2.2.2 לעיל. להוסיף של המעכב למאגר מראש הדגירה 100 מיקרומטר ולתת דגירה עבור שעה 2, ולאחר מכן להעביר למאגר דגירה עם קוטל עשבים ושוב להוסיף 100 מעכב מיקרומטר. לדוגמא, מלתיון וtetcyclacis לעכב פעילות ציטוכרום P450 מסוימת בצמחי 15-17. - שטוף את החלק השקוע של עלים נכרת עם מים ללא יונים ולהעביר עלים נכרת לרבע-כוח Murashige וSkoog פתרון (MS) מלחים (500 μl) לשעה 0, 5 שעות, 11 שעות, 23 שעות, או 35 שעות, בהתאמה, בתא הצמיחה למחקר חילוף חומרים בזמן קורס.
- קציר על ידי הסרת חופשהים מפתרון דגירה בנקודת הזמן המתאימה וידני לטחון כל רקמת עלה בחנקן נוזלי באמצעות צינור פוליפרופילן (15 מיליליטר) ועלי זכוכית.
- לחלץ קוטל עשבים רדיואקטיבי ומטבוליטים שלו מכל עלה עם 7 מיליליטר של אצטון 90% עם homogenizer רקמות מעבדה באותו הצינור פוליפרופילן כאמור לעיל. יש לשטוף homogenizer רקמות עם 7 מיליליטר נוסף של אצטון 90%, ולהמשיך homogenize עד רקמה כתושה (בדרך כלל על 2 דקות) ביסודיות. הערה: אצטון 90% יכול לשמש להפקת רוב קוטלי עשבים מרקמות צמח. עם זאת, אם בשיטה זו היא מסוגלת לחלץ יותר מ -90% מתרכובות רדיואקטיבי נספגו, אז מתנול 90% או 90% אצטוניטריל ניתן להחליף כממס החילוץ.
- תמציות לייבל 90% אצטון (14 מיליליטר סה"כ) ולאחסן ב -4 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות כדי לאפשר ללהתרחש חילוץ נוסף.
הערה: לאחר מיצוי זה של עלים שטופלו, הסכום של רד הנשלףioactivity הוא בדרך כלל לפחות 98% של תרכובות רדיואקטיבי נקלטו על ידי העלה טופל. רדיואקטיביות ללא נשלפת (שאריות מחויבות) בעלים נכרת בממוצע רק 0.3% בכל נקודות הזמן במחקר הקודם שלנו 12, אבל סכום זה יכול להשתנות בהתאם לקוטל העשבים המשמשים ונקודת זמן שנבדק. - צנטריפוגה דגימות XG 5000 עבור 10 דקות וsupernatants להתרכז ב 40 ° C עם מאייד סיבובי עד נפח סופי של 0.5 מיליליטר מתקבלות. העבר את הנפח זה לצינור פלסטיק 2.0 מיליליטר.
- להוסיף אצטוניטריל: מים (1: 1, לפי נפח) כדי להתאים את הנפח הסופי של תמציות הצמחים לרמה של 1.25 מיליליטר מחדש צנטריפוגות ב 10,000 XG במשך 10 דקות כדי להסיר כל חלקיקים.
- למדוד רדיואקטיביות כוללת בaliquot נלקח מכל מדגם (DPM μl -1) על ידי ספקטרוסקופיה נצנץ הנוזלית (LSS) 12 ולנרמל סכומים [14 C כותרת] תרכובות מוזרקות לניתוח HPLC (לדוגמא, 10,000 DPM / מדגם / ריצה כוללת) כך y-צירים יהיו אחידות בין דגימות כאשר גרפים תוצאות.
3. ניתוח HPLC של קוטל העשבים מטבוליזם בעלים נכרת
הערה: לפתור רדיואקטיביות לחילוץ כוללת למטבוליטים קוטל עשבים הורה ועשבים באמצעות תנאי RP-HPLC הבא 12.
