Abstract
Kök hücre mutasyonları ölçmek için yeteneği, kimyasal potansiyel kansere yol mutasyonlar neden olabilir eğer ve ne ölçüde eleştirel bir hücre popülasyonu ölçmek için güçlü bir araçtır. X-bağlantılı glikoz-6-fosfat dehidrojenaz geni kök hücre mutasyonlan ölçmek için bir enzim testi kullanımı daha önce bildirilmiştir. 1 Bu yöntem, bir veren bir reaksiyon karışımı ile kesitli doku dondurulmuş bölümleri ve inkübasyon hazırlık gerektirir Hücreler fonksiyonel glikoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) enzim üreten eğer mavi renk. Eğer değilse, hücreler beyaz görünür. Bu polivinil alkol yerine optimal kesme sıcaklık Bileşik (Ekim) ortamı kullanılarak reaksiyon karışımı olarak var. Bu pH ölçme kolaylaştırır G6PD boyama bileşenlerin çözünürlüğünü arttırır ve G6PD enzimin yayılmasını engellemektedir. Bir mutasyonun kök hücre meydana geldiğini göstermek için, tüm kript G6PD enzimatik yoksun olmalıdırfaaliyet. Bir kök hücre barındıran Sadece eğer bir fenotipik G6PD mutasyon crypt döl tüm G6PD enzimatik aktivitesini yoksun olacak. Kök hücre mutasyonu olan crypts belirlemek için, arka arkaya dört bitişik dondurulmuş kesitler (seviye) 7 um kalınlığında kesildi. Bitişik kesim yapma Bu yaklaşım, aynı mutasyona uğramış crypt bitişik bölümlerde görüleceği beri crypt tam mutasyona edildi uymasını sağlar. 50'den fazla um ayrı olan doku örnekleri ile slaytlar fare başına> 10 4 crypts toplam değerlendirmek için hazırlanmıştır. Mutasyon sıklığı tedavi grubunda yabani tip (mavi) kript sayısına göre ÷ gözlemlenen mutasyona uğramış (beyaz) kript sayısıdır.
Introduction
Kolon kanseri DNA zarar verebilir çevresel ajanlar ve diyet bileşenlerin etkilenmemesi içerir ve (örneğin, APC), tümör baskılayıcı genler mutasyonları onkojenler somatik mutasyonlar aktive (örneğin, ß-katenin) ya da inaktive üretmek düşünülmektedir. Bu kritik mutasyonlar kolon kök hücrelerinde meydana geldiği kabul edilir. Çünkü kolon epitel eşsiz kript mimarisi, bu kolon kanserinin ilişkili kimyasallara maruz hayvanların sonra kolonda kök hücre mutasyonları ölçmek mümkündür. Mutasyonlar, bir kript içinde tüm hücrelerde mevcut olacak şekilde çeşitli X-bağlantılı enzimler, kök hücrelerin meydana mutasyon için gösterge olarak görev yapabilir.
Daha önce, bir prosedür farelerde kalın bağırsak tümörlerini neden kimyasallar da X-bağlı glukoz-6-fosfat dehidrojenaz (G6PD) geni mutasyonlarının analizi ile kolon somatik kök hücre mutasyonlan oluşturulan gösteren basıldı. 1-3Yöntem herhangi bir seçim baskısı olmadan kolon kök hücrelerin rastgele somatik mutasyon sıklığı quantifies. Prosedür muamele edilmiş olan ve kontrol farelerinin sabitlenmemiş dondurulmuş kolon bölümlerinin üretimi ve işlevsel G6PD aktiviteye hücrelerinden yoksun kript tanımlanmasını içerir. , Beyaz görünmesini bu mutasyona uğramış kriptler, mutasyon da mutasyona uğramış G6PD geni barındıran soyu doğurdu kök hücre meydana geldiğini göstermektedir. Enzimatik tahlilde, G6PD eksikli mutant kript nitro mavi tetrazolium (NBT) azalması için gerekli olan glikoz-6-fosfat, okside edilemez. G6PD enzimi işlevsel olduğu zaman, boyama karışımında NBT enzim ve mavi "boyama" hücre yerde biriken çözünmeyen formazana ve çökeltileri düşürülür. G6PD mutantlar hücreler mavi lekeli vahşi tip crypts aksine beyazımsı kalır. Bu yöntem, bir "boş" fenotipe sahip mutasyonları ölçer. Tr Çünküenzimler, örneğin G6PD gibi bölümler, sulu bir çözeltiye yerleştirilmiş ise, bir tespit edilmemiş dokuda bölümündeki hücrelerin üzerinden difüze olabilir, bu analiz edilecek doku kesitlerinde enzim stabilize etmek için gerekli olan. 4 enzim stabilizasyon Doku G6PD enzimatik reaksiyon için gerekli olan küçük reajan moleküllerinin difüzyon engel olmamalıdır.
