Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

من التركيبات لبلورات - نحو تحديد هيكل β برميل الخارجي بروتينات الغشاء

Published: July 4, 2016 doi: 10.3791/53245
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 2,3, 2
1Department of Biological Sciences, Markey Center for Structural Biology, Purdue University, 2National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, 3National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health

Introduction

β برميل خطط إدارة لا يمكن العثور عليها في الأغشية الخارجية للالميتوكوندريا، البلاستيدات الخضراء، والبكتيريا سالبة الجرام 1-3. في حين أنها تخدم أدوار مماثلة لالبروتينات α حلزونية، لديهم أضعاف مختلفة جدا تتكون من مجال β برميل جزءا لا يتجزأ من غشاء المركزي تتراوح 8-26 مكافحة موازية β-خيوط مع كل حبلا يجري يرتبط ارتباطا وثيقا لاثنين من فروع المجاورة (الشكلان 1 و 2). فروع الأولى والأخيرة في المجال β برميل ثم تتفاعل مع بعضها البعض، على وجه الحصر تقريبا بطريقة مضادة للالموازي (باستثناء VDAC الميتوكوندريا) ليغلق وختم المجال β برميل من الغشاء المحيط. جميع خطط إدارة β برميل لها حلقات الخلية متفاوتة تسلسل وطول والتي تلعب دورا مهما في التفاعلات يجند و / أو الاتصالات البروتين البروتين، مع هذه الحلقات يجري أحيانا كبيرة مثل 75 المخلفات، مثل الموجودة في نيسري ترانسفيرين ملزمة للمحترفينالبروتين ألف (TbpA) 4. β برميل خطط إدارة يمكن أن يكون أيضا ملحقات محيط بالجبلة N-الطرفية أو C-المحطة التي تخدم المجالات كما إضافية لغرض وظيفي البروتين (على سبيل المثال، باما 5-7، FimD 8،9، فضل 10). بينما العديد من أنواع خطط إدارة β برميل وجود 11، موصوفة اثنين من الأنواع الأكثر شيوعا أدناه كأمثلة لهذه أقل معرفة الميدان، (1) النقل تعتمد-طنب و (2) شاحنة نقل سيارات شاحنة.

النقل طنب التي تعتمد على (على سبيل المثال، FEPA، TbpA، BtuB، سي آي آر، وما إلى ذلك) ضرورية لاستيراد المواد الغذائية وتحتوي على مجال المكونات N-المحطة تتكون من 150 ~ المخلفات التي تم العثور عليها مدسوس داخل 22 الذين تقطعت بهم السبل C-محطة β- نطاق برميل جزءا لا يتجزأ في الغشاء الخارجي 12 (الشكل 3). بينما يمنع هذا مجال المكونات الركيزة من يمر بحرية من خلال المجال برميل، الركيزة ملزمة يؤدي الى تغيير متعلق بتكوين ضمن المجال المكونات عشرفي يؤدي إلى مسام تشكيل (إما عن طريق قابس إعادة ترتيب أو الجزئي / طرد الكامل من المكونات) التي يمكن بعد ذلك تسهيل النقل الركيزة عبر الغشاء الخارجي في الجبلة المحيطية. النقل تعتمد-طنب ذات أهمية خاصة لبقاء بعض السلالات المسببة للأمراض من البكتيريا سالبة الجرام مثل النيسرية السحائية التي تطورت النقل المتخصصة التي اختطاف العناصر الغذائية مثل الحديد مباشرة من البروتينات المضيف الإنسان 4،13،14.

شاحنة نقل سيارات شاحنة تنتمي إلى نوع V نظام إفراز سلبية الغرام البكتيريا وهي خطط إدارة بيتا برميل التي تتكون من مجال β برميل (عادة 12 جدائل كما هو الحال مع تهت وEspP) ومجال نقل الركاب التي إما يفرز أو قدمت في سطح الخلية 15،16 (الشكل 3). هذه خطط إدارة β برميل غالبا ما تكون أدوارا هامة في بقاء الخلية والفوعة مع المجال الركاب التي تخدم إما الأنزيم البروتيني، adhesin، و / أو EF الآخرينfector التي تتوسط المرضية.

الطرق الهيكلية مثل البلورات بالأشعة السينية، مطيافية الرنين النووي المغناطيسي، والمجهر الإلكتروني (EM) تسمح لنا لتحديد نماذج لخطط إدارة المكاتب في قرار الذري والتي يمكن بدورها أن تستخدم لفك بالضبط كيفية عملها داخل الغشاء الخارجي. ومن ثم يمكن استخدام هذه المعلومات لا تقدر بثمن لمكافحة المخدرات وتطوير اللقاحات وجدت. على سبيل المثال، وجدت ترانسفيرين بروتين ملزمة ألف (TbpA) على سطح لبكتيريا ومطلوب لالمرضية لأنه يربط مباشرة ترانسفيرين الإنسان، ثم يستخرج واردات الحديد لبقائها. دون TbpA، النيسرية لا يمكن مسح الحديد من المضيف البشري ويتم تقديمها غير المسببة للأمراض. بعد أن تم حلها التركيب البلوري للترانسفيرين الإنسان بد أن TbpA 4، أصبح أكثر وضوحا كيف ترتبط اثنين من البروتينات، ما من مناطق TbpA بوساطة التفاعل، ما البقايا كانت مهمة لاستخراج الحديد من قبل TbpA، وكيف يمكن للمرء أن تطوير علاجات ضد النيسرية تستهدف TbpA. لذلك، نظرا لأهمية خطط إدارة المكاتب β برميل في البكتيريا سالبة الجرام من أجل البقاء والمرضية، وكذلك في الميتوكوندريا وظيفة بلاستيدات الخضراء، والحاجة للحصول على معلومات هيكلية إضافية حول هذه الفئة فريدة من بروتينات الغشاء والنظم التي تعمل بها ، يتم عرض بروتوكولات العامة مع الهدف العام للتعبير عن وتنقية خطط إدارة الهدف عند مستويات مرتفعة لتوصيف بالطرق الهيكلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الاستنساخ والتعبير

ملاحظة: لتمكين الدراسات الهيكلية، كميات كافية من البروتين عالي النقاء يجب أن يكون مستعدا، وهذا يبدأ عادة مع الاستنساخ وoverexpression من البروتين الهدف β برميل الغشاء الخارجي (إم بي) في E. القولونية (الشكل 4). حتى الآن، كل الهياكل المرصد المغربي للسجون بيتا برميل، بما في ذلك تلك الهياكل لVDAC الميتوكوندريا، وقد استمدت من البروتين أعرب البكتريا 11. هنا، يتم عرض بروتوكولات العامة للالاستنساخ والتعبير عن خطط إدارة بيتا لبرميل (1) التعبير الأصلي مباشرة إلى الأغشية البكتيرية و(2) التعبير إلى الهيئات الادراج لفي المختبر refolding 17.

