Kvantifisering av Kolon stamcelle Mutasjoner

Abstract

Muligheten til å måle stamcelle mutasjoner er et kraftig verktøy for å kvantifisere i en kritisk cellepopulasjon om, og i hvilken grad kan en kjemisk indusere mutasjoner som potensielt lede til kreft. Bruken av en enzymatisk analyse for å kvantifisere stamcelle mutasjoner i X-bundet glukose-6-fosfat-dehydrogenase-genet er blitt rapportert tidligere. ¹ Denne metoden krever fremstillingen av frosne seksjoner og inkubering av snittet vev med en reaksjonsblanding som gir en blå farge hvis cellene produsere funksjonelt glukose-6-fosfat-dehydrogenase (G6PD) enzym. Hvis ikke blir cellene vises hvitaktig. Vi har endret reaksjonsblandingen ved hjelp av beste skjære Temperatur Forbindelse (OCT) medium i stedet for polyvinylalkohol. Dette muliggjør måling av pH, øker oppløseliggjøring av de G6PD fargekomponentene og begrenser diffusjon av G6PD enzymet. For å demonstrere at en mutasjon skjedde i en stamcelle, må hele krypten mangler G6PD enzymatiskaktivitet. Bare hvis en stamcelle havner en fenotypisk G6PD mutasjon vil alt avkom i krypten G6PD mangler enzymatisk aktivitet. Å identifisere krypter med stamcelle mutasjon, ble fire påfølgende tilstøtende frosne seksjoner (et nivå) kuttet på 7 mikrometer tykkelse. Denne fremgangsmåten for fremstilling av tilstøtende kutt gir bekreftelse på at en krypt var fullt mutert siden samme muterte krypten vil bli observert i tilstøtende seksjoner. Lysbilder med vevsprøver som var mer enn 50 mikrometer fra hverandre var forberedt på å vurdere totalt> 10 ⁴ krypter per mus. Mutasjonen frekvens er antallet observerte muterte (hvit) krypter ÷ med antall villtype (blå) krypter i en behandlingsgruppe.

Introduction

Tykktarmskreft er antatt å medføre eksponering for miljøagenter og kosttilskudd komponenter som kan skade DNA og produsere aktivere somatiske mutasjoner i oncogenes (f.eks ß-catenin) eller inaktivere mutasjoner i tumor suppressor gener (f.eks APC). Det antas at disse kritiske mutasjoner forekommer i kolon stamceller. På grunn av den unike krypten arkitekturen kolonepitelet, er det mulig å måle stamcelle mutasjoner i kolon etter å utsette dyrene for kjemikalier er forbundet med colon carcinogenesis. Flere X-bundne enzymer kan brukes som indikatorer for mutasjoner som forekommer i stamceller, som mutasjonene vil være til stede i alle celler i en krypt.

Tidligere ble en prosedyre publisert som viser at kjemikaliene som induserer colontumorer i mus genereres også somatiske stamceller mutasjoner i tykktarmen via analyse av mutasjoner i X-bundet glukose-6-fosfat-dehydrogenase (G6PD) genet. ^1-3Metoden kvantifiserer forekomsten av tilfeldige somatiske mutasjoner i colonic stamceller uten seleksjonstrykk. Fremgangsmåten omfatter fremstilling av frosne ufestede kolon seksjoner fra behandlede og kontrollmus og identifisering av krypter blottet for celler som produserer funksjonelle G6PD-aktivitet. Disse muterte krypter, som vises hvite, indikerer at mutasjonen skjedde i en stamcelle som ga opphav til avkom også huse en mutert G6PD gen. Ved enzymatisk assay, kan G6PD mangelfull mutant krypter ikke oksydere glukose-6-fosfat, som er nødvendig for reduksjon av nitro-blått tetrazolium (NBT). Når G6PD enzymet er funksjonell, er NBT i fargeblandingen redusert til uløselig formazan og utfellinger, akkumuleres på det sted av enzymet, og "flekker" celler blå. Celler som er G6PD mutanter forbli hvitaktig i motsetning til blå farget villtype krypter. Denne metoden måler mutasjoner som har et "null" fenotype. Fordi noenzymer, slik som G6PD, kan diffundere ut av cellene på en ufiksert vev delen hvis delene er plassert i en vandig løsning, er det nødvendig å stabilisere enzymet i vevssnitt som skal analyseres. ⁴ Stabilisering av enzymet i vev må ikke forstyrre diffusjon av små reagens-molekyler som er nødvendig for G6PD enzymatiske reaksjon.

