Quantificazione del colon le mutazioni delle cellule staminali

Abstract

La capacità di misurare mutazioni di cellule staminali è un potente strumento per quantificare in una popolazione di cellule critico se, e in quale misura, una sostanza chimica può indurre mutazioni che potenzialmente portano al cancro. L'uso di un saggio enzimatico per quantificare mutazioni di cellule staminali nel gene di glucosio-6-fosfato deidrogenasi X-linked è stata riportata in precedenza. ¹ Questo metodo richiede la preparazione di sezioni congelate e incubazione del tessuto sezionato con una miscela di reazione che produce un colore blu se le cellule producono funzionale glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) enzima. In caso contrario, le cellule appaiono biancastro. Abbiamo modificato la miscela di reazione utilizzando ottimali di taglio Temperatura composto (OCT) media al posto di alcool polivinilico. Ciò facilita la misura di pH, aumenta solubilizzazione dei componenti colorazione G6PD e limita la diffusione dell'enzima G6PD. Per dimostrare che una mutazione si è verificata in una cellula staminale, l'intera cripta deve mancare G6PD enzimaticaattività. Solo se una cellula staminale ospita una mutazione G6PD fenotipica saranno tutti della progenie nella cripta mancano attività enzimatica G6PD. Per identificare cripte con una mutazione di cellule staminali, quattro sezioni congelate adiacenti consecutivi (un livello) sono stati tagliati a 7 micron di spessore. Questo approccio di effettuare tagli adiacenti fornisce conformazione che una cripta era completamente mutato in quanto la stessa cripta mutato sarà osservato in sezioni adiacenti. Vetrini con campioni di tessuto che sono stati più di 50 micron a parte erano pronti a valutare un totale di> 10 ⁴ cripte per mouse. La frequenza di mutazione è il numero di mutanti (bianco) cripte osservati ÷ per il numero di tipo selvatico (blu) cripte in un gruppo di trattamento.

Introduction

Il cancro del colon è pensato di coinvolgere l'esposizione ad agenti ambientali e componenti della dieta che possono danneggiare il DNA e produrre l'attivazione di mutazioni somatiche in oncogeni (per esempio, ß-catenina) o mutazioni inattivanti in geni oncosoppressori (ad esempio, APC). Si presume che queste mutazioni critiche si verificano in cellule staminali del colon. A causa dell'architettura cripta unica dell'epitelio del colon, è possibile misurare mutazioni di cellule staminali nel colon dopo l'esposizione a sostanze chimiche animali associati carcinogenesi del colon. Diversi enzimi X-linked possono servire come indicatori per le mutazioni che avvengono nelle cellule staminali, come le mutazioni saranno presenti in tutte le cellule all'interno di una cripta.

In precedenza, un procedimento è stata pubblicata a dimostrazione che le sostanze chimiche che inducono tumori del colon nei topi anche generato mutazioni su cellule staminali somatiche nel colon tramite analisi delle mutazioni del glucosio-6-fosfato deidrogenasi X-linked (G6PD) gene. ^1-3Il metodo quantifica l'incidenza di mutazioni somatiche casuali nelle cellule staminali del colon senza alcuna pressione di selezione. La procedura prevede la produzione di non fissati sezioni congelate colon da topi trattati e di controllo e l'individuazione delle cripte privi di cellule che producono l'attività G6PD funzionale. Queste cripte mutati, che appaiono bianchi, indicano che la mutazione si è verificato in una cellula staminale che ha dato origine a progenie anche ospitare un gene G6PD mutato. Nel saggio enzimatico, G6PD cripte mutante carente non possono ossidare il glucosio-6-fosfato, che è richiesto per la riduzione del nitro blu tetrazolio (NBT). Quando l'enzima G6PD è funzionale, il NBT nella miscela colorazione è ridotto a formazano insolubile e precipitati, accumulando nella posizione dell'enzima e "colorazione" cellule blu. Cellule che sono mutanti G6PD rimangono biancastro in contrasto con blu macchiati di tipo cripte selvatici. Questo metodo misura le mutazioni che hanno un fenotipo "null". Perché itZymes, quali G6PD, può diffondere fuori delle cellule su una sezione di tessuto non fissata se le sezioni sono poste in una soluzione acquosa, è necessario stabilizzare l'enzima in sezioni di tessuto da analizzare. ⁴ La stabilizzazione dell'enzima nel tessuto non deve interferire con la diffusione di piccole molecole reagenti necessari per la reazione enzimatica G6PD.