  1. تصميم تعبيد التعبير
    1. الحصول على أو شراء كودون الأمثل الجينات المرصد المغربي للسجون الهدف.
    2. شراء أو الحصول على ناقلات التعبير T7 (ط) يحتوي على محيط بالجبلة تسلسل إشارة توطين، و-6X الحامض الاميني العلامة-N محطة،وموقع الأنزيم البروتيني TEV 4،18،19 في الجسم الحي التعبير عن غشاء أو (ب) دون تسلسل إشارة توطين محيط بالجبلة للتعبير للهيئات إدراج عليها في المختبر refolding.
      ملاحظة: إن البروتيني N-محطة شطورة العلامة 6X 10X أو الحامض الاميني من شأنه أن يوفر وسيلة سهلة لتنقية. كما هو الحال مع البروتينات القابلة للذوبان، تختلف اختيار العلامة تقارب (الحامض الأميني، بكتيريا، ضريبة السلع والخدمات، وما إلى ذلك)، والموقف من علامة تقارب، وإدراج موقع البروتيني (TEV، إنتيروكيناز، الثرومبين، الخ) لإزالة العلامة اللاحقة .
    3. PCR تضخيم التسلسل المستهدف مع الاشعال وsubclone المناسبة في ناقلات التعبير. استخدام ربط استنساخ المستقلة (LIC) 20،21 أو التقليدية تقنيات الاستنساخ (تقييد الانزيمات / ربط) لاستنساخ فرعي. ومع ذلك، يمكن LIC تسهيل إنتاجية عالية، والسماح لعدد كبير من مختلف بنيات (truncations، مجموعة متنوعة من العلامات، ومجموعة متنوعة من المروجين) المراد استنساخه في موازاة أكثربسهولة.
  2. في التعبير المستهدفة غشاء فيفو
    1. استخدام تحليل تسلسل للتحقق من الهدف β برميل يتم استنساخ المرصد المغربي للسجون المصب وفي الإطار مع تسلسل إشارة (أي pelB، OmpA) في بناء التعبير.
      ملاحظة: تسلسل إشارة يوجه سلسلة الوليدة إلى translocon ثانية لإفراز إلى الجبلة المحيطية والتجمع لاحقا في الغشاء الخارجي.
    2. تحويل بناء إلى سلالة التعبير من البكتيريا للتعبير من قبل pipetting 1.0 ميكرولتر من البلازميد إلى 50 ميكرولتر من BL21 (DE3) الخلايا المختصة كيميائيا والمزيج بلطف pipetting صعودا وهبوطا. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    3. نبض الحرارة في 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية باستخدام حمام مائي ثم وضع مرة أخرى على الجليد لمدة 1 دقيقة.
    4. إضافة 1 مل من وسائل الاعلام SOC استعد مسبقا ويهز في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في 1000 دورة في الدقيقة باستخدام حاضنة الفوق شاكر.
    5. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا على لوحات أجار LB تحتوي على antibiot المناسبةجيم واحتضان مقلوب ليلا 37 درجة مئوية.
    6. إجراء اختبارات التعبير على نطاق صغير، فحقن 5 مل LB + ثقافة المضادات الحيوية مع مستعمرة واحدة. كرر لمدة 5-10 المستعمرات.
      ملاحظة: بسبب السمية المحتملة للمرصد المغربي للسجون β برميل والاعتماد على مستويات التعبير القاعدية، لوحظ التباين مستعمرة إلى مستعمرة في بعض الأحيان. لذلك، وفحص مستعمرات متعددة ينصح لكل بناء يجري اختبارها. للاختبارات على نطاق ضيق التعبير، بدلا من التقليدية 5 مل الثقافات، وتزايد 25 مل الثقافات في 125 مل حير قوارير مخروطي يقترح. هذه الظروف غالبا ما تعكس أفضل ما سيحدث في نمو واسع النطاق. بالإضافة إلى ذلك، انها فكرة جيدة لفحص أيضا أنواع مختلفة من وسائل الإعلام ثقافة (السل، LB، 2xYT، M9، وما إلى ذلك)، منذ تم الإبلاغ عن مستويات متفاوتة من النجاح يتوقف على البروتين الهدف.
      1. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية مع الهز إلى OD 600 من ~ 0.6.
      2. حمل تعبير عن المرصد المغربي للسجون الهدف عن طريق الإعلاندينغ 5 ميكرولتر من 1 M الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى كل أنبوب ثقافة وتسمح لتنمو 1-2 ساعة إضافية.
      3. مقارنة مستويات التعبير لجميع المستعمرات بواسطة الطرد المركزي 1 مل من كل ثقافة (OD 600 من ~ 0.6) لمدة 1 دقيقة في 15000 x ج باستخدام microcentrifuge ل.
      4. إزالة طاف و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من العازلة تحميل 1X SDS-PAGE. حرارة 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم الطرد المركزي مرة أخرى في 15000 x ج لمدة 5 دقائق.
      5. تحليل العينات باستخدام SDS-PAGE من قبل pipetting 20 ميكرولتر في كل بئر من مادة هلامية بنسبة 10٪. تشغيل هلام لمدة 35 دقيقة في ثابت 200 V.
        ملاحظة: سيكون من المفيد في هذه المرحلة لتكون قادرة على تحديد ما إذا كان يتم طيها بشكل صحيح الهدف البروتين أو لا. هذا كثيرا ما يمكن إنجازه عن طريق القيام التنقيات على نطاق صغير أو معايرة لmodifiability الحرارة.
    7. حدد مستعمرة تظهر أفضل تعبير وأداء التعبير على نطاق واسع باستخدام 12-24 L المتوسطة.
      ملاحظة: أساليب التقليدية عادة ما تنمو الثقافات في 37 درجة مئوية مع الهز إلى OD 600 من ~ 0.6 ومن ثم تحفز مع محفز المناسب (أي 0،1-1 ملم لIPTG أو ~ 0.2٪ لالارابينوز) ل4/2 ساعة إضافية . إذا رغبت في ذلك، قبل الاستقراء، والحد من درجة الحرارة إلى ما يصل الى 20 درجة مئوية، وتمديد الوقت الاستقراء.
      1. لطريقة التعبير المتسرب، وتنمو 25 مل تطعيم الثقافة في 37 درجة مئوية في LB المتوسط ​​تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (ق) حتى OD 600 تصل إلى ~ 0.6. ثم، إضافة 1 مل من تلقيح إلى اثني عشر 1 قوارير L السل المتوسطة بالإضافة إلى المضادات الحيوية (ق) وينمو بمعدل 20 درجة مئوية إلى التشبع (~ 3 أيام).
    8. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة.
    9. انتقل إلى القسم خطوة تنقية 2.1 أو تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل لتخزين طويل الأجل في -80 درجة مئوية.
  3. التعبير لهيئات إدراج لفي المختبر Refolدينغ
    1. استخدام تحليل تسلسل للتحقق من بناء التعبير لا يحتوي على تسلسل إشارة. وعدم وجود تسلسل إشارة مباشرة البروتين المستهدف لتتراكم في العصارة الخلوية عن الهيئات إدراج.
    2. تحويل بناء التعبير إلى سلالة التعبير من البكتيريا للتعبير. للتعبير عن الجسم إدراج، فمن الأفضل للسيطرة على التعبير من خلال الاستقراء (أي IPTG، أرابينوز، الخ) للحد من الآثار السمية المحتملة.
    3. لوحة 100 ميكرولتر من الخلايا تحولت على لوحات أجار LB التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة واحتضان ليلا 37 درجة مئوية مقلوب.
    4. إجراء اختبارات التعبير على نطاق صغير، فحقن 5 مل LB + ثقافة المضادات الحيوية مع مستعمرة واحدة.
    5. كرر 1.3.4 الخطوة 2-4 مستعمرات إضافية.
    6. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية مع الهز إلى OD 600 من ~ 0.6.
    7. حمل مع محفز مناسب لمدة 1-2 ساعة.
    8. مقارنة مستويات التعبير عن كل طنانه المستعمرات التحليل باستخدام SDS-PAGE (راجع الخطوة 1.2.6). حدد مستعمرة تظهر أفضل تعبير وأداء التعبير على نطاق واسع باستخدام 12-24 L المتوسطة.
      1. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية إلى OD 600 من 0،6-0،8 وتحفز على 37 درجة مئوية لمدة 3-5 ساعة. في حين أن التعبير للهيئات إدراج أكثر قوة من غيرها من أنواع التعبير، كما هو الحال مع جميع التجارب تعبير البروتين والتعبير يمكن تحسينها من خلال تغيير المتوسطة النمو، والوقت من الاستقراء، ودرجة الحرارة الاستقراء، وتركيز وكيل حمل.
    9. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة.
    10. انتقل إلى القسم خطوة تنقية 2.2 أو تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل لتخزين طويل الأجل في -80 درجة مئوية.