- בצע RP-HPLC עם עמודת C 18 (4.6 x 250 מ"מ, 5 מיקרומטר גודל חלקיקים לHPLC אנליטי) בקצב זרימה של 1 דקות מיליליטר -1 עבור רוב קוטלי עשבים הלא-קוטביים.
הערה: גם טורי C 4 או 12 C-RP HPLC ניתן להשתמש כדי לייעל את ההפרדה של קוטל העשבים ההורה מהמטבוליטים שלה. גם מסנן מראש טור ו / או עמודת שומר ניתן להשתמש כדי להגן ולהאריך את חייו של טור RP.- השתמש בשלב הנייד הבא לRP-HPLC: eluent, חומצה פורמית 0.1% (V / V) במים, ו- 100% אצטוניטריל HPLC הכיתה eluent B.
הערה: גם מתנול HPLC הכיתה יכול לשמש כאלהשוטפת B לפתרון תרכובות ומטבוליטים קוטביות יותר, אבל להיות מודע לכך פעמים שמירה עשויות גם לשנות.
הערה: פרופיל elution משמש כדי לפתור mesotrione או primisulfuron-מתיל ממטבוליטים הקוטביים שלהם במחקר שלנו היא 12: שלב 1,: B (4: 1, נ / V) ל: B (3: 2, V / V ) בשיפוע ליניארית (12 דקות); שלב 2,: B (3: 2, נ / V) ל: B (3: 7, נ / V) בשיפוע ליניארית (5 דקות); שלב 3,: B (3: 7, נ / V) ל: B (1: 9, נ / V) בשיפוע ליניארית 2 דקות (כולל סך של 19 דקות).
הערה: מילויים וצעדי isocratic ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים המבוססים על התכונות הפיסיקליות של חומר ההורה על מנת לייעל את הרזולוציה. - בצעו את השלבים שלעיל ליניארי שיפוע עם: B (1: 9, נ / V) ל: B (4: 1, נ / V) בשיפוע ליניארית (3 דקות) ו: B (4: 1, נ ' צעד isocratic (לפחות 2 דקות / V)) מחדש לאזן את עמודת RP לפני הזרקת התמצית הבאה 12.
- השתמש בשלב הנייד הבא לRP-HPLC: eluent, חומצה פורמית 0.1% (V / V) במים, ו- 100% אצטוניטריל HPLC הכיתה eluent B.
- זיהוי ולדמיין תרכובות radiolabeled עם Scinti זרימהllation Analyzer. רשום את כמות העשבים הורה שנותרו בכל דגימה כאחוז מסך רדיואקטיביות בכל דגימה (זוהה ולכמת ידי זרימת נצנץ מנתח על פי הוראות היצרן) כדי לקבוע שיעורים של חילוף חומרים קוטלי עשבים בכל אוכלוסיית waterhemp במהלך הזמן.
4. נהלים סטטיסטיים
- לארגן טיפולים בעיצוב אקראי לחלוטין (או הסדר מתאים אחר לניתוח סטטיסטי).
- לבצע שני ניסויים בלתי תלויים עם כל טיפול, מורכב משלושה משכפל ביולוגי עבור כל ניסוי. שני ניסויים בלתי תלויים כוללים שישה משכפל ביולוגי בסך הכל. במידה והשפעת הניסוי היא לא משמעותית (α = 0.05), לשלב ולנתח נתונים מכל ניסוי עצמאי. במידה והשפעת הניסוי היא משמעותית, ולאחר מכן לנתח כל ניסוי בנפרד.
