Abstract
Пространство анализ социального описано здесь могут быть использованы для количественной оценки социальных взаимодействий Drosophila melanogaste г - или других мелких насекомых - в простой и понятной форме. Как было показано ранее на фиг.1, в двумерном камеры, сначала заставить мух, чтобы сформировать плотную группу, затем позволяя им принимать их предпочтительную расстоянии друг от друга. После мухи поселились, измерить расстояние до ближайшего соседа (или) социального пространства, обработки статическую картинку с бесплатным онлайн-программное обеспечение (ImageJ). Анализ расстояния до ближайшего соседа позволяет исследователям определить эффекты генетических и экологических факторов на социальное взаимодействие, в то время как контроль возможных факторов. Разнообразные факторы, такие как способность преодолевать, времени суток, пола и количества мух, могут изменить социальную расстояние мух. Таким образом, мы предлагаем ряд экспериментальных управления для смягчения этих смешанное воздействие. Этот анализ можетиспользовать, по крайней мере двух целей. Во-первых, исследователи могут определить, как их любимая окружающей сдвиг (например, изоляции, температуры, напряжения или токсинов) повлияет социальной интервал 1,2. Во-вторых, исследователи могут анализировать генетические и нейронные основы этого основной формой социального поведения 1,3. В частности, мы использовали его в качестве диагностического инструмента для изучения роли генов ортологичных думали участвовать в социальном поведении в других организмов, таких как гены-кандидаты для аутизма у человека 4.
Introduction
Социальные взаимодействия имеют решающее значение для правильного развития и здоровья лиц, находящихся в группе в целом, и может наблюдаться через многочисленные видов, от человека (Homo Sapiens) в простых организмов, таких как плодовых мух (дрозофилы) 5,6. Индивидуальный плодовая муха или человека имеют общие средства для обработки сенсорной информации во время этих взаимодействий, будь то: слуховые, зрительные, обонятельные, осязательные, или дегустации. Мы и другие предполагают, что существует потенциально поделился neurocircuitry лежащие в основе поведенческих реакций на социальные взаимодействия, и что нервные клетки и гены, участвующие может быть эволюционным сохраняется 7. После того, как первоначальный взаимодействие произошло, социальное пространство между взаимодействующими лиц будет либо увеличение (социальная избегание 8) или уменьшение (формирование группы / агрегации 5). Более сложные взаимодействия, как агрессия или ухаживания, может иметь место.
дрозофилы, как используется в следующих исследованиях 1-4,9. Социально пространство означает меру расстояния между муха и его ближайшего соседа 10. Социальное пространство соответствует для данной популяции D. MELANOGASTER, когда экспериментальные условия сохраняются (в среднем примерно в течение 1-2 длины тела), и изменяется по отношению к социальному опыту мух, увеличивая, если лицо было держать в изоляции 1. Правильное видение необходимо для поддержания нормального социальную дистанцию, но не классические отдушки или CVA восприятие 1. Мера социального пространства Таким образом, можноиспользовать в качестве диагностического инструмента для анализа социальных взаимодействий и количественно социальное поведение в D. MELANOGASTER 1. Опишем здесь в деталях, как выполнить эту количественную, и в какой степени общие экспериментальные переменные влияют на это поведение.
Показано, что ориентация камеры, в которой проводится этот анализ, а также от количества мух - до такой степени, - сделать влияет социальное пространство. Ранее было показано, что геометрия камеры влияет спонтанное исследовательское движение мух 11,12, и это явление в конечном итоге может повлиять, где они решают осесть. Тем не менее, до тех пор, как плотность золы (муха / см 2) и ориентации камеры хранится та же, социальное пространство мух также остается постоянным. Надежность этом анализе проиллюстрирована тем, что независимые лаборатории с использованием различных размеров камеры, форма и ориентация может повторить результат отображается в мутантах ВНITE ген (воздействие глаз пигментации), что является увеличением социального пространства (вертикальная или горизонтальная треугольник круг в 1, горизонтальная квадратная с потоком воздуха в 3).
Наши результаты также показывают, что поддержание время, в которое выполняется социальное пространство эксперимент имеет решающее значение для согласованности результатов, как мы покажем, что мужчины, но не женщины, находятся дальше по вечерам. Тем не менее, различия наблюдаются между дневными и вечерними часами не из-за различий активности мух, и мы обсудим аргументы, указывающие, что уровень активности не коррелирует с социальным пространством.
Наконец, существуют генетические подкрепления к определению социального пространства, как указано белым мутанта уже описано 1,3, и различия между различными инбредных и диких поймали штаммов мух, которые мы представляем здесь.
Таким образом, этот анализ делает отличный инструмент Fили изучения эффектов генетическая, а также экологические факторы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Оборудование и реактивы, созданных в доме (См Перечень материалов для других)
- Подготовьте холодный анестезии аппарат дрозофилы, как описано ранее 8.
- Подготовка лету аспиратор, как описано ранее 13.
- Подготовка социального пространства камеры и держатели.
- Заказать или сделать стекол и акриловые прокладки для создания космических камер социальные. Каждое пространство камеры социальной состоит из двух квадратных стекол (17,6 см на 17,6 см, толщиной 0,3 см), два прямоугольного треугольника акриловые распорки (высотой 16,5 см, основание 8,9 см, толщиной 0,3 см ), и два прямоугольных Пространства (9 см на 1,5 см толщиной 0,3 см) (рис 1а).
