Introduction
잡초의 제초제 저항은 식품 및 섬유 1, 2의 글로벌 생산에 심각한 위협을 선물한다. 현재 백 이상 잡초 종에 강한 집단과 생물 형의 수천 전 세계적으로 문서화하고 3 연구되고있다. 식물에 제초제 저항성을 부여하는 주요 메커니즘은 제초제 - 단백질 결합 반응 속도 또는 대상 사이트 유전자 2의 증폭에 영향을 미치는 유전 적 변이를 포함하는 제초제 대상 사이트 유전자와 단백질의 변경입니다. 시토크롬 P450 모노 옥 시게나 제 (P450) 또는 글루타치온 S의 -transferase (GST) 효소의 높은 활동을 통해 대사 해독 대상 현장 기반 메커니즘 2에서 여러 가지 방법으로 구분된다 잡초의 제초제 저항성을 부여하는 또 다른 메커니즘입니다. 대사 기반의 저항 (피트니스 처벌 일명) 공장 피트니스 비용은 제초제 저항 메커니즘 정보 발생할 수 있는지 여부에 대한 상당한 파급 효과를 가지고m뿐만 아니라 잡초 개체군 1,2,4에서 교차 또는 다중 제초제 내성을 부여하는 단일 해독 메커니즘 전위에. 일반적으로 식물에 제초제 대사는 세 가지 단계 5로 나눌 수 있습니다. 증가 극성 부분 제초제 해독 5,6로 이어지는, 또는 O- 탈 알킬화 반응 - 단계 I는 방향족 고리 또는 알킬 그룹의 P450 매개 수산화, 또는 N으로 같은 제초제 변환 또는 활성화를 포함한다. 새로 나는 GSTs 감소 글루타티온에 결합에 대한 링크 사이트를 제공 할 수 있습니다 또는 단계 II 5,7에서 UDP에 의존하는 글리코에 의해 포도당 단계에 관능기를 도입했다. 예를 들어, 옥수수의 primisulfuron 메틸의 주요한 초기 대사 산물은 또한 하이드 록시 primisulfuron 글루코 내지 (단계 II)를 대사 후 장기간 저장 또는 상기 대사위한 액포로 이송 될 수 히드 록시 primisulfuron 메틸 8 인 찬성cessing 5,6 (단계 III).
Waterhemp (Amaranthus의 tuberculatus)는 미국의 옥수수 생산 (ZEA이 메이), 콩 (글리신 최대), 면화을 (고십 피움 히르 수툼) 방해하기 어려운 제어, 쌍자엽 연간 잡초 종입니다. waterhemp의 유전 적 다양성의 높은 수준은 자웅 이주의 생물학 및 장거리 바람 수분에 의해 촉진되고, 하나의 여성 waterhemp 공장 만 씨앗 9 개까지 생성 할 수 있습니다. 이 씨는 자연스럽게 효과적인 분산 메커니즘 waterhemp을 부여하는, 작고 쉽게 확산됩니다. Waterhemp는 성장시기 (9)에 걸쳐 연속 발아를 표시하고, 그 씨앗은 휴면 몇 년 후 발아 할 수 있습니다. Waterhemp은 경작 할 작물 재배 시스템 (10)에있는 대부분의 잎이 넓은 잡초보다 더 높은 성장률을 가지고 C 4 식물입니다. 또한, 다수의 집단 waterhemp 여러 FAM에 내성제초제 3 ilies.
일리노이 waterhemp (MCR)의 이용의 인구는 4- 히드 록시 phenylpyruvate 시게나 제 (HPPD) 예컨대 메소 트리 온 등 -inhibiting 제초제 (11)뿐만 아니라, 아트라진 및 아세토 락 테이트 신타 제 (ALS)에, 제초제 -inhibiting primisulfuron 메틸을 포함하는 내성 비 대상 현장 기반 메커니즘 (12, 13)로 인해. 와 아트라진에 강한하지만 메소 트리 온에 민감하고, primisulfuron 메틸을 민감 WCS (14) 지정된 waterhemp 인구 (때문에 ALS 유전자의 돌연변이에) primisulfuron 메틸 내성 ACR (14) 지정 waterhemp의 다른 인구, 메소 트리 온 및 아트라진가 우리의 이전 연구 12, 현재 실험 MCR와 비교 하였다 (표 1에 요약 하였다). 초기 연구는 MCR에, HPPD 유전자 서열 또는 발현 수준의 변화, 또는 감소 메소 트리 온의 흡수를 감지하지 않았다인구 때 메소 트리 온 민감한 인구 (12)와 비교. 그러나, 전체 식물 대사 연구는 11, 12 메소 이전 표현형의 반응과 상관 ACR과 WCS에 비해 MCR에서 부모 메소 트리 온 제초제의 상당히 낮은 수준을 보여 주었다.
| Waterhemp 인구 | 약어 | 메소에 표현형 | 메소 트리 온 저항 메커니즘 | Primisulfuron에 표현형 | Primisulfuron 저항 메커니즘 |
| 맥린 카운티 저항하는 | MCR | 저항하는 | 대사 * | 저항하는 | 대사 |
| 아담스 카운티 저항하는 | ACR | Sensit필자 | - | 저항하는 | ALS (14)에 대상 사이트 돌연변이 |
| 웨인 카운티에 민감한 | WCS | 민감한 | - | 민감한 | - |
* 향상된 대사 이외의 비 표적 사이트 저항 메커니즘은 또한 MCR 인구 (12) 메소 트리 온 저항을 부여 할 수있다.
표 1 : 본 연구에 사용 일리노이 waterhemp 개체군의 설명.
그대로 waterhemp 모종의 제초제 대사의 비율을 결정하는 것에 더하여, 다른 실험적 방법은 개발되었으며 절제 waterhemp 리프 세이 (12)뿐만 아니라 다양한 P450 억제제 (예 tetcyclacis 및 말라 티온)를 사용하여 대사를 조사하기 이전 연구에서 사용. 이 방법은 previ에서 waterhemp을 위해 특별히 적응했다적출 된 잎의 분석이 아직 쌍자엽 식물에 제초제 대사 연구를 수행보고되지 않은 때문에 절제 옥수수에 primisulfuron 메틸 대사의 OU를 조사, 15 나뭇잎. organophophosate 살충제 말라 티온 자주 생체에 사용 된 체외 제초제 대사 연구에서 P450의 참여 (16)를 나타냅니다. 예를 들어, 관용과 옥수수에 메소 트리 온의 빠른 대사는 말라 티온은 메소 트리 온 (17) 옥수수 감도를 증가 할 때 확인되었다 P450 - 촉매 링 수산화,에 기인한다. 마찬가지로, 말라 티온은 절제 옥수수에서 루게릭 병 억제제 primisulfuron 메틸 15 잎의 신진 대사를 억제 하였다. 식물 조직, 출현 후 제초제의 대사를 평가할 때 적출 리프 기술의 주요 이점은, 생성 된 데이터는 전체 플랜트 전위 패턴 무관하다는 것이다, 중요한 요인을 고려한다. 따라서,이 방법은 정량 할 수 있으며질적 대사는 단일 처리 리프 (12)에 초점을 분석한다.
식물 클로닝 전략은 적출 리프 프로토콜과 함께, 이전에 대사 과정 (12)을 실시 waterhemp에 이용 하였다. 때문에 waterhemp (별도의 남성과 여성의 식물)과 자웅 이주 Amaranthus 종 (9) 내에서 유전 적 다양성의 큰 정도의 이종간 교배 특성으로,이 프로토콜은 유 전적으로 동일한 waterhemp 모종 시간 코스 실험에서 분석 하였다 것을 보장. 이 문서는 쌍자엽 잡초 (waterhemp)에서 제초제 신진 대사의 속도를 측정하기위한 절제 잎 방법의 유틸리티를 보여줍니다. 부모 제초제의 양 (흡수 된 제초제의 50 %가 저하하는 시간을 추정하기 위해 단순 일차 곡선 적합 하였다 비선형 최소 제곱 회귀 분석에 의해 각각의 시간 점 (도 1)에서 측정 한 한 나머지 DT 50). 대리인역상 고속 액체 크로마토 그래피 (RP-HPLC)에서 크로마토 내성 ALS-및 시간 과정 연구 중에 부모 제초제 및 극성 대사 산물 (들)의 병용 형성의 소실을 나타내는 과민 waterhemp 인구 (그림 표시되는 2). 우리 문서의 포커스가 균일 링 - 표지 (URL- 14 C) 제초제를 사용하여 설명하고 쌍자엽 식물 제초제 대사의 정확하고 재현 가능한 요금을 결정하기위한 식물 클로닝 방법과 조합 적출 리프 분석의 유용성을 입증하는 것이다 자신의 전체 식물의 반응에 차이가 세 waterhemp 인구는 HPPD-하고 루게릭 병 억제 제초제 (표 1).
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Protocol
1. 식물 재료, 성장 조건, 그리고 식물 복제
참고 : 세 waterhemp 집단이 연구 조사 하였다 : MCR (아담스 카운티, 일리노이에서), ACR, 및 WCS (맥린 카운티, 일리노이에서) (표 1) (웨인 카운티, 일리노이에서).
- 수집하여 0.1 g L-1 한천 waterhemp 씨앗 일시 : 발아를 강화하기 위해 적어도 30 일 동안 4 ℃에서 용액을 물. 참고 : 일부 waterhemp 인구가 휴면 있지만,이 단계는 휴면을 극복하고 종자가보다 균일하게 발아 할 수 있도록 도와줍니다.
- 온실에서 화분 매체를 포함하는 12 X 12cm 트레이에 (표 1에서와 같이) 각 waterhemp 인구의 씨앗을 발아.
- 16/8 시간의 광주 (12) 내에 22분의 28 ° C를 주 / 야간 온도에서 온실 조건을 유지한다.
- 500 μmol m의 최소값을 제공하는 할로겐화 수은 램프로부터의 빛을 온실에서 자연광을 보충 -2 -1 광자 플럭스.
- 그들은 80cm 온실에서 3 냄비에 2cm 키가 큰 경우 이식 모종을 등장.
- 1 : 1 : 포팅 믹스의 1 : 1 혼합물 토양 : 이탄 : 모래 모종 4cm 키가 950cm 3를 포함하는 3 냄비에 이식 모종. 각각의 냄비에 서방 비료 과립 5g을 추가하고이 토양 혼합물로 섞는다.
- 혀끝의 지배력을 제거하기 위해 잘라 7cm 키가 큰 식물에서 세 어린 잎을 포함하는 촬영을 혀끝의 분열 조직을 제거합니다.
참고 :이 단계는 각 공장은 복제 할 수있는 충분한 3cm의 겨드랑이 촬영을 증가 할 것을 보장한다. - 모종 (표 1에서와 같이) 각 waterhemp 인구에서 높이 약 14cm가 소비세 다섯 겨드랑이 촬영 (길이 3cm). 추가 처리시 수분 손실을 줄이기 위해 이러한 겨드랑이 촬영에 잎의 대부분을 제거 할 수 있지만 이식에 추가 성장을 할 수 있도록 두 어린 잎을 유지합니다.
- 이식 겨드랑이는 발아에 사용 된 것과 같은 매체 포팅 매체에 80cm 3 냄비 (냄비 당 하나의 경종)로 촬영합니다. 포팅 매체는 초기에 포화 성장 챔버에 뿌리를 형성 할 때까지, 다음 뿌리를 설정하기 위해 7 일간 성장 챔버에서 일정한 수분과 장소 냄비를 유지해야한다.
참고 : 식물이 시점에서 매우 민감하고 스트레스를해서는 안된다.- 16/8 시간의 광주 (12) 내에 22분의 28 ° C를 주 / 야간 온도에서 성장 챔버 조건을 유지한다.
- 백열등과 형광등의 조합이 성장 챔버에서 광을 제공하는데 사용될 수 있고, 적어도 550 μmol m -2의 식물 캐노피 수준에서 12 초 -1 광자 플럭스를 제공한다.
- 950cm 3 냄비에 다시 이식 (포트 당 하나의 경종) C1 : 1 : 포팅 믹스의 1 : 1 혼합물 토양 : 이탄 : 3 ontaining 복제 식물이 4cm 높이있을 때 모래를 다시 온실로 전송, (도 5g 서방 비료 과립을 포함한다).
- 상술 한 바와 같은 방법을 사용하여 식물을 한 번 복제 (즉, 반복 단계는 1.5 내지 1.8, 및 2.1 단계로 진행). 전형적인 시간 코스 연구를 위해, 각 waterhemp 인구에서 최소 6 독립적 인 식물에서 클론을 생성하고 라인 MCR 1-6, ACR 1-6과 WCS 1-6로 기록한다.
- 실험을 반복하고 적절하게 각 waterhemp 인구 내에서 유전 적 다양성을 표현하기 위해 적어도 6 별개 "부모"클론 라인을 설정합니다.
- 분석 얼마나 많은 시간이 지점에 따라, 시간 코스 연구를 수행하기 위해 각 "부모"클론 라인에서 충분히 서브 클론을 생성합니다.
2. 절제 Waterhem과 대사 연구를 실시P 잎
- 복제 waterhemp 식물 제초제 대사와 DT (50) 분석을위한 높이 10~12cm이 때 세 번째로 어린 잎 (첨부 잎자루 0.5 CM을 포함 길이 2-3cm)을 절제.
- 각 waterhemp 공장에서 잘라 잎은 잎자루 두 번째 물 속에서 (잎자루의 0.3 cm가 될 수 있도록 보장),이 컷은 1.5 ml의 플라스틱 병 (유리 병 당 하나의 잎) (15)에 종료 놓습니다.
참고 : 물에서 두 번째로 절단 형성과 목부 혈관을 연결에서 공기 방울을 방지 할 수 있습니다.- 첫째, 부분적으로 1 시간 동안 0.1 M 트리스 - 염산 (PH 6)의 사전 배양 버퍼 (200 μL)에서 컷 잎자루와 잎 적출 몰입.
- 둘째, 새로운 1.5 ml의 유리 병 0.1 M 트리스 - 염산 (PH 6) 플러스 150 μM [URL- (14) C] 제초제 (200 μL) 배양 버퍼를 포함하는 각 잎을 이동하고, 1 시간 동안 28 ℃에서 배양 잎에 제초제 흡수 할 수 있습니다.
참고 : 모두 14 C-메소 트리 온 및
주 : 제초제 대사 대사 억제제의 효과는 단계 2.2.1 및 2.2.2 상기 수정에 의해 결정될 수있다. 사전 배양 버퍼에 억제제의 100 μM을 추가 한 다음 제초제와 배양 버퍼로 전송하고 다시 100 μm의 억제제를 추가, 2 시간 동안 품어 보자. 예를 들어, 말라 티온 및 tetcyclacis 식물 15-17 특정 시토크롬 P450 활동을 억제한다. - 탈 이온수로 절제 잎의 침지 부분을 세척하고 분기 강도 무라 시게과 스쿡 (MS) 염 용액 (500 μL)는 각각 0 시간, 5 시간, 11 시간, 23 시간, 35 시간, 용에 절제 잎을 전송, 시간 코스 대사 연구를위한 성장 챔버.
- 휴가를 제거하여 수확수동 배양 적절한 시점에서의 용액은 폴리 프로필렌 튜브 (15 mL) 및 유리 유봉을 사용하여 액체 질소의 각 잎 조직을 분쇄.
- 방사성 표지 제초제와 위와 같은 폴리 프로필렌 튜브 실험실 조직 균질 90 % 아세톤의 7 ml의 각 잎에서의 대사 산물의 압축을 풉니 다. 90 % 아세톤의 추가 7 ml의 조직 균질 린스, 그리고 조직이 철저하게 (보통 2 분) 분쇄 될 때까지 균질화를 계속합니다. 참고 : 90 % 아세톤 식물 조직에서 가장 제초제의 추출에 사용될 수있다. 이 방법은 흡수 된 방사성 표지 화합물의 90 % 이상을 추출 할 수없는 경우에는, 90 % 메탄올, 90 % 아세토 니트릴을 추출 용매로 치환 될 수있다.
- 추가 추출이 발생하는 레이블 90 % 아세톤 추출물 (14 ml의 총)과 상점은 -4 16 시간 동안 C를 허용하는 °.
참고 : 처리 된 잎의 추출 후, 추출 방사선의 양을ioactivity는 처리 잎에 흡수 방사성 표지 화합물의 적어도 98 %가 일반적이다. 절제 잎에 비 추출 방사능 (결합 잔류 물은) 우리의 이전 연구 (12)의 모든 시점에서 0.3 %로 평균,하지만이 금액은 조사 된 사용 제초제와 시점에 따라 달라질 수 있습니다. - 0.5 ㎖의 최종 부피까지 원심 분리를 10 분 동안 5,000 XG에 샘플 및 로타리 증발기로 40 ℃에서 농축 상청액이 얻어진다. 2.0 ml의 플라스틱 튜브에이 볼륨을 전송합니다.
- 식물의 최종 부피는 1.25 ml의 추출 조정하고 다시 원심 분리기를 10,000 XG에 10 분 동안 모든 입자를 제거하기 위해 (볼륨 1, 1) 물 : 아세토 니트릴을 추가합니다.
- (DPM μL -1) 액체 섬광 분광 (LSS) (12)에 의해 각각의 샘플에서 가져온 나누어 총 방사능을 측정하고 양을 정상화 (예를 들어, HPLC 분석을 위해 주입 화합물, 10,00 [14 C 표지]결과를 그래프 0 총 DPM / 샘플 / 실행) 그래서 Y 축 샘플에서 통일 될 것입니다.
절제된 잎에서 제초제 대사 3. HPLC 분석
주 : 다음 RP-HPLC 조건 (12)를 사용하여 부모 제초제 제초제 대사로 총 추출 방사능를 해결합니다.
- 1ml의 분의 유속으로 18 C 컬럼 (4.6 × 250mm, HPLC 분석 용 5 ㎛의 입자 크기)와 RP-HPLC를 수행 -1 가장 비극성 대한 제초제.
주 : 4 C 또는 C 12 RP-HPLC 컬럼은 또한 대사에서 상위 제초제의 분리를 최적화하기 위해 사용될 수있다. 미리 열 필터 및 / 또는 보호 컬럼은 보호 RP 컬럼의 수명을 연장하는 데 사용될 수있다.- 리제, 물에 0.1 % 포름산 (V / V)와 리제 B 100 % HPLC 급 아세토 니트릴 : RP-HPLC에 대해 다음 이동상을 사용합니다.
주 : HPLC 등급 메탄올 또한 엘로서 사용될 수있다uent의 극성 화합물 및 대사 문제를 해결하기 위해 B,하지만 체류 시간도 변경 될 수 있음에 유의하십시오.
참고 : 우리의 연구 (12)에서의 극성 대사에서 메소 또는 primisulfuron 메틸를 해결하는 데 사용되는 용출 프로파일은 다음과 같습니다 1 단계 : B (4 : 1, v / v)로 : B (3 : 2, V / V ) 선형 구배 (12 분) B :에 : (2, V / V 3) : 2 단계, B (3 : 7, v / v)의 선형 구배 (5 분) 3 단계 : B :에 : (7, V / V 3) B : 2 분 선형 그라데이션 (1 9, v / v)로 (19 분의 총을 포함).
주 : 그래디언트 및 등용 매 단계 분해능을 최적화하기 위해 모재의 물성에 기초하여 조절 될 필요가있을 수있다. - B (4 : 1, v / v)의 선형 구배 (3 분) : 행 (9, V / V 1) B :와, 상기 선형 그라데이션 단계에 따라 B를 (4 : 1, V / v)의 최소 2 분 동안 등용 매 단계 () 다음 추출물 (12)를 주입하기 전에 RP 열을 다시 평형을합니다.
- 리제, 물에 0.1 % 포름산 (V / V)와 리제 B 100 % HPLC 급 아세토 니트릴 : RP-HPLC에 대해 다음 이동상을 사용합니다.
- 검색 및 흐름 Scinti과 방사성 동위 원소 표지 화합물을 시각화llation 분석기. 각 샘플의 총 방사능 량의 백분율로 각 샘플에 남아있는 상위 제초제의 양을 녹음 (검출하고 제조자의 지시에 따라 상기 흐름 섬광 분석기로 정량) 시간 중에 각 waterhemp 인구 제초제 대사의 속도를 결정한다.
4. 통계 절차
- 완전히 무작위 디자인 (또는 통계 분석을위한 다른 적절한 배열)에서 치료를 정렬합니다.
- 각 실험에 대한 세 가지 생물학적 복제로 구성된 각각의 처리, 두 개의 독립적 인 실험을 수행합니다. 두 개의 독립적 인 실험은 총 여섯 생물 복제를 포함한다. 실험 효과 (α가 = 0.05)가 아닌 심각한 경우, 각각의 독립적 인 실험으로부터의 데이터를 결합 분석. 실험 효과가 중요한 경우, 개별적으로 각 실험 분석.
참고 : 처음 세 생물학적 복제를 포함 전n은 1을 실험과 실험 2에서 향후 3 생물 복제는 각 생물 복제는 (MCR 1-6, ACR 1-6, 및 WCS 1-6) 각 집단에서 파생 된 클론 라인 있도록 별개의 "부모"를 나타내는 각각의 시간 - 물론 분석은 유전자 동일한 식물을 사용합니다. 두 개의 독립적 인 실험은 각 waterhemp 인구에 대한 중간 DT (50)의 유전 적 다양성과 결정의 적절한 표현을 가능하게 총 여섯 생물 복제를 포함한다. - 비선형 최소 자승 회귀 분석으로 데이터를 분석하고 DT 50 (S)를 추정하기 위해 단순 일차 곡선들을 장착한다. 아래의 방정식 모델을 설명합니다 :
- 여기서,이 모델 (Y)으로 시간 t에서 나머지 상위 제초제의 비율을 나타내고, μ 나 각 DT 50waterhemp 인구 내가하고 매개 변수 C 0 T = 0 (12)의 부모 제초제 현재의 추정 금액입니다.
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Representative Results
메소 트리 온 신진 대사의 속도에 큰 차이는 WCS 또는 ACR과 MCR (그림 1) 중 하나를 사이에 검출되었다. 각각의 시점에서, MCR은 더 빠른 속도로 이전의 전체 공장의 표현형 응답 (11)과 상관이 메소 트리 온 민감한 인구, WCS 및 ACR보다 메소 트리 온을 물질 대사로 변화했다. 각 집단에서 단일 부모의 공장에서 충분히 식물을 복제하여, 제초제 대사 시간 코스 분석에 의한마다 코스 (12) 내에서 유전 적 다양성의 부족으로 균일하고 재현성이다. 예를 들어, 클론 5 호선 12 메소 대사의 시간 과정은 그림 1에 표시됩니다. 여섯 가지 클론 라인의 총 여섯 개별 부모 식물에서 파생 된 각 인구 (표 1)에서 분석 하였다 전체 평균 (DT)를 결정하기 위해 MCR에 그 메소 트리 온 신진 대사를 표시 (50) 값이 훨씬 빠르게이었다 (
MCR에서 메소 내성 기전을 연구 외에 관련 목적 MCR에서 ALS 억제제에 대한 내성을위한 메커니즘을 결정하는 것이었다. 선행 연구로부터 도출 MCR 서브 모집단 ALS 내성했지만 비 표적 사이트 기반기구 (13)를 나타내는 ALS 목표 부위 유전자의 돌연변이를 가지지 않았다는 것을 보여 주었다. 이는 덜 민감한 ALS 효소 14 부여 목표 부위 돌연변이에 내성 ALS ACR과 대조적이다. TES하기 위해T이 가설, 적출 된 잎의 분석은 [URL- (14) C] primisulfuron 메틸, 설 포닐 우레아 가족의 루게릭 병 억제 제초제로 하였다. 대표적인 HPLC 크로마토 그램에서 14 C-primisulfuron 메틸의 피크 면적 (약 21.6 분의 체류 시간) 12 모자 (그림 2)에서 ACR과 WCS에 비해 MCR에서 유의하게 작았 다. 또한, primisulfuron 메틸보다 짧은 체류 시간에 두 극성 대사는 세 인구 (그림 2)로부터 절단 잎 추출물에서 검출되었다. 이 두 극성 대사 산물의 구조는이 연구에서 결정되지 않은 있지만, 자신의 급속한 형성은 포도당 활용 5 (단계 II 대사) 다음 primisulfuron 메틸 8 (단계 I 대사)의 링 수산화과 일치한다.
MCR, ACR, 및 WCS에 primisulfuron 대사의 정성 분석과 조합하여 (도 2), 양각 시점에서 남아있는 상위의 제초제는 정량화 MCR (13.6 시간), ACR (> 24 시간)에 primisulfuron 메틸 대한 DT 50 값을 결정하는 데 사용 하였다 WCS (> 24 시간) (도 3). MCR에서 상당히 짧은 DT (50) 값은 이전의 전체 식물 연구 (13)에 있던이 인구 ALS 저항의 주요 메커니즘으로 증가 신진 대사와 일치한다. MCR 및 ACR 모두 ALS-억제제 내성 표현형 (표 1)를 표시에도 불구하고 흥미롭게도, 그러나, ACR과 WCS에 primisulfuron의 DT (50) 값은 크게 이상 MCR (그림 3)에 비해 아직 유사하다. ACR은 주요 저항기구 (14)와 같은 덜 민감한 ALS 효소를 가지고 있기 때문에이 빠르게 primisulfuron을 대사 할 필요가 없기 때문에 ACR에서 비교적 긴 DT (50)은 가능하다. 요약하자면, 우리의 연구에 사용되는 절제 waterhemp 잎 분석은 가치있는 ...로서 열매를 산출litative 및 정량적 데이터와는 MCR, ACR, 및 WCS에서 두 개의 서로 다른 제초제를 향해 대사 기반의 저항 메커니즘에 새로운 통찰력을 제공했다.
그림 1 :. 절제 waterhemp에 메소 트리 온 대사의 시간 과정은 무성 복제 인구에서 출발 절제된 잎 (제 3 - 어린 잎, 길이 2-3cm) waterhemp 모종 (10-12cm)에서이 무성 복제 된 각 시간 코스 있도록 각 라인에 대한 연구는 유 전적으로 동일한 식물로 구성되었다. 절제 잎은 ( '펄스')을 1 시간 동안 0.1 M 트리스 -HCl (pH를 6) 플러스 150 μM 방사성 메소 트리 온,이어서 1 시간 동안 0.1 M Tris-HCl 완충액 (pH 6)에 넣고, 다음 분기 강도 무라 시게 및 스쿡 (MS) 염 용액을 0 시간, 5 시간, 11 시간, 23 시간, 35 시간 동안 ( '체이스') 대사가 발생 할 수 있습니다. 다ACR 및 WCS 클론 라인 메소을 대사 동안 TA는, 비선형 최소 제곱 회귀 분석에 의해 분석하고 12 국지적 MCR 클론 라인이 빠르게 메소을 대사 각각 클로닝 waterhemp 인구 별도로 DT (50)을 추정하는 간단한 일차 곡선 적합했다 천천히. 표시 데이터 (식물 생물학의 미국 사회에 의해 저작권) 이전 용지 (12)에서 수정 된 각 waterhemp 인구 만 클론 5 호선에서 시간 과정이다.
그림 2 :. MCR, ACR, 및 WCS (12 HAT)에서 Primisulfuron 메틸 대사 대표 역상 HPLC 크로마토 그램을 150 μM (프로토콜에 설명 된대로) 방사성 표지 primisulfuron 메틸에서 함께 제공 절제 waterhemp 잎 추출물 (12 HAT)에 대한 맥린 카운티 (MCR,), 아담스 카운티 (ACR, B)차 웨인 카운티 제초제에 민감한 (WCS, C) 인구 (표 1). 본격적인 분석 표준과 비교함으로써 결정되는 바와 같이 21.6 분의 머무름 시간의 피크 방사능은 primisulfuron 메틸를 포함한다. 짧은 체류 시간을 가진 봉우리는 히드 록시 primisulfuron 메틸 8 또는 히드 록 대사 5,6의 당화 형태로 primisulfuron 메틸의 가능성이 극성 적은 식물 독성 대사 산물이다. MCR 인구 MCR위한 하부 DT 50 (도 3)로 정량화 ACR 및 WCS, 부모 primisulfuron 메틸 상대적인 양의 상당한 감소를 표시.
그림 3 :. 절제 waterhemp 잎에서 절제된 waterhemp 잎 primisulfuron 메틸 대사의 시간 코스 (THIRD-어린 잎; 그림 1과 메소 트리 온 (12)와 우리의 이전 연구에 설명 된대로 '펄스'와 잎이 0 시간 동안 MS 염 용액 ( '체이스')에서 배양 하였다으로 그 150 μm의 방사성 표지 primisulfuron가 포함 된 것을 제외하고 2) 3cm에가 치료를 받았다 , 3 시간 및 11 시간. 메소 대사 (도 1) (12)에 대해 전술 한 바와 같이 데이터가 비선형 최소 제곱 회귀 분석에 의해 분석 하였다. ACR 및 WCS 더 느리게 (DT 50> 24 시간)을 primisulfuron 메틸을 대사하는 동안 MCR 인구는 빠르게, primisulfuron 메틸 (DT 50 = 13.6 시간)을 대사.
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Discussion
여기에 설명 된 절제 잎 방법은 옥수수가 15 나뭇잎에 primisulfuron 대사 연구에서 이전에 사용되었지만, 우리의 결과는이 프로토콜은 또한 쌍자엽 잡초 종 12 제초제 신진 대사를 측정하기위한 효과적인 정확하고 재현성이 있음을 입증. 전체 식물 연구에 비해 적출 잎 기술의 가장 큰 장점은 적출 잎은 전체 식물 전위의 출현 후 패턴, 전신 제초제 또는 식물 또는 인구 중 제초제 흡수의 차이 독립적이라는 것이다. 적출 리프 세이가 온실 조건 하에서 성장 된 전체 식물에 비해 공부 튜브에 넣고 단일 리프로, 성장 챔버에서 수행되기 때문에, 또한, 환경 적 변동성이 감소된다. 식물 복제 전략도 내 유전 분산의 큰 정도를 최소화 할 MCR (12)에 메소 트리 온 저항 메커니즘을 연구하기위한 우리의 방법에 포함트윈 Amaranthus 인구 9. 잡초 Amaranthus 집단 내 유전 적 다양성은 출현 후 제초제 (18)의 여러 가족 전체 식물의 답변에 설명 된 변동의 양에 의해 설명된다. 정확한 DT (50)의을 결정하는 시간 코스 연구를 수행 할 때와 큰 차이를 검출하는 waterhemp 인구 (12) 사이 DT (50) 값을 비교하면, 다음 단계는 (우리의 적출 잎과 식물 복제 프로토콜에 설명 된대로) 제거 또는 유전 적, 환경 적 감소에 중요한 변화.
다른 메커니즘은 제초제 저항 1,2를 부여하기위한 식물에 존재합니다. 예를 들어, 루게릭 병 억제 제초제에 waterhemp 저항은 목표 사이트가 될 수있는 14 기반 또는 13 비 표적 사이트를 기준으로합니다. primisulfuron 메틸 (그림 3)의 대사 속도는 분명히 두 루게릭 병에 강한 waterh 사이의 이러한 차이를 보여EMP 인구, MCR 및 ACR (표 1). PCR 증폭 및 제초제 대상 부위의 유전자 서열 분석과 조합 절제 잎 분석 크게 waterhemp 또는 다른 쌍자엽 잡초의 제초제 내성이 목표 부위 또는 비 표적 사이트 메커니즘 (2)에 의해 부여되어 있는지 여부를 식별하는쪽으로 도울 것이다.
세포 또는 하위 세포 격리 메커니즘 즉 잡초 2의 비 표적 현장 기반의 저항을 부여 존재하는 경우 우리의 적출 잎 방법의 한계 시각화 또는 공장 전체에 걸쳐 제초제 전위 패턴을 측정하거나 판단 할 수없는 점 등이있다. 앞서 언급 한 바와 같이,이 형태는 메소 내성 잡초 인구 (12)에 정확한 제초제 대사 속도를 결정하는 이점으로 간주되었지만, 식물 크게 대사되지 않은 전신 제초제을 연구 할 때, 반대로 (즉, 비 선택적 허브의 단점을 고려 될 수있다icides) 등 파라쿼트 또는 글루 포시 네이트 (19) 자연 잡초 집단, 비 선택적인 제초제 2, 또는 연락처 제초제 등. 제초제 대사의 대상 사이트 메커니즘이 처음 밝혀하고 있지 않으면, 다음 향상된 속도는 일반적으로 특히 이러한 메소 12 HPPD 억제 제초제에 위드 저항 공부 다음 1,4- 조사되어, 이러한 primisulfuron 메틸 13 ALS 억제 제초제 이러한 아트라진, 12, 또는 광계 II 억제 제초제 제초제 4 아세틸는-CoA를 억제.
P450s는 MCR (12, 13)에서 루게릭 병 Echinochloa 인구 (20)의 저항, 잡초 잔디 종뿐만 아니라와 메소 트리 온과 루게릭 병 저항성과 관련이있다. waterhemp 관련 자웅 이주, 쌍자엽 잡초, 팔머 아마란스 (A.의 palmeri)는, 여러 가지 다른 메커니즘 1을 통해 또한 개발 제초제 저항하는 경향이있다이상의 제초제 내성 잡초 개체군과 종 3 세계에 걸쳐 설명되어 3 내지. 급속히 전위 저항기구로서 제초제 대사 검사에 대한 필요성은 계속 증가 할 것이다. 그러나 일반적으로 별개의 제초제 내성 기전을 조사하기 위해 사용되는 전체 플랜트 시험과 관련이 절제 리프 방식은, 공장에서 평가하고 제초제 대사를 정량화 정확하고 유용한 도구이다. 결과적으로, 성능은 크게 두 풀 4 및 12 쌍자엽 잡초 비 표적 부위 내성 메카니즘을 결정하는데 도움이 될 것 연구자 절제 리프 분석 포함 정확하고 재현성있는 방법으로 이러한 분석을 수행한다.
이 방법의 미래 애플리케이션은 또한 콩 및면과 같은 쌍자엽 작물 제초제 대사의 속도를 결정하는 것을 포함 할 수있다. 제초제 내성 대두 품종과 우리의 실험실에서 진행하는 연구는 또한 절제 L을 이용했다전기로 접근. 그러나 콩은 세 잎의 잎 콩과 작물이기 때문에, '절제 잎자루'기술이 적용되어 있으며, 각 trifoliolate 잎 메인 잎자루 (스켈 톤, Lygin 및 Riechers, 게시되지 않은 데이터)을 통해 흡수를 통해 방사성 표지 제초제를 흡수 할 수 있도록 개발했다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 ml tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 ml tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
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