Introduction
β-barrel OMP'er kun kan findes i de ydre membraner af mitokondrier chloroplaster, og gramnegative bakterier 1-3. Mens de tjener lignende roller som a-spiralformede proteiner, de har en meget forskellig fold bestående af en central membran-embedded β-tønde-domæne der spænder fra 8-26 anti-parallelle p-strenge med hver streng bliver tæt forbundet med de to tilstødende tråde (figur 1 og 2). Den første og sidste strenge af β-tønden domæne derefter interagere med hinanden, næsten udelukkende i en anti-parallel måde (undtagen mitokondriel VDAC), at lukke og forsegle β-tønde domæne fra den omgivende membran. Alle β-barrel OMP'er har ekstracellulære løkker af varierende sekvens og længde, som spiller en vigtig rolle i ligand-interaktioner og / eller protein-protein kontakter, med disse sløjfer undertiden være så stor som 75 rester, såsom fundet i Neisseria transferrinbinding proTEIN A (TbpA) 4. β-barrel OMP'er kan også have N-terminale eller C-terminale periplasmatiske forlængelser, der tjener som yderligere domæner for proteinets funktionelle formål (f.eks Bama 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Mens mange typer af β-barrel OMP'er eksisterer 11, to af de mere almindelige typer er beskrevet nedenfor som eksempel for de mindre fortrolige med området, (1) TonB-afhængige transportører og (2) autotransporters.
TonB-afhængige transportører (f.eks FEPA, TbpA, BtuB, Cir, etc.) er essentielle for import af næringsstoffer og indeholder et N-terminalt prop domæne bestående af ~ 150 rester, der findes gemt inde i en C-terminal 22-strenget β- tøndedomæne indlejret i den ydre membran 12 (fig 3). Mens dette plug domæne forhindrer underlag fra frit passere gennem tønden domæne, substrat binding inducerer en konformationel ændring i stikket domænet thved fører til poredannelse (enten ved stik omlejring eller ved delvis / fuld udstødning af proppen), som derefter kan lette substrat transport over den ydre membran til periplasmaet. TonB-afhængige transportører er særligt vigtige for overlevelsen af visse patogene stammer af Gram-negative bakterier, såsom Neisseria meningitidis, der har udviklet specialiserede flytransporternes kapre næringsstoffer såsom jern direkte fra humane værtsproteiner 4,13,14.
Autotransporters tilhører den type V sekretion system med Gram-negative bakterier og er p-barrel OMP'er, der består af en β-tønde-domæne (typisk 12-strenge som med ESTA og ESPP) og en passager domæne, der udskilles enten eller præsenteret på overfladen af cellen 15,16 (figur 3). Disse β-barrel OMP'er tjener ofte vigtige roller i celleoverlevelse og virulens med passageren domæne tjener enten som en protease, adhesin, og / eller anden effector der medierer patogenesen.
Strukturelle metoder såsom røntgenkrystallografi, NMR-spektroskopi, og elektronmikroskopi (EM) tillader os at bestemme modeller for OMP'er på atomar opløsning som igen kan anvendes til at dechifrere nøjagtigt, hvordan de fungerer i den ydre membran. Denne uvurderlige oplysninger kan derefter anvendes til lægemiddel og vaccineudvikling hvis relevant. For eksempel er transferrinbindende protein A (TbpA) findes på overfladen af Neisseria og er nødvendig for patogenese, fordi den direkte binder human transferrin og derefter udtrækker og importerer strygejernet for sin egen overlevelse. Uden TbpA, kan Neisseria ikke skyllepumpetab jern fra det menneskelige vært og er gjort ikke-sygdomsfremkaldende. Efter krystalstrukturen af humant transferrin bundet til TbpA 4 blev løst, blev det meget tydeligere, hvordan de to proteiner associeret, hvilke regioner af TbpA medierede interaktionen, hvilke rester var vigtige for jern ekstraktion ved TbpA, oghvordan man kan udvikle lægemidler mod Neisseria målretning TbpA. Derfor grund af betydningen af β-barrel OMP'er i Gram-negative bakterier for overlevelse og patogenese, samt i mitochondrier og chloroplast funktion, og behovet for yderligere strukturel information om denne enestående klasse af membranproteiner og de systemer, hvor de virker generelle protokoller er præsenteret med det overordnede mål at udtrykke og rense mål OMP'er på høje niveauer til karakterisering af strukturelle metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning og ekspression
Bemærk: For at aktivere strukturelle studier, skal tilstrækkelige mængder højt oprenset protein være forberedt, og det starter normalt med kloning og overekspression af mål β-tønde ydre membran-protein (OMP) i E. coli (figur 4). Til dato, alle β-tønde OMP strukturer, herunder de strukturer for mitokondrie VDAC, er afledt af bakterielt udtrykte protein 11. Her er generelle protokoller præsenteres for kloning og udtrykker β-tønde OMPs for (1) indfødte udtryk direkte i bakterielle membraner og (2) udtryk i inklusioner organer til in vitro refoldning 17.
- Designe en ekspressionskonstruktion
- Opnå eller købe codon optimerede target OMP-genet.
- Køb eller opnåelse af en T7 ekspressionsvektor (I) indeholdende en periplasmatisk lokalisering signalsekvens, en N-terminal 6x-histidinmærke,og en TEV protease-site 4,18,19 til in vivo-ekspression til membranen eller (ii) uden en periplasmatisk lokalisering signalsekvens til ekspression til inklusionslegemer til in vitro-refoldning.