- Собирают стакан и акриловой социального пространства камеры таким образом, что она идентична камере на фиг.1В. Чтобы сделать это, начните с размещения одной треугольной прокладка плоский на вершине одного квадратного стеклу так, что прямой уголтреугольной распоркой выравнивается с одним из углов квадрата панели. Далее, поместите второй треугольный распорную плоский на вершине квадратной панели, отражая первую треугольную распорку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в перчатках, чтобы не загрязнять куски масла и запахов из ваших рук. - Поместите два маленькие прямоугольные прокладки плоские на вершине квадратной панели, вдоль стороны панели, которая не покрывается. Теперь акриловые прокладки на верхней части плоскости квадрата должны сформировать треугольную арену.
- Поместите второй квадратный оконное стекло поверх акриловых прокладок таким образом, что оно располагалось выше исходного оконного стекла ниже.
- Используйте четыре зажимы для крепления стекла и прокладки вместе, чтобы сформировать пространство камеру социальной. Поместите один клип на углу, по длинной стороне каждого из треугольных распорных, обеспечивая их внутрь стекол. На этих же сторон, поместите клип в соседнем углу, над каждой из прямоугольных прокладками, обеспечивая ихстороны стекол.
- Соберите опору стойки и опоки зажим такой, что зажим будет поддерживать пространство социальной камеру в вертикальном положении, как социальное пространство камеры зависит от его края на верхней части рабочей поверхности.
- Для каждого повтора в эксперименте, собрать космическую камеру социальной поддержки и стоять.
- Подготовьте аппарат отклика анализ скалолазания, чтобы проверить способность преодолевать мух тестировали.
- Использование противоточного аппарата, как описано ранее 14,15.
- Убедитесь, однородные условия освещения, выполняя эксперимент на рабочей поверхности, покрытой белой скамейке крышки и в белом фоне.
2. Подготовка мух до эксперимента
- Поддерживать мух в бутылках, содержащих стандартное дрозофилы летать пищу. Хранить их в инкубационной камере при 25 ° С на 12 ч циклом свет / темнота.
- Один-два дня до еXperiment, собирают и пол летит под холодной анестезии, как описано ранее 8.
- Охладите анестезии аппарат холодной -4 ° C. Место летит в 50 мл пластиковых труб. Полностью погрузите пластмассовые пробирки, содержащие мух в лед в ведерке со льдом изолированной, подождите по крайней мере 5 мин для мух становятся неподвижными.
- Поместите мух на полиэтиленовую листа анестезии аппарата холодной. В РТ, используйте стереомикроскопа, чтобы отделить самцов от самок. Поддерживать мух, в группах, во флаконах, содержащих стандартную дрозофилы летать пищу, не превышающей 40 мух в пузырек.
- За два часа до начала эксперимента, чтобы температура в помещении, где будет выполняться эксперимент между 24-25 ° С, а влажность составляет приблизительно 50%.
- Перевести мух в новых флаконах, содержащих еду, и разместить их в течение 2 ч на рабочей поверхности, где будет выполняться эксперимент.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих экспериментальTS, штаммы летать были использованы Drosophila штаммы MELANOGASTER: Кантон-Специальные или Кантон-S (CS), W 1118 Cs 10 (или W - W 1118 ауткроссной 10 раз Кантон-S), Орегон и Самаркандской мухи были из нашей лаборатории запасы 16; Elwood мухи были собраны осенью 2011 года в Элвуд города Хантингтон, на Лонг-Айленде, Нью-Йорк, США 8. Помимо когда указано иное, результаты, представленные были получены с Canton-S летит (в оттенках красного).
3. Выполнение эксперимента
- Выполните эксперимент между 12 вечера и 3 вечера (Zeitgeber время - время в часах после начала света - из ZT 4 до 7).
- Подготовьте пространство камеру социальной для передачи мух.
- Поставьте социального пространства камеры квартиру на рабочей поверхности, со стороной, содержащей прямоугольные прокладки ближайших к вашему телу.
- Удалить опе клип ближайшие вашего тела и слайд один прямоугольный прокладку наружу, создавая зазор примерно 1 см между прямоугольными прокладками.
- Использование ленты и маркера, маркер пространство камеру социальной в верхнем углу с пола, процедить и количество повторений. Позаботьтесь, чтобы обеспечить ленту не распространяется часть внутренней треугольной арене.
- Перевести мух в пространство камеры социальной.
- Передача летит из их флакон, содержащий пищу в новой, пустой флакон. Аспирируйте летит из пустого флакона и передать их в пространство камеры социальной.
- Вдохните, чтобы привлечь мух в наконечник аспиратора. Поместите наконечник в 1 см между прямоугольными прокладками пространства камеры социальной и выдох на постоянной скоростью, чтобы заставить мух во внутреннюю треугольной арене.
- Сразу скользить прямоугольную прокладку на место, закрывая основание внутренней треугольной арене, и поместить клип связующего обратно.
- На стучать колодки, которая находится на другой стенд, где, чем экспериментальная работа происходит, держите камеру пространства социальной вертикально таким образом, что прямоугольные прокладки находятся на нижней стороне. Фунт три раза, чтобы убедиться, что все мухи упали на дно арене.
ПРИМЕЧАНИЕ: В связи с акриловой прокладки, торчащие из маленького размера камеры (рис 1D), бац локти на рабочей поверхности, сохраняя при этом надежную фиксацию на аппарате, чтобы мухи упали на дно. - Начало таймер.
- Поместите пространство камеру социальной работы на поверхности и использовать подставке и колбу зажим, чтобы держать его в вертикальном положении. Поместите линейку или наклейку известной длины плоской против космической камеры социальной, но не охватывающую любую часть внутренней треугольной арене.
- Для горизонтально экспериментов, не устанавливайте камеру пространства социальной поддержки в стенде; вместо заложить пространство камеры единого социального на рабочей поверхности.