Abbiamo fatto una serie di cambiamenti significativi alla procedura originale. Il mezzo per la colorazione enzimatica critica è stata cambiata da polivinilalcool a taglio ottimale Temperatura Compound (OCT), che facilita il controllo del pH e la solubilizzazione dei componenti utilizzati nel saggio. La colorazione viene effettuata con 0,4 - 0,5 ml pozzi realizzati rondelle in acciaio in modo che ciascuna sezione di tessuto ricevuto lo stesso volume della miscela di reazione G6PD. Una procedura è stata sviluppata per stimare il numero di cripte in una sezione immaginata che fornisce una grande campionamento del tessuto del colon senza doverdi contare manualmente> 10 ⁵ cripte per ciascun colon. L'analisi di 7 micron adiacenti sezioni di tessuto permette la visualizzazione di una cripta mutante più diapositive, che riduce potenziali artefatti di colorazione. Questi cambiamenti rendono la procedura più efficiente e riproducibile.

Usando questo protocollo rivisto, abbiamo quantificato la frequenza di mutazione in cellule staminali del colon dopo l'esposizione di topi C57BL / 6 a azoxymethane, un agente cancerogeno colon noto nei roditori. ^5-7

Protocol

Le procedure sperimentali e trattamento etico degli animali è stato approvato dal l'Università di Pittsburgh IACUC (protocollo # 1.104.674).

1. Preparazione di G6PD colorazione Miscela

NOTA: Assicurarsi che la concentrazione finale di ogni reagenti è il seguente; 5 mM di glucosio-6-fosfato (G6P); 2 NADP mM, 5 mM MgCl _2, NBT mM 0,35 mm 1-metossi-5-metil methylphenazinium solfato (MMPMS) e 0,8. ^1,8,9 Per ogni reagente la concentrazione iniziale è stata derivata per 40 ml di volume finale. Soluzioni sono state preparate al momento e utilizzati ogni giorno.

1. Aggiungere 2 ml di 200 mM pH 7,4 tampone fosfato (PB) a 35 ml di ottobre medio in un tubo da 50 ml e agitare vigorosamente. Conferma con carta pH che la soluzione è ~ pH 7.4. Se non scartare la soluzione.
2. Aggiungere 61 mg G6P disciolto in 0,94 ml di PB 200 mM, 61 mg NADP disciolto in 0,94 ml di PB 200 mM, e 41 mg di MgCl ₂ disciolto in 0,96 ml di 100 mM PB. Riconfermare che il pH è ~ 7,4 ingegnoh carta pH. In caso contrario ~ 7.4, scartare la soluzione.
3. Aggiungere 5 mg di MMPMS disciolti in 0,25 ml di PB 200 mM (pH 7,4). Agitare la miscela di reazione risultante per generare una chiara omogenato rosso scuro. Se la soluzione è torbida, la miscela deve essere scartato. La provetta contenente la miscela di reazione è avvolto in un foglio per minimizzare l'esposizione alla luce. Conservare la miscela di reazione a temperatura ambiente, mentre il componente finale, NBT, viene preparato.
4. Preparare a parte una soluzione 5 mM NBT aggiungendo 0,4 ml anidra formammide dimetil (DMF) e 0,4 ml di etanolo anidro a 164 mg di NBT in una provetta 2 ml di un coperchio O-ring. Chiudere il coperchio liberamente (non ermeticamente chiusi) e portare la soluzione ad ebollizione vigorosa in un bagno ad olio fino a quando il NBT è in soluzione. ⁸
5. Lasciare solubilizzato NBT raffreddare a RT e quindi aggiungere tutta la soluzione alla miscela di reazione Office e agitare energicamente per ottenere una soluzione limpida. Osservare il cambiamento di colore della soluzione da rosso-arancio iniziale a un rosso scuro o purpcolore le nel tempo. E 'normale.
6. Posizionare la miscela finale G6PD colorazione a 37 ° C camera calda per 1 ora prima dell'uso.