הערה: כולל שלושה משכפל הביולוגי הראשון שn ניסוי 1 ושלושה משכפל הביולוגי הבא בניסוי 2. כל לשכפל ביולוגי מייצג "הורה" ברור קו משובט נגזר מכל אוכלוסייה (1-6 MCR, ACR 1-6, וWCS 1-6), כך שכל גוזלים זמן ניתוח כמובן מנצל צמחים גנטי זהים. שני ניסויים בלתי תלויים כוללים שישה משכפל ביולוגי בסך הכל, המאפשר לייצוג הולם של השתנות ונחישות גנטיות של חציון 50 DT לכל אוכלוסיית waterhemp. - לנתח את הנתונים עם ניתוח רגרסיה ריבועים לפחות שאינו ליניארי ולהתאים אותם עם עקומה מסדר הראשון פשוט כדי להעריך DT 50 של. המשוואה הבאה מתארת את המודל:
- שבו בy מודל זה מייצג את אחוז קוטל העשבים ההורה שנותרו בזמן t, μ i היא DT 50 לכלהאוכלוסייה אני, והפרמטר C waterhemp 0 הוא הסכום המשוער של הווה קוטל עשבים הורה בזמן t = 0 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הבדלים גדולים בשיעורים של חילוף החומרים mesotrione התגלו בין שני WCS או ACR וMCR (איור 1). בכל נקודת זמן, MCR שחילוף חומרי mesotrione מהירות רב יותר מאשר אוכלוסיות שתי mesotrione רגיש, WCS וACR, אשר בקורלציה עם תגובות פנוטיפי-כל מפעל קודם 11. על ידי שיבוט מספיק צמחי מצמח הורים יחיד מכל אוכלוסייה, ניתוחים בזמן קורס חילוף חומרים קוטלי עשבים הם אחידים ושחזור בשל חוסר ההשתנות גנטית בתוך כל קורס זמן 12. לדוגמא, במהלך הזמן לחילוף חומרי mesotrione בקו משובט 5 12 מוצג באיור 1. כולל של שישה קווים משובטים שונים, הנגזרים משישה צמחי הורה בודדים, נותחו מכל אוכלוסייה (טבלה 1) כדי לקבוע חציון DT 50 ערך, אשר הצביע על כך שחילוף חומרי mesotrione בMCR היה מהיר יותר באופן משמעותי (
בנוסף ללימוד המנגנונים להתנגדות mesotrione בMCR, מטרה נלווה הייתה לקבוע המנגנון להתנגדות למעכבי ALS בMCR. המחקר קודם הראה כי תת-אוכלוסייה נובעת מMCR הייתה ALS עמידה אבל לא הייתה מוטציה בגן אתר היעד ALS, המצביעה על מנגנון 13 מבוסס יעד הלא-אתר. זאת בניגוד עם ACR, שהוא ALS עמיד עקב מוטציה אתר יעד שמעניקה אנזים ALS פחות רגיש 14. כדי TESלא השערה זו, assay העלה נכרת נערך עם [URL- 14 C] primisulfuron-מתיל, קוטל עשבים ALS-עיכוב של משפחת sulfonylurea. אזור השיא של 14 C-primisulfuron-מתיל בchromatogram HPLC נציג (זמן שמירה של כ 21.6 דקות) היה קטן יותר באופן משמעותי בMCR מאשר בACR וWCS ב 12 HAT (איור 2). בנוסף, שני מטבוליטים קוטביים עם זמנים קצרים יותר מאשר שמירת primisulfuron-מתיל אותרו בתמציות עלה נכרתו מן כל שלוש האוכלוסיות (איור 2). למרות שהמבנים של שני מטבוליטים קוטביים אלה לא נקבעו במחקר זה, ההיווצרות המהירה שלהם עולה בקנה אחד עם hydroxylation טבעת של primisulfuron-מתיל 8 (שלב I חילוף חומרים) ואחריו נטיית 5 (חילוף חומרים Phase II) של גלוקוז.