Vi har gjort en rekke viktige endringer i den opprinnelige prosedyren. Mediet for den kritiske enzymatiske flekker er endret fra polyvinylalkohol til Optimal Cutting Temperatur Forbindelse (OCT), som muliggjør pH-kontroll og oppløseliggjøring av de komponenter som benyttes i analysen. Fargingen utføres med 0,4 - 0,5 ml brønner laget av stålskiver, slik at hvert vev seksjon mottok det samme volum av den G6PD reaksjonsblandingen. En fremgangsmåte ble utviklet for å estimere antall krypter i en avbildes del som gir et stort utvalg av tarmvev utenå telle manuelt> 10 ⁵ krypter for hver kolon. Analysen av tilstøtende 7 mikrometer vevssnitt gir visualisering av en mutant krypt på mer enn ett lysbilde, noe som reduserer eventuelle flekker gjenstander. Disse forandringer gjør fremgangsmåten mer effektiv og reproduserbar.

Ved hjelp av denne reviderte protokollen, har vi kvantifisert mutasjonsfrekvens i colonic stamceller etter eksponering av C57BL / 6 mus til azoxymethane, et kjent karsinogen colon hos gnagere. ^5-7

Protocol

De eksperimentelle prosedyrer og etisk behandling av dyr ble godkjent av University of Pittsburgh IACUC (protokoll # 1104674).

1. Utarbeidelse av G6PD Farging Blanding

MERK: Pass på at den endelige konsentrasjonen av hver reagenser er som følger; 5 mM glukose-6-fosfat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM _MgCl2, 0,35 mM 1-metoksy-5-metylfenazinium metylsulfat (MMPMS) og 0,8 mM NBT. ^1,8,9 For hvert reagens startkonsentrasjonen ble utledet for en 40 ml sluttvolum. Løsninger ble tilberedes og brukes hver dag.

1. Tilsett 2 ml av 200 mM pH 7,4 fosfatbuffer (PB) i 35 ml oktober medium i et 50 ml rør og rist kraftig. Bekreft med pH-papir at oppløsningen er ~ pH 7,4. Hvis ikke skal den kastes.
2. Legg 61 mg G6P oppløst i 0,94 ml 200 mM PB, 61 mg NADP oppløst i 0,94 ml 200 mM PB, og 41 mg _MgCl2 ble oppløst i 0,96 ml 100 mM PB. Bekrefte at pH er ~ 7,4 viddh pH-papir. Hvis ikke ~ 7.4, skal den kastes.
3. Tilsett 5 mg MMPMS oppløst i 0,25 ml 200 mM PB (pH 7,4). Rist den resulterende reaksjonsblanding for å generere en klar mørk rød homogenat. Hvis løsningen er uklar, skal blandingen kastes. Røret inneholdende reaksjonsblandingen blir innpakket i folie for å minimere eksponering for lys. Oppbevar reaksjonsblandingen ved romtemperatur, mens den siste komponenten, NBT, blir fremstilt.
4. Klargjør for seg en 5 mM NBT-løsning ved tilsetning av 0,4 ml vannfritt dimetylformamid (DMF) og 0,4 ml vannfri etanol til 164 mg av en NBT i 2 ml rør med en O-ring lokk. Lukk lokket løst (ikke lufttett) og bringe oppløsningen til en kraftig koking i et oljebad inntil NBT er i løsning. ⁸
5. Tillat det solubiliserte NBT avkjøles til RT og deretter legge all oppløsningen til OCT reaksjonsblandingen og rist kraftig for å oppnå en klar løsning. Observer løsningen fargeendring fra innledende orange-rød til en mørkerød eller purple farge over tid. Dette er normalt.
6. Plasser den endelige G6PD farging blandingen i et 37 ° C varmt rom i 1 time før bruk.

