Количественное толстой стволовых клеток мутации

Abstract

Возможность измерения стволовых клеток мутации является мощным инструментом для количественной оценки в критическом клеточной популяции, если и в какой степени, химикат может вызывать мутации, которые потенциально могут привести к раку. Применение ферментативного количественного анализа для количественной оценки мутаций стволовых клеток в гене глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Х-хромосомой уже сообщалось ранее. ¹ Этот метод требует подготовки замороженных срезов и инкубации секционного ткани с реакционной смеси, что приводит к синий цвет, если клетки продуцируют функциональный глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) фермент. Если нет, то появляются беловатые клетки. Мы модифицировали реакционной смеси с использованием оптимальных температуры резания Соединение (OCT) среды в месте поливинилового спирта. Это облегчает измерение рН, повышает растворимость компонентов Г6ФД окрашивания и ограничивает диффузию Г6ФД фермента. Чтобы продемонстрировать, что мутация произошла в стволовой клетки, вся склепа должны хватает Г6ФД ферментативныеМероприятия. Только если стволовая клетка питает фенотипическим мутации Г6ФД будет все потомство в крипты хватает Г6ФД ферментативную активность. Чтобы определить склепов с мутацией стволовых клеток, четыре последовательных смежных замороженные срезы (уровень) были вырезаны в 7 мкм толщиной. Этот подход сделать соседние сокращений обеспечивает конформацию, что склеп был полностью мутировал так же мутировавший склепа будет наблюдаться в соседних секций. Слайды с образцами тканей, которые были более, чем 50 мкм друг от друга были готовы оценить в общей сложности 10> ⁴ склепов на мышь. Частота мутации число наблюдаемых мутантных (белых) крипт ÷ на количество дикого типа (синий) крипт в группе лечения.

Introduction

Рак толстой кишки, как полагают, подвержен воздействию окружающей среды агентов и пищевых компонентов, которые могут повредить ДНК и производить активации соматических мутаций в онкогены (например, SS-катенин) или инактивации мутации в генах супрессоров опухолей (например, APC). Предполагается, что эти критические мутации происходят в толстой стволовых клеток. Из-за уникального крипт архитектуры ободочной эпителия, можно измерить стволовых клеток мутации в толстой кишке после экспонирования животных к химикатам, связанных с толстой кишки канцерогенеза. Несколько Х-сцепленные ферменты могут служить в качестве индикаторов мутаций, которые происходят в стволовых клетках, так как мутации будут присутствовать во всех клетках крипты внутри.

Ранее процедура была опубликована демонстрируя, что химические вещества, которые вызывают опухоли толстой кишки у мышей также генерируется соматических мутаций стволовых клеток в толстой кишке с помощью анализа мутаций в Х-хромосомой глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (G6PD) генов. ^1-3Метод определяет количество случаев случайных соматических мутаций в толстой стволовых клеток без давления отбора. Процедура включает в себя производство незаписанных участков толстой кишки замороженных из обработанных и контрольных мышей и определение склепов, лишенных клеток, которые производят функциональную активность Г6ФД. Эти мутантные склепов, которые кажутся белыми, показывают, что мутация произошла в стволовой клетки, которые привели к потомству также укрывательство мутантный ген G6PD. В ферментативного количественного анализа, Г6ФД дефицитных мутантных крипты не может окислить глюкозо-6-фосфат, который необходим для снижения нитро синего тетразолия (NBT). Когда Г6ФД фермента функционально, НБТ в окрашивания смеси снижается до нерастворимого формазана и осадков, накапливая на месте фермента и "окрашивания" клеток синего. Клетки, которые Г6ФД мутанты остаются беловатые, в отличие от синих окрашенных диких склепов типа. Этот метод измеряет мутации, которые имеют «нулевого» фенотип. Потому что анзимов, такие как G6PD, могут диффундировать из клеток на участке нефиксированной ткани, если участки размещены в водном растворе, необходимо, чтобы стабилизировать фермент в срезах тканей для анализа. ⁴ Стабилизация фермента в ткань не должна мешать диффузии малых молекул реагентов, необходимых для реакции ферментативного Г6ФД.

Мы сделали ряд существенных изменений в первоначальной процедуре. Среда для критической ферментативного окрашивания был изменен с поливинилового спирта с Оптимальное температуры резания соединения (OCT), что облегчает контроль рН и растворение компонентов, используемых в анализе. Окрашивание осуществляется с использованием 0,4 - 0,5 мл колодцев из стальными шайбами ​​так, чтобы каждый срез ткани животных получала такой объем реакционной смеси Г6ФД. Процедура была разработана, чтобы оценить количество крипт в виде изображения сечения, которая обеспечивает большой выборки толстой ткани безвручную рассчитывать> 10 ⁵ склепов для каждого толстой кишки. Анализ соседних участков ткани 7 мкм обеспечивает визуализацию мутантного склепе на более чем одного слайда, который снижает потенциальные артефакты окрашивания. Эти изменения делают процедуру более эффективным и воспроизводимым.

Используя этот пересмотренный протокол, мы количественно частоты мутаций в клетках ободочной стволовых после воздействия на мышей C57BL / 6, чтобы azoxymethane, известный канцероген толстой кишки у грызунов. ^5-7

Protocol

Экспериментальные методики и этичное обращение с животными был утвержден в университете Питтсбурга IACUC (протокол № 1104674).

1. Подготовка Г6ФД окрашивания смеси

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что конечная концентрация каждого реагентов следующим образом 5 мМ глюкозо-6-фосфат (G6P); 2 мМ НАДФ, 5 мМ MgCl _2, 0,35 мМ 1-метокси-5-метил methylphenazinium сульфат (MMPMS) и 0,8 мМ NBT. ^1,8,9 Для каждого реагента начальная концентрация была получена в течение 40 мл конечного объема. Растворы свежеприготовленный и использовали каждый день.

1. Добавить 2 мл 200 мм рН 7,4 фосфатный буфер (PB) в 35 мл ОКТ среды в 50 мл пробирку и энергично встряхивают. Подтверждение индикаторной бумагой, что раствор подвергают ~ рН 7,4. Если не отменить решение.
2. Добавить 61 мг G6P растворяли в 0,94 мл 200 мМ PB, 61 мг НАДФ растворяют в 0,94 мл 200 мМ PB, и 41 мг _MgCl 2, растворенного в 0,96 мл 100 мМ PB. Подтвердить, что рН ~ 7,4 остроумиеч рН бумаги. Если не ~ 7,4, отменить решение.
3. Добавить 5 мг MMPMS растворенных в 0,25 мл 200 мМ PB (рН 7,4). Энергично встряхнуть полученной реакционной смеси для создания четкого темно-красный гомогената. Если раствор мутный, смесь должна быть отброшена. Трубка, содержащая реакционную смесь завернуть в фольгу, чтобы свести к минимуму воздействие света. Храните реакционной смеси при комнатной температуре, а последний компонент, НБТ, готовится.
4. Приготовьте отдельно раствор 5 мМ NBT добавлением 0,4 мл безводного диметилформамида (ДМФ) и 0,4 мл безводного этанола до 164 мг NBT в 2 мл пробирку с уплотнительным кольцом крышки. Закройте крышку неплотно (не плотно закрытой) и довести раствор до энергичного кипения на масляной бане до тех пор, пока NBT в растворе. ⁸
5. Разрешить растворенный NBT остыть до комнатной температуры, а затем добавить все решения OCT реакционной смеси и энергично встряхивают, чтобы получить прозрачный раствор. Соблюдайте изменение цвета раствора от начального оранжево-красного до темно-красного или PurpЦвет ле течением времени. Это нормально.
6. Поместите окончательного окрашивания Г6ФД смеси в 37 ° C теплом помещении в течение 1 часа перед использованием.

2. Животное Лечение и тканей Коллекция

1. Лечить 6-недельных C57BL / 6 самцов мышей с ДНК повреждающего агента, например, 10 мг / кг azoxymethane (ОСО) в объеме 200 мкл PBS путем инъекции IP. Лечить контрольных мышей с 200 мкл PBS по инъекцией.
2. В 90 дней, усыпить мышей СО ₂ удушья с последующим смещением шейных позвонков, утвержденного протоколом IACUC.
3. Хирургическим вскрыть брюшную полость от чуть выше ануса до основания грудины. Перемещение тонкий кишечник из полости тела, но не вырезать его. Акцизный нижнюю кишечник чуть ниже слепой кишки к прямой кишки. ¹⁰
4. Осторожно разрезать вдоль одной стороны толстой кишки с помощью микро-рассечение ножницами и удалить фекалии из открытой толстой кишки путем промывки чистой стерильной PBS. Рулет акцизд толстой кишки с просвета стороной наружу, и место в ткани формы. ¹⁰
5. Полностью погрузиться толстой кишки в октябре среднего и место пресс-формы в Дьюар с жидким _N 2. Удержание формы с тем, что пластмассовое основание просто в контакте с жидкой _N 2 до среда ОСТ замерзла.
6. Храните блок замороженной ткани при -80 до резки замороженных срезов. Не используйте закрепитель, который приведет к инактивации фермента G6PD.

3. Подготовка замороженных срезов

1. Сокращение замороженных срезов при толщине 7 мкм, использу криостат при -25 ° С. Вырезать 4 последовательных 7 мкм разделы и поместите два из них на одном слайде (рис 1). Подготовьте 2 горки, или четыре последовательных 7 мкм разделы, представляют собой один уровень толстой кишки (рис 1).
2. Повторите для следующего уровня с минимального расстояния> 50 мкм от последней части прevious уровень. Это расстояние обеспечивается, что склепы начисленных для каждого уровня не дублируют друг друга.
3. Часто протрите лезвие криостата со 100% этанола, чтобы удалить остаток, который накапливается OCT во время резки. Перед секционирования возобновляется, сухой лезвие протереть антистатической листа сушилки для рассеивания статического заряда накопленного. Храните слайды с замороженных срезов при -80 ^{о С.}

4. Окрашивание Замороженные срезы ткани

1. Выполните реакцию фермент гистохимии в 37 ° C теплом помещении с высокой влажностью.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Попытка ферментативную реакцию в инкубационном духовке или на слайд грелки привело к ухудшению и непоследовательной окрашивания Г6ФД.
2. Построить скважин для ткани окрашивания с использованием двух 1,5 см х стальными шайбами ​​0,15 см (внутренний диаметр х высота), которые соединяются вместе при помощи силиконовой смазкой (рис 1). Вырезать парафильмом, чтобы соответствовать базы скважины с центром вырезать и место хорошоd по сечению ткани на слайде.
   Примечание: парафильмом на нижней части стиральной машины создает уплотнение между стеклом и шайбой, который поддерживает вязкой окрашивания Г6ФД смесь на участке ткани. Эта конструкция дает хорошо с 0,4 - 0,5 мл объеме, так что каждый срез ткани в исследовании принимает тот же объем реакционной смеси Г6ФД окрашивания.
3. Выдержите замороженные слайды ткани на 37 ^{о С} в теплом помещении в течение 10 мин. При 37 ° С, добавить окрашивания Г6ФД реакционной смеси до каждого среза ткани скважины (2 секции на слайд) 45-50 мин. Удалить слайды из теплой комнате, и осторожно поднимите скважин из нержавеющей стали выключения слайдов.
4. Установка скользит по их длинной стороне, чтобы реакционная среда, чтобы высушить. Место слайдов в 100 мМ PB (рН 7,4) в течение 30-60 мин для удаления окрашивания Г6ФД реакционной смеси из ткани, не нарушая окрашивание тканей. Submerge слайды в дистиллированной воде в течение 5-10 мин, чтобы удалить соли PB
5. Уплотнение ткани дополненияING фтор-гель от капельницы на ткани и ждет ~ 30 мин для того, чтобы высохнуть. Избегайте пузырей, которые могут затруднить выявление мутантных склепов.
   Примечание: Если пузырьки образуют, процедура может быть повторена после удаления фтор-гель путем замачивания в дистиллированной воде. Не используйте крышку скользит, как они, как правило, воздушных пузырьков ловушки.

5. Определение Г6ФД Mutant гробницы и частоты мутаций

1. Анализ слайды для Г6ФД мутантных криптах под световым микроскопом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии, используемые для идентификации полностью мутантный крипту были: (я) весь склепа был лишен синего цвета; (II) наружный структура крипт была цела, (III) мутант крипты наблюдалось на смежных участках 7 мкм и, (IV) два наблюдателя были определить тот же крипту как мутанта. Мутанты, наблюдаемые на соседних 7 мкм разделов считаются как одного мутанта.
2. Изображение каждой Г6ФД мутант склепа в 40-кратном увеличении и каталогизировать изображения, используя 5,0-мегапиксельную камеру сПО для обработки изображений.
3. Количественно общее количество крипт, рассмотренных в мыши, выбрав репрезентативной секции для каждой мыши из уровня с наименьшим площадь поверхности и образу его на 10-кратным увеличением (рис 1c).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень представляет собой четыре последовательных 7 мкм секций (рис 1D), которые из-за их близости часто показывают мутировал склепов на более чем одном разделе. Уровни разделены> 50 мкм для визуализации крипты из разных областей толстой кишки.
4. Открытие каждого файла изображения и визуально подсчитывают количество крипт на уровне путем анализа файлов (показано на рисунке коробки 1с). Изображения файлы различаются по числу крипт наблюдается от самого низкого, как 20> 300 склепов в одном файле.
5. Умножить общее число крипт от выбранного уровня (рис 1в) для каждой мыши на число уровней, проверенных на Г6ФД мутантных криптах для каждого толстой кишки. Например, общее количество из1250 крипты в выбранном уровне, умноженные на 8 уровней, проверенных на мутантных криптах равняется общее количество 10000 склепов. Оценка как минимум 10000 крипт ободочной кишки для каждого статистического анализа.
6. Смешайте количество мутантов наблюдалось во всех животных на общее количество крипт на экране, чтобы рассчитать MF для каждой обработки. Фоновый уровень стволовых клеток Ф. в необработанном мышей <0.1x10 ^-4 (Таблица 1), что близко к тому, что ранее сообщалось, в C57Bl / 6 мышей. ¹¹

Representative Results

Возможность измерения толстой мутации стволовой клетки у животных предоставляет уникальный способ соотнести мутации в индукции рака. Обычно предполагается, что важным шагом в процессе канцерогенеза включает активирующие мутации в онкогены и / или инактивации мутации в генах супрессоров опухолей. Мы вводили мышам C57BL / 6 с 200 мкл PBS или 10 мг / кг АОМ в 200 мкл PBS. ОСО является известным канцерогеном толстой кишки. ^5-7 В 90 дней были проанализированы двоеточия для стволовых клеток мутации. Это время необходимо, чтобы стволовые клетки полностью заполнить, чтобы склеп, и только тогда, когда весь крипт не производит Г6ФД является крипты идентифицирован как стволовых клеток мутанта. Примеры полностью мутантных криптах показаны на рисунке 2. На рисунке показано два разных направления (вертикальные и горизонтальные) склепы, которые происходят в подготовке замороженных срезов. Вертикальная вид смотрит вниз длинной оси склепе в то время как горизонтальная обеспечивает вид сбоку. КрикPTS, которые дикого типа для Г6ФД пятно синего цвета с какой-то белый, который из-за слизистой продукции из бокаловидных клеток. Посредством подсчета общего количества крипт на слайде (рис.1) и числа мутантных криптах, МФ для мутантных криптах может быть рассчитана. Нет мутированные крипты были обнаружены ни в одном из> 100000 диких крипт типа проверяемых в контроле (PBS не лечить) мышей. Мы устанавливаем MF для контрольных мышей быть <0.1x10 ^-4, что близко к тому, что сообщалось ранее для мышей C57BL / 6. ¹

Рисунок 1. Подготовка слайдов для окрашивания Г6ФД реагента. (А) Два 1,5 см х 0,15 см стальной шайбы (внутренний диаметр х высота) запечатаны вместе, используя силиконовую смазку. Парафильмом затем вырезать, чтобы соответствовать базы хорошо с центром вырезать и хорошо помещается на швейцарский сортового проката ткань толстой кишки наслайд. (Б) Два срезы ткани из соседних 7 мкм сокращений размещены на одном слайде и окрашивали в то же время. Масштабная линейка: 1,0 см. (C) количество склепов в разделе определяется, глядя на ткани в 10-кратным увеличением. Количество полей (показано как коробки) изменяется с каждой секции. Крипт в каждой области количество определяется путем визуального подсчета и добавлены, чтобы дать общее количество крипт на этом уровне. (D) уровень определяется как четыре последовательных секций 7 мкм ткани. Уровни> 50 мкм друг от друга, чтобы избежать дублирования с ранее начисленных склепов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Типичные примерымутировавших склепов, наблюдаемых в ОСО рассматриваться C57BL / 6 самцов мышей, которые не производят функциональную Г6ФД. склепы Г6ФД мутантные хорошо определены, но практически лишены синевы. Дикие склепов типа, которые составляют большинство склепов в области синий / фиолетовый указывает Г6ФД ферментативную активность. Масштаб:. 10 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

лечение	Заболеваемость мутантных криптах	мутантные крипты	Всего проанализировано крипты	MF (х 10 -4)
растворитель	0/6 мышей	0	> 10 5	<0.10
ОСО	10/12 мышей	43	96821	60; 4.44

Таблица 1. Частота мутаций в необработанном и azoxymethane лечение мышей C57BL / 6. ¹²
Кишечное мутации стволовой клетки в WT C57BL / 6 мышей через 90 дней после воздействия 10 мг / кг azoxymethane (ОСО) или контроля растворителя.

Discussion

Часто генотоксичных эффект соединения определяют по его способности изменять ДНК. Обычно это делается путем выделения ткани и измерения глобальный уровень аддуктов ДНК. Для острого среднего отита, это будет означать количественного ^O 6 -methylguanine аддукты в толстой кишке. Используя эту информацию, подход на повреждения в конкретных типах клеток, например, в ниши стволовых клеток, теряется. Кроме того, аддукт ДНК не такой же, как мутации, так как только небольшая часть аддуктов, в конечном счете преобразовано в фиксированных мутаций. ¹² Мы предлагаем в данном документе детали воспроизводимо количественно стволовых клеток мутации в толстой кишке, основываясь на начальной методу, описанному Гриффитс и др. ¹ и на основе Г6ФД окрашивания, разработанной VanNorden. ^4,8,9,13,14

Есть несколько важных шагов для этого метода фермент гистохимии для получения количественной результат. Одним из них является в срезов тканей. Значительно более ткани сектаионы должны быть сгенерированы и проанализированы чем можно было бы обычно делается с H & E гистологического анализа. Мы определили, что 7 мкм срезы получают лучшее окрашивание Г6ФД после оценки 5, 6, 7, 8 и 10 мкм толстых секций.

Во-вторых, окрашивания необходимое количество секций ценных тканей требует воспроизводимого реакционной смеси. Мы нашли применение поливинилового спирта (ПВС), используемого в оригинальном протоколе будет проблематично, потому что это достаточно вязким при процентном растворе (18% и больше) необходимо для облегчения реакции фермент гистохимии, предотвращая диффузию Г6ФД фермента от ткань. Лучше солюбилизации реагентов и контроля рН было достигнуто путем замены PVA с ОКТ среде, содержащей 10% PVA. Значение рН может быть точно определено с индикаторной бумаге и, если значение рН не близко к 7,4, раствор отбрасывали, не теряя драгоценного образца и время ткани. Это изменение привело к лучше и мРуды последовательное окрашивание в срезах тканей. В рН (7.2-7.4), необходимых для измерения активности G6PD, полный реакционную смесь имеет характерный четкий глубокий оранжевый цвет, который будет медленно изменять до фиолетового. Независимо от цвета, если окрашивание реакционный раствор мутный он должен быть отброшен, так как он не будет себе хорошую окраску. Мы обнаружили, что некоторые много OCT среде при условии, смеси за пределами требуемого диапазона рН, поэтому желательно, чтобы проверить множество добавлением Pb (7,4) среде OCT и определения рН. Мы также использовали MMPMS как предложено ранее, ^8,9, а не 5-метил сульфат methylphenazenium используемой в оригинальной статье ^1, чтобы устранить светочувствительность Г6ФД реакции окрашивание смеси.

Наконец, метод получения МЖ является новым по сравнению с другими методами, ранее занятых. ^1,2 Окрашивание артефакты могут привести к потенциальному идентификации ложно Г6ФД крипт мутантных. Для устранения тего проблема, мы проанализировали 4 смежных участков ткани 7 мкм, что позволяет для визуализации же мутировавший склепе в более чем одной ткани разделе (рис 4D). Эта проверка снижает шансы окрашивания артефакты, влияющие на анализ MF. Кроме того, наш метод использует фактическое значение общего объема склепов подсчитанных оценить общее количество склепов анализируемых при расчете MF.

Из-за уникальной структуры крипт, найденной в тонком и толстом кишечнике, можно определить местоположение стволовых клеток и клеточной линии для каждого крипты. Основным ограничением к подхода является то, ограничивается кишечника, потому что морфология других тканей не так хорошо, как определено в толстой кишке. Таким образом, это не возможно, чтобы определить стволовых клеток MF в большинстве других тканей, которые восприимчивы к развитию рака. Поскольку анализ является фенотипический анализ, основанный на потере ферментативной активности Г6ФД, фактическое МФ в популяции стволовых клеток будетвыше, чем мы сообщаем на G6PD из-за мутаций в извилин баз и точечных мутаций, которые не оказывают существенного влияния ферментативной активностью.

В то время как есть ограничения и проблемы, окрашивания для Г6ФД деятельности в ткани толстой кишки для количественного соматических мутаций стволовых клеток, значительные изменения были внесены в этой статье для повышения возможности использования этого метода. Мы обнаружили, что эти изменения повысили воспроизводимость генерации окрашивания Г6ФД реагента и количественной оценки MF. Кроме того, окрашивание Г6ФД активности фермента в качестве маркера для соматических мутаций стволовых клеток не требует знания в окрашивании иммуногистохимии, как было тестирование на экспрессию металлотионеином, ¹⁵ еще один потенциальный маркер соматических мутаций стволовых клеток.

В дальнейшем, мы будем анализировать толстой мутации стволовой клетки у мышей, обработанных природных соединений, таких как 2-амино-1-метил-6-фенилимидазо [4,5-b] пиридина (PhIP) И другие ароматические амины, найденные в мясо на гриле, которые связаны с раком толстой кишки человека.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room