בשילוב עם הניתוח האיכותי של חילוף חומרים primisulfuron בMCR, ACR, וWCS (איור 2), הסכוםשל הורה קוטל עשבים שנותרו בכל נקודת זמן היה לכמת ומשמשים כדי לקבוע את DT 50 הערכים לprimisulfuron-מתיל בMCR (13.6 שעות), ACR (> HR 24), וWCS (> 24 שעות) (איור 3). DT 50 הערך הקצר יותר באופן משמעותי בMCR עולה בקנה אחד עם חילוף חומרים מוגברים כמנגנון העיקרי להתנגדות ALS באוכלוסייה זו, עולים בקנה אחד עם מחקר-כל המפעל הקודם 13. מעניין לציין, עם זאת, DT 50 הערכים לprimisulfuron בACR וWCS דומים עדיין באופן משמעותי יותר מאשר בMCR (איור 3), למרות שני MCR וACR בו מוצגות פנוטיפים עמידים ALS-מעכב (טבלה 1). DT הארוך יחסית 50 בACR הוא אולי בגלל זה הוא לא הכרחי לחילוף חומרי primisulfuron במהירות, שכן יש ACR אנזים ALS פחות רגיש כמנגנון ההתנגדות העיקרי שלה 14. לסיכום, assay עלה waterhemp נכרת בשימוש במחקר שלנו הניב קואה יקרהנתונים וlitative וכמותיים הניתנים תובנה חדשה מנגנוני התנגדות מבוסס חילוף חומרים לשני קוטלי עשבים שונים בMCR, ACR, וWCS.
איור 1:. כמובן זמן של חילוף חומרים mesotrione בwaterhemp נכרת יוצא מאוכלוסיות משובטות vegetatively עלים נכרת (עלה שלישי צעיר; 2 עד 3 ס"מ אורך) משתילי waterhemp (10 עד 12 סנטימטרים) היו משובט vegetatively כך שכל זמן כמובן מחקר עבור כל קו מורכב מצמחים גנטי זהים. עלים נכרת הונחו ב 0.1 חיץ M טריס- HCl (pH 6) במשך שעה 1, ואחריו 0.1 מ 'טריס-HCl (pH 6) בתוספת 150 מיקרומטר mesotrione רדיואקטיבי עבור שעה 1 ("דופק"), ואז רבע כוח Murashige ו Skoog (MS) פתרון מלחים ("מרדף") לשעה 0, 5 שעות, 11 שעות, 23 שעות, ו -35 שעות כדי לאפשר חילוף חומרים להתרחש. Daת"א נותחו על ידי ניתוח רגרסיה ריבועים לפחות שאינו ליניארי ולהתאים עם עקומה מסדר הראשון פשוט להעריך DT 50 בנפרד עבור כל אוכלוסיית waterhemp משובט 12 קו משובט .the MCR במהירות חילוף החומרים mesotrione, ואילו הקווים המשובטים ACR וWCS חילוף החומרים mesotrione לאט יותר. הנתונים שמוצגים הם קורסי זמן מרק קו משובט 5 עבור כל אוכלוסיית waterhemp, אשר שונות מהקודמות נייר 12 (זכויות יוצרים על ידי האגודה האמריקנית של צמח ביולוגים).
איור 2:. חילוף חומרים Primisulfuron-מתיל בMCR, ACR, וWCS (HAT 12) נציג הפוך-שלב chromatograms HPLC לתמציות נכרת waterhemp עלה (HAT 12) מסופקות עם 150 מיקרומטר primisulfuron-מתיל רדיואקטיבי (כפי שמתוארים בפרוטוקול) מ מחוז מקלין (MCR,), מחוז אדאמס (ACR, B),אוכלוסיות ND מחוז יין קוטל עשבים רגישים (WCS, ג) (טבלה 1). שיא רדיואקטיבי עם זמן שמירה של 21.6 דקות מכיל primisulfuron-מתיל, כפי שנקבע על ידי השוואה עם סטנדרטי אנליטיים אותנטי. פסגות עם זמנים קצרים יותר הן שמירת מטבוליטים סביר קוטביים, פחות של נסיבות primisulfuron-מתיל, כגון הידרוקסי-מתיל-primisulfuron 8 או צורות מסוכרות של מטבוליטים hydroxylated 5,6. אוכלוסיית MCR מוצג ירידה משמעותית בכמות של הורה primisulfuron-מתיל ביחס לACR וWCS, אשר לכמת כמו DT נמוך 50 לMCR (איור 3).