Bemærk: En N-terminal proteasespaltelige 6x eller 10x-histidinmærke ville tilvejebringe en nem fremgangsmåde til oprensning. Som med opløselige proteiner, variere valget af affinitetsmærket (histidin, Strep, GST, etc.), positionen af affinitetsmærket Inkluderingen af et protease-site (TEV, enterokinase, thrombin, etc.) til efterfølgende fjernelse tag . - PCR amplificere målsekvensen med passende primere og subklon i ekspressionsvektoren. Brug ligering uafhængig kloning (LIC) 20,21 eller konventionelle kloningsteknikker (restriktionsenzymer / ligeringsprodukter) til subkloning. Dog kan LIC lette high throughput, der giver mulighed for et stort antal forskellige konstruktioner (trunkeringer, forskellige tags, forskellige promotorer), der skal klones parallelt merelet.
- In vivo Membran-målrettet Expression
- Brug sekventeringsanalyse at verificere target β-tønde OMP klones nedstrøms og i ramme med en signalsekvens (dvs. pelB, OmpA) i ekspressionskonstruktionen.
Bemærk: Signalsekvensen dirigerer den nascente kæde til Sec translocon til sekretion til periplasmaet og efterfølgende samling i den ydre membran. - Omdan konstruktionen i et udtryk bakteriestamme til ekspression ved pipettering 1,0 pi plasmidet i 50 pi BL21 (DE3) kemisk kompetente celler og blandes forsigtigt ved pipettering op og ned. Der inkuberes på is i 30 minutter.
- Varmepuls ved 42 ºC i 30 sek anvendelse af et vandbad og derefter placere tilbage på is i 1 min.
- Der tilsættes 1 ml forvarmet SOC medium og rystes ved 37 * C i 1 time ved 1.000 rpm ved anvendelse af en benchtop rysteinkubator.
- Plade 100 pi af celler på LB-agarplader indeholdende en passende Antibiotic og inkuberes natten over ved 37 ºC inverteret.
- Udfør små udtryk tests ved podning en 5 ml LB + antibiotikum kultur med en enkelt koloni. Gentag for 5-10 kolonier.
Bemærk: På grund af den potentielle toksicitet af et β-tønde OMP og afhængigheden af basale udtryk niveauer, er koloni-til-koloni variabilitet undertiden observeret. Derfor screening af flere kolonier anbefales, for hver konstruktion, der testes. For små udtryk tests, snarere end konventionelle 5 ml kulturer, der vokser 25 ml kulturer i 125 ml forbløffet Erlenmeyer-kolber foreslås. Disse betingelser ofte bedre afspejler, hvad der vil ske i en storstilet vækst. Desuden er det en god ide at også screene forskellige dyrkningsmedier (TB, LB, 2xYT, M9, etc.), da forskellige grader af succes er blevet rapporteret afhængigt af målproteinet.- Vokse ved 37 ºC under omrystning til en OD 600 på ~ 0,6.
- Fremkald udtryk af målet OMP ved annonceding 5 pi 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til hver kultur rør og tillade at vokse yderligere 1-2 timer.
- Sammenlign ekspressionsniveauer for alle kolonierne ved centrifugering 1 ml af hver kultur (OD 600 på ~ 0,6) i 1 min ved 15.000 xg ved anvendelse af en mikrocentrifuge.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 200 pi 1x SDS-PAGE loading buffer. Opvarm ved 100 * C i 5 minutter og centrifugeres igen ved 15.000 x g i 5 min.
- Prøverne analysere anvendelse af SDS-PAGE ved pipettering 20 pi i hver brønd i en 10% gel. Kør gel til 35 min ved konstant 200 V.
Bemærk: Det vil være fordelagtigt på dette tidspunkt for at kunne afgøre, om det protein-target bliver korrekt foldet eller ej. Dette kan ofte opnås ved at gøre mindre oprensninger eller ved at analysere for varme for ændring.
- Vælg kolonien viser den bedste ekspression og udføre storstilet ekspression under anvendelse 12-24 I medium.
Bemærk: Konventionelle metoder typisk vokse kulturerne ved 37 ºC under omrystning til en OD 600 på ~ 0,6 og derefter inducere med en passende inducer (dvs. 0,1-1 mM for IPTG eller ~ 0,2% for arabinose) i yderligere 2-4 timer . Om ønsket forud for induktion, reducere temperaturen til så lavt som 20 ° C og forlænge induktionstiden.- For utætte ekspression metode, vokser en 25 ml inokulere kulturen ved 37 ° C i LB-medium indeholdende den passende antibiotikum (e), indtil OD600 når ~ 0,6. Derefter tilsættes 1 ml af inokulatet til tolv 1 L kolber med TB-medium plus antibiotika (er) og vokse ved 20 ° C til mætning (~ 3 dage).
- Cellerne høstes ved centrifugering ved 6.000 x g i 10 min.
- Fortsæt til oprensningstrin afsnit 2.1 eller fryse cellepelleten i flydende nitrogen til langvarig opbevaring ved -80 ºC.
- Brug sekventeringsanalyse at verificere target β-tønde OMP klones nedstrøms og i ramme med en signalsekvens (dvs. pelB, OmpA) i ekspressionskonstruktionen.