Biz orijinal prosedüre önemli bir dizi değişiklik yaptık. Kritik enzimatik boyama ortam pH'ının kontrolüne ve deneyde kullanılan bileşenlerin çözünürlüğünü kolaylaştırır Optimal Kesme Sıcaklık Bileşim (Ekim), polivinil alkolden değiştirilmiştir. Her bir doku kesiti G6PD reaksiyon karışımının, aynı hacimde, böylece çelik pullar imal 0,5 mi kuyu - boyama 0,4 kullanılarak gerçekleştirilir. Bir prosedür kalmadan kolon dokusunun büyük bir örnekleme sağlayan görüntülü bölümünde kriptalarının sayısını tahmin için geliştirilmiştirEl> Her kolon için 10 5 crypts saymak. Bitişik 7 mikron doku kesitlerinde analizi, potansiyel boyama eserler azaltır birden fazla slayt üzerinde bir mutant crypt görselleştirme tanıyor. Bu değişiklikler prosedürü daha verimli ve tekrarlanabilir hale.
Bu yeniden protokolü kullanarak, kemirgenlerde iyi bilinen kolon kanserojen azoksimetan C57BL / 6 farelerinin maruz kaldıktan sonra kolon kök hücrelerinde mutasyon sıklığı sayısal var. 5-7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deney prosedürleri ve hayvanların etik tedavi Pittsburgh IACUC Üniversitesi (protokol # 1104674) tarafından onaylanmıştır.
G6PD Boyama karışımının hazırlanması 1.
NOT: Her birinin reaktiflerin nihai konsantrasyon olduğunu temin etmek; 5 mM glikoz-6-fosfat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl2, 0.35 mM 1-metoksi-5-methylphenazinium metil sülfat (MMPMS) ve 0,8 mM NBT. Başlangıç konsantrasyonu, 40 ml'lik bir nihai hacim için elde edilmiştir, her bir reaktif için 1,8,9. Çözümler, taze hazırlanmış ve her gün kullanıldı.
- 50 ml'lik bir tüp içinde Ekim ortamı 35 ml 200 mM pH 7.4 fosfat tampon maddesi (PB) 2 ml ilave edilir ve kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Solüsyon pH 7.4 pH kağıdı ile onaylayın. Aksi takdirde çözüm atın.
- 61 mg G6P 200 mM PB 0,94 ml içinde çözüldü ekle, 61 mg NADP 200 mM PB 0,94 ml içinde çözüldü ve 41 mg MgCl2 0.96 ml 100 mM PB içerisinde çözündürüldü. PH olduğunu Reconfirm ~ 7,4 with pH kağıdı. Değil ~ 7.4 Eğer çözüm atın.
- 200 mM PB (pH 7.4) 0.25 ml içinde çözüldü MMPMS 5 mg ekleyin. Şiddetle açık koyu kırmızı homojenatın üretmek için ortaya çıkan reaksiyon karışımı sallayın. Çözelti bulanık olduğu takdirde, karışım atılmalıdır. Reaksiyon karışımını içeren tüp ışığa maruz kalmasını en aza indirmek için folyo ile sarılır. Son bileşeni, NBT, hazırlanırken oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı saklayın.
