Abstract
Det sosiale rommet analysen beskrevet her kan brukes til å kvantifisere sosiale interaksjoner av Drosophila melanogaste r - eller andre små insekter - på en enkel måte. Som vi tidligere har demonstrert en, i en to-dimensjonal kammer, vi først tvinger fluene til å danne en tett gruppe, deretter slik at de kan ta sin foretrukne avstand fra hverandre. Etter fluene har avgjort at vi måler avstanden til nærmeste nabo (eller sosiale rom), behandling av en statisk bilde med gratis online programvare (ImageJ). Analysen av avstanden til nærmeste nabo tillater forskerne å fastslå effekten av genetiske og miljømessige faktorer på sosial interaksjon, mens kontrollere for mulige konfunderende faktorer. Ulike faktorer som klatring evne, tid på døgnet, kjønn og antall fluer, kan endre sosial avstand av fluer. Vi foreslår derfor en rekke eksperimentelle kontroller for å redusere disse konfunderende effekter. Denne analysen kanbrukes i minst to formål. Først kan forskerne finne ut hvordan deres favoritt miljøskifte (som isolasjon, temperatur, stress eller giftstoffer) vil påvirke sosial avstand 1,2. For det andre kan forskerne dissekere de genetiske og nevrale fundamentet for denne grunnleggende form for sosial atferd 1,3. Spesielt vi brukte det som et diagnostisk verktøy for å studere rollen ortologe gener antas å være involvert i sosial atferd hos andre organismer, som for eksempel kandidatgener for autisme hos mennesker 4.
Introduction
Sosial samhandling er avgjørende for riktig utvikling og helse av individer i en gruppe som helhet, og kan sees på tvers av en rekke arter, fra mennesker (Homo sapiens) til enklere organismer som fruktfluer (Drosophila melanogaster) 5,6. Et individ bananflue eller menneske har felles midler til å behandle sanseinformasjon i løpet av disse interaksjoner, enten det er: auditiv, visuell, olfactory, taktile, eller gustation. Vi og andre hypoteser om at det er et potensielt delt neurocircuitry underliggende atferdsmessige reaksjoner på sosiale interaksjoner og at de nevronale celler og gener som er involvert kan være evolusjonært konservert 7. Når første samspillet har oppstått, sosiale rom mellom samhandlende individer vil enten øke (sosial unngåelse 8) eller reduser (gruppedannelse / aggregering 5). Mer kompliserte interaksjoner, som aggresjon eller frieri, kan da finne sted.
Drosophila melanogaster, som brukes i følgende studier 1-4,9. Sosiale rom refererer til et mål på avstanden mellom et fly og nærmeste nabo 10. Sosiale rom er konsistent for en gitt populasjon av D. melanogaster når eksperimentelle forhold er bevart (i snitt tilnærmelsesvis innenfor 1-2 kroppslengder), og varierer med hensyn til sosial opplevelse av fluene, øke hvis den enkelte har blitt holdt i isolasjon 1. Riktig visjon er nødvendig for å opprettholde normal sosial avstand, men ikke klassisk odoranter eller CVA oppfatning en. Mål på sosiale rom kan således værebrukes som et diagnostisk verktøy for å analysere sosiale interaksjoner og kvantifisere sosial atferd i D. melanogaster en. Vi beskriver her i detaljer hvordan du utfører denne kvantifisering, og i hvilken grad vanlige eksperimentelle variabler påvirker denne atferden.
Vi viser at orienteringen av kammeret hvori analysen er utført, så vel som antall fluer - til en viss grad - påvirker do sosial plass. Det ble tidligere vist at kammeret geometrien påvirker spontan utforskende bevegelse av fluer 11,12, og dette fenomenet kan til slutt påvirke hvor de velger å bosette seg. Imidlertid, så lenge som fluetetthet (fly / cm 2) og kammeret orientering holdes den samme, den sosiale plass av fluene også forblir konstant. Robusthet av denne analysen er illustrert ved det faktum at uavhengige laboratorier ved hjelp av ulike kammer størrelser, form og orientering kan replikere vist resultatet av mutanter av white genet (påvirker pigmentering øyet), som er en økning sosiale rom (vertikal trekant eller horisontal sirkel i en horisontal kvadrat med luftstrøm i tre).
Våre resultater indikerer også at å opprettholde det tidspunkt det sosiale rommet eksperimentet er utført er avgjørende for konsistensen av resultatene, som vi viser at menn, men ikke kvinner, står lengre fra hverandre på kveldene. Men forskjellene sett mellom dag- og kveldstimer er ikke på grunn av aktivitetsforskjeller fluer, og vi diskuterer argumenter som viser at aktivitetsnivået ikke er korrelert med sosiale rom.
Endelig er det genetiske grunnlaget for fastsettelse av sosiale rom, som indikert av den hvite mutant allerede beskrevet 1,3, og forskjellene mellom ulike innavlede og villfanget stammer av fluer som vi presenterer her.
Derfor gjør denne analysen et utmerket verktøy feller studere effekten av genetiske og miljømessige faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utstyr og reagenser Laget In-house (Se liste over materialer for andre)
- Forbered en Drosophila kald anestesi apparat som tidligere beskrevet åtte.
- Forbered en flue aspirator som tidligere beskrevet 13.
- Forbered sosiale plass kamre og holdere.
- Bestille eller lage glassruter og akryl avstandsstykker for å skape det sosiale rommet kamre. Hver sosiale rom kammer består av to kvadratiske glassruter (17,6 cm x 17,6 cm, med en tykkelse på 0,3 cm), to rettvinklet trekant akryl avstandsstykker (med en høyde på 16,5 cm, en base av 8,9 cm, med en tykkelse på 0,3 cm ), og to rektangulære mellomrom (9 cm med 1,5 cm med en tykkelse på 0,3 cm) (Figur 1a).