- Expression til inklusionslegemer for In Vitro Refolding
- Brug sekventeringsanalyse at verificere ekspressionskonstruktionen ikke indeholder en signalsekvens. Fraværet af en signalsekvens vil direkte målproteinet at akkumulere i cytosolen som inklusionslegemer.
- Omdan ekspressionskonstruktionen til et udtryk bakteriestamme til ekspression. For inklusionslegeme ekspression, er det bedst at styre ekspression ved induktion (dvs. IPTG, arabinose, etc.) for at minimere mulige toksiske virkninger.
- Plade 100 pi transformerede celler på LB-agarplader indeholdende et passende antibiotikum og inkuberes natten over ved 37 * C inverteret.
- Udfør små udtryk tests ved podning en 5 ml LB + antibiotikum kultur med en enkelt koloni.
- Gentag trin 1.3.4 til 2-4 yderligere kolonier.
- Vokse ved 37 ºC under omrystning til en OD 600 på ~ 0,6.
- Inducerer med en passende inducer for 1-2 timer.
- Sammenlign ekspressionsniveauer for alle than kolonier ved analyse under anvendelse af SDS-PAGE (se trin 1.2.6). Vælg kolonien viser den bedste ekspression og udføre storstilet ekspression under anvendelse 12-24 I medium.
- Grow cellerne ved 37 ° C til en OD600 på 0,6-0,8 og inducerer ved 37 ° C i 3-5 timer. Mens ekspression til inklusionslegemer er mere robust end andre typer af ekspression, som med alle protein ekspressionseksperimenter kan ekspression forbedres ved at variere vækstmedium, tidspunkt for induktion, temperatur induktion, og koncentrationen af det inducerende middel.
- Cellerne høstes ved centrifugering ved 6.000 x g i 10 min.
- Fortsæt til oprensningstrin afsnit 2.2 eller fryse cellepelleten i flydende nitrogen til langvarig opbevaring ved -80 ºC.
2. Oprensning
- Isolering fra membranfraktioner
Bemærk: I modsætning til opløselige proteiner, er integrale membranproteiner indlejret i lipiddobbeltlaget og derforkræver detergenter til at udtrække dem til yderligere oprensning og analyse (figur 5). Efter udtryk, det første skridt i oprensningen af en β-tønde OMP er udtræk fra membranfraktionen.- Resuspender cellerne i lysepuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 pg / ml AEBSF, 5 pg / ml DNase I) i et forhold på 5 ml / g cellepasta.
- Lyse cellerne ved hjælp af en fransk presse eller cellehomogenisator. Spin de lyserede celler ved 15.000 xg i 30 minutter ved 4 ºC for at fjerne lyserede celler og cellerester.
- Supernatanten overføres til et rent rør og centrifugeres igen ved høj hastighed (200.000 x g) i 1 time ved 4 * C. Den resulterende pellet membranfraktionen som indeholder proteinet af interesse.
- Ved hjælp af en Dounce homogenisator, resuspender membranfraktionen, først overføre membranerne og derefter tilsætte solubiliseringsbuffer (50 mM KH 2 PO 4 pH 7,5, 200 mM NaCl, 20 mM imidazol, PH 8,0) (50 ml pr 20 g celler) ved 2x koncentration, uden detergent.
- Hæld de resuspenderede membraner i en lille bægerglas, og der tilsættes detergent (dvs., n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM), lauryldimethylamine-N-oxid (LDAO), n-octyl-β-D-glucopyranosid (OG), Triton X-100, etc.) langsomt til en slutkoncentration på ~ 10x kritiske micellekoncentration (CMC).
- Fyldes med vand, indtil en endelig koncentration på 1x solubiliseringsbuffer. Omrør i 0,5 til 16 timer ved 4 * C, afhængigt af hvor let målproteinet ekstraheres fra membranerne.
Bemærk: Vaskemiddel anvendes til langsomt opløseliggøre membranerne at ekstrahere målproteinet. Der er 3 typer af vaskemidler, der kan bruges her: ioniske (SDS, deoxycholsyre), nonioniske (Elugent, Tween, Triton X-100, OG, DDM), og zwitterioniske (LDAO, CHAPS). Et protein-vaskemiddel kompleks, der er stabil og monodisperse under oprensningen skridt vil i høj grad hjælpe med succes membranprotein crystallization. Mere information om vaskemidler, deres egenskaber, CMC information og deres anvendelse til oprensning af membranproteiner og andre applikationer kan findes på kommercielle leverandør websites. - Centrifugeres opløseliggjorte prøve ved 300.000 xg i 1 time ved 4 * C. Supernatanten indeholder nu detergent-solubiliseret target β-tønde OMP.
- Fortsæt med afsnit 2.3 som beskrevet nedenfor.
- Refoldning fra inklusionslegemer
Bemærk: Til in vitro genfoldning, målet β-tønde OMP udtrykkes direkte i inklusionslegemer. En fordel her er, at disse proteiner kan produceres i høje niveauer. ulempen er imidlertid, at genfoldning ofte ineffektiv og varierer fra refoldning eksperiment til det næste. Alligevel er der mange eksempler på proteiner, der med succes er blevet refoldet for strukturelle studier. Efter udtryk i inklusionslegemer, må man nu isolere inklusionslegemerne til genfoldning eksperiments.- Resuspender cellerne i lysepuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 pg / ml AEBSF, 5 pg / ml DNase I, 4 mM 2-mercaptoethanol (BME)) (5 ml pr g cellepasta). Lyse ved hjælp af enten en fransk presse, lydbehandling, eller cellehomogenisator.