- Когда мухи поселились, как правило, после 30 мин вокруг, сфотографировать пространства камеры социальной. Убедитесь, что кадр содержит всю внутреннюю треугольную арену, правитель, и этикетку.
- Повторите эксперимент для каждого генотипа и условий (в идеале 3 внутренних повторов и 3 независимых повторов).
4. Анализ социального пространства данных
- Импорт следующие макросы в ImageJ 17
- ImageJ можно ознакомиться здесь: http://rsbweb.nih.gov/ij/.
- Вы можете создать команду 'измерять расстояния "в меню Plugins, сохраняя макросы ниже в файле с именем" Measure_Distances.txt "в папке ImageJ / плагинов, в макро, вложенной и использования Помощь> Обновление команды меню.
- Копировать в .txt файл макросов, которые предоставляются в дополнительных данных и были первоначально опубликованы в 3.
- Загрузить фотографии с компьютера и открыть одну ковRe используя ImageJ.
- Создать масштаб рисуя линию от 0 см до 1 см марок на линейке в картине, и на вкладке Анализ, выбрать функцию Set Scale, чтобы установить масштаб 1 см для этого расстояния (тот же подход для наклейкой Известно длина). Выберите глобальный параметр до применения шкалы к картине.
- Обрезать изображение, используя функцию Crop на вкладке Image такой, что она включает в себя все мухи, удаляя, как большая часть остальной части изображения, как это возможно.
- Сделайте снимок черно-белый, выбрав 8-бит с возможностью Тип на вкладке Image.
- Удалить все посторонние шумы с картинки, перейдя к функции порога под Adjust опции на вкладке Image. Перетащите ползунки, чтобы усилить или удалить контрастность так, чтобы тело каждого лету можно ясно увидеть без каких-либо других маркировок на изображении. Если есть маркировка, не являющиеся мухи, захватить их с прямоугольной инструмент и удалить их.
- УстановитьИзмерения с помощью Set измерения инструмента на вкладке анализировать. Выбрать Регион, центр масс, центр тяжести, и дисплей метку. Затем выберите анализировать частицы имеют под вкладке Анализ создать нумерованный список всех мест, представляющих черных мух.
- При использовании Анализ частиц; комплект размер 0,01-0,1 (НЕ выбирать пиксельный блок); округлость 0.00-1.00; Показать очертания; отображения результатов, и добавить к менеджеру.
- Убедитесь, что каждый черное пятно (каждая частица) является точным представлением мух, которые на оригинальном снимке, путем сравнения с номером списка исходного изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если некоторые мухи, которые очень близко друг к другу, как подсчитываются одной частицы, вручную нарисовать белую линию, чтобы отделить мух от двух бинарных изображений.
- Если выбран список, используйте ближайший сосед - Список Расстояния макрос под второй вариант Макросы на вкладке Плагины для создания нового списка, содержащего расстояния в см, от ЕАч лететь в их ближайшего соседа.
- Скопируйте ближайших соседей расстояния от ImageJ и вставить в столбец программе электронных таблиц.
- Компиляция всех данных из каждого повторения на одной таблице и организовать по генотипу и состояния.
- Выполнить анализ данных с использованием статистического программного обеспечения. В этом эксперименте, График Pad Prism (версия 6 для MacOSX, GraphPad Software, Сан-Диего Калифорния, США, www.graphpad.com) был использован для проведения односторонней ANOVA, и Крускала-Уоллиса тесты, Тьюки и пост-Hoc тесты Dunnet в.
- Распределение расстояний следует без распределение параметрического 1, и данные представлены в виде коробки и усов Тьюки (выбросы устранить).
5. Восхождение анализа (контроль поведения)
- Используйте для скалолазания анализа в качестве контроля на испытательных мух способность преодолевать 14,15,18.
- Используйте противоточный аппарат, такой, что три испытания сработать параллельно.
- Передача 50 до 100 наивных мух (мухи, которые не были проверены ранее) в трех различных тестовых флаконов, и оснастки их в 1-й, 3-й и последний слоты в нижней части противотоком аппарата, со свежими пустых флаконов в противоположных местах.
- Поместите свежие, пустые флаконы в пустые слоты в нижней части аппарата.
- Нажмите вниз аппарата три раза, таким образом, что все мухи в нижней части каждой трубы, чтобы инициировать эксперимент.
- Запустите таймер на 15 сек (время, достаточное для ~ 100% 3-7 дней старые Кантон-S, чтобы достичь вершины флакон - рис 3F).
- Слайд верхнюю часть против течения аппарата, сместить топ ампул один слот.
- Соберите мух, нажав на аппарат вниз, чтобы привести все мухи в нижних флаконах.
- 1-й и 2-й трубы (или 3-й и 4-й, 5-й 6-й) соответствуют соответственно мух, которые не достигли к началу и мух, которые достигли верхней флакон.
- Рассчитать индекс производительности (PI).
- Подсчитайте количество мух в каждом флаконе.
- ПИ процент мух, способных подняться на верхнюю трубку.
- Средства ПИ следовать нормальному распределению 1, и данные представлены в виде столбцов графиков среднего плюс или минус стандартная ошибка среднего до (SEM).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, ПИ может быть рассчитана как процент мух, способных достичь верхнюю часть нижней флакон (для пожилых мух, 5 сек время достаточно количественно разницу в восхождении способность между инфицированных и не инфицированных 12 дней Кантон-S количественно из неподвижного изображения: см. результаты) Другие используют различные меры производительности в испуга, вызванного негативными geotaxis, которые также подходит для количественного способность преодолевать 19-22.