- Monter glass eller akryl sosial plass kammeret slik at det er identisk med kammeret i figur 1B. For å gjøre dette, start ved å plassere en trekantet spacer flat på toppen av en firkantet glassrute slik at den rette vinkelenav den trekantede avstandsholderen er innrettet med ett av hjørnene i kvadratet ruten. Deretter plasserer den andre trekantede spacer flat på toppen av plassen ruten, speiling den første trekant spacer.
MERK: Pass på å bruke hansker for ikke å forurense bitene med oljer og dufter fra hendene. - Plasser to små rektangulære spacere flate på toppen av plassen ruten langs siden av panelet som ikke er dekket. Akryl avstandsstykker på toppen av plassen flyet skal nå danne en trekantet arena.
- Plassere en andre firkantet glassrute på toppen av de akryliske avstandsholderne, slik at den er på linje over den opprinnelige glassrute nedenfor.
- Bruk fire bindemiddel klipp for å feste rutene og avstandsstykker sammen til det sosiale rommet kammeret. Plasser ett klipp nær hjørnet, over den lange siden av hver av de trekantede avstandsstykker, sikre dem inne i glassene. På de samme sidene, plasserer et klipp i den tilstøtende hjørnet, over hver av de rektangulære avstandsstykker, sikre dem iside glassrutene.
- Montere en støtte stativ og en kolbe klemme slik at klemmen vil opprettholde det sosiale rommet kammeret i oppreist stilling, som det sosiale rommet kammeret hviler på kanten på toppen av arbeidsflaten.
- For hver rapport i forsøket, montere en sosial plass kammer og støtte stå.
- Forbered en klatre analysen beredskapsapparatet for å kontrollere klatring evne fluene testet.
- Bruke et motstrømsapparat, som tidligere beskrevet 14,15.
- Sikre homogene lysforholdene ved å utføre eksperimentet på en arbeidsflate dekket med en hvit benk cover og foran en hvit bakgrunn.
2. Forbereder Fluenes før Experiment
- Opprettholde fluer i flasker som inneholder standard Drosophila fly mat. Holde dem i en inkubasjon kammer ved 25 ° C på en 12 timers lys / mørke syklus.
- En til to dager før det eXperiment, samle og sex flyr under kaldt anestesi, som tidligere beskrevet åtte.
- Kjøle den kalde anestesiapparat ved -4 ° C. Sted flyr i 50 ml plastrør. Fullt senk plastrør som inneholder fluer i isen i en isolert isen bøtte, vent i minst 5 min for fluer å bli immobile.
- Plasser fluene på polyethylenlag av kulden anestesi apparat. Ved RT, bruk en stereomikroskop for å skille menn fra kvinner. Oppretthold fluer, i grupper, i hetteglass som inneholder standard Drosophila fly mat, som ikke overstiger 40 fluer per hetteglass.
- To timer før begynnelsen av forsøket, sikre at temperaturen i rommet der forsøket blir utført er mellom 24-25 ° C, og fuktigheten er omtrent 50%.
- Overfør fluene inn i nye ampuller inneholdende mat, og plassere dem i 2 timer på arbeidsflaten der forsøket vil bli utført.
MERK: For disse experiments, flue stammene som ble brukt var bananflue stammer: Canton-spesielle behov eller Canton-S (CS), w 1118 Cs 10 (eller W - w 1118 outcrossed 10 ganger til Canton-S), Oregon og Samarkand fluer var alle fra vårt laboratorium bestandene 16; Elwood fluer ble samlet inn høsten 2011 i Elwood området i Huntington, på Long Island, New York, USA 8. Hverandre når noe annet er spesifisert, ble resultatene presentert oppnådd med Canton-S flyr (i nyanser av rødt).
3. Utføre Experiment
- Utfør eksperimentet 24:00-15:00 (zeitgeber tid - tiden i timer etter utbruddet av lys - av ZT 4 til 7).
- Forbered det sosiale rommet kammer for overføring av fluer.
- Plasser en sosial plass kammer flat på en arbeidsflate, med den siden som inneholder rektangulære spacere nærmest kroppen din.
- Fjern one klipp nærmeste kroppen og gli én rektangulær spacer utad, og skaper en avstand på ca. 1 cm mellom de rektangulære avstandsstykker.
- Ved hjelp av tape og en markør, merke det sosiale rommet kammer i en øvre hjørne med sex, belastning, og gjenta nummer. Pass på å sikre båndet dekker ikke en del av den indre trekantet arena.
- Overfør fluene i det sosiale rommet kammeret.
- Transfer flyr fra deres hetteglass med mat inn i en ny, tom ampulle. Aspirer flyr fra det tomme hetteglasset og overføre dem til det sosiale rommet kammeret.
- Inhalerer å trekke fluene inn i spissen av aspirator. Plasser tuppen inn i en cm gap mellom de rektangulære avstandsstykker av det sosiale rommet kammeret og puster i en jevn hastighet for å tvinge fluene inn i den indre trekantet arena.
- Umiddelbart skyv den rektangulære spacer tilbake på plass, lukker bunnen av indre trekantet arena, og plasser bindemiddel klippet igjen.
- På en pounding pad, som ligger på annen benk enn der det eksperimentelle arbeidet foregår, holder det sosiale rommet kammeret oppreist slik at de rektangulære spacere er på undersiden. Pound-tre ganger for å sikre at alle fluer har falt til bunnen av arenaen.
MERK: På grunn av akryl spacer stikker ut av den minste kammeret størrelse (figur 1D), bang albuene på arbeidsflaten og samtidig opprettholde et sikkert grep på apparatet for å sikre fluene har falt til bunns. - Start en tidtaker.