- Pelletere organer ved en lav hastighed centrifugering integration ved 6.000 xg i 10 min ved 4 ºC.
- Vask af inklusionslegemerne ved resuspendering i 25 ml 1,0 M urinstof under anvendelse af en Dounce homogenisator. Pelleter igen ved en centrifugering med lav hastighed ved 6.000 xg i 10 minutter ved 4 * C.
- Gentag trin 2.2.3 som nødvendigt.
- Resuspender vaskede inklusionslegemer til en slutkoncentration på 10 mg / ml under anvendelse af buffer indeholdende 8,0 M urinstof (eller 6,0 M guanidiniumhydrochlorid (GdCl)) plus detergent (dvs. DDM eller LDAO) ved 2x CMC eller højere.
Bemærk: Hvis det ønskes, for membran proteinmål der indeholder en histidin-tag, kan immobiliseret metal-affinitetskromatografi (IMAC) oprensning udføres ved anvendelse denaturerende cold (i 8,0 M urinstof eller 6,0 M GdCl) som et første skridt svarende til den nedenfor skitseret i afsnit 2.3. - Udfør Genfoldningsreaktionen ved langsomt (natten over) fjernelse af denatureringsmidlet ved hjælp af dialyse i en buffer mangler denatureringsmidlet.
Bemærk: Det kan tage flere ændringer i dialyse buffer til at opnå dette. Alternativt, hvis inklusionslegemerne først er bundet til en IMAC-søjle, kan man gøre Genfoldningsreaktionen mens den stadig er bundet til søjlen ved langsomt at udveksle puffere for at fjerne denatureringsmidlet. I begge tilfælde huske, at dette er et membranprotein, derfor skal detergent være til stede for at stabilisere målet. Også, hvis detergentet er i brug, dialyserbart, skal det sættes til dialyse puffer (er) samt. - Spin de genfoldede prøver ved 200.000 xg i 1 time ved 4 ºC. Supernatanten indeholder den refoldede detergent-solubiliseret target β-tønde OMP.
- Fortsæt med afsnit 2.3 som beskrevet nedenfor.
- Oprensning ved anvendelse af IMAC, Ion-Exchange og Gel Filtration
Bemærk: Hvis man antager proteinet er blevet manipuleret med et histidinmærke, hvad enten nativt udtrykt eller genfoldes ved anvendelse in vitro-metoder, derefter immobiliseret metal-affinitetskromatografi (IMAC) udføres til oprensning meget gerne for histidinmærkede opløselige proteiner, bortset vaskemiddel skal opbevares i alle efterfølgende buffere til at holde målet β-tønde OMP solubiliseret og stabilt.- Forbered en 1-5 ml IMAC kolonne eller brug en færdigpakket kolonne. Udfør efterfølgende kromatografitrin ved 4 ° C. Skyl med vand for at fjerne alle spor af konserveringsmidler. Hvis der anvendes en automatiseret oprensningssystem, installere søjle ifølge producentens instruktioner.
- Forbered 500 ml IMAC Buffer A (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM) og 250 ml IMAC Buffer B (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM og 1,0 M imidazol).
Bemærk: Andre detergenter, der kan anvendes include Cymal-6 (0,05%), Triton X-100 (0,03%), og LDAO (0,05%). - Ækvilibrering af IMAC-søjle under anvendelse af 10 søjlevolumener IMAC puffer A.
- Tilføj imidazol til proteinet prøven til en endelig koncentration på 25 mM og blandes. Indlæse prøven på den ækvilibrerede IMAC søjlen ved 2 ml / min. Saml gennemstrømningen.
- Vask IMAC søjlen med 5 søjlevolumener af hver af stigende koncentrationer af imidazol anvendelse af buffer B (dvs. 25 mM, 50 mM, 100 mM). Indsamle vaske i 2 ml fraktioner.
- Eluere prøven med en slutkoncentration på 250 mM for 5 søjlevolumener. Saml den eluerede prøve i 2 ml fraktioner.
- Analyser flowet gennem, Vaskefraktionerne og elueringsfraktionerne anvendelse af SDS-PAGE-analyse (se trin 1.2.6) baseret på deres absorbans ved 280 nm. Pool fraktionerne indeholdende mål-β-tønde OMP som verificeret ved SDS-PAGE-analyse.
- Fjern 6x-histidin tag ved at tilføje TEV protease til samleprøve (ifølgetil producentens protokol) og inkubere natten over ved 4 ºC med blide vuggende.
- Indlæse prøve / protease opløsningen på en IMAC-søjle igen for at separere target β-tønde OMP (gennemstrømning) fra de spaltede tags og enhver uspaltede prøve. Gennemstrømningen vil indeholde den spaltede prøve mangler tagget.
Bemærk: Dette vil også fjerne eventuelle protease som TEV-His, som også har en ikke-spaltelig 6x-histidinmærke selv. Ellers vil være behov for andre metoder til at fjerne proteasen efter fordøjelse. - Eventuelt udføre ionbytningskromatografi til yderligere oprensning af prøven. Følg producentens anvisninger for den kolonne, der skal bruges, og sørg for at medtage vaskemiddel i alle buffere.
- Som forberedelse til krystallisation, indlæse prøven på en gelfiltreringssøjle i en buffer indeholdende detergent, der skal anvendes til krystallisation, såsom 25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1% OG.
