Abstract
La capacité de mesurer les mutations de cellules souches est un outil puissant pour quantifier dans une population de cellules critique si, et dans quelle mesure, un produit chimique peut induire des mutations qui conduisent potentiellement à un cancer. L'utilisation d'un dosage enzymatique pour quantifier des mutations de cellules souches dans le gène de la glucose-6-phosphate-déshydrogénase liée au chromosome X a été indiqué précédemment. 1 Ce procédé nécessite la préparation de coupes congelées et incubation du tissu sectionné avec un mélange de réaction qui donne un couleur bleue si les cellules produisent fonctionnelle glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) enzyme. Si non, les cellules apparaissent blanchâtres. Nous avons modifié le mélange réactionnel en utilisant Optimal Cutting Temperature composé (OCT) moyen à la place de l'alcool de polyvinyle. Ceci facilite la mesure de pH, augmente la solubilisation des composants de coloration de la G6PD et limite la diffusion de l'enzyme G6PD. Pour démontrer que la mutation a eu lieu dans une cellule souche, l'ensemble doit crypte manque G6PD enzymatiqueactivité. Seulement si une cellule souche abrite une mutation G6PD phénotypique sera tout de la descendance dans la crypte manquer activité enzymatique en G6PD. Pour identifier les cryptes avec une mutation de cellules souches, quatre coupes congelées adjacentes consécutives (un niveau) ont été coupées à 7 um d'épaisseur. Cette approche de faire des coupes adjacentes conformation qui fournit une crypte a été entièrement muté depuis la même crypte muté sera observée dans les sections adjacentes. Diapositives avec des échantillons de tissus qui étaient plus de 50 um part étaient prêts à évaluer d'un total de> 10 4 cryptes par souris. La fréquence de mutation est le nombre de mutés (blanc) cryptes Observée ÷ par le nombre de type sauvage (bleu) cryptes dans un groupe de traitement.
Introduction
Le cancer du côlon est pensé pour impliquer une exposition à des agents environnementaux et composants alimentaires qui peuvent endommager l'ADN et de produire des mutations activatrices somatiques dans oncogènes (par exemple, la ß-caténine) ou d'inactiver les mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs (par exemple, APC). On suppose que ces mutations se produisent dans les cellules critiques souches du côlon. En raison de l'architecture de la crypte unique de l'épithélium du côlon, il est possible de mesurer des mutations de cellules souches dans le côlon après avoir exposé les animaux à des produits chimiques associés à la cancérogenèse colique. Plusieurs enzymes liées au chromosome X peuvent servir d'indicateurs pour des mutations qui se produisent dans les cellules souches, comme les mutations seront présentes dans toutes les cellules au sein d'une crypte.
Auparavant, une procédure a été publiée démontrer que les produits chimiques qui induisent des tumeurs du côlon chez les souris générées également des mutations de cellules souches somatiques dans le côlon par l'intermédiaire d'une analyse de mutations de la glucose-6-phosphate déshydrogénase liée à l'X (G6PD) gène 1-3.La méthode quantifie l'incidence des mutations somatiques aléatoires dans les cellules souches du côlon sans aucune pression de sélection. La procédure implique la production de sections congelées non fixées du côlon de souris traitées et de contrôle et l'identification des cryptes dépourvues de cellules qui produisent l'activité de la G6PD fonctionnel. Ces cryptes mutées, qui apparaissent blancs, indiquent que la mutation a eu lieu dans une cellule souche qui a donné lieu à une progéniture hébergeant également gène G6PD mutant. Dans le dosage enzymatique, G6PD mutant déficient cryptes peuvent pas oxyder le glucose-6-phosphate, qui est nécessaire pour la réduction du nitro bleu de tétrazolium (NBT). Lorsque l'enzyme est fonctionnelle en G6PD, le NBT dans le mélange de coloration est réduite à formazan insoluble et précipités, l'accumulation à l'emplacement de l'enzyme et des cellules "bleues" de coloration. Les cellules qui sont des mutants de la G6PD restent blanchâtre à la différence de cryptes colorés bleus de type sauvage. Cette méthode permet de mesurer les mutations qui ont un phénotype «nulle». Parce que enenzymes, comme la G6PD, peut diffuser hors des cellules sur une section de tissu non fixé si les articles sont placés dans une solution aqueuse, il est nécessaire de stabiliser l'enzyme dans les sections de tissu à analyser. 4 La stabilisation de l'enzyme dans le le tissu ne doit pas interférer avec la diffusion de petites molécules nécessaires à la réaction enzymatique en G6PD de réactifs.
Nous avons fait un certain nombre de changements importants dans la procédure initiale. Le milieu pour la coloration enzymatique critique a été modifié à partir de l'alcool polyvinylique à Optimal Cutting Température composé (OCT), ce qui facilite le contrôle du pH et la solubilisation des composants utilisés dans l'essai. La coloration est effectuée en utilisant 0,4 - 0,5 ml puits en rondelles en acier de sorte que chaque section de tissu a reçu le même volume de mélange de réaction de la G6PD. Une procédure a été développée pour estimer le nombre de cryptes dans une section imagée qui fournit un grand échantillonnage du tissu du côlon, sans avoirde compter manuellement> 10 5 cryptes pour chaque colon. L'analyse des coupes de tissus adjacents 7 um permet la visualisation d'une crypte mutant sur plus d'un coulisseau, ce qui permet de réduire des artefacts de coloration potentiels. Ces changements rendent la procédure plus efficace et reproductible.
En utilisant ce protocole révisé, nous avons quantifié la fréquence de mutation dans les cellules souches du côlon après exposition des souris C57BL / 6 à azoxyméthane, un cancérogène du côlon bien connu chez les rongeurs. 5-7
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Protocol
Les procédures expérimentales et traitement éthique des animaux a été approuvé par l'Université de Pittsburgh IACUC (protocole # 1104674).
1. Préparation de la G6PD coloration Mélange
NOTE: Assurez-vous que la concentration finale de chacun des réactifs est la suivante; 5 mM de glucose-6-phosphate (G6P); 2 mM de NADP, 5 mM de MgCl2, 1 mM de 0,35-méthoxy-5-méthylphénazinium sulfate de méthyle (MMPMS) et 0,8 mM NBT. 1,8,9 Pour chaque réactif, la concentration initiale a été obtenue pour un 40 ml de volume final. Des solutions ont été fraîchement préparés et utilisés chaque jour.
- Ajouter 2 ml de 200 mM pH 7,4 tampon phosphate (PB) à 35 ml de milieu PTOM un tube de 50 ml et agiter vigoureusement. Confirmez avec du papier pH que la solution est d'environ pH 7,4. Si jetez pas la solution.
- Ajouter 61 mg G6P dissous dans 0,94 ml de PB 200 mM, 61 mg PNDA dissous dans 0,94 ml de PB 200 mM, et 41 mg de MgCl2 dissous dans 0,96 ml de 100 mM PB. Reconfirmons que le pH est de 7,4 ~ esprith papier pH. Sinon ~ 7.4, jeter la solution.
- Ajouter 5 mg de MMPMS dissous dans 0,25 ml de PB 200 mM (pH 7,4). Agiter vigoureusement le mélange réactionnel résultant pour générer un homogénat rouge foncé clair. Si la solution est trouble, le mélange doit être jetée. Le tube contenant le mélange de réaction est enveloppé dans une feuille de minimiser l'exposition à la lumière. Stocker le mélange réactionnel à la température ambiante tandis que le composant final, NBT, est préparé.
- Préparer séparément une solution NBT 5 mM en ajoutant 0,4 ml de formamide de diméthyle (DMF) anhydre et 0,4 ml d'éthanol anhydre à 164 mg de NBT dans un tube de 2 ml avec un couvercle joint torique. Fermez le couvercle lâche (non étanche) et porter la solution à ébullition vigoureuse dans un bain d'huile jusqu'à ce que le NBT est en solution. 8
- Laisser le NBT solubilisé refroidir à température ambiante puis ajouter toute la solution au mélange de réaction PTOM et agiter vigoureusement pour obtenir une solution claire. Observez le changement de couleur de la solution de rouge-orange initial à un rouge foncé ou purpLe couleur au fil du temps. C'est normal.
- Placez le mélange final G6PD de coloration dans un 37 ° C pièce chaude pendant 1 heure avant utilisation.
2. Traitement des animaux et de collecte de tissus
- Traiter six semaines d'âge souris C57BL / 6 mâles avec un agent endommageant l'ADN, par exemple, 10 mg / kg azoxymethane (AOM) dans un volume de 200 ul de PBS par injection ip. Traiter les souris témoins avec 200 ul de PBS par injection ip.
- À 90 jours, euthanasier les souris par le CO 2 asphyxie suivie par dislocation cervicale tel qu'approuvé par le protocole IACUC.
- Chirurgicalement ouvrir la cavité abdominale juste au-dessus de l'anus de la base du sternum. Déplacer l'intestin grêle hors de la cavité du corps, mais elle ne exciser. Exciser l'intestin grêle juste en dessous du cæcum au rectum. 10
- Découper soigneusement le long d'un côté du côlon en utilisant une paire de ciseaux micro-dissection et enlever les matières fécales du côlon ouvert propre par lavage avec du PBS stérile. Swiss roll le accised côlon avec la face luminale tournée vers l'extérieur, et le placer dans un moule de tissu. 10
- Immerger complètement le côlon dans un PTOM, moyen et lieu moule dans un Dewar contenant de l'azote liquide 2. Tenez le moule de sorte que la base en plastique est juste en contact avec le liquide N 2 jusqu'à ce que le moyen PTOM gelé.
- Rangez le bloc de tissu congelé à -80 ° C jusqu'à la coupe des coupes congelées. Ne pas utiliser de fixateur, ce qui donnerait lieu à l'inactivation de l'enzyme de la G6PD.
3. Préparation des sections congelées
- Couper des sections de tissus congelés à une épaisseur de 7 pm en utilisant un cryostat à -25 ° C. Couper 4 7 um sections consécutives et placer deux d'entre eux sur la même lame (Figure 1). Préparez 2 toboggans, quatre ou 7 um sections consécutives pour représenter un niveau du côlon (Figure 1).
- Répéter pour le prochain niveau avec une distance minimale de> 50 um à partir de la dernière section de la prEvious niveau. Cette distance est assuré que les cryptes évalués pour chaque niveau ne reproduisent pas les uns les autres.
- Foire essuyer la lame de cryostat avec 100% d'éthanol pour enlever le résidu des PTOM qui accumule pendant la coupe. Avant de sectionnement est reprise, la lame sec est essuyée avec une feuille sèche antistatique pour dissiper la charge statique accumulée. Stocker les lames avec les coupes congelées à -80 o C.
4. La coloration des tissus congelés Section
- Effectuer la réaction enzyme histochimie dans un 37 ° C chambre chaude avec une humidité élevée.
REMARQUE: Tenter la réaction enzymatique dans un four d'incubation ou sur une plus chaud de diapositives a conduit à une mauvaise et incohérente coloration en G6PD. - Construire des puits pour la coloration des tissus en utilisant deux 1,5 cm x 0,15 cm rondelles d'acier (diamètre intérieur x hauteur) qui sont collées ensemble avec de la graisse de silicone (Figure 1). Couper le parafilm pour correspondre à la base du puits avec le centre découper et le lieu de biend sur la coupe de tissu sur la diapositive.
Remarque: le parafilm sur le fond de la rondelle crée un joint entre le coulisseau et la rondelle qui maintient le mélange visqueux G6PD de coloration sur la coupe de tissu. Cette construction donne une bien avec un 0,4 - 0,5 ml de volume de sorte que chaque section de tissu dans l'étude reçoit le même volume du mélange de réaction de coloration de la G6PD. - Incuber les lames de tissus congelés à 37 o C dans une pièce chaude pendant 10 min. A 37 ° C, ajouter le mélange de réaction G6PD de coloration à chaque section de tissu puits (2 sections par lame) pour 45-50 min. Retirer les lames de pièce chaude, et soulevez délicatement les puits en acier inoxydable au large des diapositives.
- Ensemble lames sur leur grand côté pour permettre au milieu réactionnel au drain. Placer les lames dans 100 mM PB (pH 7,4) pendant 30 à 60 minutes pour éliminer le mélange de réaction G6PD de coloration du tissu sans perturber la coloration des tissus. Plonger les lames dans de l'eau distillée pendant 5-10 min pour éliminer les sels PB
- Sceller le tissu par adjonctioning fluoro-gel à partir d'un compte-gouttes sur le tissu et d'attente ~ 30 min pour le sécher. Éviter les bulles qui peuvent confondre l'identification des cryptes mutés.
Remarque: si des bulles se forment, la procédure peut être répétée après enlèvement de la fluoro-gel par trempage dans de l'eau distillée. Ne pas utiliser des lamelles comme ils ont tendance à bulles d'air piège.
5. Détermination de la G6PD Mutant cryptes et Mutation Fréquence
- Analyser diapositives pour G6PD cryptes mutantes sous un microscope optique.
REMARQUE: Les critères utilisés pour identifier une crypte entièrement mutant étaient: (i) la totalité de la crypte était dépourvue de couleur bleue; (ii) la structure externe de la crypte était intact, (iii) le mutant a été observé crypte de 7 um sections adjacentes et, (iv) deux observateurs ont pour identifier le même crypte comme un mutant. Mutants observés sur 7 um sections adjacentes sont comptés comme un seul mutant. - Chaque image crypte mutant G6PD à un grossissement de 40x et de cataloguer les images à l'aide d'un appareil photo 5,0 mégapixels avecun logiciel d'imagerie.
- Quantifier le nombre total de cryptes examinés dans une souris en sélectionnant une section représentant pour chaque souris à partir du niveau de la surface plus petite et de l'image au moment de grossissement de 10x (figure 1C).
REMARQUE: Un niveau représente quatre 7 um sections consécutives (figure 1D), qui en raison de leur proximité montrent souvent mutés cryptes sur plus d'une section. Les niveaux sont séparés par> 50 um à visualiser cryptes de différentes régions du côlon. - Ouvrez chaque fichier image et comptez visuellement le nombre de cryptes sur un niveau en analysant les fichiers (représentées par des cases dans la figure 1C). Fichiers Images varient dans le nombre de cryptes observées d'aussi peu que 20 à> 300 cryptes dans un seul fichier.
- Multipliez le nombre total des cryptes du niveau sélectionné (figure 1C) pour chaque souris par le nombre de niveaux de dépistage du G6PD cryptes mutantes pour chaque colon. Par exemple, un nombre total de1250 cryptes par niveau choisi multiplié par 8 niveaux projetés pour cryptes mutantes est égal à un nombre total de 10.000 cryptes. Évaluer un minimum de 10.000 cryptes pour chaque colon pour l'analyse statistique.
- Combinez le nombre de mutants observés dans tous les animaux par le nombre total de cryptes projetés pour calculer le MF pour chaque traitement. Le niveau MF de cellules souches de fond dans les souris non traitées est <0.1x10 -4 (tableau 1), qui est proche de celle précédemment rapportée dans C57BL / 6. 11
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Representative Results
La capacité de mesurer les mutations de cellules souches du côlon chez les animaux offre un moyen unique de corréler des mutations à l'induction du cancer. Normalement, il est supposé que l'étape critique dans la carcinogenèse implique l'activation des mutations dans des oncogenes et / ou inactiver les mutations dans les gènes suppresseurs de tumeurs. Nous avons injecté souris C57BL / 6 avec 200 pl de PBS ou de 10 mg / kg AOM dans 200 ul de PBS. AOM est un cancérogène du côlon connue. 5-7 à 90 jours les deux points ont été analysés pour les mutations de cellules souches. Ce temps est nécessaire pour permettre aux cellules souches pour remplir tous une crypte, et seulement quand une crypte ensemble ne produit pas G6PD est une crypte identifié comme un mutant de cellules souches. Des exemples de cryptes entièrement mutants sont présentés sur la figure 2. La figure montre deux orientations différentes (verticales et horizontales) des cryptes qui se produisent dans la préparation des coupes congelées. La vue verticale regarde vers le bas l'axe long de la crypte tout l'horizontale fournit une vue de côté. Le cripts qui sont de type sauvage pour G6PD tache bleu avec un peu de blanc qui est due à la production de mucus des cellules caliciformes. En comptant le nombre total des cryptes sur un coulisseau (figure 1) et le nombre de cryptes mutées, le MF pour cryptes mutés peut être calculé. Pas de cryptes mutés ont été observés dans l'un des> 100.000 cryptes de type sauvage inspectés dans le contrôle (PBS) traité des souris. Nous avons fixé le MF pour les souris de contrôle pour être <0.1x10 -4, ce qui est proche de celui rapporté précédemment pour souris C57Bl / 6. 1
Figure 1. Préparation des lames pour G6PD réactif de coloration. (A) Deux rondelles de 1,5 cm x 0,15 cm d'acier (diamètre x hauteur intérieure) sont scellés ensemble avec de la graisse de silicone. Parafilm est ensuite découpé pour correspondre à la base du puits avec le centre découpé et bien placé sur la suisse roulé coupes de tissus du côlon surla diapositive. (B) des deux sections de tissus provenant de coupes adjacentes 7 um sont placés sur la même lame et coloré en même temps. Barre d'échelle: 1,0 cm. (C) Le nombre de cryptes dans la section est déterminé en examinant le tissu à un grossissement de 10x. Le nombre de champs (représentée sous forme de cases) varie en fonction de chaque section. Le nombre de cryptes dans chaque champ est déterminé par comptage visuel et ajouté pour donner le nombre total de cryptes pour ce niveau. (D) Un niveau est défini comme étant quatre coupes de tissus de 7 um consécutifs. Les niveaux sont> 50 um à part pour éviter les chevauchements avec cryptes antérieurement établis. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Des exemples représentatifsdes cryptes mutés observés dans AOM traité C57BL / 6 mâles qui ne produisent pas G6PD fonctionnelle. Les cryptes G6PD mutantes sont bien définies mais sont pratiquement dépourvues de bleuissement. Cryptes de type sauvage qui composent la plupart des cryptes dans le domaine sont de couleur pourpre indiquant une activité bleu / G6PD enzymatique. Échelle:. 10 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| traitement | incidence de cryptes mutantes | un mutant cryptes | cryptes totale analysée | MF (x 10 -4) |
| solvant | 0/6 souris | 0 | > 10 5 | <0,10 |
| AOM | 10/12 souris | 43 | 96821 | 60; 4.44 |
Tableau 1. Fréquence de mutation dans azoxyméthane traité et non traité C57BL / 6. 12
Mutations de cellules souches du côlon chez WT C57BL / 6 90 jours après l'exposition à 10 mg / kg azoxyméthane (AOM) ou le contrôle de solvant.
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Discussion
Souvent l'effet génotoxique d'un composé est déterminée par sa capacité à modifier l'ADN. Cela se fait normalement en isolant le tissu et la mesure du niveau global d'adduits d'ADN. Pour AOM, cela impliquerait quantifier O 6 -méthylguanine adduits dans le côlon. En utilisant cette information d'approche sur les dommages dans des types cellulaires spécifiques, comme dans la niche de cellules souches, est perdu. En outre, un produit d'addition d'ADN est pas de même d'une mutation car seul un petit sous-ensemble de produits d'addition sont finalement convertis en les mutations fixes. 12 Nous fournissons présentes les détails de quantifier de manière reproductible des mutations de cellules souches dans le côlon selon la méthode initiale décrite par Griffiths et al. 1 et sur la base de la G6PD coloration développé par VanNorden. 4,8,9,13,14
Il ya plusieurs étapes critiques pour cette méthode enzyme histochimie pour produire un résultat quantifiable. Il se trouve dans la découpe des tissus. Nettement plus secte de tissuions doivent être produites et analysées que ce qui serait généralement fait avec l'analyse histologique H & E. Nous avons déterminé que 7 um sections ont donné le meilleur coloration en G6PD après évaluation de 5, 6, 7, 8 et 10 um sections épaisses.
D'autre part, le nombre nécessaire de coloration de coupes de tissus de valeur requise d'un mélange réactionnel reproductible. Nous avons trouvé que l'utilisation d'alcool polyvinylique (PVA) utilisé dans le protocole original d'être problématique car il est très visqueux à des pourcentages de la solution (18% et plus) nécessaire pour faciliter la réaction enzymatique de l'histochimie, tout en empêchant la diffusion de l'enzyme G6PD de la tissu. Une meilleure solubilisation des réactifs et de contrôle du pH a été réalisée en remplaçant le PVA avec du milieu octobre, qui contient 10% de PVA. Le pH peut être déterminé avec précision avec du papier pH et si le pH est pas proche de 7,4, la solution est jetée sans perdre échantillon de tissu et le temps précieux. Ce changement conduit à une meilleure et mminerai coloration uniforme dans les coupes de tissus. Au pH (7,2-7,4) nécessaire pour mesurer l'activité de la G6PD, le mélange réactionnel complet a une couleur claire et profonde caractéristique rouge-orange, qui va lentement changer au violet. Indépendamment de la couleur, si la solution de coloration de réaction est trouble il doit être jeté, car il ne sera pas se permettre une bonne coloration. Nous avons constaté que certains lots de milieu PTOM disposait mélanges dehors de la plage de pH requis il est donc conseillé de tester beaucoup en ajoutant le PB (7.4) pour le moyen PTOM et déterminer le pH. Nous avons également utilisé MMPMS comme suggéré précédemment, de 8,9 plutôt que le sulfate de méthyle 5-methylphenazenium utilisé dans le document original afin d'éliminer une sensibilité à la lumière de la mélange de réaction de coloration de la G6PD.
Enfin, la méthode pour dériver le MF est nouvelle par rapport à d'autres méthodes précédemment employé. 1,2 artefacts coloration peut conduire à l'identification potentielle des faux G6PD cryptes mutantes. Pour résoudre tson problème, nous avons analysé 4 coupes de tissus de 7 um contigus qui permet la visualisation de la même crypte muté dans plus d'une section de tissu (Figure 4D). Cette vérification réduit les risques de coloration des artefacts affectant l'analyse MF. En outre, notre méthode utilise une valeur réelle du total des cryptes comptés pour estimer le nombre total de cryptes analysés lors du calcul de la MF.
En raison de la structure de la crypte unique qui se trouve dans le petit et le gros intestin, il est possible de déterminer l'emplacement de cellules souches et lignées de cellules pour chaque crypte. Une limitation majeure de cette approche est qu'elle est limitée à l'intestin, car la morphologie d'autres tissus ne sont pas aussi bien définie que dans le côlon. Par conséquent, il est impossible de déterminer la cellule souche MF dans la plupart des autres tissus qui sont sensibles au cancer. Étant donné que le test est un test phénotypique en fonction de la perte de l'activité enzymatique en G6PD, le MF réelle dans la population de cellules souches volontéêtre plus élevé que ce que nous rapportons pour G6PD due à des mutations dans les bases d'oscillation et des mutations ponctuelles qui ne touchent pas de manière significative l'activité enzymatique.
Bien qu'il existe des limites et des défis à coloration pour l'activité de la G6PD dans les tissus du côlon à quantifier mutations de cellules souches somatiques, d'importantes modifications ont été introduites dans le présent document pour améliorer la faisabilité de l'utilisation de cette méthode. Nous avons constaté que ces changements ont amélioré la reproductibilité de générer le réactif G6PD de coloration et de la quantification de la MF. De plus, la coloration pour l'activité enzymatique en G6PD en tant que marqueur pour des mutations de cellules souches somatiques ne nécessite pas de compétences en immunohistochimie coloration comme on teste pour l'expression de la métallothionéine, un autre 15 marqueur potentiel de mutations de cellules souches somatiques.
À l'avenir, nous allons analyser des mutations de cellules souches du côlon chez les souris traitées avec les composés de l'environnement, tel que le 2-amino-1-méthyl-6-phénylimidazo [4,5-b] pyridine (PhIP) Et d'autres amines aromatiques trouvés dans les viandes grillées, qui sont associés avec le cancer du côlon humain.
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Acknowledgments
Les auteurs ont pas accusés de réception.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. The clonal origin of experimental large bowel tumours. Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).
- Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity. Mutat. Res. 379 (1), (1997).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide. Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).
- Giardina Rosenberg, D. W., C,, Tanaka, T. Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
- Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane. Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).
- Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells. J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). J Vis Exp. (35), (2010).
- Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice. J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).
- Whetstone, R. D., Gold, B. T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon. Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).
- Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).
- Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation. J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).