- Bir O-ring kapaklı bir 2 ml tüp içinde NBT 164 mg 0,4 ml susuz dimetil formamid (DMF) ile 0,4 ml susuz etanol eklenerek ayrı ayrı 5 mM NBT solüsyonu hazırlayın. Gevşek kapağını kapatın (ağzı sıkıca kapatılmış değil) ve NBT çözelti içinde olduğu kadar bir yağ banyosu içinde güçlü bir raddeye çözüm getirecek. 8
- Çözündürülmüş NBT oda sıcaklığına soğumaya bırakıldı ve daha sonra tepkime karışımına Ekim çözüm tüm ekleme ve berrak bir çözelti elde etmek için kuvvetli bir şekilde çalkalanır izin verir. Koyu kırmızı veya amacı ü başlangıç portakal rengi-kırmızı çözelti renk değişimi dikkate alınmalıdırzamanla le rengi. Bu normal.
- Kullanımdan önce 1 saat süreyle 37 ° C sıcak bir odaya son G6PD boyama karışımı yerleştirin.
2. Hayvan Tedavisi ve Doku Toplama
- DNA hasar verici madde ile, örneğin 6 haftalık C57BL / 6 erkek farelere verilmesi tedavi, ip enjeksiyonu ile 200 ul PBS hacminde 10 mg / kg azoksimetan (AOM). Ip enjeksiyonu ile 200 ul PBS kontrol fareleri tedavi edin.
- 90 gün sonra, CO IACUC protokolü ile onaylanan servikal dislokasyon 2 boğulmaya fareler euthanize.
- Cerrahi sadece sternum tabanına anüs yukarıdan karın boşluğuna açılır. Vücut boşluğundan dışarı ince bağırsağı taşımak ama tüketim yok. Sadece rektum çekum altında alt bağırsak tüketim. 10
- Dikkatli bir şekilde mikro-disseksiyon makas kullanılarak kolon bir tarafı boyunca dilim ve temiz ve steril PBS ile yıkanarak açılan kolondan dışkı çıkarmak. Tüketim İsviçre ruloBir doku kalıbı içinde luminal dışa bakan tarafı ve yerine d kolon. 10
- Tamamen bir Dewar sıvı N 2 ihtiva eden Ekim, orta ve yer kalıpta kolon batırmayın. Plastik taban sadece Ekim ortamı donup kadar sıvı N 2 ile temas halinde olacak şekilde kalıp tutun.
- Dondurulmuş bölümleri kesme kadar -80 ° C'de dondurulmuş doku bloğu saklayın. G6PD enzimin inaktivasyonu ile sonuçlanacaktır bir fiksatif, kullanmayın.
Dondurulmuş Bölüm 3. Hazırlık
- -25 ° C de, bir kriyostat kullanarak 7 um kadar bir kalınlıkta donmuş doku bölümleri kesilir. 4 ardışık 7 mikron bölümleri kesmek için ve aynı slayt (Şekil 1) ikisini yerleştirin. Kolon (Şekil 1) bir düzeyde temsil etmek 2 slaytları ya da dört ardışık 7 mikron bölümleri hazırlayın.
- Pr son bölümünden> 50 mikron minimum mesafe ile bir sonraki seviyeye için tekrarlayınevious seviyesi. Bu mesafe, her seviye için değerlendirilen kriptler birbirlerine yinelenen vermedi sağlanmalıdır.
- Sıkça kesme sırasında biriken Ekim artıklarını çıkarın% 100 etanol ile kriyostat bıçağını silin. Kesit sürdürülür önce kuru bıçak birikmiş statik elektriği boşaltmak için, antistatik kurutucu tabaka ile silinir. C o -80 donmuş bölümleri ile mağaza slaytlar
Dondurulmuş Bölüm Doku 4. Boyama
- Yüksek nem ile 37 ° C sıcak odada enzim histokimyası reaksiyonu gerçekleştirin.