- Plasser det sosiale rommet kammer på arbeidsflaten og bruke stativet og kolbe klemme for å holde det oppreist. Plasser en linjal eller et klistremerke med kjent lengde flatt mot det sosiale rommet kammeret, men ikke dekker noen del av den indre trekantet arena.
- For horisontalt plassert eksperimenter, ikke plasser det sosiale rommet kammer i stativet; i stedet lå det sosiale rommet kammeret flatt på arbeidsflaten.
- Når fluene har lagt seg, vanligvis etter rundt 30 minutter, ta et bilde av det sosiale rommet kammeret. Sørg for at rammen inneholder hele indre trekantet arena, herskeren, og etiketten.
- Gjenta eksperimentet for hver genotype og tilstand (ideelt tre interne gjentak og 3 uavhengige gjentar).
4. Analysere Social Space data
- Importere følgende makroer i ImageJ 17
- ImageJ er tilgjengelig her: http://rsbweb.nih.gov/ij/.
- Du kan lage en "måle avstander 'kommando i Plugins menyen ved å lagre makroene nedenfor i en fil som heter" Measure_Distances.txt "i ImageJ / plugins mappen i makromappen, og ved hjelp av Hjelp> Oppdater Menyer kommando.
- Kopi i en .txt-fil makroene som er gitt i utfyllende data og ble opprinnelig publisert i tre.
- Last opp bildene til en datamaskin, og åpne en picture bruker ImageJ.
- Opprett en skala ved å tegne en linje fra 0 cm til 1 cm merker på linjalen i bildet, og under kategorien Analyser velger Set Scale funksjonen til å angi en skala fra 1 cm for at avstanden (samme tilnærming for klistremerket av kjent lengde). Velg Global alternativet før påføring av skalaen til bildet.
- Beskjære bildet med Crop-funksjonen under Bilde fanen slik at det omfatter alle de fluene, mens du fjerner så mye av resten av bildet som mulig.
- Gjøre bildet svart og hvitt ved å velge 8-bit fra Type alternativ under kategorien Bilde.
- Fjern all bakgrunnsstøy fra bildet ved å gå til Threshold funksjonen under Juster alternativet i kategorien Bilde. Dra glidebryterne for å forbedre eller fjerne kontrasten slik at kroppen av hver flue kan sees tydelig uten andre markeringer i bildet. Hvis det er tegninger som ikke flyr, fange dem med den rektangulære verktøyet og slette dem.
- Settmålinger ved hjelp av Set Målinger verktøyet under kategorien Analyser. Velg Area, Center of Mass, Tyngdepunkt og visningsetikett. Deretter velger Analyze Partikler har under kategorien Analyser for å lage en nummerert liste over alle de svarte flekker som representerer fluer.
- Når du bruker Analyser partikler; sett størrelse 0,01-0,1 (Ikke velg pixel enhet); circularity 0,00 til 1,00; vis skisserer; vise resultater, og legge til manager.
- Sørg for at hver svart flekk (hver partikkel) er en nøyaktig gjengivelse av fluer som er i det opprinnelige bildet, ved å sammenligne den nummererte listen til det opprinnelige bildet.
MERK: Hvis noen fluer som er svært tett sammen blir regnet som en partikkel, manuelt trekke en hvit linje for å skille de to fluer på binære bildet.
- Mens listen er valgt, bruker nærmeste nabo - List Avstander makro under andre makroer alternativet i kategorien Plugins for å opprette en ny liste som inneholder avstander, i cm, fra each fly til sin nærmeste nabo.
- Kopier den nærmeste nabo avstander fra ImageJ og lime inn i en kolonne med et regnearkprogram.
- Kompilere alle data fra hver rapport på det samme regnearket og organisere etter genotype og tilstand.
- Utføre dataanalyse ved hjelp av statistisk programvare. I dette forsøket ble Graph Pad Prism (versjon 6 for MacOSX, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com) som brukes til å utføre enveis ANOVA, og Kruskal-Wallis tester, Tukey og Dunnet er post-hoc tester.
- Fordelingen av avstandene følger en ikke-parametrisk fordeling 1, og data blir representert som boksen og Tukey værhår (for å eliminere utliggere).
5. Klatring analysen (Kontroll Behavior)
- Bruk en klatring analysen som en kontroll for å teste fluer klatring evne 14,15,18.
- Bruk motstrøms-apparat slik at tre studier cen kjøres parallelt.
- Overføring 50 til 100 naive fluer (fluer som ikke er testet før) i tre forskjellige test ampuller, og snapper dem inn i en st, 3. og siste sporene nederst motstrøms-apparat, med ferske tomme ampuller i motsatt steder.
- Plassere friske, tomme ampuller i de tomme tidsluker på bunnen av apparatet.
- Tapp ned apparatet tre ganger, slik at alle fluer er ved bunnen av hvert rør, for å initiere forsøket.
- Starte tidtakeren for 15 sek (tid tilstrekkelig for ~ 100% av 3-7 dager gamle Canton-S for å nå toppen hetteglasset - se Figur 3F).
- Skyv den øvre del av motstrømsapparat, for å forskyve topp ampullene ved en spalte.
- Samle fluer ved å trykke på apparatet ned, for å bringe alle fluer i bunn ampuller.
- 1 og 2. rør (eller 3. og 4., 5. th) tilsvarer henholdsvis fluene som ikke nådde til toppen og fluene som nådde toppen av hetteglasset.
- Beregn Performance Index (PI).
- Telle antall fluer i hvert hetteglass.
- PI er prosentandelen av fluer i stand til å klatre opp på det øvre rør.
- Midlene for PI normalfordelte 1, og data blir representert som kolonne grafer av middelverdien pluss eller minus standardfeil til gjennomsnittet (SEM).
