Introduction
Behandling for smittsomme sykdommer har vært komplisert av den raske økningen i multiresistente bakterier som er immune mot et bredt utvalg av antibiotika 1. Med høy sykelighet og dødelighet fra resistente bakterier-mediert infeksjoner, er det behov for å trappe opp stoffet utviklingsprosesser og / eller utforske bedre anti-bakterielle alternativer for å bedre behandlingsalternativer. I det siste, er det anti-virulens tilnærming økende interesse gitt sitt potensial i å forebygge virulens via non bakteriedrepende metoder, derav dempe risikoen for resistensmekanismer 2.
Quorum-sensing er en "hovedbryter" i bakteriell virulens og forstyrrelse av dette signale fenomenet er en lovende anti-virulens metode mot patogenesen tre. Utbruddet av virulens krever opphopning av beslutningsdyktighet molekyler i den ekstracellulære miljøet etter en kritisk bakteriell befolkningstetthet er nådd. Som quorum molekylene diffunderer inn i intracellulær matriks, binding med deres beslektede reseptorer fører til aktivering av virulensfaktorer, så vel som gener som er assosiert med resistens og biofilmdannelse 4. Generelt quorum-sensing avbrudd innebærer hemme quorum molekyl og reseptorinteraksjon uten å påvirke primær stoffskifte. Derfor betyr det ikke har noen direkte implikasjon på cellevekst. Siden fitness ikke blir redusert, det er minimal seleksjonspress for bakterier å utvikle seg og få motstand mot slike behandlinger 5. I tillegg kan quorum-sensing avbrudd forstyrre iboende bakterielle beskyttende mekanismer, som i tilfelle av biofilmdannelse, som gir beskyttelse mot antibakterielle midler og vertsimmunresponser.
Det er anslått at 99% av mikrober på jorden eksisterer i komplekse biofilm-lignende matriser, overdragelse avgjørende overlevelses fordeler til de mikroorganismer som lever innenfor thESE strukturer 6. Enda viktigere, er dannelsen av disse fastsittende domener årsaken mest vedvarende og kroniske sykehusinfeksjoner 7. Acinetobacter baumannii er en av de store menneskelige patogener som er knyttet til globale sykehusinfeksjoner og dens virulens er i stor grad tilskrives quorum-sensing -mediert biofilmdannelse 8. Quorum lukk enzymer har blitt brukt med hell i forstyrre quorum-mediert signaloverføring ved å målrette en gruppe forbindelser som kalles N-acyl homoserin laktonene (Ahls) som er produsert av Gram-negative bakterier 9. Flere studier har også utvidet ved anvendelse av disse enzymer for å blokkere bakteriell patogenesen gjennom reduksjon av virulens faktor ekspresjon og celletall i biofilmer 10,11. Dessverre, er det fortsatt en mangel på følbar demonstrasjon av en effektiv bruk av quorumsprinsipper lukkende enzymer mot biofilmdannelse av bakterielle patogener. Dere har vært forsøk på å bruke beslutningsdyktighet hemmere (AHL analoger), i stedet for beslutningsdyktighet lukk enzymer, for å forstyrre A. baumannii biofilmdannelse 12. Selv om denne fremgangsmåte for anvendelse av små molekyler inhibitorer er en gyldig tilnærming, kan opprettholde dens biotilgjengelighet i translasjonelle anvendelser være en utfordring. Tvert imot, kan bruken av katalytiske quorumsprinsipper lukkende enzymer omgå problemet biotilgjengelighet som enzymer er mer mottagelig mot immobilisering på overflatene av biomedisinske innretninger for terapeutiske effekter.
Her beskriver vi en vurdering av effektene av konstruerte beslutningsdyktighet lukk lactonases fra Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 på bakteriell biofilmdannelse, ved hjelp av krystallfiolett farging og konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM). Denne studien er den første vellykkede demonstrasjon av biofilm avbrudd i en klinisk relevant A. baumannii S1 belastning ved hjelp beslutningsdyktighet lukk enzymer. Metodene som beskrivesi denne studien er nyttige for å vurdere effekten av andre beslutningsdyktighet lukk enzymer i senere terapeutiske utviklingsarbeid mot patogene Gram-negative bakterier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Crystal Violet Kvantifisering av biofilmdannelse i A. baumannii S1
- Dyrk en 5 ml kultur av A. baumannii S1 i lysogeni buljong (LB) (trypton 10 g / l, gjærekstrakt 5 g / l) ved 30 ° C i en rysteinkubator (220 opm) i 16 timer.