- Передача летит из их флакон, содержащий пищу в новой, пустой флакон. Аспирируйте летит из пустого флакона и передать их в пространство камеры социальной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пространство камеры социальной может быть использован в качестве инструмента для количественной оценки социального поведения дрозофилы. Акриловые прокладки и оконные стекла, обрезаются вместе, чтобы сформировать внутреннюю треугольную арену, которая обеспечивает двумерное область, в которой мухи могут образовывать стабильные группы без присутствия многих потенциально мешающих сигналов. Когда мухи переносят в вертикальной арене, они поражены перехвата вниз, и они отвечают на поведение побега: отрицательный geotaxis. Они поднимаются к вершине треугольника, вертикальном принудительного в тугой группы, а затем предоставляются время двигаться дальше друг у друга, и изучить арену. После 20 мин до 40, они перестают двигаться, и стабильная группа формируется. Расстояние между каждым лету и его ближайшего соседа может быть измерена с изображения, чтобы обеспечить количественную предпочтительного социального пространства. Мухи считается более социально, чем ближе они находятся к соседям.
ЛетатьПлотность не играет роль в социальном пространстве в камере до точки под емкости. Для большой группы от 20 до 70 мух в большей вертикально ориентированной камеры, социальное пространство не зависит от плотности группы (рис 2А, Б). Что только 10 или 15 мух в пространстве камеры социальной, там, скорее всего, не хватает людей, чтобы сформировать стабильную социальную группу, что приводит к увеличению социального пространства (рис 2А, Б). Тем не менее, тестирование большого количества мух не всегда удобно - в некоторых случаях, когда количество мутантных особей, ограничено, исследователи не могут собрать группы мух, достаточно большой для стандартного размера пространства камеры социальной. Для облегчения количественного социальное пространство, используя небольшие группы мух, исследователи могут манипулировать пространство камеры социальной таким образом, что площадь двумерной арене меньше, но площадь на лету остается постоянным. Показано на рисунке 1в, г два типа социальногокосмические камеры модифицированы для небольших групп, но сохранить тот же плотность, что и большей камере. Таким образом, сохраняя плотность летать, а уменьшение размера камеры позволяет получить аналогичную социальную расстояние (фиг.2с).
Те же общие тенденции справедливы для социальных космических камер, размещенных в горизонтальном положении (рис 2D). Тем не менее, мы можем заметить, что мухи, как правило, дальше друг от друга в такой горизонтальной установки, и они не оседают легко 1. Группы, которые имеют только 15 и 20 демонстрируют мух большую социальную места, чем групп с 40 мух (F igure 2D).
Чтобы подтвердить, что переполненность не несет ответственности за меньших расстояний до ближайшего соседа видели в больших группах мух, расстояние друг от летать со всеми другими мух измеряли, как в 9. Количественная расстояние до всех мух, в зависимости от расстояния до ближайшего соседа, позволяет оценить групповую behaviили, вместо того, чтобы поведение отдельных лиц в группе. Как и ожидалось, расстояние до всех мух увеличилось как количество мух в группе было больше, отражение самой группы, не из отдельных мух. Эта тенденция наблюдалась и по вертикали и по горизонтали, расположенных космических камер социальных (рис 2E, F). Таким образом, мух от больших групп не были вынуждены держать ближе расстояние до своего соседа из-за космических ограничений. Вместо этого, мухи образуют жесткие социальные группы, когда есть более чем 15 мух в камере.
Как и для других поведенческих тестов, одно ограничение на использование пространства камеры социальной вертикально, что это требует мух не geotaxis или альпинистских нарушениями. Например, кантон-S летит зараженный в течение одной недели с грам-отрицательной бактерией Провиденсия rettgeri 23 обладают дефект скалолазания и демонстрируют различные результаты социального распорных в зависимости от ориентации социальной расстояниякамер. Когда испытание проводили по вертикали, социальное пространство инфицированных мух была больше, чем социальном пространстве управления, вероятно, из-за инфицированные мухи были не в состоянии образовывать стабильную группу в верхней части камеры (фиг.3А). Когда мухи при тех же условиях были затем испытаны в горизонтально ориентированных социальное пространство камеры, не было никаких существенных различий, что указывает на передвижение способность, вероятно, менее важным фактором для социального пространства в горизонтально космических камер социальных (Фиг.3В). В то время как зараженные мухи визуально менее способны подниматься, чем в контрольной, это может быть количественно, используя подъемный анализа (фиг.3С). Через 5 сек, примерно 44% контрольных мух поднялся до верхней части нижней флакон и только 32% зараженных мух. Стоит отметить, что все летит в этом анализе подняться слабо (они редко достигают к началу флаконе, только в верхней части нижней флакона), который можетобъясняется тем, что они являются 12 дней после вылупления, что, когда мухи начинают проявлять дефект в восхождение из-за старения 22.
Тем не менее, для штаммов, которые не имеют дефект скалолазания, обе ориентации палат привело к тем же результатам, как мы уже показали, 1. В этом эксперименте, такое же увеличение в социальном пространстве была замечена в Кантон-S и W 1118 Cs 10 в вертикальном треугольника или горизонтальных круговых в камерах (рис 3D, E - повторный анализ в поле и ус данным, опубликованным в 1). Там не было никакого различия в способность преодолевать между Кантон-S и W 1118 Cs 10 указав, что он не был фактором для разницы в социальном пространстве между штаммами в любом камеры ориентации (15 сек выбор - Рисунок 3F). Если дано 5 сек выбор 17% ± 3.3 CS и 14% ±2.5 Вт 1 118 Cs 10 достигло верхнего флакона (статистически не отличается, данные не показаны).