- Saml 1 ml fraktioner og analysere using SDS-PAGE analyse (se Trin 1.2.6) baseret på deres absorbans ved 280 nm. Pool fraktioner med absorbanser ved 280 nm, da de indeholder målproteinet. Koncentrer til ~ 10 mg / ml.
Bemærk: Hvis det ønskes, kan korrekt foldning vurderes under anvendelse af en varme for ændring assay som beskrevet nedenfor.
- Heat for ændring Assay
Bemærk: En metode til at overvåge korrekt foldning af oprenset β-tønde OMP'er er at udføre varme for ændring-assays under anvendelse af en semi-nativ SDS-PAGE 22. Her vil uopvarmede prøver, der er foldet korrekt typisk migrere anderledes end dem, der er varmedenatureret. Denne egenskab er unik til p-tønde OMP'er og almindeligt anvendt til at studere denne familie af membranproteiner.- Før fremstilling prøver, samle gelapparat. Til at begynde, skal du placere buffertank i en isspand og surround helt med is. Sæt en in-house støbt eller kommercielle indfødte gradient gel ind i holderen og anbringes i tanken. Fyld than tanken helt med kolde 1x MES-løbebuffer (50 mM 2- [N-morpholino] ethansulfonsyre, 50 mM Tris-base, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,3).
- Afpipetteres 0,25 pi af prøven (10 mg / ml) i to 1,5 ml mikrocentrifugerør. Mærk en som "Kogt" og den anden som "RT".
- Tilføj 9,75 pi prøvepuffer til hver og blandes ved pipettering. Til begge prøver, tilsættes 10 pi 2x SDS loading buffer (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% bromphenolblåt og 20% glycerol) og blandes forsigtigt ved pipettering.
- Kog "Kogt" prøve ved 95 ºC i 5 min mens den "RT" prøve ved stuetemperatur. Spin "Kogt" prøve kortvarigt.
- Load 20 pi begge prøver onto formonteret native gel. Kør i 60 min ved konstant 150 V. Fjern gelen og suge i farveopløsning at visualisere resultaterne.
3. Krystallisation
Bemærk: krystallisering af bådeopløselige og membran proteinmål, det er standardprotokol at maksimere prøve renhed og stabilitet (dvs. bedste detergent, ligander, cofaktorer, etc.). Nuværende metodik til krystallisering membran proteinmål generelt omfatter tre vigtige fremgangsmåder, som opfylder de amfifile krav i dobbeltlag-embedded proteiner: (1) detergent, (2) bicelle, og (3) lipid kubiske fase (LCP) (figur 6) 23. Anvendelse af en nanoliter krystallisering robot anbefales kraftigt, når muligt, for at øge antallet af betingelser, der kan screenes for en given prøve volumen, samt, udnytte seneste fremskridt i værktøjer til at hjælpe strukturbestemmelse (figur 7).
- Krystallisering hjælp Rengøringsmidler
- Opnå en detergent solubiliseret proteinprøve, der er på ~ 10 mg / ml koncentration. Eventuelt tilsættes additivet 1,2,3-heptantriol direkte til prøven til en endelig koncentration på 3% for at reducere detergent micelle størrelse.
- Foretage prøven under anvendelse af en 0,22 um centrifugal filter til fjernelse af partikler og nedbør.
- Ved hjælp af en krystallisering robot, udføre bred matrix krystallisation screening under anvendelse af kommercielt tilgængelige 96-brønds skærme ved enten hængende eller siddende dråbe fordampning metode med dråber består af ~ 200 nl proteinprøve og ~ 200 nl krystallisation buffer.
- Inkubér krystallisations- pladerne ved ~ 21 ° C. Undersøg pladerne ugentlige for krystalvækst ved hjælp af et stereomikroskop.
- Optimer krystallisations- leads ved at variere bestanddelene i krystallisering tilstand på en systematisk måde (stigende / faldende salt eller fældningsmiddel koncentrationer, pH, inkubationstemperatur, og / eller proteinkoncentration).
- Krystallisation Brug Bicelles
Bemærk: En mere detaljeret demonstration af bicelle teknikker er tidligere blevet beskrevet af Ujwal og Abramson 24.- Forbered eller købe en 3Bicelle blanding 5% bestående af DMPC: CHAPSO i et forhold på 2,8: 1 ifølge publicerede protokoller 25. Andre koncentrationer kan også undersøges, samt, andre lipider og rengøringsmidler, som nødvendigt.
- Opnå en detergent solubiliseret proteinprøve, der er på ~ 10 mg / ml koncentration.
- Tilsæt bicelle blandingen på is ved en begyndende forhold på 4: 1 volumen / volumen (protein: bicelle) (f.eks tilsættes 10 pi bicelle blanding til 40 pi protein og bland hurtigt ved pipettering).
- Inkuber på is 30-60 min.
Bemærk: Protein: bicelle Opløsningen skal forblive meste klar, men kan ofte blive lidt uigennemsigtig. Men hvis proteinet: bicelle opløsningen bliver mælkehvid, hvilket indikerer præcipitation, så andre variabler skal analyseres (dvs. detergent, puffer, etc.). For nye prøver, laver små skala test (8 pi protein og 2 gl bicelles) anbefales at kontrollere stabilitet før opskalering for at forhindre unødvendige prøve tab. - Ved hjælp af en krystallisering robot, udføre bred matrix krystallisation screening under anvendelse af kommercielt tilgængelige 96-brønds skærme ved enten hængende eller siddende dråbe fordampning metode med dråber består af ~ 200 nl proteinprøve og ~ 200 nl krystallisation buffer.