- Juster kultur A. baumannii S1 til en ønsket OD 600 på 0,8. Ved hjelp av en 96-brønns plate, inokulere bakteriekultur (1: 100 fortynning) i friskt LB inneholdende 10 ul renset GKL enzym (40 mg / ml); den nye kulturen endelige volum er 100 pl.
- Utarbeide en kontrollkultur i tillegg; dette vil ikke inneholde noen av enzymene. Gjenta lignende forhold for å gi det ønskede antall replikater.
- Dekk platen med et lokk og sett den i en forseglet 10 L plastbeholder. Inkuber platen ved 30 ° C i 3 timer før fjerning forsiktig media.
- Legge til ytterligere 100 ul friskt LB medium til brønnen og platen inkuberes i 21 timer ved 30 ° C. Etter den andre inkubasjonsperiode, fjern forsiktig alle medier. Vask de planktoniske bakterier cellen med 200 ul sterilt vann. Sørg for at det er bare minimal forstyrrelse for cellene under vask.
- Tilsett 100 ul av 1% krystallfiolett-oppløsning til hver brønn og inkuber i 15 min ved RT. Fjerne krystallfiolett oppløsning ved vasking av brønnen med 200 ul sterilt vann. Gjenta vaskingen to ganger til.
- Tilsett 100 ul 33% eddiksyre til hver brønn og inkuber i 15 minutter med forsiktig risting; dette vil oppløse fargestoff.
- Kvantitere mengden av biofilm som dannes ved å måle absorbansen av krystallfiolett ved 600 nm. Mengden av krystallfiolett er proporsjonal med mengden av biofilm dannet.
2. Confocal Laser Scanning Mikroskopi av A. baumannii S1 Biofilm
- Dyrk en 5 ml kultur av A. baumannii S1 i LB ved 30 ° C i en rysteinkubator (220 opm) i 16 timer.
- Adbare kultur av A. baumannii S1 til en ønsket OD 600 på 0,8. Ved hjelp av en 35 mm glass-bunn μ-antenne, inokulere bakteriekultur (1: 100 fortynning) i friskt LB inneholdende 30 pl av renset GKL enzym (40 mg / ml); den nye kulturen endelige volum er 1 ml.
- Dekk til μ-Dish med lokk og legg den i en forseglet 10 L plastbeholder. Inkuber μ-oppvask ved 30 ° C i 3 timer før du tar det forsiktig media. Tilsett 30 ul renset GKL enzym og friskt medium, og bringer den til et totalt volum på 1 ml. Inkuber i ytterligere 21 timer ved 30 ° C.
- Gjenta trinn 2,3 og inkuber μ-oppvask i ytterligere 24 timer ved 30 ° C. Deretter fjerner mediet forsiktig.
- Legge til 500 ul av 5 ug / ml Alex Fluo 488-konjugert hvetekim agglutinin (WGA) oppløst i Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS) til μ-antenne og inkuber ved 37 ° C i 30 min; dette vil farge det dannet biofilm. Fjerne flekker løsningen og vask than u-oppvask med 2 ml HBSS. Gjenta vasketrinn en gang til.
- Legg 500 mL av 3,7% formaldehyd oppløst i HBSS og inkuber ved 37 ° C i 30 min; dette vil fikse biofilm på μ-oppvask. Vask μ-Dish gang med 2 ml HBSS og deretter fjerne den løsningen helt. Den μ-oppvask fiksert med biofilm kan lagres i mørke ved 4 ° C før CLSM avbildning.