MERK: Alternativt kan PI beregnes som prosentandelen av fluer i stand til å nå den øvre del av den nedre hetteglass (for voksne fluer, er 5 sek den tid som er tilstrekkelig til å kvantifisere en forskjell i klatre evne mellom infiserte og ikke-infiserte 12 dager gamle Canton-S kvantifiseres fra et stillbilde: se resultater). Andre har brukt ulike mål på ytelse i skremme-indusert negative geotaxis, som også er hensiktsmessig å kvantifisere klatring evne 19-22.
- Transfer flyr fra deres hetteglass med mat inn i en ny, tom ampulle. Aspirer flyr fra det tomme hetteglasset og overføre dem til det sosiale rommet kammeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det sosiale rommet kammeret kan brukes som et verktøy for å kvantifisere den sosiale atferden til bananflue. Akryl avstandsstykker og glassrutene er avkuttet sammen for å danne et indre trekantet arena som gir et to-dimensjonalt område der fluer kan danne stabile grupper uten tilstedeværelse av mange potensielt samvirkende signaler. Når fluene blir overført til den vertikale arena, blir de skremt av å bli tappet ned, og de reagerer ved en flukt atferd: negative geotaxis. De klatre til toppunktet på stående trekant, tvunget inn i en sammensveiset gjeng, og deretter er gitt tid til å flytte videre danne hverandre, og å utforske arenaen. Etter 20 til 40 min, de slutter å bevege seg, og en stabil gruppe er dannet. Avstanden mellom hver flue og nærmeste nabo kan måles fra et bilde, for å gi en kvantifisering av deres foretrukne sosiale rom. Fluer er ansett å være mer sosial jo nærmere de er til sine naboer.
Flytetthet ikke spiller en rolle i sosiale rom i kammeret inntil det punktet av under-kapasitet. For en stor gruppe på 20 til 70 fluer i større vertikalt orientert kammer, er det sosiale rom uavhengig av gruppen tetthet (Figur 2A, B). Med bare 10 eller 15 fluer i det sosiale rommet kammer, er det mest sannsynlig ikke nok folk til å danne en stabil sosial gruppe, som fører til en økning i det sosiale rom (Figur 2A, B). Imidlertid er å teste et stort antall fluer ikke alltid praktisk - i visse tilfeller der antall mutante individer er begrenset, kan forskerne ikke kunne samle grupper av fluer store nok for standard størrelse på det sosiale rommet kammeret. For å lette kvantifisere sosiale rom ved hjelp av små grupper av fluer, kan forskerne manipulere det sosiale rommet kammeret slik at arealet av det todimensjonale arena er mindre, men området per fly forblir konstant. Vist i figur 1C, D er to typer sosialplass kamre modifisert for mindre grupper, men opprettholder den samme tetthet som det større kammeret. På denne måte holde fly tetthet, og reduserer kammerets størrelse gjør det mulig å oppnå en lignende sosial avstands (figur 2C).
De samme generelle trendene gjelder for sosiale rom kamre plassert i horisontal stilling (figur 2D). Men vi kan observere at fluene har en tendens til å være lenger fra hverandre på en slik horisontal innstilling, og de ikke slå seg lett en. Grupper som bare har 15 og 20 fluer viser større sosial plass enn grupper med 40 fluer (F igur 2D).
For å bekrefte at overbefolkning ikke var ansvarlig for de mindre avstander til nærmeste nabo sett i større grupper av fluer, avstanden fra hvert fly til alle andre fluer ble målt, som i ni. Kvantifisere avstand til alle fluene, versus avstand til nærmeste nabo, kan vurdere en gruppe behavieller, i stedet for virkemåten av individer innenfor en gruppe. Som forventet, avstanden til alle fluer økte som mengden av fluer i gruppen var større, en refleksjon av gruppen selv, ikke av de enkelte fluer. Denne trenden ble observert for både vertikalt og horisontalt plasserte sosiale plass kamrene (figur 2E, F). Derfor ble fluene fra større grupper ikke tvunget til å holde en nærmere avstand til sin nabo på grunn av plassbegrensninger. I stedet fluer danne strammere sosiale grupper når det er mer enn 15 fluer i kammeret.
Som for andre atferdstester, en begrensning til å bruke det sosiale rommet kammeret vertikalt er at det krever fluer uten geotaxis eller klatring nedskrivninger. For eksempel, flyr Canton-S infiserte for en uke med Gram-negative bakterien Providencia rettgeri 23 har en klatre defekt og viser ulike sosiale avstands resultater avhengig av retningen på den sosiale avstandkamre. Når testen ble utført vertikalt, den sosiale plass av den infiserte fluene var større enn det sosiale plass av kontrollene, sannsynligvis fordi de infiserte fluer var ikke i stand til å danne en stabil gruppe på toppen av kammeret (figur 3A). Når fluene under samme forhold ble deretter testet i horisontalt orienterte sosial plass kamrene, var det ingen signifikante forskjeller, noe som indikerer at bevegelse evne er trolig mindre av en faktor for sosial plass i horisontalt plassert sosiale rom kamre (Figur 3B). Mens de infiserte fluer er visuelt mindre i stand til å klatre enn kontroller, kan dette kvantifiseres ved hjelp av klatre analysen (Figur 3C). Etter 5 sek, ca 44% av kontroll fluer klatret opp til den øverste halvdelen av den nedre hetteglasset og bare 32% av smittede fluer. Det er verdt å merke seg at alle fluene i denne analysen klatre dårlig (de sjelden nå til topphetteglass, bare den øvre delen av den nedre hetteglass), som kanforklares ved det faktum at de er 12 dager post-eklosjonshormon, som er når fluer begynner å oppvise en defekt i klatring på grunn av aldring 22.