2. تنقية

  1. بمعزل عن غشاء الكسور
    ملاحظة: على النقيض من البروتينات القابلة للذوبان، هي جزء لا يتجزأ بروتينات الغشاء لا يتجزأ في طبقة ثنائية المادة الدهنية، وبالتاليتتطلب المنظفات لاستخراجها لمزيد من التنقية والتحليل (الشكل 5). وبعد التعبير، فإن الخطوة الأولى في عملية تنقية والمرصد المغربي للسجون β-برميل هو استخراج من الكسر غشاء.
    1. Resuspend الخلايا في تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgCl 2، 50 ميكروغرام / مل AEBSF، 5 ميكروغرام / مل الدناز الأول) في نسبة 5 مل / ز عجينة الخلية.
    2. ليز الخلايا باستخدام الصحافة الفرنسية أو الخالط الخلية. تدور الخلايا هي lysed في 15000 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا unlysed والحطام الخلية.
    3. طاف لنقل أنبوب نظيفة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى بسرعة عالية (200000 x ج) لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. بيليه الناتج هو جزء الغشاء الذي يحتوي على البروتين من الفائدة.
    4. يستخدم الخالط dounce، Resuspend وجزء الغشاء، ونقل أول الأغشية ثم إضافة عازلة الإذابة (50 ملي KH 2 PO 4 درجة الحموضة 7.5، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 20 ملي ايميدازول، ودرجة الحموضة 8.0) (50 مل لكل 20 خلايا ز) في تركيز 2X، دون المنظفات.
    5. صب الأغشية معلق في كوب صغير وإضافة المنظفات (أي، ن دوديسيل-β-D-مالتوزيد (DDM)، lauryldimethylamine-N-أكسيد (LDAO)، ن الأوكتيل-β-D-glucopyranoside (خطأ في مرماه)، تريتون X-100، الخ) ببطء إلى التركيز النهائي من ~ 10X تركيز مذيلة الحرج (CMC).
    6. ملء مع الماء حتى تركيز النهائي من العازلة 1X الإذابة. يحرك المزيج لمدة 0،5 حتي 16 ساعة على 4 درجات مئوية، وهذا يتوقف على مدى سهولة استخراج البروتين الهدف من الأغشية.
      ملاحظة: يتم استخدام المنظفات لإذابة ببطء الأغشية لاستخراج البروتين المستهدف. هناك 3 أنواع من المنظفات التي يمكن استخدامها هنا: الأيونية (SDS، حمض deoxycholic)، غير الأيونية (Elugent، توين، تريتون X-100، OG، DDM)، وzwitterionic (LDAO، CHAPS). وهناك بروتين معقد المنظفات التي هي مستقرة وmonodisperse خلال خطوة تنقية تساعد إلى حد كبير في نجاح crystallizat بروتين الغشاءأيون. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات حول وسائل التنظيف وممتلكاتهم والمعلومات العسكرية المركزية، واستخدامها في تنقية البروتينات الغشاء وغيرها من التطبيقات على مواقع المورد التجارية.
    7. أجهزة الطرد المركزي لعينة بالفاعلات في 300000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. يحتوي طاف الآن الهدف β برميل المرصد المغربي للسجون المنظفات بالفاعلات.
    8. المضي قدما في القسم 2.3 كما هو مبين أدناه.
  2. Refolding من الهيئات إدراج
    ملاحظة: لفي المختبر refolding، الهدف β برميل وأعرب المرصد المغربي للسجون مباشرة إلى الهيئات إدراج. ميزة واحدة هنا هي أن هذه البروتينات يمكن أن تنتج عند مستويات مرتفعة. ولكن العيب هو أن refolding في كثير من الأحيان غير فعالة ويختلف من تجربة refolding واحدة إلى أخرى. ومع ذلك، هناك العديد من الأمثلة على البروتينات التي تم refolded بنجاح للدراسات الهيكلية. وبعد التعبير إلى الهيئات إدراج، يجب على المرء الآن عزل الهيئات إدراج لrefolding التجربةالصورة.
    1. Resuspend الخلايا في تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgCl 2، 50 ميكروغرام / مل AEBSF، 5 ميكروغرام / مل الدناز الأول، 4 مم 2-المركابتويثانول (BME)) (5 مل لكل ز عجينة الخلية). ليز باستخدام الصحافة، صوتنة، أو الخالط خلية الفرنسي.
    2. بيليه الهيئات الاحتواء من خلال سرعة دوران منخفضة في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    3. غسل الهيئات إدراج عن طريق إعادة التعليق في 25 مل من 1.0 M اليوريا باستخدام الخالط dounce. بيليه مرة أخرى عن طريق سرعة دوران منخفضة في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    4. كرر الخطوة 2.2.3 عند الضرورة.
    5. Resuspend والهيئات إدراج غسلها إلى تركيز النهائي من 10 ملغ / مل باستخدام العازلة التي تحتوي على 8.0 M اليوريا (أو 6.0 M guanidinium هيدروكلوريد (GdCl))، بالإضافة إلى المنظفات (أي DDM أو LDAO) في 2X CMC أو أعلى.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، على سبيل أهداف بروتين الغشاء يحتوي على علامة الحامض الأميني، يجمد المعادن تقارب اللوني تنقية (ايماك) يمكن تنفيذها باستخدام تغيير طبيعة التعاونnditions (في 8.0 M اليوريا أو 6.0 M GdCl) كخطوة أولية مماثلة لتلك المبينة أدناه في القسم 2.3.
    6. إجراء رد فعل refolding التي كتبها ببطء (بين عشية وضحاها) إزالة ممسخ من قبل غسيل الكلى في المخزن تفتقر إلى ممسخ.
      ملاحظة: قد يستغرق عدة تغييرات المخزن المؤقت لغسيل الكلى لتحقيق ذلك. بدلا من ذلك، إذا لا بد الهيئات إدراج أول من عمود إيماك، يمكن للمرء القيام به رد فعل refolding في حين لا تزال متجهة إلى العمود عن طريق تبادل مخازن ببطء لإزالة ممسخ. في كلتا الحالتين، أن نتذكر أن هذا هو بروتين الغشاء، ولذلك يجب أن يكون المنظفات الحالي لتحقيق الاستقرار في الهدف. أيضا، إذا المنظفات المستخدمة هو dialyzable، فإنه يجب أن تضاف إلى المخزن المؤقت لغسيل الكلى (ق) كذلك.
    7. تدور العينات refolded في 200000 x ج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. وطاف يحتوي على refolded المنظفات بالفاعلات الهدف β برميل المرصد المغربي للسجون.