2. Trattamento degli animali e del tessuto Collection

1. Trattare 6 settimane di età C57BL / 6 topi maschi con DNA agente dannoso, ad esempio, 10 mg / kg azoxymethane (AOM) in un volume di 200 microlitri di PBS mediante iniezione ip. Trattare topi di controllo con 200 ml di PBS mediante iniezione ip.
2. A 90 giorni, eutanasia topi da CO ₂ asfissia seguita da dislocazione cervicale come approvato dal protocollo IACUC.
3. Aprire chirurgicamente la cavità addominale da appena sopra l'ano alla base dello sterno. Spostare il piccolo intestino fuori della cavità del corpo, ma non asportare esso. Accise basso intestino appena sotto il cieco al retto. ¹⁰
4. Tagliare attentamente lungo un lato del colon mediante una forbice micro-dissezione e rimuovere le feci dal colon aperto mediante lavaggio con PBS sterile pulito. Swiss roll accised colon con lato luminale rivolto verso l'esterno, e posto in uno stampo di tessuto. ¹⁰
5. Immergere completamente i due punti in ottobre medio e luogo stampo in una Dewar contenente liquido _N 2. Tenere lo stampo in modo che la base in plastica è solo a contatto con il liquido N ₂ fino a quando il mezzo PTOM solidifica.
6. Conservare il blocco tessuti congelati a -80 fino a tagliare sezioni congelate. Non utilizzare fissatore, che si tradurrebbe in l'inattivazione dell'enzima G6PD.

3. Preparazione di sezioni congelate

1. Tagliare sezioni di tessuto congelato ad uno spessore di 7 micron utilizzando un criostato a -25 ° C. Tagliare 4 consecutivi 7 sezioni micron e posizionare due di essi sulla stessa slitta (figura 1). Preparare 2 diapositive o quattro consecutive 7 sezioni micron per rappresentare un livello del colon (Figura 1).
2. Ripetere per il livello successivo con una distanza minima di> 50 micron dall'ultima sezione del prlivello evious. Questa distanza garantito che le cripte valutati per ogni livello non riproducano l'un l'altro.
3. Pulire frequentemente la lama criostato con 100% di etanolo per rimuovere i residui ottobre che si accumula durante il taglio. Prima di sezionamento riprende, la lama secco è pulito con un foglio di essiccatore antistatica per dissipare carica statica accumulata. Conservare i vetrini con sezioni congelate a -80 ^{° C.}

4. La colorazione di sezioni congelate Tissue

1. Eseguire la reazione enzimatica istochimica a 37 ° C ambiente caldo con umidità elevata.
   NOTA: tentativo la reazione enzimatica in un forno incubazione o su un vetrino più caldo ha portato povero e incoerente G6PD colorazione.
2. La costruzione di pozzi per la colorazione dei tessuti utilizzando due rondelle di acciaio da 1,5 a 0,15 cm (interno diametro x altezza) cm x che sono legati tra loro con grasso al silicone (figura 1). Tagliare il parafilm per adattarsi alla base del pozzo con il centro tagliare e il luogo bend sulla sezione di tessuto sul vetrino.
   NOTA: Il parafilm sul fondo della rondella crea una tenuta tra la slitta e la rondella che mantiene la miscela viscosa G6PD colorazione sulla sezione di tessuto. Questo costrutto dà un pozzo con 0,4 - 0,5 ml di volume in modo che ciascuna sezione di tessuto nello studio riceve lo stesso volume della miscela di reazione di colorazione G6PD.
3. Incubare i vetrini di tessuto congelato ^a 37 ° C in un ambiente caldo per 10 minuti. A 37 ° C, aggiungere la miscela di reazione G6PD colorazione ad ogni pozzetto sezione di tessuto (2 sezioni per vetrino) per 45-50 min. Togliere i vetrini dalla camera calda, e sollevare con cautela i pozzetti in acciaio inox al largo delle diapositive.
4. Set diapositive sul loro lato lungo per permettere al mezzo di reazione di scarico. Collocare i vetrini in PB 100 mM (pH 7,4) per 30-60 minuti per rimuovere la miscela di reazione G6PD colorazione dal tessuto senza disturbare la colorazione dei tessuti. Immergere i vetrini in acqua distillata per 5-10 minuti per eliminare i sali PB
5. Sigillare il tessuto da aggiungereing fluoro-gel da un contagocce sul tessuto e in attesa ~ 30 minuti che si asciughi. Evitare bolle che possono confondere l'identificazione delle cripte mutati.
   NOTA: Se si formano bolle, la procedura può essere ripetuta dopo la rimozione del fluoro-gel per immersione in acqua distillata. Non utilizzare coprioggetto in quanto tendono a intrappolare bolle d'aria.