NOT: Bir kuluçka fırında veya sıcak bir slayt enzimatik reaksiyonu çalışılıyor yoksul ve tutarsız G6PD boyama açtı. - Silikon gres (Şekil 1) kullanılarak birbirine bağlanmış iki 1.5 cm x 0.15 cm çelik pullar (iç çap x yükseklik) kullanarak doku boyama kuyu oluşturun. Merkezi ile kuyu tabanı sığdırmak için parafilm kesin kesip ve iyi yerslayt doku bölümünde üzerinde d.
NOT: yıkayıcı altındaki parafilm slayt ve doku bölümünde viskoz G6PD boyama karışımını tutar yıkama arasında bir mühür oluşturur. Çalışmada her doku bölümü G6PD reaksiyon boyama karışımının aynı hacimde alması 0.5 ml hacminde - Bu yapı, bir 0.4 ile iyi verir. - 10 dakika boyunca sıcak bir odada 37 o C'de dondurulmuş doku slaytlar inkübe edin. 37 ° C'de, 45-50 dakika boyunca, her doku kesiti oyuk (slayt başına 2 bölüm) için G6PD boyama reaksiyon karışımı ilave edildi. Sıcak odadan slaytları çıkarın ve dikkatle slaytlar kapalı paslanmaz çelik kuyuları kaldırın.
- Uzun kenarında Set slaytlar reaksiyon ortamı boşaltmak için izin vermek. 30-60 dakika boyunca 100 mM PB (pH 7.4) içinde Slaytları, doku lekeleme bozmadan dokudan G6PD boyama tepkime karışımını ayırmak üzere. PB tuzları çıkarmak için 5-10 dakika için damıtılmış su içinde slaytlar batırın
- Add dokuyu Sealdoku üzerine bir damlalık gelen floro-jel ing ve kurutun için ~ 30 dakika bekliyorum. Mutasyona uğramış crypts belirlenmesini bulandırabilir kabarcıkları kaçının.
Not: kabarcıklar oluşturan, prosedür damıtılmış su içinde ıslatılarak floro-jel çıkarıldıktan sonra tekrar edilebilir. Onlar tuzak hava kabarcıkları eğilimi gibi kapak fişleri kullanmayın.
G6PD Mutant Crypts ve Mutasyon Frekansı 5. belirlenmesi
- Işık mikroskobu altında G6PD mutant crypts için slaytlar analiz edin.
NOT: Tam mutant crypt tanımlamak için kullanılan kriterleri: (i) tüm crypt mavi renk yoksun; (ii) crypt dış yapısı (iii) mutant crypt (iv) iki gözlemci bir mutant aynı crypt tanımlamak zorunda bitişik 7 mikron kesitlerinde gözlenen ve oldu, bozulmamış oldu. Bitişik 7 mikron bölümlerde gözlenen mutantlar tek mutant olarak sayılır. - Görüntü her G6PD mutant 40x büyütme crypt ve 5.0 megapiksel kamera ile kullanarak görüntüleri kataloggörüntüleme yazılımı.
- 10x büyütme (Şekil 1C) yüzölçümü en küçük ve görüntünün o ile seviyeden, her fare için bir temsilci bölüm seçerek fare muayene kriptalarının toplam sayısını ölçmek.
NOT: A level nedeniyle yakınlığı genellikle birden fazla bölümünde crypts mutasyona gösterirler arka arkaya dört 7 mikron bölümleri (Şekil 1D), temsil eder. Seviyeleri kolonun farklı alanlardan crypts görselleştirmek için um 50> ayrılır. - Her resim dosyasını açın ve görsel (Şekil 1C kutuları olarak gösterilen) dosyalarını analiz ederek bir seviyede crypts sayısını. Görüntüler dosyalar tek bir dosya olarak düşük 300> 20 olarak crypts gözlenen kriptalarının sayısı değişecektir.