    8. المضي قدما في القسم 2.3 كما هو مبين أدناه.
  3. تنقية باستخدام أناMAC، التبادل الأيوني، وجل الترشيح
    ملاحظة: يتم تنفيذ افتراض أن البروتين قد تم تصميمها مع علامة الحامض الأميني، سواء كانت صريحة أصلا أو refolded باستخدام الأساليب في المختبر، ثم يجمد اللوني المعادن تقارب (ايماك) لتنقية يشبه إلى حد كبير لالحامض الأميني الموسومة بروتينات قابلة للذوبان، باستثناء يجب أن تبقى المنظفات في جميع مخازن لاحقة للحفاظ على المرصد المغربي للسجون الهدف β برميل بالفاعلات ومستقر.
    1. إعداد عمود مل ايماك 1-5 أو استخدام عمود prepacked. تنفيذ الخطوات اللاحقة اللوني في 4 درجات مئوية. مطاردة مع الماء لإزالة أي آثار للمواد حافظة. في حالة استخدام نظام تنقية الآلي، وتثبيت العمود وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. إعداد 500 مل من ايماك العازلة ألف (50 ملي K 2 هبو 4، ودرجة الحموضة 7.5، 200 مم كلوريد الصوديوم، 0.1٪ DDM) و 250 مل من ايماك B الاحتياطي (50 ملي K 2 هبو 4، ودرجة الحموضة 7.5، 200 مم كلوريد الصوديوم، 0.1٪ DDM، و 1.0 M ايميدازول).
      ملاحظة: المنظفات الأخرى التي يمكن استخدامها طNCLUDE Cymal-6 (0.05٪)، تريتون X-100 (0.03٪)، وLDAO (0.05٪).
    3. تتوازن العمود إيماك باستخدام 10 مجلدات عمود من ايماك ألف الاحتياطي
    4. إضافة ايميدازول على عينة البروتين إلى تركيز النهائي من 25 ملم والمزيج. تحميل العينة على العمود إيماك معايرتها في 2 مل / دقيقة. جمع التدفق من خلال.
    5. غسل العمود إيماك مع 5 مجلدات عمود كل زيادة تركيزات ايميدازول باستخدام B الاحتياطي (أي 25 ملم، 50 ملم، 100 ملم). جمع يغسل في 2 مل الكسور.
    6. أزل العينة مع تركيز النهائي من 250 ملي لمدة 5 مجلدات العمود. جمع العينة مزال في 2 مل الكسور.
    7. تحليل التدفق من خلال كسور غسل وشطف الكسور باستخدام تحليل SDS-PAGE (انظر الخطوة 1.2.6) على أساس الامتصاصية الخاصة بهم عند 280 نانومتر. تجميع الكسور التي تحتوي المرصد المغربي للسجون الهدف β برميل كما تم التحقق منها من خلال تحليل SDS-PAGE.
    8. إزالة العلامة-6X الحامض الاميني بإضافة TEV البروتيني للعينة المجمعة (وفقالبروتوكول الشركة المصنعة) وتفرخ بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع هزاز لطيف.
    9. تحميل محلول العينة / البروتيني على عمود إيماك مرة أخرى للفصل بين الهدف β برميل المرصد المغربي للسجون (التدفق من خلال) من العلامات المشقوق وأي عينة uncleaved. وتدفق تحتوي من خلال عينة المشقوق تفتقر إلى العلامة.
      ملاحظة: وهذا من شأنه أيضا إزالة أي البروتيني مثل TEV-صاحب، التي لديها أيضا غير شطورة-6X الحامض الاميني العلامة نفسها. خلاف ذلك، سوف تكون هناك حاجة إلى أساليب أخرى لإزالة البروتيني بعد الهضم.
    10. اختياريا، نفذ التبادل الأيوني اللوني لمواصلة تنقية العينة. اتبع إرشادات الشركة المصنعة للعمود لاستخدامها، مع الحرص على تضمين مواد التنظيف في جميع المخازن.
    11. للتحضير لتبلور، تحميل العينة على عمود هلام الترشيح إلى العازلة التي تحتوي على المنظفات لاستخدامها في التبلور، مثل 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 200 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ OG.
    12. جمع 1 مل الكسور وتحليل باليودتحليل نانوغرام SDS-PAGE (انظر الخطوة 1.2.6) على أساس الامتصاصية الخاصة بهم عند 280 نانومتر. تجمع الكسور مع الامتصاصية في 280 نانومتر كما أنها تحتوي على البروتين الهدف. التركيز على ~ 10 ملغ / مل.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن تقدير للطي السليم باستخدام فحص modifiability الحرارة على النحو المبين أدناه.
  4. الحرارة Modifiability الفحص
    ملاحظة: أسلوب واحد لمراقبة قابلة للطي السليم النقي β برميل خطط إدارة هو لأداء فحوصات modifiability الحرارة باستخدام شبه الأم SDS-PAGE 22. هنا، سوف عينات القارسة التي يتم طيها بشكل صحيح تهاجر بشكل مختلف عن تلك التي التشويه والتحريف الحرارة. هذه الخاصية هي فريدة من نوعها لبيتا برميل خطط إدارة وتستخدم على نطاق واسع لدراسة هذه العائلة من البروتينات الغشاء.
    1. قبل إعداد العينات، تجميع جهاز هلام. للبدء، وضع خزان عازلة في دلو الجليد وتحيط تماما مع الثلج. إدراج المدلى بها في المنزل أو تجاري هلام التدرج الأصلي في حامل وتضع في خزان. ملء رانه خزان تماما مع 1X الباردة MES تشغيل العازلة (50 ملي 2- [N-morpholino] حامض ethanesulfonic، 50 ملي تريس قاعدة، 1 ملم EDTA، 0.1٪ SDS، ودرجة الحموضة 7.3).
    2. ماصة 0.25 ميكرولتر من العينة (10 ملغ / مل) في اثنين من 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. تسمية واحدة باسم "المغلي" والآخر باسم "RT".
    3. إضافة 9.75 ميكرولتر من عينة العازلة إلى كل ومزيج من قبل pipetting. إلى كل من العينات، إضافة 10 ميكرولتر من العازلة 2X SDS تحميل (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8 و 2٪ SDS، 0.2٪ برموفينول الأزرق، و 20٪ الجلسرين) وتخلط بلطف قبل pipetting.
    4. غلي "مسلوق" عينة على 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع ترك عينة "RT" على RT. تدور "مغلي" لفترة وجيزة عينة.
    5. تحميل 20 ميكرولتر من كل من العينات على هلام الأصلي مجمعة مسبقا. تشغيل لمدة 60 دقيقة في ثابت 150 خامسا إزالة هلام ونقع في حل تلطيخ لتصور النتائج.