5. Determinazione di G6PD Mutant Cripte e Mutazione frequenza

1. Analizzare scivoli per G6PD cripte mutanti al microscopio ottico.
   NOTA: I criteri utilizzati per individuare una cripta completamente mutante sono stati: (i) l'intera cripta era privo di colore blu; (ii) la struttura esterna della cripta era intatto, (iii) la cripta mutante è stato osservato su sezioni adiacenti 7 micron e, (iv) due osservatori dovevano identificare la stessa cripta come un mutante. Mutanti osservati su adiacenti 7 sezioni micron vengono conteggiati come un mutante.
2. Immagine ogni G6PD cripta mutante a 40x e catalogare le immagini con una fotocamera da 5.0 megapixel consoftware di imaging.
3. Quantificare il numero totale di cripte esaminati in un mouse selezionando una sezione rappresentativa per ogni mouse dal livello con la superficie più piccola e l'immagine che a ingrandimento 10x (Figura 1C).
   NOTA: Un livello rappresenta quattro consecutivi 7 sezioni micron (Figura 1D), che per la loro vicinanza spesso mostrano cripte mutati in più di una sezione. I livelli sono separati da> 50 micron per visualizzare cripte diverse aree del colon.
4. Aprire ogni file di immagine e contare visivamente il numero di cripte a livello analizzando i file (mostrate come caselle nella Figura 1C). File di immagini variano nel numero di cripte osservati da un minimo di 20 a> 300 cripte in un unico file.
5. Moltiplicare il numero totale delle cripte dal livello selezionato (Figura 1C) per ogni mouse per il numero di livelli di screening per cripte G6PD mutanti per ciascuna colon. Per esempio, un conteggio totale di1.250 cripte per livello selezionato moltiplicato per 8 livelli a screening per cripte mutanti equivale a un conteggio totale di 10.000 cripte. Valutare un minimo di 10.000 cripte per ciascun colon per l'analisi statistica.
6. Combinare il numero di mutanti osservate in tutti gli animali per il numero totale di cripte schermati per calcolare il MF per ogni trattamento. Il livello MF cellule staminali sfondo in topi non trattati è <0.1x10 ^-4 (Tabella 1), che è vicino a quello riportato in precedenza in topi C57BL / 6. ¹¹

Representative Results

La capacità di misurare mutazioni di cellule staminali del colon negli animali fornisce un modo unico per correlare le mutazioni a induzione di cancro. Normalmente, si presume che il passaggio critico nella carcinogenesi comporta mutazioni attivanti in oncogeni e / o inattivazione mutazioni in geni oncosoppressori. Abbiamo iniettato Topi C57BL / 6 con 200 microlitri di PBS o 10 mg / kg AOM in 200 ml di PBS. AOM è un agente cancerogeno del colon conosciuto. ^5-7 A 90 giorni i due punti sono stati analizzati per mutazioni di cellule staminali. Questo tempo è necessario per consentire alle cellule staminali per popolare completamente una cripta, e solo quando un intero cripta non produce G6PD è una cripta identificato come un mutante cellule staminali. Esempi di cripte completamente mutanti sono mostrati nella Figura 2. La figura mostra due diversi orientamenti (verticale e orizzontale) delle cripte che si verificano nella preparazione delle sezioni congelate. Il punto di vista verticale è guardando verso il basso l'asse lungo della cripta, mentre l'orizzontale offre una vista laterale. Il gridopunti che sono wild-type per macchia di G6PD blu con alcune bianca che è dovuto alla produzione di muco dalle cellule calice. Contando il numero totale di cripte su un vetrino (figura 1) e il numero di cripte mutati, MF per cripte mutato può essere calcolato. No cripte mutati sono state osservate in qualsiasi> 100.000 cripte tipo selvatico ispezionate nel controllo (PBS) trattata mice. Abbiamo impostato la MF per i topi di controllo per essere <0.1x10 ^-4, che è vicino a quello riportato in precedenza per topi C57BL / 6. ¹