Исследователи, использующие пространство камеру социальной должен также обеспечить их повторить свои эксперименты в то же время суток. Для обоих Кантон-S и W 1118 Cs 10 мужчина летит, время дня пострадавших социальные взаимодействия. По сравнению с дневными часами (Zeitgeber время - время в часах после наступления света - ZT4 к ZT7), мухи, испытанные в вечернее время (ZT11 к ZT12 - как раз перед выключенным светом) показали гораздо большую социальное пространство для обоих генотипов, хотя их относительная разница пространство сохраняется - то есть, со 1118 Cs 10 мух еще менее социален, чем Кантон-S летит в вечернем (рис 4а). Интересно, что только социальное пространство Кантон-S мужчин, но не тшляпа женщин увеличивается в вечернее время, хотя тенденция к большей изменчивости социального пространства для женщин мух в вечернее время (рис 4В). Ранее мы уже самостоятельно сделали те же наблюдения 24.
Как сообщалось ранее, используя Орегон-R линию, чтобы изучить влияние бисфенола А (BPA) 2, пространство камеры социального также чувствителен к генетическим фоном дрозофилы. Здесь мы показываем, что Элвуд, недавно поймали дикого типа линии, возросло социальное пространство по сравнению с Кантон-S и Самаркандской, но не Орегоне (рисунок 5). Социальные пространства Самарканде и Орегоне, достоверно не отличаются друг от друга, но оба больше, чем социальное пространство Кантон-S (рисунок 5). Эти данные показывают, что в данной среде, различные штаммы инбредных и дикого типа имеют различную социальное пространство, что указывает на генетический компонент поведения. Он также указывает, что себеnsitivity этого теста таким образом, требует, что мухи будут ауткроссной в соответствующих генетических фонов до экспериментировать. Это поможет обеспечить различия, или, наоборот, сходство, видел в социальном пространстве обусловлены фактором проходят испытания.
Рисунок 1. Социальное пространство компоненты камеры и расположение. (А) социальное пространство камеры различных размеров могут быть построены с использованием тех же стекол (17,6 см на 17,6 см на 0,3 см) и акриловых прокладками в форме правильных треугольников (с высотой 16,5 см, база 8,9 см, и толщиной 0,3 см - обозначена строчной буквой а) и прямоугольников (9 см на 1,5 см на 0,3 см. - обозначается небольшой буквой B) (B) по величине пространство камеры социальной, как описано в 1 подходит для 30-40 мухи. Он имеет внутреннюю тусклыйensions 16,5 см на 16,5 см на 14,5 см, что дает площадь 86.45 см 2, а также ведущие к площади 2,16 см 2 на лету на 40 мух. (C) Размер оптимальные камера для 20 мух. Он имеет внутреннюю размеры 16,5 см на 14,5 см по 5,96 см, что дает площадь 43.25 см 2, и, ведущих к площади 2,16 см 2 на лету. (D) Меньше камера, оптимальным для 15 мух. Он имеет внутреннюю размеры 10,2 см на 8,9 см на 8,9 см, что дает площадь 32.45 см 2, и приводит к области 2.16 см 2 на лету. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Ориентация камеры и группы размеров, но не плотности, влияет на социальное пространство. Данные представлены в коробкеи усами от расстояния до ближайшего соседа в камере, с коробкой, представляющей 1-й квартиль (25-е процентов) и 3-й квартиль (75-й процента), линии в поле, представляющей медиану, и усов Тьюки . (АВ) данные, представляющие показывает, что увеличение количества мух в камере такого же размера приводит к стабильной социальной космических измерений. Группы от 10 до 70 Кантон-S мух мужчин были введены в большей вертикальной космической камеры социальной и дают отстояться в течение 30 мин; расстояние до ближайшего соседа каждой лету был записан. Группы, имеющие менее 15 мух были значительно больше социального пространства, чем групп, имеющих более чем 20 мух в большом камеры. (A) группы из 10 п = 9, 20 п = 9, 30 N = 8, 40, N = 8, Kruskal -Wallis тест р <0,0001, тест множественного сравнения Данна: каждая буква указывают группам статистически другое в # б р <0,0001 (В) <./ STRONG> Группы 15 N = 6, 40 N = 8, 50 N = 5, 60 N = 6, 70 N = 5, Крускала-Уоллиса р <0,0001, в # б р <0,001. (C) Когда Размер камеры регулируется для поддержания плотности мухи (соответственно 15 в малом, 20 в среде или 40 в большой камере, каждый раз при плотности 2,16 см 2 на лету, никаких существенных различий не наблюдалось при испытании вертикально. (D ) Но когда эти космические камеры социальные размещаются горизонтально групп, которые 15 или 20 мух имели большее расстояние до ближайшего соседа по сравнению с группами с 40 мух (групп 15 N = 3, 20 N = 4, 40 п = 4, Крускала -Wallis тест р <0,0001, множественного сравнения Данна проверить # б р <0,01). (Е-F) расстояние до всех мух измеряли для групп от 15, 20 и 40 мужских Кантон-S мухи помещается в вертикально и горизонтально ориентированный камеры. Чем больше количество мух в камере, тем больше расстояние до всехмухи ((E): группы из 15 п = 6, 20 п = 6, 40 п = 3, Крускала-Уоллиса р <0,0001, множественного сравнения Данна проверить # б р <0,01; (F): группы из 15 н = 6, 20 п = 6, 40 п = 3, Крускала-Уоллиса р <0,0001, множественного сравнения Данна проверить # B # C P <0,0001). Примечание: (A, B и CF) приводятся данные, полученные в 3 разных географических регионах и, таким образом, различных лабораторных условиях (А) Регион 1: UCLA, Лос-Анджелес, Калифорния; (Б) Регион 2:.