2. Animal Behandling og Tissue Collection

1. Behandle 6-uker gamle C57Bl / 6 hannmus med DNA-ødeleggende middel, f.eks, 10 mg / kg azoxymethane (AOM) i et volum på 200 ul PBS ved ip injeksjon. Unn kontrollmus med 200 mL PBS ved ip injeksjon.
2. På 90 dager, avlive mus ved CO ₂ kvelning fulgt ved halshugging som godkjennes av IACUC protokollen.
3. Kirurgisk åpne bukhulen fra like over anus til undersiden av brystbenet. Flytt tynntarmen ut av kroppshulrommet, men ikke skjære det. Eksisere lavere tarmen like under cecum til endetarmen. ¹⁰
4. Skjære forsiktig langs den ene siden av tykktarmen ved hjelp av en mikro-disseksjon sakse og fjerne avføring fra den åpnede kolon ved vasking med rent steril PBS. Swiss roll avgiftsdirektoratetd tykktarm med luminal side vendt utover, og plasser i en vev mold. ¹⁰
5. Helt fordype kolon i oktober medium og sted mold i en Dewar inneholder flytende _N2. Holder formen, slik at plastbasis er bare i kontakt med den flytende _N2 inntil oktober mediet er frosset fast.
6. Oppbevar frosne vevsblokk ved -80 til å kutte frossen seksjoner. Ikke bruk fiksativ, noe som vil resultere i inaktivering av G6PD enzym.

3. Utarbeidelse av Frozen seksjoner

1. Skjær frosne vevssnitt ved en tykkelse på 7 um ved anvendelse av en kryostat ved -25 ° C. Skjær 4 påfølgende 7 mikrometer seksjoner og plassere to av dem på samme lysbilde (figur 1). Forbered 2 lysbilder eller fire påfølgende 7 mikrometer seksjoner for å representere et nivå av tykktarmen (figur 1).
2. Gjenta for neste nivå med en minimumsavstand på> 50 mikrometer fra den siste delen av previous nivå. Denne avstanden sikres at krypter vurdert for hvert nivå ikke duplisere hverandre.
3. Ofte tørke kryostaten blad med 100% etanol for å fjerne oktober rest som samler seg under sagingen. Før seksjonering er gjenopptatt, er den tørre bladet tørkes med en antistatisk tørketrommel ark å spre akkumulert statisk elektrisitet. Lagre lysbilder med de frosne seksjonene ved -80 ^o C.

4. Farging av Frozen § Tissue

1. Utføre enzym histokjemi reaksjonen i et 37 ° C varmt rom med høy fuktighet.
   MERK: Forsøk på den enzymatiske reaksjoner i en inkubasjonstid ovn eller på et lysbilde varmere førte til dårlig og inkonsekvent G6PD farging.
2. Bygge brønner for vev flekker ved hjelp av to 1,5 cm x 0,15 cm stålskiver (indre diameter x høyde) som er bundet sammen ved hjelp av silikonfett (figur 1). Kutt Parafilm for å passe til bunnen av brønnen med sentrum kuttet ut og brønnen stedetd over vev delen på lysbildet.
   MERK: parafilm på bunnen av vaskeren skaper en tetning mellom sleiden og den skive som opprettholder den viskøse G6PD flekker blandingen på vev delen. Denne konstruksjon gir en brønn med en 0,4 - 0,5 ml volum, slik at hver seksjon vev i undersøkelsen mottar det samme volumet av G6PD reaksjonsblandingen farging.
3. Inkuber frosne vev glass ved 37 ^{° C} i et varmt rom i 10 min. Ved 37 ° C, tilsett G6PD farging reaksjonsblandingen til hver vev § godt (2 seksjoner per lysbilde) for 45-50 min. Fjern lysbilder fra varmt rom, og løft av rustfritt stål brønner på lysbildene.
4. Set glir på sin langside, slik at reaksjonsmediet til avløp. Plasser glir i 100 mM PB (pH 7,4) i 30-60 min for å fjerne flekker G6PD reaksjonsblandingen fra vevet uten å forstyrre vev farging. Senk lysbilder i destillert vann i 5-10 minutter for å fjerne PB salter
5. Tett vev av adding fluor-gel fra en dropper på vev og venter ~ 30 min til den tørke. Unngå bobler som kan skamme identifisering av muterte krypter.
   MERK: Hvis det dannes bobler, kan prosedyren gjentas etter fjerning av fluor-gel ved bløtlegging i destillert vann. Ikke bruk dekkglass som de pleier å felle luftbobler.