- For CLSM bildebehandling og analyse, bruker 63 ganger forstørrelse til å generere 97 stabler per bilde med et intervall på 0,21 mikrometer per stack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I krystallfiolett kvantifisering eksperiment ble to beslutningsdyktighet lukk enzymer som brukes til å demonstrere gjennomførbarheten i forstyrre biofilmdannelse: villtype GKL og en forbedret GKL dobbel mutant (E101G / R230C). Begge enzymer er blitt vist å demonstrere lactonase aktivitet mot tre-hydroksy-dekanoyl-L-homoserin-lakton (3-OH-C 10 -HSL), som utgjør hovedbeslutningsdyktig molekylet brukt av A. baumannii S1 14. For gyldig vurdering av biofilm avbrudd, ble deres respektive katalytisk inaktive enzymer (tidligere vist seg å ikke beslaglegge AHL ligander) også inkludert som umiddelbare kontroller (GKL D266N mutant og GKL E101G / R230C / D266N mutant). Foruten ved hjelp av villtype A. baumannii S1, biofilm danner muligheten for en mutant Δ Abai stamme (AHL-syntase-manglende) ble også testet. Begge beslutningsdyktighet lukk enzymer, villtype GKL og GKL E101G / R230C mutant var i stand til å redusere biofilmdannelse i prebehandlet A. baumannii S1 kulturer (n = 10, p-verdi ≤ 0,0001) (figur 1). Ikke desto mindre er graden av biofilm avbrudd for begge enzymene ikke proporsjonal med deres effekt mot 3-OH-C 10 -HSL. Omløpshastighet (k katt) av GKL E101G / R230C mutant er seks ganger raskere enn villtype GKL mot 3-OH-C 10 -HSL 14. Imidlertid er forskjellen i graden av biofilm avbrudd mellom enzymene er bare to ganger.
Figur 1. A. baumannii biofilm avbrudd assay. biofilmdannelse ble målt ved krystallfiolett farging. Røde søylene representerer mengden av biofilm er dannet av villtype A. baumannii og Δ Abai mutant, uten tilsetning av beslutningsdyktighet lukk lactonases. Blå søylene representerer amount av biofilm er dannet av villtype A. baumannii i nærvær av fire forskjellige GKL enzymer: inaktivt GKL D266N mutant, vill-type GKL, inaktive GKL E101G / R230C / D266N mutant og GKL E101G / R230C mutant. ****, P- verdi på ≤ 0,0001. Gjengitt med tillatelse fra Antimicrobial Agents and Chemotherapy 58, 1802-1805 (2014). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Confocal avbildning av A. baumannii S1 biofilmdannelse ble anvendt for å tilveiebringe et kvalitativt og kvantitativt mål for quorumsprinsipper lukkende effekt på den strukturelle morfologien til disse fastsittende domenene. Den forbedrede GKL E101G / R230C mutant og dens katalytisk inaktive enzym ble brukt for sammenligning. Differensial bilde kontrast (DIC) bilde viste at behandling med den forbedrede GKL E101G / R230C mutant resulterte i en nedgang i biofilm størrelse (Figure 2). Analyse av fluorescens bilder viser også at det var reduksjonen i overflateareal, biomasse og gjennomsnittlig tykkelse på biofilm når de behandles med de forbedrede GKL E101G / R230C mutant (tabell 1).
Figur 2. Representant konfokal laser scanning mikroskopi bilder av A. baumannii biofilm. A. baumannii biofilm ble behandlet med inaktive GKL E101G / R230C / D266N mutant (A) og GKL E101G / R230C mutant (B) og farget med Alexa Fluor 488-konjugert WGA. DIC bilder av biofilm (til venstre) og fluorescens bilder av biofilm (til høyre) er vist for representative xy (i midten), YZ (til høyre), og XZ (nederst) seksjoner. Gjengitt med tillatelse fra Antimicrobial Agents and Chemotherapy <strong> 58, 1802 til 1805 (2014). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Verdi ± SD en | |||
| Karakteristisk | Ingen behandling | Behandling med inaktive mutant | Behandling med E101G / R230C mutant |
| Biomasse (mikrometer 3 / mikrometer 2) | 2,57 ± 1,65 | 3.39 ± 1.33 | 1,37 ** ± 0,20 |
| Gjennomsnittlig tykkelse (mikrometer) | 3,68 ± 2,51 | 3.41 ± 1.31 | 1.21 ** ± 0,21 |
| Overflateareal (um) | 235,920.59 ± 79,456.46 | 209,872.6 ± 115,094.7 | 115,354.9 * ± 7,630.3 |
| a n = 10 bildestakker. **, P ≤ 0,001; *, P ≤ 0,05, sammenlignet med behandling med inaktive E101G / R230C / D266N mutant. | |||
Tabell 1. A. baumannii biofilm strukturelle kvantifisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I begge sett av forsøk, A. baumannii S1 ble dyrket i LB-medium uten NaCl som en høykonsentrert salt kan redusere mengden av biofilm som dannes av bakterier 15. Tilstedeværelsen av en slik gjenstand kan under mengden av biofilm er dannet, så vel som effektene av quorumsprinsipper lukkende enzymer på tvers av forskjellige behandlingsforhold. Anvendelsen av et katalytisk inaktivt enzym som er viktig som en negativ kontroll for å eliminere mulige effekter av enzymbinding. Figur 1 viser at selv om inaktive enzymer sekvestrerer quorumsprinsipper molekyler, er biofilmdannelse ikke forstyrres.