-Йорк колледж, Нью-Йорк, Нью-Йорк; (CF) Регион 3:. Западный Университет, Лондон, пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Ориентация ое пространство камеры социального может быть использован для контроля смешивая geotaxis проблемы (А - С):. Группы 40 мужчин Кантон-S мух, которые были либо инфицированных P. rettgeri в течение семи дней или вводят со средствами массовой информации в качестве контроля были введены в пространстве камеры социальной вертикально (А) или горизонтально (B), расположенных и дают отстояться в течение 30 мин. Расстояние до ближайшего соседа каждой лету был записан. Данные представлены в коробке и усов участке от расстояния до ближайшего соседа в камере, с коробкой, представляющей 1-й квартиль (25-е процентов) и 3-й квартиль (75-й процента), линии в поле представляющий медиану и Тьюки усы. (А) представитель данные показывают увеличение в социальном пространстве для мух, которые заражены P. rettgeri и помещают в вертикально расположенного пространства камеры социального,по сравнению с инъекцией СМИ (Вилкоксона-Rank теста: каждая буква указывают группам статистически другой р <0,0001, п = 6) (Б) представитель данные показывают, социальное пространство, не влияет на P.. rettgeri инфекции, когда мухи помещаются в горизонтально расположенной камере пространства социального (Вилкоксона ранга испытания: р> 0,1, п = 5) (C) противотоком аппарат используется для оценки восхождение поведение обоих инфицированных и контрольных СМИ мух.. Зараженные мухи подняться хуже, чем их управления мультимедиа (летит ~ 12 дней, график представляют в виду индекс производительности ± SEM:% мух в верхней половине флакона в 5 сек выбора, два хвостом т-тест с коррекцией Уэлча, п = 6 из ~ 60 мух каждая буква указывают группы статистически отличается р = 0,08) (D - F). Вертикально и горизонтально расположенные камеры, либо треугольные или круглые, были использованы для сравнения социальное пространство Кантон-S (CS) су ш 1118 Cs 10 (W). Данные представлены в коробке и усов участке от расстояния до ближайшего соседа в камере, с коробкой, представляющей 1-й квартиль (25-е процентов) и 3-й квартиль (75-й процента), линии в поле представляющий медиану, и усы Тьюки. В обоих социальном пространстве камеры ориентации и формы, ж 1118 Cs 10 имели большее социальное пространство, чем Кантон-S ((D), вертикальный треугольник: тест Крускала-Уоллиса, каждая буква указывают группы статистически различные р <0,0001, (Е), горизонтальный круг: тест Крускала-Уоллиса, каждая буква указывают группы статистически отличается р <0,01). (F)) Противоточный аппарат используется для оценки восхождение поведение как Кантон-S и W. 1118 Cs 10штаммы (летит 3-5 дней старые, график представляют среднее индекса производительности ± SEM:% мух в верхней флакон на 15 сек выбору). Там не было никакого различия в способности между любом кантоне-S или ж 1118 Cs 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Социальное пространство мужчин увеличивается в течение вечера. (А) представитель данных показан увеличил социальные пространство между мужчиной летит в вечерние часы ("Вечер" ZT 11-12 перед выключенным светом) по сравнению с середине дня часов ("день "ZT 4-7). Группы 40 Кантон-S мух и W 1118 Cs 10мухи были помещены в пространстве камеры социальной течение либо дневные часы или вечерние часы и дают отстояться в течение 30 мин. Расстояние до ближайшего соседа каждой лету был записан. Для обоих генотипов, летит повышенную социальное пространство в вечернее время и различия между штаммами держали независимо от времени суток (п = 6-7, Крускала-Уоллиса р <0,0001, тест множественного сравнения Данна: каждая буква указывают группам статистически другой р < 0.01). (B) Если Кантон-S мухи были разделены по полу только для мужчин показали увеличение социального пространства в вечернее время (т р <0,01), хотя не значимая тенденция для увеличения внутреннего вариации видел в женщинах (Крускала -Wallis тест, каждая буква указывают группам статистически другой р <0,0002). Данные представлены в коробке и усов участке от расстояния до ближайшего соседа в камере, с коробкой, представляющей 1-й квартиль (25-е) процентов и 3й квартиль (75-й процента), линия в окне, представляющей медиану, и усы Тьюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Генетический фон мух влияет социальное пространство. Группы 40 Кантон-S, Самарканд, штат Орегон, и Elwood мухи были помещены в пространстве камеры социальной и дают отстояться в течение 30 мин. Расстояние до ближайшего соседа каждой лету был записан. Распределение групп отличаются (тест Крускала-Уоллиса, P <0,0001), группы не имеющие общую букву, значительно отличаются. Данные представлены в коробке и усов рМного расстояния до ближайшего соседа в камере, с коробкой, представляющей 1-й квартиль (25-е процентов) и 3-й квартиль (75-й процента), линии в поле, представляющей медиану, и усов Тьюки (Даннет-х тест множественного сравнения, р <0,05 [г], р <0,001 [а, Ь, с], 3 независимых повторов с 1-2 повторов внутренних, такие, что для Элвуд и Самарканде N = 3, Орегон и Кантон-S N = 4 ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, детальная процедура для количественного социального пространства было описано. Некоторые важные шаги по обеспечению эксперимент успешно: 1) всегда используйте перчатки при очистке и настройке аппарата, чтобы сохранить ваши собственные масла и ароматы от внутренней камеры аппарата, 2) обеспечить мухи собираются по меньшей мере один день, прежде чем эксперимент, чтобы уменьшить отрицательное воздействие холодной анестезии, 3) 2 ч до эксперимента предоставлять новые флаконы, содержащие свежие продукты, чтобы обеспечить мухи не голодали, и убрали сами, 4) Во время этих 2 часов, пусть летит акклиматизироваться к их Новая среда, 5), обратите внимание на температуру и влажность условий при выполнении экспериментов; попробуйте, чтобы держать их в соответствии между 24-25 ° С и 50% влажности, 6), убедитесь, чтобы не мешать космические камеры во время работы социальных эксперимент, и 7) выполняют эксперимент в то же время суток, предпочтительно от Zeitgeber время ZT4 и ZGT7.