5. Fastsettelse av G6PD Mutant krypter og Mutation Frequency

1. Analyser lysbilder for G6PD mutant krypter under et lysmikroskop.
   MERK: Kriteriene som brukes til å identifisere en fullt mutant krypten var: (i) hele krypten var blottet for blå farge; (ii) den ytre strukturen av krypten var intakt, (iii) mutanten krypt ble observert på tilstøtende seksjoner 7 um, og (iv) to observatører måtte identifisere den samme krypten som en mutant. Mutanter observert på tilstøtende 7 mikrometer seksjoner er regnet som en mutant.
2. Bilde hver G6PD mutant krypten på 40x forstørrelse og katalogisere bildene ved hjelp av et 5,0 megapiksel kamera medbildebehandlingsprogrammer.
3. Kvantifisere det totale antall krypter undersøkt i en muse ved å velge et representativt snitt for hver mus fra nivået med den minste areal og det bilde ved 10x forstørrelse (figur 1C).
   MERK: Et nivå representerer fire påfølgende 7 mikrometer seksjoner (Figur 1D), som på grunn av sin nærhet ofte viser muterte krypter på mer enn én seksjon. Nivåene er atskilt med> 50 um for å visualisere krypter fra forskjellige deler av tykktarmen.
4. Åpne hver bildefil og visuelt telle antall krypter på et nivå ved å analysere filene (vist som bokser i figur 1C). Bildefiler vil variere i antall krypter observert fra så lavt som 20 til> 300 krypter i én fil.
5. Multiplisere det totale antall krypter fra den valgte nivå (figur 1C) for hver mus med antall nivåer screenet for G6PD mutante krypter for hver kolon. For eksempel, en total telling av1250 krypter per valgte nivået multiplisert med 8 nivåer screenet for mutant krypter tilsvarer en total telling av 10.000 krypter. Evaluere et minimum på 10.000 krypter for hver kolon for statistisk analyse.
6. Kombiner antall mutanter observert i alle dyrene med det totale antall krypter screenet for å beregne MF for hver behandling. Bakgrunnen stamcelle MF-nivå i ubehandlede mus er <0.1x10 ^-4 (tabell 1), som ligger i nærheten av det tidligere er rapportert i C57Bl / 6-mus. ¹¹

Representative Results

Evnen til å måle colonic stamcelle mutasjoner hos dyr som gir en unik måte for å korrelere mutasjoner til induksjon av kreft. Vanligvis antas det at den kritiske trinnet i karsinogenese innebærer aktivering av mutasjoner i onkogener og / eller inaktiverende mutasjoner i tumorsuppressorgener. Vi injisert C57Bl / 6-mus med 200 ul PBS eller 10 mg / kg AOM i 200 ul PBS. AOM er et kjent tykktarmskreftfremkallende. ^5-7 På 90 dager kolon ble analysert for stamcelle mutasjoner. Denne gangen er nødvendig for å tillate stamceller til å fullt ut fylle en krypt, og bare når en hel krypten ikke produserer G6PD er en krypt identifisert som en stamcelle mutant. Eksempler på fullstendig mutant kryptene er vist i figur 2. Figuren viser to forskjellige orienteringer (vertikal og horisontal) av kryptene som oppstår i fremstillingen av frosne snitt. Den vertikale visnings ser ned den lange aksen av krypten mens den horisontale gir en side-visning. Ropetpts som er villtype for G6PD flekken blå med noen hvite som skyldes slimproduksjon fra slimceller. Ved å telle det totale antall krypter på et objektglass (figur 1) og antallet av muterte krypter, kan MF for muterte krypter beregnes. Ingen muterte krypter ble observert i noen av de> 100000 villtype krypter inspiseres i kontrollen (PBS behandlede mus). Vi setter MF for kontrollmusene være <0.1x10 ^-4, som er nær den som tidligere er rapportert for C57Bl / 6-mus. ¹