- Her bir kolon için G6PD mutant crypts için taranmıştır seviye sayısı, her bir fare için seçilen seviyeye (Şekil 1C) gelen kript sayısı çarpın. Örneğin, toplam sayımMutant kriptlerin için tarama 8 seviyeleri ile çarpılarak seçilen seviye başına 1250 kriptler 10.000 crypts toplam sayısını eşittir. İstatistiksel analiz için her kolon için 10.000 crypts az değerlendirin.
- Her tedavi için MF hesaplamak için filtrelenmiş kript toplam sayısı tüm hayvanların gözlenen mutantların sayısı birleştirin. Tedavi edilmeyen farelerdeki arka kök hücre MF seviyesi <0.1x10 -4 önce C57BL / 6 farelerinde bildirilen yakındır (Tablo 1). 11'dir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hayvanlarda kolon kök hücre mutasyonlarını ölçmek için yeteneği kanser indüksiyon mutasyonlar ilişkilendirmek için özel bir yol sağlar. Normal olarak, bu karsinogenezde önemli bir adım onkojenlerde mutasyonlar aktive edilmesi ve / veya tümör süpresör genler mutasyon inaktive içerir varsayılmıştır. Biz 200 ul PBS ya da PBS 200 ul 10 mg / kg AOM ile C57BL / 6 fareler enjekte edildi. AOM bilinen kolon kanserojendir. Kolonlar kök hücre mutasyonları için analiz edildi 90 gün sonra 5-7. Bu kez kök hücreler tamamen crypt doldurmak için izin gereklidir ve G6PD üretmek değil bütün bir crypt bir kök hücre mutant olarak tanımlanan bir crypt sadece. Tam mutant kript örnekleri, Şekil 2 de gösterilmiştir. Şekil Dondurulmuş kesitlerin hazırlanması meydana kript (dikey ve yatay), iki farklı yönlerde gösterir. Yatay bir yan görünüm sağlar iken dikey görünüm crypt uzun ekseni aşağı bakıyor. Ağlamakgoblet hücrelerinden mukus üretiminin nedeniyle bazı beyaz ile mavi G6PD leke vahşi tip puanlar. Bir sürgü (Şekil 1) ve mutasyona uğramış kriptlerin sayısı kript üzerindeki toplam sayının sayılması ile, mutasyona uğramış kript MF hesaplanabilir. Hayır mutasyona uğramış kriptler kontrol teftiş> 100000 vahşi tip kriptalarının herhangi gözlendi fareler (PBS tedavi). Biz <0.1x10 -4, C57BL / 6 fareleri için daha önce rapor edilene yakın olan olması kontrol fareleri için MF ayarlayın. 1
G6PD boyama reaktif slaytlar 1. Hazırlık Şekil. (A) İki 1.5 cm x 0.15 cm çelik pullar (iç çap x yükseklik) silikon gres kullanılarak birbirine kapatılmıştır. Parafilm sonra merkezi ile kuyu tabanı uyacak şekilde kesip kesip İsviçre ilgili kolon doku bölümleri haddelenmiş üzerine de yerleştirilirslayt. (B) bitişik olarak 7 um kesintilerinden iki doku bölümleri aynı anda, aynı lameli üzerine konularak boyandı. Ölçek çubuğu: 1.0 cm. (C) kısmında kript sayısı, 10x büyütmede doku bakılarak belirlenir. (Kutular olarak gösterilir) alanların sayısı her bölümü ile değişir. Her alana kript sayısı görsel sayımı ile belirlenmiştir ve bu düzeyde kript toplam sayısını vermek üzere ilave edildi. (D) bir seviyesi dört ardışık 7 um doku bölümleri olarak tanımlanır. Seviyeleri önceden değerlendirilen crypts ile çakışmasını önlemek için ayrı> 50 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2 temsili örnekleriAOM gözlenen mutasyona uğramış kript. işlevsel G6PD üretemezler C57Bl / 6 erkek fareler tedavi G6PD mutant kriptler iyi tanımlanmış, ancak mavi leke neredeyse yoksun vardır. Alanındaki kript çoğu oluşturan vahşi tip kriptler mavi / mor gösteren G6PD enzim aktivitesi vardır. Ölçek:. 10 mikron bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| tedavi | Mutant kriptlerin insidansı | mutant kriptler bir | Toplam kriptler analiz | MF (x 10 -4) |