- Inkubér krystallisations- pladerne ved ~ 21 ° C. Undersøg pladerne ugentlige for krystalvækst ved hjælp af et stereomikroskop.
- Optimer krystallisations- leads ved at variere bestanddelene i krystallisering tilstand på en systematisk måde (stigende / faldende salt eller fældningsmiddel koncentrationer, pH, inkubationstemperatur, og / eller proteinkoncentration).
- Krystallisation Brug lipid Cubic Phase (LCP)
Bemærk: En mere detaljeret demonstration af LCP-teknikker er tidligere blevet beskrevet af Liu og Cherezov 26,27.- Opnå en detergent solubiliseret proteinprøve, der er på ~ 20 mg / ml koncentration.
- Pre-varme den monoolein til ~ 40 ºC. Load60 pi monoolein i én gastæt 100 pi sprøjte og 40 pi proteinprøve til en anden.
- Ved hjælp af en blanding kobling, forbinde sprøjterne, og pas på ikke at indføre luft.
- Bland forsigtigt ved at anvende alternerende tryk på sprøjtestemplerne presser blandingen fra den ene sprøjte til den anden helt indtil prøven bliver gennemskinnelige og homogen.
- Ved hjælp af en krystallisering robot designet til LCP metoder, udføre bred matrix krystallisering screening anvendelse af kommercielt tilgængelige 96-brønds skærme med sandwich-stil krystallisering plader (tykkelse godt 0,1 mm) med dråber består af 100 nl protein prøve og 750 nl krystallisering buffer.
Bemærk: Drop nøgletal kan justeres efter behov. Desuden er faste dæksler (dvs., glas eller tyk plast) anbefales som understøtter dråberne pænt snarere end tynde film, som har tendens til at tillade dråberne at bevæge sig rundt i og pladerne håndteres. - Inkubér krystallisering plates ved ~ 21 ° C. Undersøg pladerne ugentlige for krystalvækst ved hjælp af et stereomikroskop.
- Optimer krystallisations- leads ved at variere bestanddelene i krystallisering tilstand på en systematisk måde (stigende / faldende salt eller fældningsmiddel koncentrationer, pH, inkubationstemperatur, og / eller proteinkoncentration).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
YiuR er en TonB afhængig jern transportør, der er en formodet vaccine target mod Yersinia pestis. Det blev oprindeligt identificeret ved anvendelse af en mikroarray-assay. Her er de skridt, der blev taget for at bestemme strukturen af YiuR hjælp røntgenkrystallografi skitseret (figur 9). Til kloning, DNA-sekvensen for YiuR (minus N-terminale signalsekvens) blev PCR-amplificeret fra genomisk DNA og subklones ind i en vektor indeholdende en N-terminal pelB-signalsekvensen og 10x-histidin affinitetsmærke efterfulgt af en TEV protease site. Til ekspression blev den YiuR-indeholdende plasmid transformeret til BL21 (DE3) kompetente celler og en enkelt koloni anvendes til dyrkning af en 5 ml starterkultur til OD600 ~ 0,5. Tolv kolber indeholdende 750 ml TB-medium blev derefter inokuleret med 1 ml af starterkulturen og lodes vokse i 3 dage ved 20 ºC (omrystning ved 220 rpm). Cellerne blev derefter høstet, producerer ca. 150-200g total cellepasta, som blev flash-afkølet i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 * C indtil anvendelse.
Til oprensning af YiuR blev 20 g celler resuspenderet i 120 ml 1x PBS (10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 2,7 mM KCI, 137 mM NaCl, pH 7,4) ved omrøring ved stuetemperatur med DNase I og AEBSF bliver tilføjet. Lysis blev udført ved to passager gennem en homogenisator. Lysatet blev derefter centrifugeret ved 12.000 xg i 10 min (at spinde ned ubrudte celler og inklusionslegemer). Supernatanten blev centrifugeret igen ved 235.000 xg i 60 minutter, med pelleten indeholdende membranfraktion (YiuR). Membranerne blev derefter resuspenderet i 100 ml 1x PBS under anvendelse af en Dounce homogenisator. YiuR var solubiliseret / ekstraheret fra membraner ved anvendelse Elugent ved 5% slutkoncentration, omrøring natten over (op til 16 timer) ved 4 * C. De solubiliserede membraner blev derefter centrifugeret igen ved 371 tusind xg i 60 minutter, med supernatant indeholdende det solubiliserede fraktion herunder YiuR. Til isolering YiuR blev IMAC udført under anvendelse Buffer A (1 x PBS, 0,1% DDM) og puffer B (1x PBS, 1 M imidazol, 0,1% DDM), vasket med imidazol koncentrationer fra 30-50 mM og elueres med 250-500 mM . At fjerne den N-terminale 10x-histidinmærke, inkubering med TEV HIS protease blev udført natten over ved 4 * C under dialyse i 1 x PBS-buffer. Prøven blev derefter ført over en IMAC-søjle igen, gennemstrømningen opkoncentreret, dialyseret, og derefter separeres yderligere under anvendelse af en 0-1,0 M NaCl-gradient på en ionbyttersøjle i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Fraktioner indeholdende YiuR blev derefter samlet, koncentreret og løb over en gelfiltreringssøjle ved anvendelse af 25 mM Tris-HCI, pH 7,5, 200 mM NaCl og 0,05% LDAO. Fraktionerne indeholdende YiuR blev derefter samlet og koncentreret til 10 mg / ml til krystallisation.