3. بلورة

ملاحظة: للحصول على بلورة كلأهداف البروتين القابلة للذوبان وغشاء، هو بروتوكول قياسي لتحقيق أقصى قدر من نقاء العينة والاستقرار (أي أفضل المنظفات، بروابط، العوامل المساعدة، وما إلى ذلك). المنهجية الحالية لبلورة أهداف بروتين الغشاء بشكل عام تشمل ثلاثة مناهج الرئيسية التي تلبي متطلبات محبة للجهتين من البروتينات جزءا لا يتجزأ من طبقة ثنائية: (1) المنظفات، (2) bicelle، و (3) مرحلة مكعب شحمي (نظام الإجراءات الجزائية) (الشكل 6) 23. من المستحسن استخدام الروبوت نانولتر تبلور عندما يكون ذلك ممكنا من أجل زيادة عدد من الشروط التي يمكن فرزهم لحجم عينة معينة، وكذلك، وذلك باستخدام التطورات الحديثة في الأدوات التي تهدف لمساعدة تحديد هيكل (الشكل 7).

  1. تبلور باستخدام المنظفات
    1. الحصول على المنظفات بالفاعلات عينة البروتين الذي هو في ~ 10 ملغ / مل تركيز. اختياريا، إضافة المضافة 1،2،3-heptanetriol مباشرة إلى العينة إلى تركيز النهائي من 3٪ للحد من detergالأنف والحنجرة حجم مذيلة.
    2. تصفية العينة باستخدام فلتر الطرد المركزي 0.22 ميكرون لإزالة الجسيمات وهطول الأمطار.
    3. باستخدام الروبوت التبلور، نفذ اسعة بلورة مصفوفة فحص باستخدام المتاحة تجاريا 96 شاشات جيدا قبل أي شنقا أو الجلوس انخفاض طريقة تبخير مع قطرات تتكون من ~ 200 عينة بروتين نيكولا لانغ و~ 200 عازلة بلورة نيكولا لانغ.
    4. احتضان لوحات تبلور في ~ 21 درجة مئوية. تفقد لوحات الأسبوعية لنمو البلورات باستخدام مجهر تشريحي.
    5. تحسين يؤدي تبلور من قبل عناصر من حالة التبلور بطريقة منهجية مختلفة (زيادة / تقليل الملح أو تركيزات مرسب، درجة الحموضة عازلة، ودرجة الحرارة الحضانة، و / أو تركيز البروتين).
  2. تبلور طريق Bicelles
    ملاحظة: مظاهرة أكثر تفصيلا لتقنيات bicelle قد سبق وصفها Ujwal وأبرامسون 24.
    1. إعداد أو شراء 35٪ bicelle خليط يتكون من DMPC: CHAPSO بنسبة 2.8: 1 وفقا لبروتوكولات نشرت 25. ويمكن أيضا أن يعاير تركيزات الأخرى، وكذلك، وغيرها من الدهون والمنظفات، حسب الضرورة.
    2. الحصول على المنظفات بالفاعلات عينة البروتين الذي هو في ~ 10 ملغ / مل تركيز.
    3. يضاف خليط bicelle على الجليد، في نسبة ابتداء من 4: 1 ت / ت (البروتين: bicelle) (على سبيل المثال، إضافة 10 ميكرولتر من خليط bicelle إلى 40 ميكرولتر من البروتين وتخلط بسرعة قبل pipetting).
    4. احتضان على الجليد 30-60 دقيقة.
      ملاحظة: البروتين: حل bicelle ينبغي أن تظل واضحة في الغالب ولكن يمكن أن تتحول في كثير من الأحيان مبهمة قليلا. ومع ذلك، إذا كان البروتين: bicelle حل يتحول أبيض حليبي، وهطول الأمطار مبينا، ثم متغيرات أخرى ينبغي أن يعاير (أي، المنظفات، العازلة، وما إلى ذلك). للحصول على عينات جديدة، والقيام التجارب على نطاق صغير (بروتين 8 ميكرولتر و 2 bicelles ميكرولتر) من المستحسن للتحقق من الاستقرار قبل تصعيد لمنع فقدان العينة لا لزوم لها.
    5. باستخدام الروبوت التبلور، نفذ اسعة بلورة مصفوفة فحص باستخدام المتاحة تجاريا 96 شاشات جيدا قبل أي شنقا أو الجلوس انخفاض طريقة تبخير مع قطرات تتكون من ~ 200 عينة بروتين نيكولا لانغ و~ 200 عازلة بلورة نيكولا لانغ.
    6. احتضان لوحات تبلور في ~ 21 درجة مئوية. تفقد لوحات الأسبوعية لنمو البلورات باستخدام مجهر تشريحي.
    7. تحسين يؤدي تبلور من قبل عناصر من حالة التبلور بطريقة منهجية مختلفة (زيادة / تقليل الملح أو تركيزات مرسب، درجة الحموضة عازلة، ودرجة الحرارة الحضانة، و / أو تركيز البروتين).
  3. تبلور عن طريق المرحلة مكعب شحمي (نظام الإجراءات الجزائية)
    ملاحظة: مظاهرة أكثر تفصيلا لتقنيات نظام الإجراءات الجزائية قد سبق وصفها ليو وCherezov 26،27.
    1. الحصول على المنظفات بالفاعلات عينة البروتين الذي هو في ~ 20 ملغ / مل تركيز.
    2. قبل الدافئة monoolein إلى ~ 40 درجة مئوية. حمل60 ميكرولتر monoolein إلى حقنة 100 ميكرولتر واحد ضيق الغاز و 40 ميكرولتر البروتين العينة إلى آخر.
    3. باستخدام مقرنة الاختلاط، وربط الحقن، والحرص على عدم إدخال الهواء.
    4. المزيج بلطف عن طريق الضغط بالتناوب على الغطاسون حقنة دفع خليط من حقنة واحدة إلى أخرى تماما حتى تصبح العينة شفافة ومتجانسة.
    5. باستخدام الروبوت تبلور المصممة للطرق نظام الإجراءات الجزائية، نفذ اسعة بلورة مصفوفة فحص باستخدام المتاحة تجاريا 96 شاشات جيدا مع لوحات بلورة أسلوب ساندويتش (0.1 ملم جيدا سمك) مع قطرات تتألف من 100 عينة بروتين نيكولا لانغ و 750 عازلة بلورة نيكولا لانغ.
      ويمكن تعديل النسب قطرة إذا لزم الأمر: مذكرة. أيضا، ينصح يغطي الصلبة (أي الزجاج أو البلاستيك السميك) التي تدعم قطرات لطيف بدلا من الأغشية الرقيقة، والتي تميل للسماح للقطرات للتحرك حول البئر كما يتم التعامل مع لوحات.
    6. احتضان بلورة صالمرحومين في ~ 21 درجة مئوية. تفقد لوحات الأسبوعية لنمو البلورات باستخدام مجهر تشريحي.
    7. تحسين يؤدي تبلور من قبل عناصر من حالة التبلور بطريقة منهجية مختلفة (زيادة / تقليل الملح أو تركيزات مرسب، درجة الحموضة عازلة، ودرجة الحرارة الحضانة، و / أو تركيز البروتين).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

YiuR هو طنب يعتمد نقل الحديد الذي هو هدف لقاح ضد المفترض يرسينيا بيستيس. وقد تم تحديد أصلا باستخدام الفحص ميكروأري. هنا، وترد الخطوات التي تم اتخاذها لتحديد بنية YiuR استخدام البلورات بالأشعة السينية (الشكل 9). لاستنساخ وتسلسل الحمض النووي للYiuR (ناقص تسلسل إشارة N-النهائي) وPCR تضخيمها من الحمض النووي الجيني وsubcloned في ناقلات تحتوي على تسلسل إشارة N-محطة pelB و 10x الحامض الاميني العلامة تقارب تليها موقع البروتيني TEV. للتعبير، تحولت البلازميد YiuR التي تحتوي على BL21 (DE3) الخلايا المختصة ومستعمرة واحدة تستخدم لزراعة ثقافة 5 مل بداية لOD ​​600 ~ 0.5. ثم تم تلقيح اثني عشر قوارير تحتوي على 750 مل من المتوسط ​​السل مع 1 مل من ثقافة المبتدئين والسماح للزراعة لمدة 3 د على 20 درجة مئوية (اهتزاز في 220 دورة في الدقيقة). ثم تم حصاد الخلايا، وتنتج حوالي 150-200ز من إجمالي عجينة الخلية، والتي كان فلاش تبريد في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

لتنقية YiuR، ومعلق 20 غرام من الخلايا في 120 مل من برنامج تلفزيوني 1X (10 ملي نا 2 هبو 4، 1.8 مم KH 2 PO 4، 2.7 ملي بوكل، 137 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4) عن طريق اثارة في RT مع الدناز أنا وAEBSF إضافتها. تم إجراء تحلل من قبل اثنين من يمر من خلال الخالط. وبعد ذلك طرد المحللة في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة (لتدور باستمرار خلايا متصلة والهيئات مضمن). تم طرد طاف مرة أخرى في 235000 x ج لمدة 60 دقيقة، مع بيليه الذي يحتوي على جزء غشاء (YiuR). ثم تم معلق الأغشية في 100 مل من برنامج تلفزيوني 1X باستخدام الخالط dounce. كان YiuR بالفاعلات / المستخرج من الأغشية باستخدام Elugent في التركيز النهائي 5٪، واثارة بين عشية وضحاها (تصل إلى 16 ساعة) في 4 درجة مئوية. ثم تم طرد الأغشية بالفاعلات مرة أخرى في 371000 x ج لمدة 60 دقيقة، مع سوpernatant التي تحتوي على جزء بالفاعلات بما في ذلك YiuR. لعزل YiuR، تم تنفيذ ايماك باستخدام العازلة ألف (برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ DDM) وB الاحتياطي (برنامج تلفزيوني 1X، 1 م إميدازول 0.1٪ DDM)، وغسلها مع تركيزات ايميدازول 30-50 ملم ومزال مع 250-500 ملم . لإزالة N-محطة بطاقة 10X الحامض الاميني، الحضانة مع TEV تم تنفيذ HIS البروتيني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية خلال غسيل الكلى في المخزن برنامج تلفزيوني 1X. ثم تم تمرير العينة على عمود إيماك مرة أخرى، وتدفق من خلال المركزة، مدال، ثم فصل مزيد باستخدام 0-1،0 M كلوريد الصوديوم التدرج على عمود التبادل الأيوني في 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5. ثم تم تجميع الكسور التي تحتوي YiuR، ويتركز ودهس عمود هلام الترشيح باستخدام 25 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 200 مم كلوريد الصوديوم، و 0.05٪ LDAO. وكان الكسور التي تحتوي YiuR ثم تجميع ومركزة إلى 10 ملغ / مل التبلور.