Men for belastninger som ikke har noen klatring defekt, begge orienteringer i kamrene førte til samme resultat, som vi tidligere har vist en. I dette forsøk ble den samme økningen i sosial plass sett i Canton-S og w 1118 Cs 10 i den vertikale trekant eller de horisontale sirkulære kamre (figur 3D, E - reanalysis i boksen og whisker av de data som er publisert i 1). Det var ingen forskjell i klatring evne mellom Canton-S og w 1 118 Cs 10 angir det var ikke en faktor for forskjellen i sosiale rommet mellom stammer i begge kammer orientering (15 sek valg - Figur 3F). Hvis gitt 5 sek valg 17% ± 3.3 av CS og 14% ±2.5 av w 1 118 Cs 10 nådde til øvre hetteglass (statistisk ikke forskjellige, data ikke vist).
Forskere som bruker det sosiale rommet kammeret må også sikre at de gjentar sine eksperimenter på samme tid på dagen. For både Canton-S og w 1118 Cs 10 mannlige fluer, den tiden av dagen påvirket sosiale interaksjoner. Sammenlignet med dagtid (zeitgeber tid - tiden i timer etter utbruddet av lys - ZT4 til ZT7), fluene testet i kveld (ZT11 til ZT12 - like før lysene av) viste en mye større sosial plass for begge genotyper, selv om deres relative plass forskjell ble bevart - dvs. w 1 118 Cs 10 fluer er fortsatt mindre sosiale enn Canton-S flyr i kveld (Figur 4A). Interessant, bare det sosiale rommet Canton-S-hanner, men ikke that av kvinner øker i kveld, selv om det var en trend mot større variasjon av sosiale rom for kvinnelige fluer i kveld (4B). Vi har tidligere gjort uavhengig av hverandre de samme observasjonene 24.
Som vi tidligere har rapportert ved bruk av en Oregon-R-linje for å studere effekten av bisfenol A (BPA) 2, er den sosiale rommet kammeret også følsom for den genetiske bakgrunn av Drosophila. Her viser vi at Elwood, en nylig fanget vill-type linje, hadde økt sosial plass i forhold til Canton-S og Samarkand men ikke Oregon (figur 5). De sosiale områder av Samarkand og Oregon var ikke signifikant forskjellige fra hverandre, men begge er større enn det sosiale rommet i Canton-S (Figur 5). Disse data viser at i et gitt miljø, forskjellige innavlet og villtype-stammer har forskjellig sosial plass, noe som indikerer en genetisk komponent for virkemåten. Det indikerer også at den i seg selvnsitivity av denne testen krever dermed at fluene skal outcrossed i passende genetiske bakgrunn før eksperimentere. Dette vil bidra til å sikre forskjeller, eller omvendt likheter, sett i det sosiale rom er på grunn av den faktoren som testes.
Figur 1. Sosiale rom kammer komponenter og arrangement. (A) Social plass kamre med forskjellige dimensjoner kan konstrueres ved hjelp av samme glassrutene (17,6 cm x 17,6 cm x 0,3 cm) og akrylavstandsstykker i form av rettvinklede trekanter (med en høyde på 16,5 cm, en base av 8,9 cm, og en tykkelse på 0,3 cm - indikert med en liten bokstav a) og rektangler (9 cm x 1,5 cm x 0,3 cm -. indikert med en liten bokstav b) (B) Den største sosiale rom kammer, slik som beskrevet i en er egnet for 30-40 fluer. Den har indre dimensions av 16,5 cm x 16,5 cm x 14,5 cm, noe som gir et areal på 86,45 cm 2, og som fører til et areal på 2,16 cm2 pr flue i 40 fluer. (C) Et kammer optimale størrelse for 20 fluer. Det har indre dimensjoner på 16,5 cm x 14,5 cm x 5,96 cm, noe som gir et areal på 43,25 cm 2, og som fører til et areal på 2,16 cm2 pr flue. (D) mindre kammer, optimal for 15 fluer. Den har indre dimensjoner på 10,2 cm x 8,9 cm x 8,9 cm, noe som gir et areal på 32,45 cm 2, og fører til et areal på 2,16 cm 2 per fly. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Orientering av kammeret og gruppestørrelse, men ikke tettheten, påvirker det sosiale rom. Dataene er representert i en boksog whisker tomt på avstanden til nærmeste nabo i kammeret, med boksen som representerer en st kvartil (25 th prosent) og 3. kvartil (75 th prosent), linjen i boksen som representerer medianen, og Tukey værhår . (AB) Representative data viser at en økning av antallet fluer i et kammer av samme størrelse som fører til stabile sosial plass målinger. Grupper på 10 til 70 Canton-S mannlige fluer ble satt i større vertikal sosial plass kammer og lov til å bosette seg i 30 min; avstanden til nærmeste nabo av hver flue ble registrert. Grupper som har mindre enn 15 fluer hadde betydelig mer sosial plass enn grupper som har mer enn 20 fluer i storkammer. (A) Grupper på 10 n = 9, 20 n = 9, 30 n = 8, 40, n = 8, Kruskal -Wallis test p <0,0001, Dunn multippel sammenligningstest: hver bokstav indikerer gruppene statistisk forskjellig en # b p <0,0001 (B) <./ strong> Grupper av 15 n = 6, 40 n = 8, 50 n = 5, 60 n = 6, 70 n = 5, Kruskal-Wallis test p <0,0001, en # b p <0,001. (C) Når Størrelsen av kammeret er justert for å opprettholde fly tetthet (henholdsvis 15 i den lille, 20 i medium eller 40 i store kammer, hver gang med en tetthet på 2,16 cm2 pr flue, er ingen signifikant forskjell observert ved testing vertikalt. (D ) Men når disse sosiale plass kamrene er plassert horisontalt grupper som hadde 15 eller 20 fluer hadde en større avstand til nærmeste nabo i forhold til grupper med 40 fluer (Grupper av 15 n = 3, 20 n = 4, 40 n = 4, Kruskal -Wallis test p <0,0001, Dunn multiple sammenligningstest en # b p <0,01). (E-F) Avstanden til alle fluer ble målt i grupper på 15, 20, og 40 mannlige Canton-S-fluer plassert i både vertikalt og horisontalt orientert kamre. Jo større mengden av fluer i kammeret, jo større avstanden til allefluer ((E): grupper av 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis-test p <0,0001, Dunn multiple sammenligningstest en # b p <0,01, (F): grupper av 15 n = 6, 20 n = 6, 40 n = 3, Kruskal-Wallis-test p <0,0001, Dunn multiple sammenligningstest en # b # c p <0,0001). Merk: (A, B og CF) viser data innhentet i 3 ulike geografiske regioner og dermed ulike laboratorie innstillinger (A) Region 1: UCLA, Los Angeles, CA, (B) Region 2:. York College, NY, NY; (CF) Region. 