Figur 1. Utarbeidelse av lysbilder for G6PD farging reagens. (A) To 1,5 cm x 0,15 cm stålskiver (indre diameter x høyde) er forseglet sammen med silikonfett. Parafilm blir deretter kuttet for å passe til bunnen av brønnen med sentrum kuttet ut og brønnen plasseres over sveitsiske rullet kolon på vevssnittraset. (B) To tilstøtende vevssnitt fra 7 um kutt er plassert på samme lysbilde og farget på samme tid. Skala: 1,0 cm. (C) Antall krypter i seksjonen bestemmes ved å se på vev ved 10x forstørrelse. Antall felt (vist som bokser) varierer med hver seksjon. Antallet av kryptene i hvert felt er bestemt ved visuell telling og tilsettes for å gi det totale antall krypter til det nivået. (D) En nivå er definert som fire påfølgende 7 um vevssnitt. Nivåene er> 50 mikrometer fra hverandre for å unngå overlapping med tidligere anslåtte krypter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Representative eksemplerav muterte krypter observert i AOM behandlede C57BL / 6 hannmus som ikke produserer funksjonell G6PD. De G6PD muterte krypter er godt definert, men er praktisk talt blottet for blå flekker. Vill-type-krypter som utgjør mesteparten av krypter i feltet er blå / purpur indikerer G6PD enzymatisk aktivitet. Skala. 10 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

behandling	Forekomsten av mutante krypter	mutant krypter en	totale krypter analysert	MF (x 10 -4)
løsemiddel	0/6 mus	0	> 10 5	<0,10
AOM	10/12 mus	43	96821	60; 4,44

Tabell 1. Mutasjon frekvens i ubehandlet og azoxymethane behandlet C57Bl / 6 mus. ¹²
Colonic stamcelle mutasjoner i WT C57Bl / 6-mus 90 dager etter eksponering for 10 mg / kg azoxymethane (AOM), eller løsningsmiddelkontroll.

Discussion

Ofte genotoksiske effekten av en forbindelse bestemmes ved dens evne til å modifisere DNA. Dette gjøres normalt ved å isolere vevet, og måling av nivå på DNA-addukter. For AOM, ville dette innebære å kvantifisere O ⁶ -methylguanine addukter i tykktarmen. Ved å bruke denne tilnærmingen informasjon om skade i spesifikke celletyper, som i stamcelle nisje, er tapt. I tillegg, er en DNA-addukt ikke det samme som en mutasjon siden bare en liten del av addukter blir til slutt omdannes til faste mutasjoner. ¹² Vi gir heri detaljene til reproduserbart å kvantifisere stamcelle mutasjoner i tykktarmen basert på den opprinnelige metoden beskrevet av Griffiths et al. ¹ og basert på G6PD farging utviklet av VanNorden. ^4,8,9,13,14

Det er flere kritiske trinn for dette enzymet histokjemi metode for å produsere en målbar resultat. En er i seksjonering av vevet. Betydelig mer vev sektioner må genereres og analyseres enn hva som ville være normalt gjøres med H & E histologisk analyse. Vi har fastslått at 7 mikrometer seksjoner ga den beste G6PD farging etter evaluering av 5, 6, 7, 8 og 10 mikrometer tykke seksjoner.

For det andre, farging det nødvendige antall verdifulle vevssnitt kreves en reproduserbar reaksjonsblanding. Vi har funnet at bruk av polyvinylalkohol (PVA) som anvendes i den opprinnelige protokoll for å være problematisk fordi det er ganske viskøs ved løsnings prosenter (18% og høyere) nødvendig for å lette enzym histokjemi reaksjonen mens den hindrer diffusjon av den G6PD enzym fra vev. Bedre oppløseliggjøring av reagensene og kontroll av pH-verdien ble oppnådd ved å erstatte den med PVA oktober medium, som inneholder 10% PVA. PH-verdien kan bestemmes nøyaktig med pH-papir, og hvis pH-verdien ikke ligger i nærheten av 7,4, oppløsningen kastes uten å kaste bort verdifull vevsprøve og tid. Denne endringen førte til bedre og mmalm konsistent farging i vevssnitt. Ved samme pH (7,2 til 7,4) som er nødvendig for å måle G6PD-aktivitet, har den komplette reaksjonsblanding et karakteristisk klart dyp oransje-rød farge, som vil langsomt endres til fiolett. Uavhengig av fargen, hvis reaksjonen fargeløsning som blir turbid det må kastes fordi den ikke vil gi god farging. Vi har funnet at noen masse oktober medium tilgjengelig blandinger utenfor det nødvendige pH-område slik at det er tilrådelig å teste masse ved tilsetning av PB (7,4) til den oktober medium og bestemmelse av pH. Vi har også benyttet MMPMS som tidligere er foreslått, ^8,9 i stedet for 5-methylphenazenium metylsulfat brukt i den opprinnelige papir ^{1 for å} eliminere lysfølsomhet G6PD farging reaksjonsblandingen.

Endelig er fremgangsmåten for å utlede MF er nye sammenlignet med andre metoder som tidligere anvendt. ^1,2 Farging gjenstander kan føre til identifikasjon av potensielle falske G6PD mutante krypter. Å feilsøke thans problem, analyserte vi 4 sammenhengende 7 mikrometer vevssnitt som gjør det mulig for visualisering av det samme muterte krypten i mer enn en vevet seksjon (figur 4D). Denne bekreftelsen reduserer sjansene for farging gjenstander påvirker MF analyse. Dessuten anvender foreliggende fremgangsmåte en faktisk verdi av totale krypter telles for å beregne det totale antall krypter analysert ved beregning av MF.

På grunn av den unike krypten struktur funnet i tynn- og tykktarmen, er det mulig å bestemme plasseringen av stamceller og celle-linjen for hver krypten. En viktig begrensning for metoden er at det er begrenset til tarmene på grunn av morfologien av andre vev ikke er så godt definert som i tykktarmen. Derfor er det ikke mulig å fastslå stamcelle MF i de fleste andre vev som er utsatt for kreft. Siden analysen er en fenotypisk assay basert på tap av enzymatisk aktivitet G6PD, selve MF i stammecellepopulasjonen vilvære høyere enn vi rapporterer for G6PD grunn av mutasjoner ved sling baser og punktmutasjoner som ikke i vesentlig grad påvirker enzymatisk aktivitet.

Mens det er begrensninger og utfordringer for flekker for G6PD aktivitet i tykktarmen vev å kvantifisere somatiske stamceller mutasjoner, betydelige modifikasjoner introdusert i denne artikkelen for å forbedre mulighetene for å benytte denne metoden. Vi har funnet at disse endringene forbedret reproduserbarhet for generering av G6PD fargereagens og kvantifisering av MF. Videre farging for G6PD enzymaktivitet som en markør for somatiske stamcelle mutasjoner ikke krever en kompetanse i immunhistokjemi flekker som ville teste for uttrykket av metallothionein, ¹⁵ en annen potensiell markør for somatiske stamcelle mutasjoner.

I fremtiden vil vi analysere colonic stamcelle mutasjoner hos mus behandlet med miljø forbindelser, slik som 2-amino-1-metyl-6-fenylimidazo [4,5-b] pyridin (PhIP) Og andre aromatiske aminer som finnes i grillet kjøtt, som er knyttet til menneskelig tykktarmskreft.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room