ثم تم إجراء فحص واسع المصفوفة والظروف تحديدالتي أنتجت بعض بلورات الانعراج الأولية. أدى مزيد من التحسين على بلورات أكبر والتي كانت تستخدم لجمع البيانات حيود الأشعة السينية الأم. بلورات هو مبين في الشكل 8 هي تمثيلية من البلورات واحد من بلوغ باستخدام الأساليب المقدمة هنا. بلورات من فحص المنظفات وbicelles يمكن أن تكون كبيرة مثل البلورات التي تم الحصول عليها عادة لبروتينات قابلة للذوبان. ومع ذلك، وتلك من نظام الإجراءات الجزائية هي دائما تقريبا أقل من ذلك بكثير. وكانت البيانات جيدة بما فيه الكفاية لاستخدامها لاستبدال الجزيئية التي أدت إلى هيكلة تقرير إلى 2.65 قرار Å.

شكل 1
الشكل 1. نوعين من بروتينات الغشاء متكاملة هي α-حلزونية وβ برميل. المعروضة هنا هي أمثلة على كل مع مستقبلات β2 الأدرينالية (PDB كود 2RH1، α-حلزونية) والتي تعتمد على طنب نقل BtuB (PDB كود 1NQE،بيتا برميل). ويظهر في الصف العلوي وجهة نظر خارج الخلية في حين يبين الصف السفلي وجهة نظر الغشاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. خطط إدارة β برميل تخدم العديد من الوظائف المختلفة، ويمكن أن يكون لها هياكل متنوعة. بينما البروتينات الغشاء α حلزوني يمكن أن تحتوي على واحد أو أكثر من المجالات عبر الغشاء، وتتراوح خطط إدارة β برميل 8-26 خيوط وكل حبلا يتفاعل بشكل وثيق مع فروع المجاورة. بقايا الخارجية، التي تتفاعل مع الغشاء، وعادة ما تكون مسعور في حين أن بقايا الداخلية، التي تتفاعل مع المذيب، هي القطبية وماء عادة. يظهر الصف العلوي وجهة نظر خارج الخلية، ويظهر في الصف الأوسط وجهة نظر غشاء، ويبين الصف السفلي للperiplasmiعرض ج. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. أمثلة من نوعين من خطط إدارة β برميل المشتركة. اليسار، وهيكل نقل تعتمد-طنب FEPA (PDB كود 1FEP)، والتي تصور خارج الخلية (أعلى)، غشاء (وسط) والآراء محيط بالجبلة (القاع). يشار إلى المجال β برميل باللون الأخضر بينما المجال المكونات في أرجواني. الحق، وهيكل شاحنة نقل سيارات تهت (PDB كود 3KVN)، والتي تصور خارج الخلية (أعلى)، غشاء (وسط) والآراء محيط بالجبلة (القاع). يشار إلى المجال β برميل في الذهب بينما المجال الركاب في الزرقاء. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فيرسيعلى هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4. تخطيطي الاستنساخ والتعبير خط أنابيب لإنتاج خطط إدارة المكاتب β برميل. تخطيطي من خط الانابيب المستخدمة لاستنساخ والتعبير عن المرصد المغربي للسجون الهدف إما عن طريق التعبير غشاء الأصلي (يسار) أو عن طريق التعبير إلى الهيئات إدراج لrefolding (يمين). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. تخطيطي من خط أنابيب تنقية لعزل خطط إدارة المكاتب β برميل. تخطيطي من خط الانابيب المستخدمة لاستخراج خطط إدارة المكاتب التي تم التعبير عنها مباشرة في OM. هنا، فإن الهدف المرصد المغربي للسجون أن يكون استخراجإد من الغشاء عن طريق الإذابة مع المنظفات المناسب ومن ثم تنقيته من ايماك، التبادل الأيوني اللوني، وهلام الترشيح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. تخطيطي من خط أنابيب تبلور لزراعة بلورات من خطط إدارة β برميل. ثلاث طرق يمكن استخدامها لبلورة خطط إدارة المكاتب β برميل بما في ذلك فحص المنظفات، bicelles، والمرحلة مكعب شحمي (نظام الإجراءات الجزائية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7 الرقم 7. أدوات جديدة في علم البلورات التي ساهمت إلى حد كبير في هيكلة تصميم خطط إدارة β برميل. ومن الأمثلة الروبوتات بلورة / الروبوتات نظام الإجراءات الجزائية (A)، والمجاهر الأشعة فوق البنفسجية (ب)، الدرجة الثانية الخطية التصوير من بلورات مراوان (SONICC) تصور (C)، كرات الصولجان الروبوتية / الروبوتات (D)، وأساليب rastering / ناقلات / حلزونية جمع البيانات (E )، والحزم microfocus (F). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

شكل 8
الرقم 8. صورة الممثل من البلورات الناتجة عن بروتوكول. يمكن أن بلورات من فحص المنظفات وbicelles تكون كبيرة مثل بلوراتحصلت عادة لبروتينات قابلة للذوبان. ومع ذلك، وتلك من نظام الإجراءات الجزائية هي دائما تقريبا أقل من ذلك بكثير. مقياس شريط = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9
الرقم 9. من بنيات إلى بلورات إلى هيكلة تقرير لهدف لقاح المفترض YiuR من يرسينيا بيستيس. خط الانابيب الشامل تستخدم لتحديد هيكل YiuR، مما يدل على الخطوات التي اتخذت لاستنساخ، أعرب، تنقية، تتبلور، ويحل هيكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

β برميل خطط إدارة تخدم أدوار أساسية في الجراثيم سلبية الغرام، الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء وهي أهداف هامة للالتحليل البنيوي التي تقدم ثروة من المعلومات حول الآليات الجزيئية الأساسية في الأغشية الخارجية لهذه العضيات منها. ومع ذلك، إنتاج عينة كافية لتحليل هيكلي ليست دائما واضحة، وبالتالي، يتم تقديم خط أنابيب العام لإنتاج كميات كافية من هدف خطط إدارة β برميل لتحديد هيكل، يشرح بالتفصيل عملية من بنيات إلى بلورات. في حين أن هذه البروتوكولات قد تم اختبارها وثبت للعمل بالنسبة لمعظم خطط إدارة من سلبية الغرام البكتيريا، وهناك قيود في أن هناك بعض الأهداف، ولا سيما بالنسبة للالميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء، والتي قد تتطلب أساليب أخرى للتعبير وتنقيتها. على هذا النحو، ينبغي أن أساليب هنا تكون قابلة للتطبيق بالنسبة لمعظم المشاريع التي تنطوي على خطط إدارة من البكتيريا سالبة الجرام، إلا أن مستوى التعبيروالصورة وكمية من عينة النقاء تختلف تبعا للمرصد المغربي للسجون الهدف.