A. baumannii S1 danner en delikat ringlignende biofilm forholdet mellom luft og væske-grenseflate i brønnen av 96-brønns plate. Derfor er det viktig å unngå overdreven uro under medie fjerning og vaske tiltak for å hindre tilfeldig fjerning av bakterielle biofilmer. LB-medium ble fjernet etter hver inkubasjon ieliminere planktoniske celler. I tillegg ble 96-brønns plate plassert i en 10 l plastbeholder for å redusere forstyrrelser i luftstrømmen, og for å lage et mikro anaerobt miljø som favoriserer dannelse av biofilm. Biofilm kvantifisering i en 96-brønns plate er også avhengig av mengden av krystallfiolett tilsatt til hver brønn. I det tilfelle at overskytende krystallfiolett tilsettes i en brønn, kan antall vasketrinn økes. Den krystallfiolett farging eksperiment gir en relativ sammenligning av quorum-slukke effektivitet i biofilm avbrudd. Selv om krystallfiolett farging er kvantitativt for måling av biofilmdannelse, er det bare semi-kvantitativt i forhold til den katalytiske effektiviteten av quorumsprinsipper lukkende enzymer. For nøyaktig statistisk sammenligning tilstrekkelig utvalgsstørrelsene er viktig for de ulike behandlingsgruppene. Uteliggere bør også fjernes for å unngå feiltolkning av resultater.
Confocal bildebehandling og analyse av bakteriell biofilm er en useful verktøy for å vurdere de kvalitative effektene av beslutningsdyktighet lukk enzymer. Imidlertid kan prosessen med å velge biofilm for analyse være en potensiell kanal for skjevhet hvis brukeren er klar over hvilken type beslutningsdyktig lukk enzym administrert (aktiv eller inaktiv). For å unngå muligheten for bias, kan forsøket være utformet for å utelukke enzym informasjon fra brukeren, eller bruke en tilfeldig tilnærming for utvalget. Et objektivt utvalg strategi gjør også bedre kvantitativ sammenligning av biofilm morfologi av CLSM. Likevel, dette er den første studien som beskriver en metode for å vurdere utfallet av beslutningsdyktighet lukk enzymer på bakterie- biofilm. Krystallfiolett farging har demonstrert nytten av quorumsprinsipper lukkende enzymer i biofilm avbrudd og avslørte at enzymene 'modi operandorum ikke er begrenset til å redusere celletall og virulens faktor uttrykk. I mellomtiden kan morfologiske endringer bestemt av CLSM analyse også gi innsikt i mulig molecular mål av disse enzymene. Selv om den nåværende eksperiment ble utformet for å undersøke virkningene av enzymene forbehandling på bakterielle biofilmer, kan protokollen bli modifisert for å vurdere enzymets virkning på forhånd dannet biofilm ved tilsetning av enzymet etter bakterievekst eller for å undersøke dens kompetanse under fysiologiske betingelser ved bruk av serum -lignende forhold for kultur. Protokollen som brukes til å studere GKL enzymer kan bli utvidet til andre beslutningsdyktighet lukk enzymer og patogener for å undersøke forholdet deres i biofilm avbrudd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | BD | 211705 | |
| Yeast Extract | BD | 212750 | |
| 96-well plate | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acetic Acid | Lab-Scan | PLA00654X | Caution: Flammable |
| μ-Dish | Ibidi | 80136 | |
| Alex Fluo 488-conjugated WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank’s balanced salt solution | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Caution: Corrosive |
| Synergy HT Microplate Reader | BioTek | ||
| 1X-81 Inverted Fluorescence Microscope | Olympus |
References
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
- LaSarre, B., Federle, M. J. Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).
- Waters, C. M., Bassler, B. L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).
- Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).
- Lazar, V. Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power? Anaerobe. 17, 280-285 (2011).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Perez, F., et al. Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).
- Tay, S. B., Yew, W. S. Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens. International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).
- Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. Quorum Sensing. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).
- Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing. Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).
- Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones. ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).
- Chow, J. Y., et al. Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily. The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).
- Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).
- Pour, N. K., et al. Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters. FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).