Bred matrix screening blev derefter udført og betingelser bestemmesder producerede nogle indledende diffrakterende krystaller. Yderligere optimering førte til større krystaller, som blev anvendt til at indsamle native røntgendiffraktionsdata data. Krystaller vist i figur 8 er repræsentative for krystaller kan man nå ved hjælp af de metoder, der præsenteres her. Krystaller fra screening og bicelles opvaskemiddel kan være så stor som krystaller opnået typisk for opløselige proteiner; Men dem fra LCP er næsten altid meget mindre. Dataene var gode nok til at blive anvendt til molekylær erstatning, som førte til at strukturere vilje til 2,65 Å opløsning.
Figur 1. De to typer fuldt integrerede membranproteiner er α-helix og β-tønde. Vist her er eksempler på hver med β2-adrenerge receptor (FBF kode 2RH1, α-helix) og TonB-afhængige transportør BtuB (FBF kode 1NQE,p-tønde). Den øverste række viser den ekstracellulære udsigt, mens den nederste række viser membranen visningen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. β-barrel OMP'er tjener mange forskellige funktioner og kan have forskellige strukturer. Mens a-spiralformet membranproteiner kan indeholde en eller flere transmembrandomæner, β-barrel OMP'er spænder fra 8-26 tråde og hver streng intimt interagerer med de tilstødende tråde. Outer rester, som interagerer med membranen, er typisk hydrofobe medens det indre rester, som interagerer med opløsningsmiddel, er typisk polære og hydrofile. Øverste række viser den ekstracellulære opfattelse, den midterste række viser membranen visning, og den nederste række viser periplasmic visning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Eksempler på to typer af fælles β-barrel OMP'er. Venstre, strukturen af TonB-afhængige transportør FEPA (PDB-kode 1FEP), der viser det ekstracellulære (øverst), membran (midten) og (nederst) udsigt periplasmatiske. Den β-tønde domæne er angivet med grøn, mens proppen domæne er i magenta. Højre, strukturen af autotransportør ESTA (PDB-kode 3KVN), der viser det ekstracellulære (øverst), membran (midten) og periplasmiske (nederst) synspunkter. Den β-tønde domæne er angivet i guld, mens passageren domænet er i blåt. Klik her for at se et større versipå denne figur.
Figur 4. Skematisk af kloning og ekspression pipeline til fremstilling af β-barrel OMP'er. Skematisk af rørledningen anvendes til at klone og udtrykke et mål OMP ved enten nativt membran ekspression (venstre) eller ved ekspression i inklusionslegemer for refoldning (højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Skematisk af oprensning rørledning til isolering af β-barrel OMP'er. Skematisk af rørledningen anvendes til udvinding af OMP'er, der er blevet udtrykt direkte i OM. Her er målet OMP skal være ekstrakted fra membranen ved opløsning med en passende rengøringsmiddel og derefter renset ved IMAC, ionbytningskromatografi, og gelfiltrering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Skematisk af krystallisation rørledning til dyrkning af krystaller af β-barrel OMP'er. Tre metoder kan anvendes til krystallisering af β-barrel OMP'er herunder screening vaskemiddel, bicelles, og lipid kubiske fase (LCP). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Nye værktøjer i krystallografi, som har væsentligt bidraget til at strukturere bestemmelse af β-tønde OMP. Eksempler omfatter krystallisering robotter / LCP robotter (A), UV mikroskoper (B), Second Order lineær Imaging af Chiral krystaller (SONICC) visualisering (C), robot pucke / robotter (D), rastering / vektor / spiralformet dataindsamlingsmetoder (E ), og microfocus bjælker (F). klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. Repræsentant billede af krystallerne som følge af protokollen. Krystaller fra screening og bicelles opvaskemiddel kan være så stor som krystalleropnået typisk for opløselige proteiner; Men dem fra LCP er næsten altid meget mindre. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9. Fra konstruktioner til krystaller til at strukturere beslutsomhed for den formodede vaccine target YiuR fra Yersinia pestis. Den samlede pipeline bruges til struktur bestemmelse af YiuR, illustrerer de skridt til klon, udtrykke, rense, krystallisere, og løse struktur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
β-tønde OMP'er tjene vigtige roller i Gram-negative bakterier, mitokondrier og kloroplaster og er vigtige mål for strukturel analyse, der tilbyder et væld af oplysninger om væsentlige molekylære mekanismer ved de ydre membraner af disse respektive organeller. Men der producerer nok prøve til strukturanalyse er ikke altid ligetil, og derfor er en generel rørledning præsenteret for produktion af tilstrækkelige mængder af target β-tønde OMPs for struktur bestemmelse, der i detaljer forklarer processen fra konstruktioner til krystaller. Selv om disse protokoller er blevet testet og fundet at arbejde for de fleste OMPs fra Gram-negative bakterier, der er begrænsninger i, at der er nogle mål, især for mitokondrier og kloroplaster, som kan kræve andre metoder til ekspression og oprensning. Som sådan bør de metoder, her være gældende for de fleste projekter, der involverer OMPs fra Gram-negative bakterier, men alligevel ekspressionsniveauets og mængden af oprenset prøve vil variere afhængigt af mål-OMP.