Социального пространства зависит только от плотности мух в камере, и не зависит от размера группы, до тех пор, как существует минимальный размер группы встретились.Мухи будет поддерживать такой же социальной интервал между собой, независимо от количества членов группы. Тем не менее, расстояние до всех мух в камере, как и ожидалось, зависит от размера группы, а также ориентации камеры. Важно отметить, что, несмотря на горизонтальной ориентации, сложным в использовании (мухи не оседают в легко), и приводит к уменьшению разделения между генотипами в руках (рис 3D сравнению с 3E), Burg и соавт. 3 успешно использован горизонтальный , квадрат камера. В своих экспериментах, расстояние до ближайшего соседа был наиболее близок к нашим вертикально ориентированных результатов социального пространства. Тем не менее, в их камере, там был непрерывный поток воздуха, что, возможно, способствовали расстояние социальная группа мух "является наиболее похожа на нашу вертикальной камере вместо нашего горизонтальной камерой. Ограничение на использование вертикальных камер является возможность протестировать дрозофилы, которые имеют Mobiliти нарушения. Пространство камеры социального требует мух быть мобильным, таким образом они могут выбрать, на каком расстоянии от своего соседа они хотят быть. Если мухи были неподвижны или имели дефицит в некотором роде, что они не могут образовывать стабильные группы должным образом в камере. Потенциальный средство передвижения для бедных было бы затем использовать горизонтальные камеры, или предоставить больше времени для мух, чтобы обосноваться перед съемкой. Исследователи также должны оценить способность преодолевать и возможные нарушения geotactic мух, чтобы увидеть, если вертикальное пространство камеры социального уместно. Если есть дефицит в любой из них, расположенные камеры по горизонтали может быть использован, чтобы избежать их.
Следует отметить, что если восхождение деятельности или общую выносливость и здоровье лету будет влиять на измерение социального пространства, мы показываем, что деятельность или передвижение уровни не коррелирует с социальным пространством. В другом исследовании показано, что лечение, которое уменьшает двигательную (BPA кормления) также уменьшить социальноепространство 2. Но мутанты морщинистые (A дрозофилы ортолог гена аутизма neurobeachin кандидата) дисплей гиперактивность и увеличение социального пространства 4. Наконец, белые мухи-мутанты отображения увеличение социального пространства 1,3, без увеличения передвижения или geotaxis 18. Короче говоря, несколько комбинаций уровня активности и социальной расстояния наблюдались до сих пор, что свидетельствует об отсутствии корреляции между двумя поведения. На самом деле, социальное пространство не обязательно коррелирует с другими социальными поведения либо, как социальное уклонение 8,25, предполагая, иной основной нейронной схемы. Например, мутанты морщинистые / neurobeachin дисплее увеличилось социальное пространство и уменьшить социальную уклонение 4; но белый имеет и увеличился социальное пространство, и очень сильная социальная избегание 4.
Как время суток влияет социальное пространство, по крайней мере, у мужчин, это Criticaл, что исследователи осведомлены о времени суток, когда их эксперименты выполняются и усилия, чтобы поддерживать постоянное время для всех экспериментов. Другие соображения, которые должны учитываться, включают возраст, пол и состояние Спаривание мух. Мы знаем, что социальная дистанция увеличивается в сравнении с девственницей повязана личности, как для мужчин, так и женщин 1, и мы сейчас покажем, что мужчины менее близко, чем женщины в вечернее время (рис 4В). Процедить конкретные половые различия в уровнях активности одиночных мух в течение дня, была описана ранее, предложив более высокую мужчины двигательную активность в утром и вечером по сравнению с днем может быть связано с их ухаживания поведения 26,27. Однако в нашем случае, полов разделены, но мухи сгруппированы, и к тому времени мы измеряем их социальное пространство, мухи поселились. Фуджи др. 27 сообщают, что циркадный ритм в парах мужчина держалвместе есть неустойчивый суточный ритм, без четких пиков, когда ритм женских пар напоминают, что одиночные мух. Так, увеличение расстояния у мужчин в вечернее время, вероятно, не связано с увеличением в ухаживании или конкретного увеличения двигательной активности, и причина, лежащая в основе половой диморфизм этого поведения необходимо дальнейшее расследование.
При этом во внимание, мухи всегда должны быть разделены по полу для эксперимента поэтому различия в социальном взаимодействии между мужчинами и женщинами можно увидеть. Наконец, в настоящее время мы еще не знаем, как возраст влияет на социальные взаимодействия мух. Поэтому, мы рекомендуем, что космические эксперименты социальные выполняются с мухами не старше семи дней, как различные поведения выступлений, в том числе для скалолазания деятельности, как известно, быть затронуты в мух больше, чем за одну неделю старых 22.