איור 3:. כמובן זמן של חילוף חומרים primisulfuron-מתיל בעלי waterhemp נכרת עלים waterhemp נכרת (thirד-צעיר עלה; 2 עד 3 סנטימטרים) טופלו כמתואר באיור 1 והמחקר הקודם שלנו עם mesotrione 12, פרט לכך שprimisulfuron רדיואקטיבי 150 מיקרומטר נכלל כ'דופק 'ועלים הודגרו בפתרון MS מלחים ("המרדף") לשעה 0 , 3 שעות, 11 שעות ו. הנתונים נותחו על ידי ניתוח רגרסיה ריבועים לפחות שאינו ליניארי כפי שתואר לעיל לחילוף חומרי mesotrione (איור 1) 12. אוכלוסיית MCR במהירות חילוף החומרים primisulfuron-מתיל (DT 50 = 13.6 שעות), ואילו ACR וWCS חילוף החומרים primisulfuron-מתיל לאט יותר (DT 50> 24 שעות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה נכרת העלים המתוארים במסמך זה נעשתה שימוש בעבר במחקר חילוף החומרים primisulfuron בתירס משאיר 15, אבל התוצאות שלנו מראות כי בפרוטוקול זה הוא גם יעיל, מדויק, ושחזור למדידת חילוף חומרים קוטלי עשבים במיני עשבי dicot 12. יתרון עיקרי של טכניקת העלה נכרתה בהשוואה למחקרים-כל מפעל הוא שעלה נכרת אינו תלוי בדפוסים-צמח כל טרנסלוקציה של postemergence, קוטלי עשבים מערכתיים או הבדלים בספיגת קוטל עשבים בין צמחים או אוכלוסיות. בנוסף, שונות סביבתיות מצטמצמת מאז מבחני העלה נכרתו מתבצעים בתא צמיחה, עם עלה יחיד להציב צינור, בהשוואה ללימוד כל צמחים שגודלו בתנאי חממה. אסטרטגית שיבוט וגטטיבי נכללה גם בשיטה שלנו ללימוד מנגנוני mesotrione-התנגדות ב -12 MCR למזער את המידה הגדולה של שונות גנטיות בתוך ולהיותאוכלוסיות tween Amaranthus 9. מגוון גנטי בתוך אוכלוסיות Amaranthus עשבים בא לידי ביטוי בכמות של השתנות המתועדות בתגובות-כל מפעל לכמה משפחות של קוטלי עשבים postemergence 18. בעת ביצוע מחקרים בזמן כמובן לקבוע DT 50 של מדויק ולאיתור הבדלים משמעותיים כאשר משווה DT 50 ערכים בין אוכלוסיות waterhemp 12, את הפעולות הבאות (כפי שמתואר בעלה נכרתה ופרוטוקול שיבוט וגטטיבי) הן קריטיות לביטול או צמצום גנטי וסביבתי השתנות.
מנגנונים שונים קיימים בצמחים להענקת התנגדות קוטל עשבים 1,2. לדוגמא, התנגדות waterhemp לקוטלי עשבים ALS-עיכוב יכולה להיות יעד אתר 14 מבוססים או יעד הלא-אתר מבוסס 13. קצב חילוף חומרים של primisulfuron-מתיל (איור 3) מראה בבירור את ההבדלים האלה בין שני waterh ALS עמידאוכלוסיות EMP, MCR וACR (טבלת 1). בשילוב עם הגברה PCR וניתוח רצף של גני מטרת אתר קוטל עשבים, assay העלה נכרת יסייע מאוד לזיהוי אם התנגדות קוטל עשבים בwaterhemp או עשבי dicot אחרים מוענקת על ידי מנגנוני אתר היעד או היעד הלא-אתר 2.
