Introduction
Herbicidresistens hos ogräs utgör ett allvarligt hot mot den globala produktionen av livsmedel och fiber 1,2. För närvarande tusentals av resistenta populationer och naturtyper från över hundra ogräsarter i världen har dokumenterats och studerat 3. En viktig mekanism som förlänar herbicidresistens i växter är förändringen av ogräsmedel mål-site gener och proteiner, inklusive genetiska mutationer som påverkar herbicid-proteinbindnings kinetik eller amplifiering av mål-site-gen 2. Metabolisk avgiftning via förhöjda verksamhet cytokrom P450 monooxygenas (P450) eller glutation S -transferase (GST) enzymer är en annan mekanism som ger herbicidresistens hos ogräs, vilket skiljer sig på flera sätt från målet plats baserade mekanismer 2. Metabolic baserade motstånd har betydande konsekvenser för om växt fitness kostnader (aka fitness påföljder) kan resultera från herbicidresistens mechanism, samt om risken för en enda avgiftning mekanism för att ge kors- eller flera herbicidresistens i ogräspopulationer 1,2,4. Generellt kan ogräsmedel metabolism i växter delas in i tre olika faser 5. Fas I omfattar ogräsmedel konvertering eller aktivering såsom P450-medierad hydroxylering av aromatiska ringar eller alkylgrupper, eller genom N - eller O-dealkyleringsreaktioner, vilket leder till ökad polaritet och partiell ogräsmedel avgiftning 5,6. Nyinförda funktionella grupper i fas I kan ge länk platser för konjugering till reducerat glutation med GSTs eller glukos från UDP-beroende glykosyltransferaser i fas II 5,7. Till exempel är den stora initiala metaboliten av primisulfuron-metyl i majs hydroxy-primisulfuron-metyl-8, som kan metaboliseras vidare till hydroxi-primisulfuron-glukosid (fas II) och sedan transporteras till vakuolen för långsiktig lagring eller ytterligare metabolisk probearbetning 5,6 (fas III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) är en svår kontroll, dikotyledona årliga ogräsarter som hindrar produktionen av majs (Zea mays), sojaböna (Glycine max), och bomull (Gossypium hirsutum) i USA. Den höga graden av genetisk mångfald waterhemp underlättas av dess tvåbyggare biologi och långväga vind pollinering, och en enda kvinnlig waterhemp planta kan producera upp till en miljon frön 9. Dessa frön är små och lätt sprids, vilket naturligtvis förse waterhemp med en effektiv spridning mekanism. Waterhemp visar kontinuerlig groning under hela växtsäsongen 9, och dess frön kan gro efter flera år av dvala. Waterhemp är en C4-växt som har en högre tillväxttakt än de flesta bredbladiga ogräs i jordbruks odlingssystem 10. Dessutom, många waterhemp populationer är resistenta mot flera famjer av ogräsmedel 3.
En population av waterhemp (betecknad MCR) från Illinois är resistent mot 4-hydroxi-fenylpyruvat dioxygenas (HPPD) -inhibiting herbicider 11, såsom mesotrion, liksom till atrazin och acetolaktatsyntas (ALS) -inhibiting herbicider, inklusive primisulfuron-metyl , på grund av icke-mål-site baserade mekanismer 12,13. En annan population av waterhemp betecknad ACR 14, som är primisulfuron-metyl-resistenta (till följd av en mutation i ALS-genen) och atrazin resistent men känsliga för mesotrion och en waterhemp population betecknad WCS 14 som är känslig för primisulfuron-metyl, mesotrion, och atrazin användes i jämförelse med MCR i vår tidigare forskning 12 och aktuella experiment (sammanfattade i Tabell 1). Initiala studier inte upptäcka förändringar i HPPD gen sekvens eller uttrycksnivåer, eller minskad mesotrion upptag i MCRbefolkning jämfört med Mesotrion känsliga populationer 12. Men metabolismstudier med hela växter uppvisade signifikant lägre nivåer av moder mesotrion ogräsmedel i MCR jämfört med ACR och WCS, som korrelerade med tidigare fenotypiska svar på mesotrion 11,12.