هناك طريقتان العامة للتعبير عن خطط إدارة المكاتب β برميل للدراسات الهيكلية، (1) في التعبير الجسم الحي مباشرة في الغشاء الخارجي و (2) التعبير للهيئات إدراج عليها في المختبر refolding. لفي الجسم الحي نهج التعبير، وتستهدف خطط إدارة بيتا برميل في الغشاء الخارجي للE. القولونية حيث يتم طي أصلا هم ومعزولة مباشرة من الأغشية. التعبير عن غشاء هو النهج المفضل منذ أكثر عرضة لتكون مطوية بشكل صحيح الأهداف. في حين أن هذا النهج عادة ينتج مستويات منخفضة من البروتين الكلي، فإنه يتجنب التعقيدات المرتبطة أحيانا مع في المختبر refolding. وقد أعرب العديد من خطط إدارة β برميل بنجاح في هذا المجال لتحديد هيكل 4،5،11. كثيرا ما يتم تحقيق نجاح استخدام نظام يعتمد على التعبير التأسيسية على مستوى منخفض من T7 تروجص، ولكن غيرها من النظم التي تعتمد على الاستقراء (أي IPTG، أرابينوز) للتعبير تستخدم أيضا بشكل روتيني مع النجاح.

التعبير مباشرة في الغشاء الخارجي يتطلب البروتين المستهدف أن يكون إشارة تسلسل-N المحطة التي توجه مجمع سلسلة الريبوسوم الوليدة إلى translocon ثانية، لإفراز الوليدة المرصد المغربي للسجون β برميل في الجبلة المحيطية. والمشقوق تسلسل إشارة على الجانب محيط بالجبلة من الغشاء الداخلي، ولذلك فمن المهم أن تسلسل إشارة تسبق أية علامات N-محطة تضاف إلى الهدف. ثم اصطحب الوليدة المرصد المغربي للسجون β-برميل بحلول مرافقين من خلال الجبلة المحيطية إلى مجمع BAM لإدراجها في الغشاء الخارجي 2،3.

للأهداف التي لا يمكن overexpressed في غشاء، وهو نهج بديل هو التعبير إلى الهيئات إدراج لفي المختبر refolding 28-30. هذا النهج النتائج عادة في مستوى عال وقوي التعبير سو البروتين الهدف. ومع ذلك، فإنه يمكن أن يكون تحديا لتحديد refolding الظروف، كما refolding يمكن أن يكون غير فعال. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من الصعب لفحص عندما يكون الهدف β برميل يتم طي المرصد المغربي للسجون بشكل صحيح. ومع ذلك، هناك العديد من الأمثلة على البروتينات التي تم refolded بنجاح للدراسات الهيكلية بما في ذلك OmpA 31، امرض 19، OmpF 32، وVDAC 33. لاستنساخ لا تعبر على الإطلاق (أصلا أو إلى الهيئات مضمن) أو التعبير ولكن لا يتم تجميعها بشكل صحيح في غشاء (أصلا)، يمكن للمرء أن محاولة تحور β برميل إلى أكثر شبها أن من E. القولونية 34،35. تسلسل الأحماض الأمينية في β-إشارة المجال برميل مهم للاعتراف والتجمع من قبل مجمع BAM والاختلافات في تسلسل β-إشارة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على حد سواء نشوء حيوي والتعبير مستويات مناسبة من المرصد المغربي للسجون الهدف β برميل 11،34 (35 عاما). التكامل السليم للهدف β-بريمكن رصدها شرم المرصد المغربي للسجون عن طريق فحص للتجزئة الغشاء والاستخلاصية المنظفات تليها فحوصات modifiability الحرارة.

تبلور بروتينات الغشاء في وجود المذيلات المنظفات هي أقدم تقنية وتتيح التكيف السهل المعدات البروتين بلورة القابلة للذوبان التقليدية والاستراتيجيات. عن طريق إخفاء الغشاء المناطق جزءا لا يتجزأ مع جزيئات المنظفات، تتركز البروتين يمكن أن يعامل بطريقة مماثلة لبروتينات قابلة للذوبان (على سبيل المثال، مختلطة مع المشروبات الكحولية أم بلورة والمغلقة في جهاز نشر بخار الذي يسبب الجفاف البطيء للانخفاض البروتين). في حين بسيطة في مفهومها ومميزاتها المنظفات وخصائص إضافة طبقة كبيرة من التعقيد على رأس التحديات بلورة العادية. على وجه التحديد، فإن الطابع الجزيئي من المنظفات يجب أن تكون مصممة تجريبيا لبروتين هدف معين، بما في ذلك حجم مذيلة، قطبية رئيس مجموعة (أنيوني، الموجبة، غير الأيونية، أوzwitterionic)، وطول السلسلة الهيدروكربونية، حيث أن كل هذه عوامل تؤثر على استقرار البروتين غشاء الهدف في الحل. وتشمل عيوب هذا النهج البيئة الكيميائية غير الأم، التعتيم المحتملين من المناطق السطحية التي يمكن أن تشكل الاتصالات وضوح الشمس، والقضايا تركيز المنظفات.

Bicelles هي مزيج من الدهون ومزدوج الألفة (على سبيل المثال، المنظفات أو نسبة الدهون في سلسلة قصيرة) التي تجمع في الجزيئات الفردية التي تحاكي بنية طبقة ثنائية مشابهة لالأغشية الموجودة في الخلايا 36،37. أقنعة مزدوج الألفة جوهر مسعور من هذه طبقة ثنائية حيث يتعرض في أطرافها بطريقة مماثلة إلى المذيلات في بلورة المنظفات. وهذا يوفر بيئة أكثر مواليد شبيهة للمساعدة في استقرار البروتينات المستهدفة.

ويمكن أيضا أن أهداف بروتين الغشاء أن تبلور مع المرحلة مكعب شحمي (نظام الإجراءات الجزائية) أساليب 38. نظام الإجراءات الجزائية هو mesophase التي شكلتها اختلاط الدهون والماء، فيالتي تعم طبقة ثنائية مستمرة من قبل اثنين من الشبكات غير المتقاطعة من القنوات المذيبات. هذا الهيكل ثلاثي الأبعاد يسمح نشر الدهن جزءا لا يتجزأ من بروتينات الغشاء في بيئة المحلية مثل حد كبير ويسمح الاتصالات وضوح الشمس لتشكيل بين السطوح مسعور وماء من البروتينات ويقلل من محتوى المذيب العام للبلورات في الوقت الذي تعزز طلباتهم. منذ عرضه في 1990s، كانت تقنيات نظام الإجراءات الجزائية حاسما في تحديد هياكل العديد من الأهداف بروتين الغشاء بعيد المنال، مثل رودوبسين 39،40 وGPCRs 41-43. استخدام نظام الإجراءات الجزائية في شاشات إنتاجية عالية يتطلب أحكاما خاصة (أي، نظام الإجراءات الجزائية محددة الروبوت، والمحاقن مانعة لتسرب الغاز، نظام الإجراءات الجزائية أداة الاستغناء، لوحات ساندويتش التبلور، الخ) كما monoolein سميكة تستخدم عادة لنظام الإجراءات الجزائية لا يمكن التعامل معها من قبل التقليدي التعامل نانولتر السائل الروبوتات.

هلام الترشيح اللوني هو خطوة هامة للغايةلبلورة البروتينات الغشاء بشكل عام نظرا لأنها تؤدي المعلومات حول كيفية تحقيق الاستقرار في المنظفات اختار هو لهدف بروتين الغشاء، والتي يمكن أن تصور من قبل اللوني. من خلال مقارنة كمية عينة في حجم الفراغ، الاحتفاظ مرات، والأشكال من القمم، والاستقرار الشامل وmonodispersity من العينة يمكن الوصول إليها. ومن شأن عينة مثالية لديها القليل جدا من دون عينة خسر في حجم الفراغ وسيكون له الذروة شطف متماثل واحدة مع توزيع جاوس. المنظفات C 8 E 4 (0.8٪)، OG (1.0٪)، وLDAO (0.05٪) تستخدم بشكل روتيني لبلورة خطط إدارة المكاتب β برميل مع النجاح وجيدة منها لتبدأ. من الناحية المثالية، والتجارب الصغيرة تتم المقارنة بين عدة المنظفات أو خليط من المنظفات لتحديد الأكثر ملاءمة لبلورة. تلك التي وجدت لتكون أكثر استقرار ثم تستخدم لاستعدادات واسعة النطاق للهدف β-باالمرصد المغربي للسجون rrel وللمحاكمات التبلور.