| çözücü | 0/6 farenin | 0 | > 10 5 | <0.10 |
| AOM | 10/12 fareler | 43 | 96.821 | 60; 4.44 |
C57BL / 6 fareleri tedavi ve tedavi edilmemiş azoksimetan Tablo 1. Mutasyon sıklığı. 12
90 gün 10 mg / kg azoksimetan (AOM) ve solvent, kontrol maruz kaldıktan sonra WT C57BL / 6 farelerinde kolon kök hücre mutasyonları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genellikle bir bileşimin genotoksik etki DNA değiştirme kabiliyeti tarafından belirlenir. Bu, normal olarak doku izole DNA adduct küresel seviyesinin ölçülmesiyle yapılır. AOM için bu kolonda Ø 6 -methylguanine aduktlar miktarının içerecektir. Böyle kök hücre niş gibi özel hücre tipleri, içinde hasar bu yaklaşım bilgileri kullanarak, kaybolur. Adüktlerinin sadece küçük bir alt grubu sonunda sabit mutasyonlara dönüştürülür Ek olarak, bir DNA adükt mutasyon ile aynı değildir. Bu 12 tekrarlanabilir Griffiths tanımlanan ilk yönteme göre kolon kök hücre mutasyonlan ölçmek için bu tarifnamede ayrıntıları ve ark., 1 ve VanNorden tarafından geliştirilen G6PD boyama göre. 4,8,9,13,14
Ölçülebilir bir sonuç üretmek için bu enzim histokimyası yöntemi için birkaç kritik adımlar vardır. Bir dokuların kesit yer almaktadır. Önemli derecede daha fazla doku mezhepiyonlar üretilir ve genellikle H & E histolojik analiz ile yapılabilir ne daha analiz edilmelidir. Biz 7 um'lik kesitler 5, 6, 7, 8 ve 10 um kalınlığında kesitler değerlendirilmesi sonucunda, iyi G6PD boyama elde olduğu tespit edilmiştir.
İkinci olarak, çok değerli doku bölümlerinin gerekli sayıda boyama tekrarlanabilir bir reaksiyon karışımı gerekli. Biz gelen G6PD enzimin yayılmasını engellerken, enzim histokimyası reaksiyonunun kolaylaştırılması için çözelti yüzdeleri (% 18 ve daha büyük) gerekli oldukça viskoz olması nedeniyle, orijinal protokolde kullanılan polivinil alkol (PVA) kullanımı sorun olduğu bulundu dokusu. Reaktifler ve pH kontrolü daha iyi çözündürme,% 10 PVA içeren Ekim ortamı ile PVA değiştirilmesiyle gerçekleştirilmiştir. PH doğru pH kağıdı ile tespit edilebilir ve pH 7.4'e yakın değilse, çözüm değerli doku örneği ve vakit kaybetmeden atılır. Bu değişim daha iyi ve m yol açtıdoku kesitlerinde tutarlı boyama cevher. G6PD aktivitesini ölçmek için gerekli olan pH (7.2-7.4) olarak, tam reaksiyon karışımı yavaş yavaş mor değişecektir karakteristik açık koyu turuncu-kırmızı renk vardır. Ne olursa olsun renk, reaksiyon boyama çözüm iyi boyama göze olmaz çünkü atılmalıdır bulanık ise. Biz Ekim ortamına PB (7.4) eklenmesi ve pH belirlenerek çok test etmek için tavsiye edilir, böylece Ekim ortamının bir çok gerekli pH aralığı dışında karışımları Resim bulundu. Daha önce önerilen gibi biz de MMPMS kullanılan oldukça G6PD boyama reaksiyon karışımının ışık duyarlılığını ortadan kaldırmak için, orijinal kağıt 1 kullanılan 5-metil sülfat methylphenazenium daha 8,9.
Son olarak, MF diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, yeni bir türetmek için yöntem daha önce kullanılan. 1,2 Boyama eserler yanlış G6PD mutant kript potansiyel tanımlanmasına yol açabilir. T gidermek içinOnun sorunu, biz birden fazla doku bölümünde (Şekil 4D) aynı mutasyona uğramış crypt görselleştirme sağlar 4 bitişik 7 mikron doku bölümleri inceledik. Bu doğrulama MF analizi etkileyen eserler boyama şansını azaltır. Ayrıca, bizim yöntem MF hesaplanırken analiz crypts toplam sayısını tahmin etmek sayılan toplam kriptalarının gerçek değerini kullanır.
Çünkü büyük ve küçük bağırsakta bulunan eşsiz kript yapısı, her bir kript kök hücre konumu ve hücre soyunu belirlemek mümkündür. Yaklaşımın önemli bir sınırlama, diğer dokulara morfolojisi da kolon içinde olduğu gibi tanımlanmış değildir çünkü bağırsak ile sınırlı olmasıdır. Bu nedenle, kansere yatkın En diğer dokularda kök hücre MF belirlemek mümkün değildir. Deney, bir fenotipik tahlil, G6PD enzimatik aktivitesinin kaybına dayalı olduğundan, kök hücre gerçek MF olacakBiz nedeniyle önemli ölçüde enzimatik aktivitesini etkilemeyen salınım bazlar ve nokta mutasyonları mutasyonlara G6PD rapor daha yüksek.
Sınırlamalar ve sorunlar somatik kök hücre mutasyonlarını ölçmek için kolon dokusunda G6PD aktivitesi için lekelenmeye olmakla birlikte, önemli değişiklikler bu yöntemi kullanan uygulanabilirliğini artırmak için bu yazıda tanıtıldı. Biz bu değişikliklerin G6PD boyama reaktif üreten ve MF miktarının tekrarlanabilirliği gelişmiş olduğunu gördük. Ayrıca, somatik kök hücre mutasyonlar için bir marker olarak G6PD enzim aktivitesi için boyama metallotionein, 15 somatik kök hücre mutasyonlarının bir diğer potansiyel markör ekspresyonu için test gibi immünohistokimya boyama bir uzmanlık gerektirmez.
Gelecekte, çevre bileşikleri ile tedavi edilen farelerdeki kolonsal kök hücre mutasyonlan analiz örneğin 2-amino-1-metil-6-fenilimidazo [4,5-b] piridin (PhIP olarak) Ve insan kolon kanseri ile ilişkili ızgara etler bulunan diğer aromatik aminler,.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar herhangi bir onayları vardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| nitroblue tetrazolium | |||
| NADP | |||
| glucose-6-phosphate | |||
| 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate | |||
| dimethyl formamide | |||
| phosphate buffer (pH 7.4 | |||
| Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) | |||
| Equipment | |||
| light microscope equipped with 5 megapixel camera | |||
| cryostat | |||
| warm room |
References
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. The clonal origin of experimental large bowel tumours. Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).
- Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity. Mutat. Res. 379 (1), (1997).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer’s guide. Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).
- Giardina Rosenberg, D. W., C,, Tanaka, T. Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
- Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate. Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).
- Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane. Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).
- Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells. J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).
- Hisada, R., Yagi, T. 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate. Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). J Vis Exp. (35), (2010).
- Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice. J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).
- Whetstone, R. D., Gold, B. T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon. Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).
- Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).
- Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).
- Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation. J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).