| Waterhemp Population | Förkortning | Fenotyp till mesotrion | Mesotrion Resistance Mechanism | Fenotyp till Primisulfuron | Primisulfuron Resistance Mechanism |
| McLean County-resistent | MCR | Resistent | Metabolism * | Resistent | Metabolism |
| Adams County-resistent | ACR | Sensitive | - | Resistent | Mål-site mutation i ALS 14 |
| Wayne County-Sensitive | WCS | Känslig | - | Känslig | - |
* Icke-mål-site resistensmekanismer, andra än förbättrad metabolism, kan också ge mesotrion motstånd i MCR befolkningen 12.
Tabell 1: Beskrivning av waterhemp populationer från Illinois användes i denna studie.
Förutom att bestämma andelen ogräsmedel metabolism i intakta waterhemp plantor, var en annan experimentell metod som utvecklats och används i vår tidigare forskning för att undersöka metabolism genom att använda en utskuren waterhemp bladanalys 12 samt olika P450-hämmare (t.ex. tetcyclacis och malation). Denna metod anpassades specifikt för waterhemp från en PREVígående undersökning av primisulfuron-metyl metabolism i utskurna majs blad 15, eftersom den utskurna blad analysen ännu inte hade rapporterats för att bedriva ogräsmedel metabolism, forskning i en dicot anläggning. Den organophophosate insektsmalation har använts flitigt för in vivo och in vitro ogräsmedel-metabolism forskning för att indikera P450 engagemang 16. Till exempel, tolerans och snabb metabolism av mesotrion i majs beror på P450-katalyserade ring hydroxylering, som kontrollerades när malation ökad känslighet majs till mesotrion 17. På samma sätt, malation hämmade metabolismen av ALS-hämmare primisulfuron-metyl i utskurna majs blad 15. En stor fördel med den utskurna blad tekniken är att data som genereras är oberoende av hela växtslokamönster, en viktig faktor beakta vid bedömningen metabolism av system, efter uppkomsten herbicider i växter. Detta gör det möjligt metod kvantitativ ochkvalitativa metaboliska analyser att fokusera på en enda behandlat blad 12.
En vegetativ kloningsstrategin, i kombination med den utskurna blad protokollet, tidigare användes i waterhemp att genomföra metabolismstudier 12. På grund av korsnings karaktär waterhemp (separata manliga och kvinnliga växter), och hög grad av genetisk mångfald inom dioika Amaranthus arter 9, säker detta protokoll som genetiskt identiska waterhemp plantor analyserades inom tidsförloppet experiment. Denna artikel visar användbarheten av den utskurna blad metod för att mäta hastigheter av herbicid metabolism i tvåhjärtbladig ogräs (waterhemp). Återstående Mängden moder herbicid bestämdes vid varje tidpunkt (figur 1) genom icke-linjär minsta kvadratregressionsanalys, och passar med en enkel första ordningens kurva för att uppskatta hur lång tid för 50% av absorberad ogräsmedel att bryta ned ( DT 50). Representativakromatogrammen från omvänd fas högupplösande vätskekromatografi (RP-HPLC) visas för ALS-resistenta och -känsliga waterhemp populationer, som visar försvinnandet av moder ogräsmedel och åtföljande bildning av polära metabolit (er) under en tidsförloppsstudie (Figur 2). Fokus för vår artikel är att beskriva och demonstrera användbarheten av utskurna blad analys i kombination med ett vegetativt kloningsmetod för att bestämma exakta och reproducerbara hastigheter av ogräsmedel metabolism i dikotyledona växter, med hjälp av likformigt ringmärkt (URL- 14 C) herbicider i tre waterhemp populationer som skiljer sig i deras hel-växtsvar att HPPD- och ALS-inhiberande herbicider (tabell 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. växtmaterial, odlingsbetingelser och vegetativt Cloning
Obs: Tre waterhemp populationer undersöktes i denna forskning: MCR (från McLean County, IL), ACR (från Adams County, IL), och WCS (från Wayne County, IL) (tabell 1).