מגבלות של שיטת העלה נכרתה כוללות חוסר היכולת לחזות או למדוד את דפוסי טרנסלוקציה קוטל העשבים לאורך כל הצמח, או לקבוע אם מנגנוני תפיסה סלולריים או משנה הסלולר קיימים שמקנים עמידות מבוססת היעד הלא-אתר בעשבים 2. כאמור, היבט זה נחשב גם יתרון בעת קביעת שיעורי חילוף חומרים קוטלי עשבים מדויקים באוכלוסיות עשב mesotrione עמידה 12, אבל מנגד יכול להיחשב חסרון כאשר לומדים קוטלי עשבים מערכתיים שאינם עוברים חילוף חומרים באופן משמעותי בצמחים (כלומר עשב, הלא סלקטיביicides) כגון קוטלי עשבים גלייפוסט 2, או קשר שלא סלקטיבי באוכלוסיות עשב טבעיים, כגון paraquat או glufosinate 19. שיעורים עם זאת, אם מנגנוני יעד אתר אינם מתגלים בתחילה ולאחר מכן משופרים של חילוף חומרים קוטלי עשבים נחקרים בדרך כלל 1,4 הבא, במיוחד כאשר לומדים התנגדות עשב לקוטלי עשבים עיכוב HPPD כגון mesotrione 12, קוטלי עשבים ALS-עיכוב כגון primisulfuron-מתיל 13 , קוטלי עשבים photosystem השני-עיכוב כגון אטרזין 1,12, או אצטיל-CoA-עיכוב קוטלי עשבים 4.
P450s נקשר עם התנגדות ALS באוכלוסיית Echinochloa 20, מיני דשא עשבים, כמו גם עם mesotrione והתנגדות ALS בMCR 12,13. עשב dioecious, dicot הקשורים לwaterhemp, ירבוז פלמר (Palmeri א), גם נוטה התנגדות קוטל עשבים פיתוח באמצעות מספר מנגנונים שונים 13. ככל שיותר אוכלוסיות עשבים עמידים בפני קוטלי עשבים ומינים מתועדים בכל רחבי העולם 3, את הצורך במהירות בוחן את חילוף החומרים קוטלי עשבים כמנגנון התנגדות פוטנציאלי ימשיך להגדיל. גישת העלה נכרת, והוא שונה אך קשור ללימודים-שלם צמח משמשים בדרך כלל כדי לחקור מנגנוני התנגדות קוטל עשבים, היא כלי מדויק ורב ערך כדי להעריך ולכמת את חילוף החומרים קוטלי עשבים בצמחים. כתוצאה מכך, את היכולת לבצע ניתוחים אלו בשיטות מדויקות, לשחזור כולל assay העלה נכרת יסייעו לחוקרים באופן משמעותי בקביעת מנגנוני התנגדות היעד הלא-אתר בשני דשא 4 וdicot 12 עשבים.
יישומים עתידיים של שיטה זו עשויים לכלול גם קביעת שיעורים של חילוף חומרים קוטלי עשבים בגידולי dicot כגון סויה וכותנה. מחקר מתמשך במעבדה שלנו עם זני סויה קוטל עשבים סובלניים גם נצל l נכרתגישת EAF. עם זאת, מאז סויה היא יבול קטניות עם עלים trifoliate, טכניקה 'נכרת פטוטרת' הותאמה ופותחה כך שכל עלה trifoliolate יכול לספוג קוטל עשבים רדיואקטיבי באמצעות ספיגה דרך הפטוטרת העיקרית (סקלטון, Lygin, וRiechers, נתונים שלא פורסמו).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 ml tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 ml tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
- Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
- Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
- Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
- Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
- Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
- Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
- Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
- Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
- Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
- Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
- Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
- Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
- Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).
- Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
- Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
- Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).