3: Western University, London, ON Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Orientering of det sosiale rommet kammeret kan brukes til å kontrollere for forvirrer geotaxis problemer (A - C). Grupper på 40 hann Canton-S-fluer som ble enten infisert med P. rettgeri i syv dager eller injisert med media som en kontroll ble benyttet i en sosial plass kammer enten vertikalt (A) eller horisontalt (B) plassert og lov til å bosette seg i 30 min. Avstanden til nærmeste nabo av hver flue ble registrert. Dataene er representert i en boks og whisker plott av avstanden til nærmeste nabo i kammeret, med boksen som representerer en st kvartil (25 th prosent) og 3. kvartil (75 th prosent), linjen i boksen representerer medianen, og Tukey værhår. (A) Representant data viser en økning i sosial plass for fluer som er infisert med P. rettgeri og plassert i en vertikalstilt sosial plass kammer,sammenlignet med injeksjon med media (Wilcoxon-Rank test: hver bokstav indikerer gruppene statistisk forskjellig p <0,0001, n = 6) (B) Representant data viser sosiale rom er ikke påvirket av P.. rettgeri infeksjon når fluer ble plassert i en horisontalt plassert sosial plass kammer (Wilcoxon Rank-test: p> 0,1, n = 5) (C) en motstrøms-apparat ble brukt for å vurdere klatring oppførselen til både infiserte og media kontroll fluer.. Infiserte fluer klatre dårligere enn sine mediekontroller (flyr ~ 12 dager gammel, grafen representerer bety ytelsen indeksen ± SEM:% av fluer i øverste halvdel av hetteglass på 5 sek valg, to tailed t-test med Welch korreksjon; n = 6 av ~ 60 fluer, hver bokstav indikerer gruppene statistisk forskjellig p = 0,08) (D - F). vertikalt og horisontalt plassert kamre, enten trekantet eller sirkulær, ble brukt til å sammenligne det sosiale rommet i Canton-S (CS) medat av w 1118 Cs 10 (W). Dataene er representert i en boks og whisker plott av avstanden til nærmeste nabo i kammeret, med boksen som representerer en st kvartil (25 th prosent) og 3. kvartil (75 th prosent), linjen i boksen representerer medianen, og Tukey værhår. I både sosiale rom kammer orienteringer og former, w 1118 Cs 10 hadde en større sosial plass enn Canton-S ((D), vertikal trekant: Kruskal-Wallis test, hver bokstav indikerer gruppene statistisk forskjellige p <0,0001, (E), horisontal sirkel: Kruskal-Wallis test, hver bokstav indikerer grupper statistisk forskjellig p <0,01). (F)) En motstrøms-apparat ble brukt for å vurdere klatreadferd av både Canton-S og w 1118 Cs 10stammer (flyr 3-5 dager gamle, grafen representerer gjennomsnittlig ytelse index ± SEM:% av fluer i topp hetteglass på 15 sek valg). Det var ingen forskjell i evnen mellom enten Canton-S eller w 1 118 Cs 10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Sosiale rom av menn er økt i løpet av kvelden. (A) Representant data viser en økt sosial plass mellom mannlige fluer i løpet av kvelden ("kveld" ZT 11-12, før lysene) sammenlignet med mid-dag timer ("dag "ZT 4-7). Grupper av 40 Canton-S fluer og w 1 118 Cs 10fluer ble satt i et sosialt rom kammeret under enten dagtid eller kveldstid og lov til å bosette seg i 30 min. Avstanden til nærmeste nabo av hver flue ble registrert. For begge genotyper, fluer økt sosial plass i kveld, og forskjellene mellom stammene ble holdt uavhengig av tid på døgnet (n = 6-7, Kruskal-Wallis test p <0,0001, Dunn multippel sammenligningstest: hver bokstav indikerer gruppene statistisk forskjellig p < 0,01). (B) Når Canton-S fluer ble atskilt med sex kun menn har vist en økning i det sosiale rom i kveld (t p <0,01), selv om en ikke-signifikant trend for større intern variasjon er sett hos kvinner (Kruskal -Wallis test, hver bokstav indikerer gruppene statistisk forskjellig p <0,0002). Dataene er representert i en boks og whisker plott av avstanden til nærmeste nabo i kammeret, med boksen som representerer en st kvartil (25 th prosent) og 3rd kvartil (75 th prosent), linjen i boksen som representerer medianen, og Tukey værhår. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Genetisk bakgrunn av fluer påvirker det sosiale rom. Grupper av 40 Canton-S, Samarkand, Oregon, og Elwood fluer ble satt i et sosialt rom kammer og lov til å bosette seg i 30 min. Avstanden til nærmeste nabo av hver flue ble registrert. Utdeling av gruppene er forskjellige (Kruskal-Wallis test, p <0,0001), grupper ikke deler en felles brev er vesentlig forskjellige. Dataene er representert i en boks og whisker pMye av avstand til nærmeste nabo i kammeret, med boksen som representerer en st kvartil (25 th prosent) og 3. kvartil (75 th prosent), linjen i boksen som representerer medianen, og Tukey værhår (Dunnet s multiple sammenligningstest, p <0,05 [d], p <0,001 [a, b, c], 3 uavhengige rapporter med 1-2 replikater indre, slik at for Elwood og Samarkand n = 3, Oregon og Canton-S n = 4 ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, ble en detaljert fremgangsmåte for kvantifisering av sosiale rom beskrevet. Noen avgjørende skritt for å sikre eksperimentet er vellykket er: 1) Bruk alltid hansker når du rengjør og setter opp apparatet, for å holde dine egne oljer og dufter av den indre kammer av apparatet, 2) sikre fluer samles minst en dag før eksperimentet for å redusere eventuelle effekter av kulde anestesi, 3) 2 timer før forsøket gi nye hetteglass som inneholder fersk mat for å sikre fluene er ikke utsultet, og har renset seg selv, 4) I løpet av disse to timer, la fluene akklimatisere til deres nytt miljø, 5) oppmerksom på temperatur og luftfuktighet når du utfører eksperimenter; prøver å holde dem konsekvent mellom 24-25 ° C og 50% luftfuktighet, 6) Sørg for å ikke forstyrre det sosiale rommet kamrene mens du kjører eksperimentet, og 7) utføre eksperimentet på samme tid på dagen, helst mellom zeitgeber tid ZT4 og ZGT7.