Окончательное рассмотрение для социального пространства является наблюдаемые вариации в среднемсоциальная дистанция. Социальное пространство измерения были взяты из различных мест, включая (Лос-Анджелес, Калифорния: Рисунок 2А; Нью-Йорк, Нью-Йорк: Рисунок 2B, Фигурное 3D, рисунок 4, рисунок 5; Лондон, ON: рис 2С-F, Итака, штат Нью-Йорк: Рисунок 3а, б, все в том же Кантон-S фоне). Не указан переменные, которые не были постоянным между географических пунктах, или лабораторных условиях, влияет на средний социальную дистанцию. Возможные факторы включают в себя различные продукты, высота, атмосферное давление само по себе, и изменения в атмосферном давлении 28. Хотя медианы не были постоянными между точками, в месте медианы высоко постоянным и воспроизводимым; и тенденции и видели в измерениях социального пространства остался прежним среди местах. Таким образом, до тех пор, исследователи считают, внутри постоянные условия, они будутБле, чтобы обнаружить различия в социальном пространстве.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo Zoom Microscope | Nikon | SMZ-645 | Any other standard scope for fly handling would work |
| Small paint brushes | for pushing flies | ||
| Jazz-mix | Fisher | 33545 | any other standard drosophila food would work |
| Mini-Alarm Timer/Stopwatch | |||
| Sharpie pens | |||
| Adhesive Tape | |||
| Medium size binder clips | Staples | to hold the chambers together: 1-1/4" (32mm) medium clips with 5/8" capacity | |
| small SupportStands | Carolina | 707161 | to hold the chambers in a vertical orientation |
| Buret clamps | Carolina | 707362 | |
| Digital Camera | Nikon | Coolpix S8000 | to take the still pictures |
| small ruler | to be able to scale the picture | ||
| trifold board and white bench cover | to provide a white background, and a homogeneous light. | ||
| pounding pad | any mouse pad works. | ||
| Prism 6 | GraphPad Software Inc. | Prism 6 for Mac OS X | Any statistical analysis software with t-test, one-way and two ANOVA would work |
References
- Simon, A. F., et al. A simple assay to study social behavior in Drosophila.: measurement of social space within a group. Genes Brain Behav. 11, 243-252 (2012).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on the behavior of Drosophila melanogaster. - Potential use of Drosophila as a model in the study of neurodevelopmental disorders. Behavioural Brain Research. , (2015).
- Burg, E. D., Langan, S. T., Nash, H. A. Drosophila social clustering is disrupted by anesthetics and in narrow abdomen ion channel mutants. Genes Brain Behav. 12, 338-347 (2013).
- Wise, A., et al. The autism candidate gene Neurobeachin (Rugose) mutants in Drosophila exhibit neuro-developmental disorders, aberrant synaptic properties, altered locomotion, impaired adult social behavior and activity patterns. J Neurosci. , 1-9 (2015).
- Parrish, J. K., Edelstein-Keshet, L. Complexity, pattern, and evolutionary trade-offs in animal aggregation. Science. 284, 99-101 (1999).
- Sokolowski, M. B. Social interactions in ‘‘simple’’ model systems. Neuron. 65, 780-794 (2010).
- Rittschof, C. C., Robinson, G. E. Genomics: moving behavioural ecology beyond the phenotypic gambit. Animal Behaviour. 92, 263-270 (2014).
- Fernandez, R. W., et al. Straightforward assay for quantification of social avoidance in Drosophila melanogaster. JoVE. (94), e52011 (2014).
- Hahn, N., et al. Monogenic heritable autism gene neuroligin impacts Drosophila. social behaviour. Behav Brain Res. 252, 450-457 (2013).
- Mogilner, A., Edelstein-Keshet, L., Bent, L., Spiros, A. Mutual interactions, potentials, and individual distance in a social aggregation. J Math Biol. 47, 353-389 (2003).
- Liu, L., Davis, R. L., Roman, G. Exploratory activity in Drosophila requires the kurtz nonvisual arrestin. Genetics. 175, 1197-1212 (2007).
- Soibam, B., et al. Open-field arena boundary is a primary object of exploration for Drosophila. Brain Behav. 2, 97-108 (2012).
- Ejima, A., Griffith, L. C. Ch. 30. Drosophila Neurobiology - A laboratory Manual., Ch. , Cold Spring Harbor Press. 475-481 (2010).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila melanogaster. isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Connolly, J. B., Tully, T. Drosophila: A practical approach. Roberts, D. B. 1, 2nd, IRL Press. 265-317 (1998).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299, 1407-1410 (2003).
- Rasband, W. S. ImageJ. , US National Institutes of Health. Maryland, U.S.A. (1997).
- Simon, A. F., et al. Drosophila, vesicular monoamine transporter mutants can adapt to reduced or eliminated vesicular stores of dopamine and serotonin. Genetics. 181, 525-541 (2009).
- Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila .dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. JoVE. (74), e50339 (2013).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila. models of neurodegeneration. JoVE. , e2504 (2011).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Simon, A. F., Liang, D. T., Krantz, D. E. Differential decline in behavioral performance of Drosophila melanogaster. with age. Mech Ageing Dev. 127, 647-650 (2006).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. JoVE. , (2015).
- Fernandez, R. W., Akinleye, A. A., Nurilov, M., Rouzyi, Z., Simon, A. F. 54th Annual Drosophila Research Conference, Washinton D.C., , (2013).
- Suh, G. S. B., et al. A single population of olfactory sensory neurons mediates an innate avoidance behaviour in Drosophila. Nature. 431, 854-859 (2004).
- Helfrich-Förster, C. Differential control of morning and evening components in the activity rhythm of Drosophila melanogaster.--Sex-specific differences suggest a different quality of activity. J. Biol. Rhythms. 15, 135-154 (2000).
- Fujii, S., Krishnan, P., Hardin, P. E., Amrein, H. Nocturnal male sex drive in Drosophila. Curr Biol. 17, 244-251 (2007).
- Pellegrino, A. C., et al. Weather forecasting by insects: modified sexual behaviour in response to atmospheric pressure changes. PLoS One. 8, e75004 (2013).