مرة واحدة تتشكل بلورات من المرصد المغربي للسجون الهدف β برميل، وتحسين الرئيسي (أي فحص مضافة، البرد الفرز، المنظفات المضافة الفرز، الخ) وغيرها من التقنيات المشابهة لأهداف البروتين القابلة للذوبان يمكن اتباعها مع بعض الاختلافات. ومع ذلك، هناك بعض التطورات الحديثة التي هي مفيدة للغاية عند العمل مع بروتينات الغشاء. على وجه التحديد، يمكن أن بلورات البروتين غشاء غالبا ما يكون من الصعب كشف في الخمور والدتهم لمجموعة متنوعة من الأسباب. بروتينات غشاء غالبا ما تشكل بلورات صغيرة نسبيا ويمكن المغلوطة سوء توجيه الأمثل وضوح الشمس. تقنيات نظام الإجراءات الجزائية وخاصة تحديات إضافية الحالية، نظرا لزجة جدا، وبيئات غالبا مبهمة التي تزرع البلورات. استراتيجيات لمعالجة وتشمل هذه القضايا استخدام المجاهر فوق البنفسجية (UV) بالتزامن مع المجاهر الخفيفة، مما يسمح للبلورات بروتين فلوري بطبيعة الحال إلى تمييزها ومدمج الملح غير الإستشعاع وبلورات المنظفات (الشكل 7). لا تزال هناك تحديات، ولكن في تحديد هوية من البلورات البروتينية التي تشكل في مجالات مرسب. ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن بلورات من استغلال تأثير تردد مضاعفة من معظم بلورات مراوان عندما التقط بواسطة نبضات ليزر الفيمتو ثانية المسح الضوئي، والتي تنفذها التكنولوجيا SONICC 44. هذا ارتفاع القرار، وتقنية عالية التباين يمكن استخدامها لتمييز بلورات submicron من ظروف التعتيم.

يتم بروتينات الغشاء الحصاد باستخدام تقنيات علم البلورات القياسية، لا سيما في المنظفات الصناعية وبلورة bicelle. يتم تنفيذ حلقات من ناحية استخدام المجهر تضخم منخفضة وحلقة تركيب الكريستال (أي ألياف النايلون، والأسلاك، أو البوليمر). فتل من المذيبات الزائدة وحماية البرد قبل أن يغرق التجميد في السائل المبردة وأيضا الإجراءات القياسية عند حصاد بلورات المرصد المغربي للسجون β برميل. ومع ذلك، والحصادجي من نظام الإجراءات الجزائية نمت بلورات يعرض مشاكل معينة، وخاصة إذا كان حصاد مباشرة من لوحات ساندويتش، كما بلورات يمكن أن يكون من الصعب الوصول ولا يمكن ملاحظتها بسهولة من خلال المجهر. أيضا، بلورات نمت في نظام الإجراءات الجزائية يجب أحيانا أن تحصد بكميات كبيرة منذ خليط نظام الإجراءات الجزائية لا يمكن فصلها بسهولة داخل الحلقة.

جمع البيانات عن خطط إدارة β برميل لا يمكن أن يؤديها كما هو الحال مع بلورات البروتين القابلة للذوبان مع سوى عدد قليل من اعتبارات إضافية. في حين أن حجم البلورات التي يزرعها أساليب المنظفات وbicelle غالبا ما تكون مماثلة لتلك التي نمت مع بروتينات قابلة للذوبان، بلورات نمت من طريقة نظام الإجراءات الجزائية هي دائما تقريبا أصغر بكثير. وبالإضافة إلى ذلك، لأن عينات تحصد من مصفوفة الإجراءات الجزائية غالبا ما تحتوي على بلورات متعددة والتي يصعب مراقبة، لا بد من الاستفادة من مصادر السنكروترون التي لديها مصغرة شعاع وحلقة قدرات rastering التي يمكن مسح منهجي حلقة كاملة لتحديد المواقف من بلورات على أساس دفراction (الشكل 7). صغر حجم بلورات نظام الإجراءات الجزائية أيضا يجعلهم عرضة بشكل خاص لأضرار الأشعة. لذلك غالبا ما يتم دمج البيانات من بلورات متعددة من أجل جمع بيانات كاملة.

ويتم الحصول على بلورات الانعراج مرة واحدة بشكل جيد ويتم جمع مجموعة بيانات كاملة، تصميم هيكل لخطط إدارة β برميل ويمكن تحقيق ذلك باستخدام نفس الإجراءات المتبعة بروتينات قابلة للذوبان، مع الأخذ في الاعتبار أن بلورات البروتين غشاء عموما تظهر على نسبة أعلى المذيبات. كما هو الحال مع جميع الأهداف البلورات، سواء بروتين قابل للذوبان أو بروتين الغشاء، كل تقدم وتحدياته الخاصة، ولهذا السبب لا خط أنابيب واحد يمكن أن تنطبق مباشرة إلى جميع الأهداف. لذلك، بل هي مهمة للباحث الرئيسي (ق) لتكييف هذه البروتوكولات العامة وفقا لذلك لضمان نجاح له / مشروعها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crystallization Robot TTP Labtech, Art Robbins - Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocycler Eppendorf, BioRad -
Media Shaker New Brunswick, Infors HT -
UV-vis spectrometer Eppendorf -
SDS-PAGE apparatus BioRad 1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gels BioRad, Life Technologies 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA Prime GE Healthcare -
AkTA Purifier GE Healthcare -
Microcentrifuge Eppendorf -
Centrifuge (low-medium speed) Beckman-Coulter -
Ultracentrifuge (high speed) Beckman-Coulter -
SS34 rotor Sorvall -
Type 45 Ti rotor Beckman-Coulter -
Type 70 Ti rotor Beckman-Coulter -
Dounce homogenizer Fisher Scientific 06 435C
Emulsiflex Avestin -
Dialysis tubing Sigma D9652
LCP tools Hamilton, TTP Labtech -
VDX 24 well plates Hampton Research HR3-172
Sandwich plates Hampton Research, Molecular Dimensions HR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheets Grace Bio-Labs 875238
HiPrep S300 HR column GE Healthcare 17-1167-01
Q-Sepharose column GE Healthcare 17-0510-01
Crystallization screens Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions -
Gas-tight syringe (100 ml) Hamilton 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
  2. Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
  3. Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
  4. Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
  5. Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
  6. Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
  7. Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
  8. Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
  9. Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
  10. van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
  11. Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
  12. Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
  13. Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
  14. Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
  15. Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
  16. Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
  17. Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
  18. Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
  19. Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
  20. Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
  21. Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
  22. Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
  23. Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
  24. Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
  25. Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
  26. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
  27. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
  28. Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
  29. Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
  30. Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
  31. Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
  32. Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
  33. Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
  34. Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
  35. Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510 (2012).
  36. Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
  37. Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
  38. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
  39. Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
  40. Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
  41. White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
  42. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  43. Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).

Tags

الكيمياء، العدد 113، بيتا برميل، بروتين الغشاء والبروتين التبلور، البيولوجيا البنيوية، الأغشية، وبروتين refolding، تنقية البروتين
من التركيبات لبلورات - نحو تحديد هيكل β برميل الخارجي بروتينات الغشاء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Noinaj, N., Mayclin, S., Stanley, A. … More

Noinaj, N., Mayclin, S., Stanley, A. M., Jao, C. C., Buchanan, S. K. From Constructs to Crystals – Towards Structure Determination of β-barrel Outer Membrane Proteins. J. Vis. Exp. (113), e53245, doi:10.3791/53245 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter