Introduction
Resistenza agli erbicidi in erbacce presenta una grave minaccia per la produzione mondiale di cibo e fibre 1,2. Attualmente, migliaia di popolazioni e biotipi resistenti provenienti da oltre un centinaio di specie infestanti in tutto il mondo sono stati documentati e studiati 3. Un meccanismo importante che conferisce resistenza agli erbicidi nelle piante è l'alterazione di erbicidi geni e proteine bersaglio del sito, tra cui le mutazioni genetiche che colpiscono erbicida di proteine cinetica vincolanti o l'amplificazione del target loco gene 2. Disintossicazione metabolica attraverso attività elevati di citocromo P450 monoossigenasi (P450) o glutatione S -transferase (GST) enzimi è un altro meccanismo che conferisce resistenza agli erbicidi in piante infestanti, che è distinto in diversi modi dai meccanismi bersaglio posto a base 2. Resistenza a base metabolica ha ramificazioni significative per se i costi dell'impianto di fitness (aka sanzioni fitness) possono derivare dalle mechanis erbicidi resistenzam, nonché per quanto riguarda il potenziale di un singolo meccanismo di disintossicazione per conferire resistenza incrociata o multiplo erbicidi nelle popolazioni infestanti 1,2,4. Generalmente, il metabolismo erbicidi nelle piante può essere suddiviso in tre fasi distinte 5. Fase I implica la conversione erbicidi o l'attivazione come idrossilazione P450-mediata di anelli aromatici o gruppi alchilici, o da N - o reazioni dealchilazione O-, con conseguente aumento di polarità e erbicida parziale disintossicazione 5,6. Recentemente introdotto gruppi funzionali in fase I in grado di fornire i siti di collegamento per la coniugazione di glutatione ridotto da GST o di glucosio da parte glicosiltransferasi UDP-dipendenti in fase II 5,7. Ad esempio, il principale metabolita iniziale di primisulfuron-metile in mais è idrossi-primisulfuron-metil 8, che può essere ulteriormente metabolizzato a idrossi-primisulfuron-glucoside (Fase II) e poi trasportato al vacuolo per l'archiviazione a lungo termine o ulteriori metabolica professionistaelaborazione 5,6 (fase III).
Tuberculatus (Amaranthus tuberculatus) è un difficile da controllare, dicotiledoni specie infestanti annuali che ostacola la produzione di mais (Zea mays), soia (Glycine max), e cotone (Gossypium hirsutum) negli Stati Uniti. L'elevato grado di diversità genetica delle tuberculatus è facilitata dalla sua biologia dioica e lunga distanza l'impollinazione vento, e un singolo impianto tuberculatus femmina può produrre fino a un milione di semi 9. Questi semi sono piccoli e facilmente diffondersi, che naturalmente dotare tuberculatus con un meccanismo di dispersione efficace. Tuberculatus mostra la germinazione continua per tutta la stagione di crescita 9, ei suoi semi sono in grado di germinare dopo diversi anni di dormienza. Tuberculatus è una pianta C 4 che possiede un tasso di crescita superiore alla maggior parte infestanti a foglia larga nei sistemi a seminativo 10. Inoltre, numerose popolazioni tuberculatus sono resistenti alla fam multiplailies di erbicidi 3.
Una popolazione di tuberculatus (designato MCR) da Illinois è resistente 4-idrossi-phenylpyruvate diossigenasi (HPPD) erbicidi -inhibiting 11, come mesotrione, nonché atrazina e acetolattato sintetasi (ALS) -inhibiting erbicidi, compresi primisulfuron-metil , a causa della non-bersaglio-site meccanismi basati 12,13. Una diversa popolazione di tuberculatus designato ACR 14, che è primisulfuron-metil-resistenti (a causa di una mutazione nel gene ALS) e atrazina resistente ma sensibile al mesotrione, e una popolazione tuberculatus designato WCS 14 che è sensibile alla primisulfuron-metile, mesotrione, atrazina e sono stati utilizzati in confronto con MCR nella nostra ricerca anteriore 12 ed esperimenti correnti (riassunti nella Tabella 1). Gli studi iniziali non hanno rilevato alterazioni nei livelli di sequenza genica HPPD o di espressione, o ridotto mesotrione captazione, nel MCRpopolazione se confrontato con le popolazioni mesotrione sensibili 12. Tuttavia, studi sul metabolismo con piante intere dimostrato significativamente più bassi di mesotrione genitore erbicidi in MCR rispetto al ACR e WCS, che correlata con le risposte fenotipiche precedenti per mesotrione 11,12.
| Tuberculatus Popolazione | Abbreviazione | Fenotipo a Mesotrione | Resistenza mesotrione Meccanismo | Fenotipo a primisulfuron | Resistenza primisulfuron Meccanismo |
| McLean County-resistente | MCR | Resistente | Metabolismo * | Resistente | Metabolismo |
| Adams County-resistente | ACR | Sensitive | - | Resistente | Obiettivo-site mutazione in SLA 14 |
| Wayne County-Sensitive | WCS | Delicato | - | Delicato | - |
* Meccanismi di resistenza non-bersaglio-site, diversi metabolismo potenziato, può anche conferire resistenza mesotrione nella popolazione MCR 12.
Tabella 1: Descrizione delle popolazioni tuberculatus da Illinois utilizzati in questo studio.
Oltre a determinare i tassi di metabolismo erbicida piantine tuberculatus intatti, un approccio sperimentale diverso è stato sviluppato e impiegato nella nostra precedente ricerca per indagare il metabolismo utilizzando un tuberculatus asportato foglia saggio 12, nonché vari inibitori P450 (ad esempio, tetcyclacis e malathion). Questo metodo è stato adattato appositamente per tuberculatus da un previinvestigazione unità organizzative del metabolismo primisulfuron-metile in mais asportato lascia 15, dal momento che il test foglia asportato non era ancora stata segnalata per condurre ricerche metabolismo diserbante in un impianto dicot. L'insetticida malathion organophophosate è stato spesso utilizzato per in vivo e in vitro, la ricerca erbicidi metabolismo per indicare il coinvolgimento P450 16. Per esempio, la tolleranza e rapido metabolismo del mesotrione nel mais sono dovuti a idrossilazione anello P450-catalizzata, che è stata verificata quando malathion maggiore sensibilità mais mesotrione 17. Allo stesso modo, malathion inibito il metabolismo della SLA inibitore primisulfuron-metile in mais asportato lascia 15. Un importante vantaggio della tecnica foglio asportato è che i dati generati sono indipendenti modelli traslocazione intero impianto, un fattore importante da considerare quando si valuta metabolismo sistemico, erbicidi postemergence nelle piante. Di conseguenza, questo metodo consente quantitativa emetabolica analisi qualitative di concentrarsi su una singola foglia trattata 12.
Una strategia di clonazione vegetativa, in combinazione con il protocollo foglio asportato, è stato precedentemente utilizzato in tuberculatus condurre studi sul metabolismo 12. A causa della natura outcrossing di tuberculatus (separati per uomini e piante femminili), e alto grado di diversità genetica all'interno delle specie dioica Amaranthus 9, questo protocollo ha assicurato che piantine tuberculatus geneticamente identici sono stati analizzati entro gli esperimenti time-corso. Questo articolo illustra l'utilità del metodo di foglia asportato per misurare i tassi di metabolismo erbicidi in una pianta infestante dicot (tuberculatus). La quantità di erbicida genitore restante è stato determinato in ogni momento (Figura 1) da almeno analisi di regressione non lineare, e si forma con una curva semplice primo ordine per stimare il tempo per il 50% di erbicidi assorbita a degradare ( DT 50). Rappresentantecromatogrammi di fase inversa cromatografia liquida ad alta prestazione (RP-HPLC) vengono visualizzati per la SLA-resistenti e delle popolazioni tuberculatus sensitive, che indicano la scomparsa di erbicidi genitore e formazione concomitante del metabolita polare (s) nel corso di un periodo di studio-corso (Figura 2). Il focus del nostro articolo è quello di descrivere e dimostrare l'utilità del test foglia asportato in combinazione con un metodo di clonazione vegetativo per determinare i tassi di precise e riproducibili del metabolismo erbicidi nelle piante dicotiledoni, utilizzando uniformemente anello marcato (URL- 14 C) erbicidi tre popolazioni tuberculatus che si differenziano per le loro risposte integrali vegetali HPPD- e SLA-inibitori erbicidi (Tabella 1).
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Protocol
1. materiale vegetale, condizioni di crescita, e Vegetativo clonazione
Nota: Tre popolazioni tuberculatus sono stati studiati in questa ricerca: MCR (da McLean County, IL), ACR (da Adams County, IL), e WCS (da Wayne County, IL) (Tabella 1).
- Raccogliere e sospendere semi tuberculatus a 0,1 g agar L -1: soluzione di acqua a 4 ° C per almeno 30 giorni per migliorare la germinazione. Nota: Alcune popolazioni tuberculatus sono dormienti, ma questo passaggio aiuta a superare dormienza e rendere seme germogliare più uniforme.
- Germinare semi di ciascuna popolazione tuberculatus (come in Tabella 1) in 12 x 12 cm vassoi contenenti un mezzo di impregnazione nella serra.
- Mantenere condizioni di serra a 28/22 ° C le temperature giorno / notte in un fotoperiodo 16/8 ore 12.
- Supplemento luce naturale in serra con luce di lampade ad alogenuri mercurio per fornire un minimo di 500 mmol m -2 -1 fotoni a livello di impianto baldacchino.
- Trapianto emerso piantine quando sono alti in 80 cm 3 vasi nella serra di 2 cm.
- Trapiantare le piantine in 950 cm 3 vasi contenenti un 3: 1: 1: 1 miscela di invasatura mix: terreno: torba: sabbia quando piantine sono alti 4 cm. Aggiungere 5 g di lento rilascio granuli fertilizzanti per ogni pentola e mescolare con questa miscela suolo.
- Tagliare e rimuovere il meristema apicale contenente le tre foglie più giovani da 7 cm piante alte per eliminare dominanza apicale.
Nota: Questo passaggio garantisce che ogni pianta crescerà abbastanza tre centimetri ascellari germogli da clonare. - Accise cinque germogli ascellari (3 cm di lunghezza) quando piantine sono circa 14 cm di altezza da ciascuna popolazione tuberculatus (come nella tabella 1). Rimuovere la maggior parte delle foglie su questi germogli ascellari per ridurre la perdita di acqua su ulteriore manipolazione, ma mantenere le due foglie più giovani per consentire l'ulteriore crescita al trapianto.
- Trapianto ascellare spara in 80 cm 3 pentole (una piantina per piatto) in mezzo di impregnazione, che è lo stesso mezzo utilizzato per la germinazione. Mezzo di impregnazione deve essere saturo inizialmente fino al modulo radici nella camera di crescita, quindi mantenere costanti umidità e pentole posto nella stanza di crescita per 7 giorni di tempo per mettere radici.
Nota: Le piante sono molto sensibili a questo punto e non devono essere sottolineato.- Mantenere la crescita condizioni della camera a 28/22 ° C le temperature giorno / notte in un fotoperiodo 16/8 ore 12.
- Una combinazione di lampadine a incandescenza e fluorescenti può essere utilizzato per fornire luce nella camera di crescita e dovrebbe fornire almeno 550 mmol m-2 sec -1 flusso di fotoni a livello di impianto baldacchino 12.
- Trapianto di nuovo in 950 cm 3 pentole (una piantina per piatto) containing un 3: 1: 1: 1 miscela di invasatura mix: terreno: torba: sabbia (includere anche 5 g lento rilascio granuli di fertilizzante) quando le piante clonate sono alti 4 cm, poi trasferire di nuovo alla serra.
- Clonare le piante una seconda volta utilizzando lo stesso metodo descritto sopra (cioè, passi ripetizione da 1.5 a 1.8, e poi passare al punto 2.1). Per un tipico studio a tempo-corso, generare cloni di almeno sei impianti indipendenti di ogni popolazione tuberculatus e li registra come linee MCR 1-6, ACR 1-6 e 1-6 WCS.
- Stabilire almeno sei "madri" linee clonali distinte per ripetere l'esperimento e adeguatamente rappresentare la variabilità genetica all'interno di ciascuna popolazione tuberculatus.
- A seconda di quanto tempo punti verranno analizzati, generare abbastanza sub-cloni da ogni "genitore" linea clonale di condurre uno studio temporale corso.
2. conducendo uno studio del metabolismo con asportati Waterhemp Foglie
- Accise le terze più giovani foglie (da 2 a 3 cm di lunghezza, 0,5 cm di includere picciolo attaccato) quando le piante tuberculatus clonate sono da 10 a 12 cm di altezza per il metabolismo di erbicidi e DT 50 analisi.
- Piccioli fogliari taglio di ciascun impianto tuberculatus una seconda volta (in modo che 0.3 cm del picciolo rimane) sotto l'acqua, e mettere questi estremità tagliate in 1,5 ml fiale di plastica (una foglia per flaconcino) 15.
Nota: Tagliare una seconda volta sotto l'acqua impedisce la formazione di bolle d'aria e collegare vasi xilematici.- In primo luogo, in parte immergere foglie escisse con il taglio picciolo nel buffer di pre-incubazione (200 ml) di 0,1 M Tris-HCl (pH 6) per 1 ora.
- In secondo luogo, spostare ogni foglio in un flacone contenente 1,5 ml di tampone di incubazione (200 ml) di 0,1 M Tris-HCl (pH 6) più 150 pM [URL- 14 C] erbicidi, e incubare a 28 ° C per 1 ora a consentire l'assorbimento erbicidi nelle foglie.
Nota: Entrambi i 14 C-mesotrione e
Nota: L'effetto di inibitori metabolici sul metabolismo erbicida può essere determinata modificando passi 2.2.1 e 2.2.2. Aggiungere 100 mM dell'inibitore al buffer pre-incubazione e lasciate incubare per 2 ore, poi il trasferimento a tampone di incubazione con erbicida ed ancora aggiungere 100 pM inibitore. Ad esempio, malathion e tetcyclacis inibiscono alcune attività del citocromo P450 in impianti di 15-17. - Lavare la parte immersa di foglie asportati con acqua deionizzata e trasferire foglie escisse per un quarto di forza Murashige e Skoog (MS) sali soluzione (500 ml) per 0 ore, 5 ore, 11 ore, 23 ore o 35 ore, rispettivamente, nella camera di crescita per lo studio del metabolismo tempo portate.
- Vendemmia rimuovendo congedos dalla soluzione di incubazione al punto di tempo appropriato e macinare manualmente ogni tessuto fogliare in azoto liquido utilizzando un tubo di polipropilene (15 ml) e pestello di vetro.
- Estrarre erbicidi radiomarcato e dei suoi metaboliti di ciascun foglio con 7 ml di 90% acetone con un omogeneizzatore tessuto laboratorio nella stessa provetta di polipropilene come sopra. Risciacquare omogeneizzatore tessuto con un ulteriore 7 ml di 90% di acetone, e continuare per omogeneizzare fino tessuto è completamente polverizzato (di solito circa 2 min). Nota: 90% acetone può essere utilizzato per l'estrazione della maggior erbicidi dai tessuti vegetali. Tuttavia, se questo metodo non è in grado di estrarre più del 90% dei composti radiomarcati assorbite, poi metanolo al 90% o 90% acetonitrile possono essere sostituiti come solvente di estrazione.
- Label 90% estratti acetone (14 ml totali) e conservare a -4 ° C per 16 ore per consentire l'estrazione supplementare a verificarsi.
Nota: Seguendo questa estrazione di foglie trattate, la quantità di rad estraibiliioactivity è tipicamente almeno il 98% di composti radiomarcati assorbite dalla foglia trattata. La radioattività non estraibili (residui legati) nelle foglie asportato in media solo dello 0,3% in tutti i punti di tempo nel nostro precedente studio di 12, ma questa cifra può variare a seconda all'erbicida utilizzato e punto di tempo esaminato. - Centrifugare i campioni a 5.000 xg per 10 minuti e concentrarsi supernatanti a 40 ° C con un evaporatore rotante fino ad un volume finale di 0,5 ml si ottiene. Trasferire questo volume di un tubo di plastica 2,0 ml.
- Aggiungere acetonitrile: acqua (1: 1 in volume) per regolare il volume finale della pianta estratti 1,25 ml e ri-centrifugare a 10.000 xg per 10 minuti per rimuovere eventuali particelle.
- Misurare la radioattività totale in un'aliquota prelevata su ogni campione (dpm microlitri -1) mediante spettroscopia scintillazione liquida (LSS) 12 e normalizzare quantità di [14 C-marcato] composti iniettati per l'analisi HPLC (per esempio, 10,000 totale dpm / campione / run) in modo da assi Y sarà uniforme tra campioni durante la rappresentazione grafica dei risultati.
3. Analisi HPLC di erbicidi metabolismo in fogli escisse
Nota: Risolvere totale radioattività estraibile in erbicidi genitore e erbicidi metaboliti utilizzando le seguenti condizioni RP-HPLC 12.
- Eseguire RP-HPLC con una colonna C 18 (4,6 x 250 mm, 5 micron dimensione delle particelle per HPLC analitico) ad un flusso di 1 ml min -1 per la maggior parte degli erbicidi non polari.
Nota: colonne C 4 o C 12 RP-HPLC possono anche essere utilizzati per ottimizzare la separazione dell'erbicida madre dai suoi metaboliti. Un filtro precolonna e / o precolonna possono anche essere usati per proteggere e prolungare la durata della colonna RP.- Utilizzare la seguente fase mobile per RP-HPLC: Eluente A, 0,1% di acido formico (v / v) in acqua, e Eluente B 100% HPLC acetonitrile.
Nota: HPLC-grade metanolo può essere utilizzato anche come Elconfluente B per la risoluzione di composti più polari e metaboliti, ma essere consapevoli del fatto che i tempi di ritenzione possono anche cambiare.
Nota: Il profilo di eluizione utilizzato per risolvere mesotrione o primisulfuron-metil dai loro metaboliti polari nella nostra ricerca 12 è: Fase 1, A: B (4: 1, v / v) di A: B (3: 2, v / v ) in un gradiente lineare (12 min); Fase 2, A: B (3: 2, v / v) di A: B (3: 7, v / v) in un gradiente lineare (5 min); Fase 3, A: B (3: 7, v / v) di A: B (1: 9, v / v) in un gradiente lineare per 2 min (per un totale di 19 min).
Nota: Le sfumature e passaggi isocratiche possono avere bisogno di essere regolato in base alle proprietà fisiche del materiale di base, al fine di ottimizzare la risoluzione. - Seguire la procedura sopra gradiente lineare con A: B (1: 9, v / v) a A: B (4: 1, v / v) in un gradiente lineare (3 min) e A: B (4: 1, v / v) step isocratica (per almeno 2 minuti) per riequilibrare colonna RP prima di iniettare il successivo 12 estratto.
- Utilizzare la seguente fase mobile per RP-HPLC: Eluente A, 0,1% di acido formico (v / v) in acqua, e Eluente B 100% HPLC acetonitrile.
- Rilevare e visualizzare composti radiomarcati con un flusso Scintillation Analyzer. Registrare la quantità di genitore erbicidi rimanente in ciascun campione come percentuale della radioattività totale in ciascun campione (rilevati e quantificati dalla portata scintillazione Analyzer secondo le istruzioni del produttore) per determinare i tassi di metabolismo erbicidi in ciascuna popolazione tuberculatus durante il corso del tempo.
4. Procedure statistiche
- Disporre trattamenti in un design completamente randomizzati (o dispositivo adatto per l'analisi statistica).
- Eseguire due esperimenti indipendenti con ogni trattamento, composto da tre repliche biologiche per ogni esperimento. I due esperimenti indipendenti includono sei repliche biologiche in totale. Se l'effetto esperimento non è significativo (α = 0,05), combinare e analizzare dati da ciascun esperimento indipendente. Se l'effetto è significativo esperimento, quindi analizzare ogni esperimento separatamente.
Nota: Includere i primi tre repliche biologiche in Esperimento 1 e per i prossimi tre repliche biologiche in Esperimento 2. Ogni replica biologica rappresenta un "genitore" distinta linea clonale derivata da ciascuna popolazione (MCR 1-6, 1-6 ACR, e WCS 1-6) in modo che ogni tempo- Analisi corso utilizza piante geneticamente identici. I due esperimenti indipendenti includono sei repliche biologiche in totale, che permette per una rappresentanza adeguata della variabilità genetica e la determinazione di un valore mediano DT 50 per ogni popolazione tuberculatus. - Analizzare i dati con almeno analisi di regressione non lineare e inserirli con una curva semplice del primo ordine al fine di stimare DT 50 s. L'equazione che segue descrive il modello:
- dove in questo modello y rappresenta la percentuale dell'erbicida genitore rimanente al tempo t, μ i è il DT 50 per ciascuntuberculatus popolazione i, e il parametro C 0 è la quantità stimata di genitore erbicida presente at = 0 12.
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Representative Results
Grandi differenze nei tassi di metabolismo mesotrione sono stati rilevati tra una WCS o ACR e MCR (Figura 1). Ad ogni punto di tempo, MCR ha metabolizzato mesotrione più rapidamente delle due popolazioni mesotrione sensibili, WCS e ACR, che è correlato con precedenti intero impianto risposte fenotipiche 11. Clonando abbastanza piante da una pianta parentale singolo da ciascuna popolazione, metabolismo erbicida analisi volta portate sono uniformi e riproducibili a causa della mancanza di variabilità genetica all'interno di ogni corso temporale 12. Ad esempio, il periodo di tempo per il metabolismo mesotrione in linea clonale 5 12 è illustrato nella Figura 1. Un totale di sei differenti linee clonali, derivato da sei piante madri singole, sono stati analizzati da ciascuna popolazione (Tabella 1) per determinare una media complessiva DT 50 del valore, che ha indicato che il metabolismo in mesotrione MCR era significativamente più veloce (
Oltre a studiare i meccanismi di resistenza in mesotrione MCR, un obiettivo correlato è stato quello di determinare il meccanismo per la resistenza alla SLA inibitori di MCR. Prima di ricerca ha dimostrato che una sottopopolazione derivato da MCR era SLA resistente, ma non possedeva una mutazione nel gene ALS sito di destinazione, indicando un meccanismo basato non bersaglio in loco 13. Questo è in contrasto con ACR, che è ALS resistente dovuto un sito di mutazione obiettivo che conferisce un meno sensibile ALS enzima 14. Per TESt questa ipotesi, il saggio foglia asportato è stato condotto con [URL- 14 C] primisulfuron-metile, un erbicida ALS-inibizione della famiglia sulfonilurea. L'area del picco del 14-C-metil primisulfuron in un cromatogramma HPLC rappresentante (tempo di ritenzione di circa 21,6 min) era significativamente più piccola rispetto a MCR in ACR e WCS a 12 HAT (Figura 2). Inoltre, due metaboliti polari con tempi di ritenzione brevi rispetto primisulfuron-metil stati rilevati in estratti di foglie prelevati da ogni tre popolazioni (Figura 2). Sebbene le strutture di questi due metaboliti polari non sono stati determinati in questo studio, la loro formazione rapida è coerente con l'anello di idrossilazione primisulfuron-metil 8 (fase I metabolismo) seguita da glucosio coniugazione 5 (metabolismo Fase II).
In combinazione con le analisi qualitative del metabolismo primisulfuron in MCR, ACR e WCS (figura 2), l'importodi genitore erbicidi rimanente in ogni punto è stato quantificato e utilizzato per determinare i DT 50 valori per primisulfuron-metile in MCR (13,6 ore), ACR (> 24 ore), e WCS (> 24 ore) (Figura 3). La significativamente più breve DT 50 valore MCR è in linea con l'aumento del metabolismo come il meccanismo principale per la resistenza SLA in questa popolazione, in accordo con ricerche precedenti intero impianto 13. È interessante notare, tuttavia, i DT 50 valori per primisulfuron in ACR e WCS sono simili ma significativamente più lungo rispetto a MCR (figura 3), nonostante sia MCR e ACR visualizzazione ALS-inibitori fenotipi resistenti (Tabella 1). Il relativamente lungo DT 50 in ACR è forse perché non è necessario per metabolizzare rapidamente primisulfuron, poiché ACR ha un enzima ALS meno sensibili come principale meccanismo di resistenza 14. In sintesi, il escissa test foglia tuberculatus utilizzati nella nostra ricerca ha prodotto prezioso quadati litative e quantitativi e fornito una nuova visione meccanismi di resistenza metaboliche verso due erbicidi diversi MCR, ACR, e WCS.
Figura 1:. Naturalmente il tempo di metabolismo mesotrione in tuberculatus asportato parte da popolazioni vegetativa clonati foglie asportato (foglia terzo più giovane; 2 a 3 cm di lunghezza) di piantine tuberculatus (da 10 a 12 cm) sono stati vegetativa clonati in modo che ogni volta portate studio per ogni linea costituita da piante geneticamente identici. Foglie asportati sono stati collocati in 0,1 tampone M Tris-HCl (pH 6) per 1 ora, seguito da 0,1 M Tris-HCl (pH 6) più di 150 micron mesotrione radioattivo per 1 ora ('impulso'), poi un quarto di forza Murashige e Skoog (MS) soluzione sali ('caccia') per 0 ore, 5 ore, 11 ore, 23 ore e 35 ore per consentire il metabolismo si verifichi. Data sono stati analizzati da almeno analisi di regressione non lineare e in forma con una curva semplice del primo ordine di stimare un DT 50 separatamente per ogni popolazione tuberculatus clonato 12 .La MCR linea clonale rapidamente metabolizzata mesotrione, mentre le linee clonali ACR e WCS metabolizzati mesotrione più lentamente. I dati riportati sono corsi a tempo a partire da soli linea clonale 5 per ogni popolazione tuberculatus, che è stato modificato rispetto alla precedente carta 12 (Copyright by American Society of Biologi vegetali).
Figura 2:. Metabolismo primisulfuron-metile in MCR, ACR, e WCS (12 HAT) Rappresentante in fase inversa cromatogrammi HPLC degli estratti asportati tuberculatus foglia (12 HAT) in dotazione con 150 micron radioattivo primisulfuron-metile (come descritto nel protocollo) da McLean County (MCR, A), Adams County (ACR, B), unand Wayne County erbicidi sensibili (WCS, C) le popolazioni (Tabella 1). Picco radioattivo con un tempo di ritenzione di 21,6 min contiene primisulfuron metile, come determinato mediante confronto con uno standard di autentica analitica. Picchi con tempi di ritenzione brevi sono probabilmente polari, metaboliti meno fitotossici primisulfuron-metile, come idrossi-primisulfuron-metil 8 o forme glicosilate di metaboliti idrossilati 5,6. La popolazione MCR visualizzata una significativa diminuzione della quantità di genitore primisulfuron-metil rispetto al ACR e WCS, che viene quantificato come DT inferiore del 50 per MCR (Figura 3).
Figura 3:. Naturalmente il tempo di metabolismo primisulfuron-metile in foglie tuberculatus asportato foglie tuberculatus asportato (third-foglia più giovane; 2 a 3 cm) sono stati trattati come descritto nella Figura 1 e la nostra ricerca precedente con mesotrione 12, ad eccezione che 150 mM primisulfuron radiomarcato è stato incluso come 'impulsi' e le foglie sono state incubate nella soluzione MS sali ('chase') per 0 hr , 3 ore e 11 ore. I dati sono stati analizzati mediante analisi di regressione almeno non lineare come descritto in precedenza per il metabolismo mesotrione (Figura 1) 12. La popolazione MCR rapidamente metabolizzato primisulfuron-metile (DT 50 = 13,6 ore), mentre ACR e WCS metabolizzati primisulfuron-metil più lentamente (DT 50> 24 ore).
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Discussion
Il metodo espunto-foglia qui descritto è stato utilizzato in precedenza nella ricerca metabolismo primisulfuron nel mais lascia 15, ma i nostri risultati dimostrano che questo protocollo è anche efficace, preciso e riproducibile per misurare il metabolismo erbicidi in una specie infestanti dicotiledoni 12. Un importante vantaggio della tecnica foglio asportato rispetto studi intero impianto è che un foglio asportato è indipendente intero impianto modelli traslocazione di postemergence, erbicidi sistemici o differenze di erbicida assorbimento tra le piante o popolazioni. Inoltre, la variabilità ambientale è ridotto poiché i saggi foglia escisse sono condotti in una camera di crescita, con un singolo foglio collocato in un tubo, rispetto a studiare piante intere coltivate in condizioni di serra. Una strategia di clonazione vegetativo è stato anche incluso nel nostro metodo per lo studio dei meccanismi di resistenza in mesotrione-MCR 12 per ridurre al minimo l'elevato grado di variabilità genetica all'interno ed esserepopolazioni tween Amaranthus 9. La diversità genetica all'interno delle popolazioni Amaranthus erbacce è illustrato dalla quantità di variabilità documentata nelle risposte intero impianto a diverse famiglie di erbicidi post-emergenza 18. Nel condurre studi tempo-corso per determinare accurati DT 50 s e per rilevare differenze significative nel confronto DT 50 valori tra le popolazioni tuberculatus 12, questi passaggi (come indicato nella nostra foglia asportato e protocollo clonazione vegetativa) sono fondamentali per eliminare o ridurre genetica e ambientale variabilità.
Esistono meccanismi diversi impianti per conferire resistenza agli erbicidi 1,2. Ad esempio, la resistenza agli erbicidi ALS tuberculatus-inibitori può essere bersaglio posto a base 14 o non bersaglio posto a base 13. Tassi metabolici di primisulfuron-metile (Figura 3) mostrano chiaramente queste differenze tra waterh due ALS-resistentepopolazioni EMP, MCR e ACR (Tabella 1). In combinazione con l'amplificazione PCR e analisi della sequenza di erbicidi geni bersaglio-site, il saggio foglia asportato sarà di grande aiuto ad individuare se la resistenza agli erbicidi in tuberculatus o altre infestanti dicotiledoni è conferito dal sito bersaglio o non bersaglio-site meccanismi 2.
Limitazioni del nostro metodo foglia asportato includono l'impossibilità di visualizzare o misura modelli erbicida traslocazione in tutta la pianta, o determinare se esistono dei meccanismi di sequestro cellulari o sub-cellulari che conferiscono non bersaglio posto resistenza con sede a erbacce 2. Come accennato in precedenza, questo aspetto è stato considerato un vantaggio nel determinare i tassi precisi metabolismo erbicida in mesotrione resistente popolazioni infestanti 12, ma al contrario potrebbe essere considerato un inconveniente quando si studia erbicidi sistemici che non sono metabolizzate significativamente nelle piante (cioè, erba non selettivoicides) come il glifosato 2, o contatto erbicidi che non selettive nelle popolazioni infestanti naturali, come il paraquat o glufosinato 19. Tassi Tuttavia, se i meccanismi di destinazione del sito non vengono rivelati inizialmente poi avanzate del metabolismo erbicidi sono tipicamente indagati prossimo 1,4, specialmente quando si studia la resistenza delle infestanti agli erbicidi HPPD inibizione, come mesotrione 12, ALS-inibitori erbicidi quali primisulfuron-metil 13 , fotosistema II-inibendo erbicidi come l'atrazina 1,12, o acetil-CoA-inibizione erbicidi 4.
P450 sono state associate a resistenza ALS in una popolazione Echinochloa 20, una specie di erba erbacce, nonché con mesotrione e resistenza ALS in MCR 12,13. Un dioica, erbaccia dicot relativi a tuberculatus, Palmer amaranto (A. Palmeri), è anche inclini a sviluppare la resistenza agli erbicidi attraverso diversi meccanismi diversi 1-3. Come più popolazioni e specie infestanti resistenti agli erbicidi sono documentati in tutto il mondo 3, la necessità di esaminare rapidamente metabolismo erbicida come potenziale meccanismo di resistenza continuerà ad aumentare. L'approccio foglia asportato, distinto ma correlato agli studi intero impianto tipicamente utilizzati per studiare i meccanismi di resistenza agli erbicidi, è uno strumento preciso e prezioso per valutare e quantificare il metabolismo erbicidi nelle piante. Come risultato, la capacità di eseguire queste analisi, con metodi riproducibili accurati comprese foglia dosaggio escisso notevolmente assistere i ricercatori a determinare meccanismi di resistenza non bersaglio-site in entrambe erba 4 e 12 dicot erbacce.
Le future applicazioni di questo metodo possono includere anche la determinazione del tasso di metabolismo erbicidi nelle colture dicotiledoni come la soia e il cotone. La ricerca in corso nel nostro laboratorio con varietà di soia resistenti agli erbicidi ha anche utilizzato il l asportatoapproccio eaf. Tuttavia, poiché la soia sono un raccolto di legume con foglie trifoliate, un 'picciolo asportato' tecnica è stata adattata e sviluppata in modo che ogni foglia trifoliolate può assorbire erbicida radioattivo tramite assorbimento attraverso la picciuolo principale (Skelton, Lygin e Riechers, dati non pubblicati).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 ml tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 ml tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
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