Figura 1. Preparazione di diapositive per reagente G6PD colorazione. (A) Due rondelle 1,5 centimetri x 0,15 centimetri di acciaio (diametro interno x altezza) sono sigillati tra loro con grasso al silicone. Parafilm viene poi tagliato per adattarsi alla base del pozzetto con il centro di taglio e la ben posizionato sopra il Swiss laminati su sezioni di tessuto del colonla diapositiva. (B) Due sezioni di tessuto da adiacenti 7 micron tagli sono collocati sulla stessa slitta e colorato allo stesso tempo. Scala bar: 1,0 centimetri. (C) Il numero delle cripte nella sezione viene determinata esaminando il tessuto ingrandimento 10x. Il numero di campi (mostrato come caselle) varia con ciascuna sezione. Il numero di cripte in ciascun campo è determinato dal conteggio visivo e aggiunto per dare il numero totale di cripte per quel livello. (D) Un livello è definito come quattro sezioni di tessuto 7 micron consecutivi. I livelli sono> 50 micron a parte per evitare sovrapposizioni con cripte precedentemente determinati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Esempi rappresentatividelle cripte mutati osservati in AOM trattato topi C57BL / 6 maschio che non producono G6PD funzionale. Le cripte G6PD mutanti sono ben definiti, ma sono praticamente privi di blu macchia. Cripte tipo selvaggio che costituiscono la maggior parte delle cripte sul campo sono blu viola indicano attività / G6PD enzimatica. Scala:. 10 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

treatment	incidenza di cripte mutanti	cripte mutanti un	cripte totale analizzati	MF (x 10 -4)
solvent	0/6 topi	0	> 10 5	<0,10
AOM	10/12 topi	43	96.821	60; 4.44

Tabella 1. frequenza di mutazione in azoxymethane non trattati e trattati topi C57BL / 6. ¹²
Mutazioni delle cellule staminali del colon in WT C57Bl / 6 topi di 90 giorni dopo l'esposizione a 10 mg / kg azoxymethane (AOM) o controllo con solo solvente.

Discussion

Spesso l'effetto genotossico di un composto è determinata dalla sua capacità di modificare il DNA. Questo avviene normalmente isolando il tessuto e misurando il livello globale di addotti di DNA. Per AOM, ciò comporterebbe la quantificazione O ⁶ -methylguanine addotti nel colon. Utilizzando queste informazioni approccio sui danni entro specifici tipi cellulari, come ad esempio nella nicchia delle cellule staminali, è perduto. Inoltre, un addotto DNA non è la stessa come una mutazione in quanto solo un piccolo sottoinsieme di addotti sono poi convertiti in mutazioni fisse. ¹² Forniamo qui riportati i dettagli per quantificare riproducibile mutazioni di cellule staminali nel colon basato sul metodo iniziale descritto da Griffiths et al. ¹ e sulla base di G6PD colorazione sviluppata da VanNorden. ^4,8,9,13,14

Ci sono diversi passaggi critici per questo metodo enzimatico istochimica per produrre un risultato quantificabile. Uno è il sezionamento dei tessuti. Significativamente più setta tessutoioni devono essere generati ed analizzati che cosa sarebbe tipicamente fatto con H & E l'analisi istologica. Abbiamo determinato che 7 sezioni micron offerta la migliore colorazione G6PD dopo la valutazione di 5, 6, 7, 8 e 10 micron sezioni spesse.