- Samla in och avbryta waterhemp frön i 0,1 g L -1 agar: vattenlösning vid 4 ° C under minst 30 dagar för att förbättra groning. Obs! Vissa waterhemp populationer är vilande, men det här steget hjälper till att övervinna dvala och göra frö gro mer enhetligt.
- Gro frön av varje waterhemp befolkning (som i tabell 1) på 12 x 12 cm magasin innehållande en planteringsjord medium i växthuset.
- Behåll växthusbetingelser vid 28/22 ° C dag / natt temperaturer inom en 16/8 timmars fotoperiod 12.
- Komplettera naturligt ljus i växthuset med ljuset från kvicksilverhalogenlampor att tillhandahålla ett minimum av 500 fimol m -2 -1 fotonflöde vid anläggningen canopy nivå.
- Transplant uppstod plantor när de är 2 cm i 80 cm 3 krukor i växthuset.
- Transplant plantor till 950 cm 3 krukor innehållande en 3: 1: 1: 1 blandning av ingjutning mix: jord: torv: sand när plantorna är 4 cm lång. Lägg 5 g långsam frisättning gödningsmedelsgranuler till varje kruka och blanda med denna jordblandning.
- Klipp ut och ta bort skjuta apikala meristem innehåller de tre yngsta bladen från 7 cm höga växter för att eliminera apikal dominans.
Obs! Det här steget säkerställer att varje anläggning kommer att växa tillräckligt 3 cm armhålan skott att klona. - Punkt fem axillära skott (3 cm i längd) när plantor är cirka 14 cm hög från varje waterhemp populationen (som i Tabell 1). Avlägsna huvuddelen av bladen på dessa armhålan skott för att minska vattenförlusten vid vidare hantering, men behåller de två yngsta bladen för att möjliggöra ytterligare tillväxt på transplantation.
- Transplant axillär skjuter in i 80 cm 3 krukor (ett plantor per kruka) i planteringsmedium, vilket är samma medium som används för groning. Ingjutning medium bör vara mättad först till rötterna form i tillväxtkammaren, sedan behålla konstant fukt och placera krukor i odlingskammaren under 7 dagar för att etablera rötter.
Obs: Växter är mycket känsliga på denna punkt och bör inte understrykas.- Bibehålla tillväxt kammarförhållanden vid 28/22 ° C dag / natt temperaturer inom en 16/8 timmars fotoperiod 12.
- En kombination av glödlampor och lysrör kan användas för att ge ljus i tillväxtkammaren och bör leverera minst 550 fimol m -2 s -1 fotonflöde vid anläggningen canopy nivå 12.
- Transplant igen till 950 cm 3 krukor (en planta per kruka) containing en 3: 1: 1: 1 blandning av ingjutning mix: jord: torv: sand (inkluderar 5 g långsam frisättning gödningsmedelsgranuler) när klonade plantor är 4 cm lång, sedan överföra tillbaka till växthuset.
- Klona växterna en andra gång genom att använda samma metod som beskrivits ovan (dvs. upprepa steg från 1,5 till 1,8, och sedan vidare till steg 2,1). För en typisk tidsförlopp studien generera kloner från minst sex oberoende växter från varje waterhemp befolkningen och spela in dem som linjer MCR 1-6, ACR 1-6 och WCS 1-6.
- Upprätta minst sex distinkta "förälder" klonala linjer för att upprepa experimentet och fullgott sätt representera genetiska variationen inom varje waterhemp population.
- Beroende på hur många tidpunkter kommer att analyseras, generera tillräckligt under kloner från varje "förälder" klonal linje för att genomföra en tidsförloppsstudie.
2. Genomföra en Metabolism studie med utskurna Waterhemp Löv
- Skära de tredje yngsta blad (2 till 3 cm i längd, omfattar 0,5 cm av bifogade bladskaft) när klonade waterhemp växter är 10 till 12 cm höga för ogräsmedel metabolism och DT 50 analys.
- Klipp bladskaft från varje waterhemp plantera en andra gång (se till att 0,3 cm av bladskaft fortfarande) under vatten, och placera dessa skurna ändarna i 1,5 ml plastflaskor (en blad per flaska) 15.
Obs: Skär en andra gång under vatten förhindrar luftbubblor bildas och plugga xylem fartyg.- För det första, delvis fördjupa utskurna blad med skurna bladskaft i pre-inkubationsbuffert (200 ^ il) av 0,1 M Tris-HCl (pH 6) under en timme.
- För det andra rör sig varje blad i ett annat 1,5 ml ampull innehållande en inkubationsbuffert (200 ^ il) av 0,1 M Tris-HCl (pH 6) plus 150 pM [URL- 14 C] herbicid, och inkubera vid 28 ° C under 1 timme till möjliggöra ogräsmedel absorption i bladen.
Obs: Både 14 C-mesotrion och
Obs: Effekten av metabola hämmare på ogräsmedel metabolism kan bestämmas genom att modifiera steg 2.2.1 och 2.2.2 ovan. Lägg 100 ^ M av inhibitom till pre-inkubationsbuffert och låt inkubera i 2 h, sedan överföra till inkubationsbuffert med herbicid och igen lägga 100 iM hämmare. Till exempel, malation och tetcyclacis hämmar vissa cytokrom P450 verksamhet i växter 15-17. - Tvätta den nedsänkta delen av utskurna blad med avjoniserat vatten och överför utskurna blad till en kvarts styrka Murashige och Skoog (MS) saltlösning (500 l) för 0 timmar, 5 timmar, 11 timmar, 23 timmar, eller 35 timmar, respektive, i tillväxtkammare under tidsförloppet metabolismstudie.
- Skörd genom att ta bort ledighetar från inkubation lösning vid lämplig tidpunkt och manuellt slipa varje bladvävnad i flytande kväve med användning av ett polypropenrör (15 ml) och glas mortelstöt.
- Extrahera radiomärkt herbicid och dess metaboliter från varje blad med 7 ml 90% aceton med en laboratorievävnadshomogenisator i samma polypropenrör som ovan. Skölj vävnadshomogenisator med ytterligare 7 ml 90% aceton, och fortsätter att homogenisera tills vävnaden är ordentligt pulvriseras (vanligen ca 2 min). Obs: 90% aceton kan användas för utvinning av de flesta herbicider från växtvävnader. Men om denna metod är inte extrahera mer än 90% av de radioaktivt märkta föreningarna absorberas, därefter 90% metanol eller 90% acetonitril kan vara substituerad som extraktionslösningsmedel.
- Etikett 90% aceton extrakt (14 ml totalt) och förvara vid 4 ° C under 16 timmar för att möjliggöra ytterligare extraktion skall ske.
Obs: Efter denna extraktion av behandlade bladen, mängden extraherbart radioactivity är typiskt minst 98% av radiomärkta föreningar som absorberas av det behandlade bladet. Icke-extraherbar radioaktivitet (bundna rester) i utskurna blad i genomsnitt endast 0,3% i alla tidpunkter i vår tidigare studie 12, men detta belopp kan variera beroende på herbiciden används och tidpunkt undersöktes. - Centrifugera proverna vid 5000 xg under 10 minuter och koncentreras supernatanter vid 40 ° C med en rotationsindunstare till dess att en slutlig volym av 0,5 ml. Överför denna volym till 2,0 ml plaströr.
- Lägg acetonitril: vatten (1: 1, beräknat på volym) för att justera den slutliga volymen av växtextrakt till 1,25 ml och åter centrifugera vid 10 tusen xg under 10 min för att avlägsna eventuella partiklar.
- Mät den totala radioaktiviteten i en alikvot som tas från varje prov (dpm il -1) genom vätskescintillationsspektroskopi (LSS) 12 och normalisera mängderna av [14 C-märkt] föreningar injiceras för HPLC-analys (till exempel, 10,000 total dpm / prov / run) så y-axlarna blir enhetlig bland prover när graf resultat.
3. HPLC-analys av herbicid Metabolism i Utskurna Löv
Obs: Lös total extraherbar radioaktivitet i moder ogräsmedel och ogräsmedel metaboliter med följande RP-HPLC-betingelser 12.
- Utför RP-HPLC med en kolonn C 18 (4,6 x 250 mm, 5 | im partikelstorlek för analytisk HPLC) vid en flödeshastighet av 1 ml min -1 för de flesta icke-polära herbicider.
Anm: C 4 eller C 12 RP-HPLC-kolonner kan också användas för att optimera separation av moder herbiciden från dess metaboliter. En förkolonn filtret och / eller skyddskolonn kan också användas för att skydda och förlänga livslängden av RP-kolonn.- Använd följande mobila fasen för RP-HPLC: Elueringsmedel A, 0,1% myrsyra (volym / volym) i vatten, och elueringsmedium B 100% HPLC-kvalitet acetonitril.
Obs: HPLC-kvalitet metanol kan också användas som Eluent B för att lösa mer polära föreningar och metaboliter, men tänk på att uppehållstider också kan komma att ändras.
Obs: Elueringsprofilen användas för att lösa mesotrion eller primisulfuron-metyl från deras polära metaboliter i vår forskning 12: Steg 1, A: B (4: 1, v / v) till A: B (3: 2, v / v ) i en linjär gradient (12 min); Steg 2, A: B (3: 2, volym / volym) till A: B (3: 7, volym / volym) i en linjär gradient (5 min); Steg 3, A: B (3: 7, volym / volym) till A: B (1: 9, vol / vol) i en linjär gradient under 2 minuter (innefattande totalt 19 min).
Obs: Gradienter och isokratiska steg kan behöva justeras baserat på de fysikaliska egenskaperna hos grundmaterialet i syfte att optimera upplösning. - Följ ovanstående linjär gradient steg med A: B (1: 9, vol / vol) och A: B (4: 1, vol / vol) i en linjär gradient (3 min) och A: B (4: 1, v / v) isokratisk steg (minst 2 min) att åter jämvikt RP kolumnen innan du injicerar nästa extraktet 12.
- Använd följande mobila fasen för RP-HPLC: Elueringsmedel A, 0,1% myrsyra (volym / volym) i vatten, och elueringsmedium B 100% HPLC-kvalitet acetonitril.
- Identifiera och visualisera radiomärkta föreningar med Flow Scintillation Analyzer. Anteckna mängden moder ogräsmedel kvar i varje prov som andel av den totala radioaktiviteten i varje prov (detekteras och kvantifieras genom Flow Scintillation Analyzer enligt tillverkarens anvisningar) för att fastställa andelen ogräsmedel metabolism i varje waterhemp population under tidsförloppet.
4. Statistiska procedurer
- Ordna behandlingar i en helt randomiserad utformning (eller annat lämpligt arrangemang för statistisk analys).
- Utför två oberoende experiment med varje behandling, består av tre biologiska replikat för varje experiment. De två oberoende experiment inkluderar sex biologiska replikat totalt. Om experimentet effekten är icke-signifikant (α = 0,05), kombinera och analysera data från varje oberoende test. Om försöket effekten är betydande, sedan analysera varje experiment separat.
Obs: Inkludera tre första biologiska replikat in Experiment 1 och de nästa tre biologiska replikat i experiment 2. Varje biologiskt replikat representerar en distinkt "förälder" klonal linje härledd från varje population (MCR 1-6, ACR 1-6, och WCS 1-6) så att varje tids- kursanalys utnyttjar genetiskt identiska växter. De två oberoende experiment inkluderar sex biologiska replikat totalt, vilket möjliggör tillräcklig representation av genetisk variation och bestämning av en median DT 50 för varje waterhemp population. - Analysera data med icke-linjär minsta kvadratregressionsanalys och montera dem med en enkel första ordningens kurva för att uppskatta DT 50 s. Ekvationen nedan beskriver modellen:
- där i denna modell y betecknar den procentuella andelen av den överordnade herbicid som återstår vid tidpunkten t, μ i är DT 50 för varjewaterhemp befolkningen i, och parametern C 0 är den uppskattade mängden moder ogräsmedel närvarande vid t = 0 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stora skillnader i andelen mesotrion metabolism upptäcktes mellan antingen WCS eller ACR och MCR (Figur 1). Vid varje tidpunkt, hade MCR metaboliseras mesotrion snabbare än de två Mesotrion känsliga populationer, WCS och ACR, som korrelerar med tidigare hel-anläggning fenotypiska svar 11. Genom kloning tillräckligt växter från en enda föräldra växt från varje population, ogräsmedel metabolism tidsförloppet analyser är enhetliga och reproducerbara på grund av bristen på genetisk variation inom varje gång kursen 12. Till exempel är tidsförloppet för mesotrion metabolism i klonal linje 5 12 visas i figur 1. Totalt sex olika klonala linjer, som härrör från sex individuella moderplantor, analyserades från varje population (tabell 1) för att fastställa en övergripande median DT 50 värde, vilket tydde på att mesotrion metabolism i MCR var betydligt snabbare (
Förutom att studera mekanismerna för mesotrion motstånd i MCR, en relaterad Målet var att fastställa mekanismen för resistens mot ALS-hämmare i MCR. Tidigare forskning har visat att en sub-population härledd från MCR var ALS resistenta men inte har en mutation i ALS målplatsen genen, vilket tyder på en icke-mål-site baserad mekanism 13. Detta står i kontrast med ACR, som är ALS resistent på grund av en målställe mutation som förlänar en mindre känsligt ALS-enzym 14. För att test denna hypotes var utskurna blad analysen genomfördes med [URL- 14 C] primisulfuron-metyl, en ALS-hämmande herbicid av sulfonylurea familjen. Topparean för 14 C-primisulfuron-metyl i ett representativt HPLC-kromatogram (retentionstid av ca 21,6 minuter) var signifikant mindre i MCR än i ACR och WCS vid 12 HAT (Figur 2). Dessutom framställdes två polära metaboliter med kortare retentionstider än primisulfuron-metyl detekteras i utskurna bladextrakt från alla tre populationer (Figur 2). Även om strukturerna hos dessa två polära metaboliter inte bestämdes i denna studie, är deras snabb bildning förenlig med ring hydroxylering av primisulfuron-metyl 8 (fas I-metabolism) följt av glukos konjugering 5 (fas II metabolismen).
I kombination med de kvalitativa analyser av primisulfuron metabolism i MCR, ACR och WCS (Figur 2), beloppetModer herbicid återstår vid varje tidpunkt kvantifierades och användes för att bestämma de DT 50 värdena för primisulfuron-metyl i MCR (13,6 h), ACR (> 24 h), och WCS (> 24 h) (Figur 3). Den betydligt kortare DT 50 värde i MCR är förenligt med ökad metabolism som den viktigaste mekanismen för ALS resistens i denna population, i enlighet med tidigare hela-växtforskning 13. Intressant, dock DT 50 värdena för primisulfuron i ACR och WCS är liknande men betydligt längre än i MCR (Figur 3), trots både MCR och ACR visar ALS-hämmare resistenta fenotyper (tabell 1). Den relativt långa DT 50 i ACR är möjligen eftersom det inte är nödvändigt att snabbt metabolisera primisulfuron, eftersom ACR har en mindre känsligt ALS-enzym som sin huvudsakliga resistensmekanism 14. Sammanfattningsvis, det utskurna waterhemp bladanalys används i vår forskning gav värdefulla qualitative och kvantitativa data och gav ny insikt metabolism baserade resistensmekanismer mot två olika herbicider i MCR, ACR och WCS.
Figur 1:. Tidsförloppet för mesotrion metabolism i utskurna waterhemp avgår från vegetativt klonade populationer Utskurna blad (tredje yngsta blad, 2 till 3 cm i längd) från waterhemp plantor (10 till 12 cm) var vegetativt klon så att varje tidsförlopp studie för varje linje bestod av genetiskt identiska växter. Utskurna blad placerades i 0,1 M Tris-HCl-buffert (pH 6) under en timme, följt av 0,1 M Tris-HCl (pH 6) plus 150 pM radiomärkt mesotrion för en timme ("puls"), sedan kvartsstyrka Murashige och Skoog (MS) saltlösning ("chase") till 0 timmar, 5 timmar, 11 timmar, 23 timmar och 35 timmar för att tillåta ämnesomsättning att inträffa. DaTA analyserades genom icke-linjär minsta kvadratregressionsanalys och passa med en enkel första ordningens kurva för att uppskatta en DT 50 separat för varje klonad waterhemp populationen 12 .Det MCR klonal linje metaboliseras snabbt mesotrion, medan ACR och WCS klonala linjer metaboliseras mesotrion långsammare. Data som visas är tidsförlopp från endast klon linje 5 för varje waterhemp befolkning, som har modifierats från våra tidigare papper 12 (Copyright av American Society of Plant Biologists).
Figur 2:. Primisulfuron-metyl metabolism i MCR, ACR och WCS (12 HAT) representant omvänd fas HPLC-kromatogram för utskurna bladextrakt waterhemp (12 HAT) medföljer 150 iM radiomärkt primisulfuron-metyl (som beskrivs i protokollet) från McLean länet (MCR, A), Adams län (ACR, B), ennd Wayne County ogräsmedel känsliga (WCS, C) populationer (Tabell 1). Radioaktivt topp med en retentionstid av 21,6 minuter innehåller primisulfuron-metyl, såsom bestämts genom jämförelse med ett autentiskt analytisk standard. Toppar med kortare uppehållstider är sannolikt polära, mindre fytotoxiska metaboliter av primisulfuron-metyl, såsom hydroxy-primisulfuron-metyl-8 eller glykosylerade former av hydroxylerade metaboliter 5,6. MCR befolkningen visade en signifikant minskning av mängden föräldra primisulfuron-metyl i förhållande till ACR och WCS, som kvantifierats som ett lägre DT 50 för MCR (Figur 3).
Figur 3:. Tidsförloppet för primisulfuron-metyl metabolism i utskurna waterhemp blad Utskurna waterhemp blad (third-yngsta blad; 2-3 cm) behandlades såsom beskrivits i figur 1 och vår tidigare forskning med mesotrion 12, förutom att 150 iM radiomärkt primisulfuron ingick som "puls" och blad inkuberades i MS saltlösningen ("chase") till 0 timmar , 3 timmar och 11 timmar. Data analyserades genom icke-linjär minsta kvadratregressionsanalys som beskrivits tidigare för mesotrion metabolism (Figur 1) 12. MCR befolkningen snabbt metaboliseras primisulfuron-metyl (DT 50 = 13,6 timmar), medan ACR och WCS metaboliseras primisulfuron-metyl långsammare (DT 50> 24 timmar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den utskurna blad metod som beskrivs häri har tidigare använts i forskning primisulfuron metabolism i majs blad 15, men våra resultat visar att detta protokoll är också effektiv, noggrann och reproducerbar för att mäta ogräsmedel metabolism i en dikotyledona ogräsarter 12. En stor fördel med den exciderade bladteknik jämfört med hel-växt studier är att en utskuren blad är oberoende av hel-växtslokamönster efter uppkomsten, systemiska herbicider eller skillnader i herbicid upptag bland växter eller populationer. Dessutom är variationen miljö minskat sedan de utskurna blad analyser genomförs i en tillväxtkammare, med en enda blad placerades i ett rör, jämfört med att studera hela växter som odlas under växthusförhållanden. En vegetativ kloningsstrategi ingick också i vår metod för att studera mesotrion-resistensmekanismer i MCR 12 för att minimera den stora graden av genetisk variation inom och varatween Amaranthus populationer 9. Genetisk mångfald inom luftig Amaranthus populationer illustreras av mängden variabilitet dokumenteras i sin helhet-växt svar på flera familjer av efter uppkomsten herbicider 18. När de utför tidsförlopp studier för att fastställa korrekta DT 50 s och för att upptäcka signifikanta skillnader när man jämför DT 50 -värden mellan waterhemp populationer 12, dessa steg (som beskrivs i vår utskuren blad och vegetativt kloningsprotokoll) är kritiska för att eliminera eller minska genetiska och miljömässiga variabilitet.
Olika mekanismer finns i anläggningar för ge herbicidresistens 1,2. Till exempel kan waterhemp resistens mot ALS-hämmande herbicider vara mål-webbplats baserat 14 eller icke-mål-webbplats baserat 13. Metabola andelen primisulfuron-metyl (Figur 3) visar tydligt dessa skillnader mellan två ALS-resistenta waterhEMP populationer, MCR och ACR (tabell 1). I kombination med PCR-amplifiering och sekvensanalys av ogräsmedel mål-site gener, kommer det utskurna blad analysen stor hjälp på att identifiera huruvida herbicidresistens i waterhemp eller andra dikotyledona ogräs ges av målställen eller icke-mål-site mekanismer 2.
Begränsningar av vår exciderad blad metod inkluderar oförmåga att visualisera eller mäta ogräsmedel transloka mönster i hela anläggningen, eller avgöra om cellulära eller subcellulära kvarstad mekanismer som ger icke-mål-webbplats baserad resistens hos ogräs 2. Som tidigare nämnts, var denna aspekt också vara en fördel när man fastställer exakta ogräsmedel ämnesomsättningen priser i Mesotrion resistenta ogräspopulationer 12, men omvänt kan betraktas som en nackdel när man studerar system herbicider som inte metaboliseras signifikant i växter (dvs. den icke-selektiva örticides) såsom glyfosat 2, eller kontakt herbicider som är icke-selektiva i naturliga ogräspopulationer, såsom parakvat eller glufosinat 19. Men om målet-site mekanismer inte avslöjas först då Lönetillägg av ogräsmedel metabolism typiskt undersöks nästa 1,4, i synnerhet när man studerar ogräs motstånd mot HPPD-hämmande herbicider såsom mesotrion 12, ALS-hämmande herbicider såsom primisulfuron-metyl 13 , fotosystem II-hämmande herbicider såsom atrazin 1,12 eller acetyl-CoA-hämmande herbicider 4.
P450 har förknippats med ALS resistens i en Echinochloa befolkning 20, en luftig gräsarter, liksom med mesotrion och ALS resistens i MCR 12,13. En tvåbyggare, dicot ogräs i samband med waterhemp är också benägna att utveckla herbicidresistens Palmer amaranth (A. Palmeri), via flera olika mekanismer 1-3. När fler herbicidresistenta ogräs populationer och arter finns dokumenterade i hela världen 3, kommer behovet av snabbt undersöka ogräsmedel metabolism som en potentiell motståndsmekanismen fortsätter att öka. Den utskurna blad strategi som är tydligt, men relaterat till hela-växtstudier som vanligtvis används för att undersöka ogräsmedel resistensmekanismer, är en noggrann och värdefullt verktyg för att utvärdera och kvantifiera ogräsmedel metabolism i växter. Som ett resultat, skall förmågan att utföra dessa analyser med noggranna, reproducerbara metoder inklusive utskurna analysbladet kommer till stor hjälp forskare vid fastställandet icke-mål-site resistensmekanismer i både gräs 4 och dikotyledon 12 ogräs.
Framtida tillämpningar av detta förfarande kan även innefatta bestämning hastigheter av herbicid metabolism i dikotyledona grödor såsom sojaböna och bomull. Pågående forskning i vårt laboratorium med herbicidtolerant soja sorter har också utnyttjat utskurna lEAF tillvägagångssätt. Eftersom sojabönor är en baljväxt gröda med trifoliate blad, en "utskurna bladskaft" teknik har anpassats och utvecklas så att varje trifoliolate blad kan absorbera radiomärkt ogräsmedel via upptag genom huvudbladskaft (Skelton, Lygin och Riechers, opublicerade data).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 ml tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 ml tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 ml, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
- Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
- Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
- Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
- Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
- Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
- Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
- Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
- Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
- Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
- Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
- Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
- Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
- Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).
- Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
- Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
- Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).