Sosiale rom er bare avhengig av tettheten av fluer i kammeret, og ikke avhengig av størrelsen av gruppen, så lenge det er en minimal gruppestørrelse oppfylt.Fluer vil opprettholde samme sosiale avstanden mellom seg selv, uavhengig av mengden av medlemmer av gruppen. Men avstanden til alle fluer i kammeret, som forventet, er påvirket av gruppestørrelse, samt kammeret orientering. Det er viktig å merke seg at til tross for horisontal orientering er vanskelig å bruke (fluer ikke slå seg så lett), og som fører til redusert avstand mellom genotyper i våre hender (figur 3D forhold til 3E), Burg et al. 3 med hell brukt en horisontal , firkantet kammer. I sine eksperimenter, avstanden til nærmeste nabo var mest lik våre vertikalt orienterte sosial plass resultater. Men i sitt kammer, var det en kontinuerlig luftstrøm som kan ha bidratt til fluene 'sosial gruppe avstanden være mest lik vår vertikale kammer i stedet for vår horisontal kammeret. En begrensning til ved hjelp av vertikale kamre er evnen til å teste Drosophila som har mobility nedskrivninger. Det sosiale rommet kammer krever fluene å være mobile, slik at de kan velge i hvilken avstand fra sin nabo de ønsker å være. Hvis fluer var immobile eller hadde underskudd på noen måte, kan de ikke være i stand til å danne stabile grupper skikkelig i kammeret. En potensiell middel for dårlig bevegelse ville være å deretter bruke horisontale kamre, eller for å gi mer tid for fluene å bosette før du tar bildet. Forskere må også vurdere klatreevne og mulige geotactic nedskrivninger av fluer for å se om den vertikale sosiale rommet kammeret er hensiktsmessig. Hvis det er underskudd i en av disse, kan horisontalt plassert kamre brukes for å unngå dem.
Av notatet, hvis klatring aktivitet eller generell utholdenhet og helse på flua vil påvirke målingen av sosiale rom, viser vi at aktivitets eller locomotion nivåene ikke er korrelert med sosiale rom. I en annen studie viser vi at en behandling som reduserer bevegelse, (fôring BPA) også redusere sosialplass 2. Men mutanter av rugose (en Drosophila ortolog av autisme kandidat genet neurobeachin) skjerm hyperaktivitet og økt sosial plass 4. Til slutt, hvite mutante fluer vise en økning i sosiale rom 1,3, uten noen økning i bevegelse eller geotaxis 18. Kort sagt har flere kombinasjoner av aktivitetsnivå og sosial mellomrom er observert så langt, som indikerer ingen korrelasjon mellom de to virkemåter. Faktisk ikke sosialt rom ikke nødvendigvis relateres til andre sosiale atferd enten, for eksempel sosial unngåelse 8,25, noe som tyder på forskjellige underliggende nevrale kretser. For eksempel, mutanter av rugose / neurobeachin skjerm økt sosial plass og redusert sosial unngåelse 4; men hvit har både økt sosial plass, og veldig sterk sosial unngåelse fire.
Etter hvert som tiden på dagen påvirker sosiale rom, i det minste hos menn, er det critical at forskerne er bevisste på den tiden av dagen når sine eksperimenter utføres og innsats er gjort for å opprettholde en konstant tid for alle eksperimenter. Andre hensyn som skal regnskapsføres inkluderer alder, kjønn, og parring status av fluene. Vi vet at sosial avstand økes i jomfru i forhold til parret enkelte, både for både menn og kvinner 1, og vi viser nå at menn er mindre tett enn kvinner i kveld (4B). Strain spesifikke kjønnsforskjeller i aktivitetsnivået av enslige fluer i løpet av dagen har tidligere blitt beskrevet, foreslår at menn høyere muskelaktivitet i morgen og kveld i forhold til dagtid kan være relatert til deres frieri atferd 26,27. Men i vårt tilfelle, er kjønnene separert, men fluene er gruppert, og etter den tid vi måle deres sosiale rom, har fluene avgjort. Fujii et al. 27 rapporterer at døgnrytmen i par av mannlige holdtsammen har en ujevn døgnrytme, uten klare topper, når rytmen kvinnelige parene likne som enkelt fluer. Så, er den økte avstanden hos menn i kveld trolig ikke knyttet til en økning i frieri atferd eller spesifikk økning i muskelaktivitet, og grunnen til grunn for kjønnsdimorfisme av denne atferden må utredes videre.