In secondo luogo, la colorazione del numero necessario di sezioni di tessuto preziosi richiesta una miscela di reazione riproducibile. Abbiamo trovato l'uso di alcool polivinilico (PVA) utilizzato nel protocollo originale essere problematico perché è piuttosto viscosa alle percentuali di soluzione (18% e più) necessario per facilitare la reazione enzimatica istochimica evitando la diffusione dell'enzima G6PD dal tissue. Meglio solubilizzazione dei reagenti e il controllo del pH è stato realizzato sostituendo il PVA e di ottene medio, che contiene il 10% PVA. Il pH può essere determinata con precisione con la carta pH e se il pH non è vicino a 7,4, la soluzione viene scartata senza sprecare prezioso campione e tempo. Questo cambiamento ha portato ad una migliore e mORE colorazione coerente in sezioni di tessuto. Al pH (7,2-7,4) necessario per misurare l'attività G6PD, la miscela di reazione ha una caratteristica completa profondo rosso-arancione chiaro, che si modifica lentamente al viola. Indipendentemente dal colore, se la soluzione di reazione di colorazione è torbida deve essere eliminato poiché non offrirà una buona colorazione. Abbiamo scoperto che alcuni lotti degli OCT medio forniti miscele di fuori dell'intervallo pH richiesto quindi è consigliabile testare lotti aggiungendo il PB (7.4) al mezzo di Office e determinazione del pH. Abbiamo usato anche MMPMS come suggerito in precedenza, ^8,9 piuttosto che il solfato di metil-5 methylphenazenium utilizzati nell'industria della carta originale ¹ per eliminare la sensibilità alla luce della miscela di G6PD reazione di colorazione.

Infine, il metodo per derivare la MF è nuovo rispetto ad altri metodi precedentemente impiegati. ^1,2 artefatti di colorazione può portare al potenziale identificazione di falsi G6PD cripte mutanti. Per risolvere i problemi tsuo problema, abbiamo analizzato 4 contigui sezioni di tessuto 7 micron che permette la visualizzazione della stessa cripta mutato in più di una sezione di tessuto (Figura 4D). Questa verifica riduce le possibilità di colorazione manufatti che interessano l'analisi MF. Inoltre, il nostro metodo utilizza un valore effettivo di cripte totale contati per stimare il numero totale delle cripte analizzati nel calcolo del MF.

A causa della struttura unica cripta trovato nel tenue e crasso, è possibile determinare la posizione di cellule staminali e linea cellulare per ogni cripta. Un limite importante il approccio è che è limitato agli intestini perché la morfologia di altri tessuti non è così definita nel colon. Pertanto, non è possibile determinare la cellula staminale MF in molti altri tessuti che sono suscettibili al cancro. Poiché il test è un test fenotipica basata sulla perdita di G6PD attività enzimatica, l'attuale MF nella popolazione di cellule staminali saràessere superiore riportiamo per G6PD a causa di mutazioni a basi Wobble e mutazioni puntiformi che non influenzano significativamente l'attività enzimatica.

Mentre ci sono limiti e le sfide per la colorazione per l'attività G6PD nel tessuto del colon per quantificare le mutazioni di cellule staminali somatiche, sono state introdotte modifiche significative in questo documento per migliorare la fattibilità di utilizzare questo metodo. Abbiamo scoperto che questi cambiamenti hanno aumentato la riproducibilità di generare reagente G6PD colorazione e quantificare il MF. Inoltre colorazione per l'attività dell'enzima G6PD un marcatore per le mutazioni di cellule staminali somatiche non richiede una competenza in immunoistochimica colorazione come sarebbe il test per l'espressione di metallotioneina, ¹⁵ un altro potenziale marcatore di mutazioni di cellule staminali somatiche.

In futuro, analizzeremo le mutazioni delle cellule staminali del colon nei topi trattati con composti ambientali, come ad esempio 2-amino-1-metil-6-fenilimmidazo [4,5-b] piridina (PhIP) E altre ammine aromatiche si trovano in carni alla griglia, che sono associati al cancro del colon umano.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room