Med dette i betraktning, bør fluer alltid være atskilt med sex for eksperimentet så forskjeller i sosial interaksjon mellom menn og kvinner kan sees. Til slutt har vi i dag ikke vet ennå hvordan alder påvirker sosiale interaksjoner av fluer. Derfor anbefaler vi at sosiale plass eksperimenter er utført med fluer ikke eldre enn sju dager, som ulike adferds forestillinger, inkludert klatreaktivitet er kjent for å være påvirket i flyr mer enn én uke gamle 22.
En endelig vurdering for sosiale rom er variasjonene observert i mediansosial avstand. Sosiale rom målinger ble tatt fra forskjellige steder, inkludert (Los Angeles, CA: figur 2A, New-York, NY: figur 2B, Figur 3D, figur 4, figur 5, London, ON: Figur 2C-F, Ithaca, NY: Figur 3A, B; alle i samme Canton-S bakgrunnen). Ukjente variabler som ikke var konstant mellom geografiske steder, eller laboratoriet, påvirket median sosial avstand. Mulige faktorene omfatter ulike matvarer, høyde, atmosfærisk trykk i seg selv, og endring i atmosfærisk trykk 28. Selv medianer var ikke konstant mellom steder, innenfor en plassering medianer er svært konstant og reproduserbar; og trender og mønstre sett i det sosiale rommet målingene forble den samme blant steder. Derfor, så lenge som forskere opprettholder internt konstante betingelser, vil de være engjengelig for å påvise forskjeller i det sosiale rom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Nikon | SMZ-645 | Any other standard scope for fly handling would work |
| Small paint brushes | for pushing flies | ||
| Jazz-mix | Fisher | 33545 | any other standard drosophila food would work |
| Mini-Alarm Timer/Stopwatch | |||
| Sharpie pens | |||
| Adhesive Tape | |||
| Medium size binder clips | Staples | to hold the chambers together: 1-1/4" (32mm) medium clips with 5/8" capacity | |
| small SupportStands | Carolina | 707161 | to hold the chambers in a vertical orientation |
| Buret clamps | Carolina | 707362 | |
| Digital Camera | Nikon | Coolpix S8000 | to take the still pictures |
| small ruler | to be able to scale the picture | ||
| trifold board and white bench cover | to provide a white background, and a homogeneous light. | ||
| pounding pad | any mouse pad works. | ||
| Prism 6 | GraphPad Software Inc. | Prism 6 for Mac OS X | Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work |
References
- Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila.: measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11, 243-252 (2012).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on the behavior of Drosophila melanogaster. - Potential use of Drosophila as a model in the study of neurodevelopmental disorders. Behavioural Brain Research. , (2015).
- Burg, E. D., Langan, S. T., Nash, H. A. Drosophila social clustering is disrupted by anesthetics and in narrow abdomen ion channel mutants. Genes Brain Behav. 12, 338-347 (2013).
- Wise, A., et al. The autism candidate gene Neurobeachin (Rugose) mutants in Drosophila exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social behavior and activity patterns. J Neurosci. , 1-9 (2015).
- Parrish, J. K., Edelstein-Keshet, L. Complexity, pattern, and evolutionary trade-offs in animal aggregation. Science. 284, 99-101 (1999).
- Sokolowski, M. B. Social interactions in ‘‘simple’’ model systems. Neuron. 65, 780-794 (2010).
- Rittschof, C. C., Robinson, G. E. Genomics: moving behavioural ecology beyond the phenotypic gambit. Animal Behaviour. 92, 263-270 (2014).
- Fernandez, R. W., et al. Straightforward assay for quantification of social avoidance in Drosophila melanogaster. JoVE. (94), e52011 (2014).
- Hahn, N., et al. Monogenic heritable autism gene neuroligin impacts Drosophila. social behaviour. Behav Brain Res. 252, 450-457 (2013).
- Mogilner, A., Edelstein-Keshet, L., Bent, L., Spiros, A. Mutual interactions, potentials, and individual distance in a social aggregation. J Math Biol. 47, 353-389 (2003).
- Liu, L., Davis, R. L., Roman, G. Exploratory activity in Drosophila requires the kurtz nonvisual arrestin. Genetics. 175, 1197-1212 (2007).
- Soibam, B., et al. Open-field arena boundary is a primary object of exploration for Drosophila. Brain Behav. 2, 97-108 (2012).
- Ejima, A., Griffith, L. C. Ch. 30. Drosophila Neurobiology - A laboratory Manual., Ch. , Cold Spring Harbor Press. 475-481 (2010).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Connolly, J. B., Tully, T. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. 1, 2nd, IRL Press. 265-317 (1998).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299, 1407-1410 (2003).
- Rasband, W. S. ImageJ. , US National Institutes of Health. Maryland, U.S.A. (1997).
- Simon, A. F., et al. Drosophila, vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
- Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila .dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. JoVE. (74), e50339 (2013).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila. models of neurodegeneration. JoVE. , e2504 (2011).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Simon, A. F., Liang, D. T., Krantz, D. E. Differential decline in behavioral performance of Drosophila melanogaster. with age. Mech Ageing Dev. 127, 647-650 (2006).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. JoVE. , (2015).
- Fernandez, R. W., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Simon, A. F. 54th Annual Drosophila Research Conference, Washinton D.C., , (2013).
- Suh, G. S. B., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster.--Sex-specific differences suggest a different quality of activity. J. Biol. Rhythms. 15, 135-154 (2000).
- Fujii, S., Krishnan, P., Hardin, P. E., Amrein, H. Nocturnal male sex drive in Drosophila. Curr Biol. 17, 244-251 (2007).
- Pellegrino, A. C., et al. Weather forecasting by insects: modified sexual behaviour in response to atmospheric pressure changes. PLoS One. 8, e75004 (2013).