Der er to generelle fremgangsmåder til ekspression af β-barrel OMP'er til strukturelle studier, (1) in vivo-ekspression direkte i den ydre membran og (2) ekspression til inklusionslegemer til in vitro-refoldning. Til in vivo-ekspression tilgang, er β-barrel OMP'er målrettet mod ydre membran af E. coli, hvor de er indbygget foldet og isoleres direkte fra membraner. Ekspression til membranen er den foretrukne fremgangsmåde, da målene er mere tilbøjelige til at blive foldet korrekt. Mens denne fremgangsmåde typisk giver lavere samlede protein, det undgår de komplikationer undertiden forbundet med in vitro-genfoldning. Mange β-barrel OMP'er er blevet succesfuldt udtrykt på denne måde for strukturbestemmelse 4,5,11. Succes opnås ofte ved hjælp af et system, der bygger på lavt niveau konstitutiv ekspression fra en T7 fremmerr, men andre systemer, som er afhængige af induktion (dvs. IPTG, arabinose) til ekspression, er også rutinemæssigt anvendes med succes.
Ekspression direkte ind i den ydre membran kræver målproteinet til at have en N-terminal signalsekvens, som dirigerer ribosom-nascente kæde komplekset til Sec translocon, sekretion af det spirende β-tønde OMP til periplasmaet. Signalsekvensen spaltes på det periplasmiske side af den indre membran, så det er vigtigt, at signalsekvensen forud nogen N-terminal tags tilsat til målet. Den spirende β-tønde OMP derefter eskorteret af chaperoner gennem periplasmaet til BAM-komplekset til indsættelse i den ydre membran 2,3.
For mål, der ikke kan overudtrykkes i membranen, en alternativ metode er udtryk i organer for in vitro-refoldning 28-30 inklusion. Denne fremgangsmåde resulterer typisk i høj og robust udtryk of målproteinet. Det kan imidlertid være svært at identificere genfoldning betingelser, som refoldning kan være ineffektivt. Desuden kan det være vanskeligt at analysere, når målet β-tønde OMP er korrekt foldet. Alligevel er der mange eksempler på proteiner, der med succes er blevet refoldet til strukturelle studier, herunder OmpA 31, Ail 19, OmpF 32, og VDAC 33. For kloner, som ikke udtrykker på alle (nativt eller i inklusionslegemer) eller udtrykker men er ikke samles korrekt i membranen (nativt), kan man forsøge at mutere β-tønde til mere ligner den for E. coli 34,35. Aminosyresekvensen i β-signal af tønden domæne er vigtig for genkendelse og samling af BAM kompleks og variationer i β-signalsekvensen kan påvirke både ordentlig Biogenese og ekspressionsniveauer af mål-β-tønde OMP 11,34 betydeligt , 35. Korrekt integration af target β-barrel OMP kan overvåges ved screening for membranfraktionering og vaskemiddel ekstraherbarhed efterfulgt af varme for ændring assays.
Krystallisation af membranproteiner i nærvær af detergent miceller er den ældste teknik og tillader nem tilpasning af traditionelle opløseligt protein krystallisering udstyr og strategier. Ved at maskere membranen indlejrede regioner med detergentmolekyler, koncentreret protein kan behandles på en lignende måde til opløselige proteiner (f.eks blandet med krystallisations- moderlud og indesluttet i en dampdiffusion apparat, der forårsager den langsomme dehydrering af proteinet dråbe). Mens enkelt koncept, detergent kendetegn og egenskaber føjer en væsentlig lag af kompleksitet oven på de normale krystallisationsprocedurer udfordringer. Specifikt skal den molekylære karakter af et detergent empirisk tilpasset et givet målprotein, herunder micelle størrelse, hovedgruppe polaritet (anioniske, kationiske, nonioniske ellerzwitterioniske), og carbonhydridkædelængde, som hver af disse påvirker stabiliteten af målmembranen protein i opløsning. Ulemper ved denne fremgangsmåde omfatter den ikke-native kemiske miljø, potentiel tilsløring af overfladevand regioner, der kunne danne krystal kontaktpersoner og koncentration vaskemiddel spørgsmål.
Bicelles er en blanding af lipider og amfifiler (fx detergenter eller kortkædede lipider), der samles til individuelle partikler, der efterligner et dobbeltlag struktur svarende til membranerne, der findes i celler 36,37. De amfifile maskerer den hydrofobe kerne af denne dobbeltlag, hvor det udsættes ved sine kanter på en lignende måde til miceller i detergent krystallisation. Dette tilvejebringer en mere nativt-lignende miljø at hjælpe med at stabilisere målproteiner.
Membran protein mål kan også krystalliseres med lipide kubiske fase (LCP) metoder 38. LCP er et mesofase dannet ved blanding af lipid og vand, isom en kontinuerlig dobbeltlag er gennemsyret af to ikke-krydsende netværk af opløsningsmidler kanaler. Denne tredimensionelle struktur tillader diffusion af lipid indlejret membranproteiner i en stort set nativ-lignende miljø og tillader krystal kontakter til dannelse mellem de hydrofobe og hydrofile overflader af proteinerne og reducerer det samlede indhold af krystaller opløsningsmiddel og samtidig øge deres bestilling. Siden introduktionen i 1990'erne, har LCP teknikker været afgørende for, strukturerne af mange flygtige membran protein mål, såsom rhodopsiner 39,40 og GPCR'ere 41-43. Anvendelse af LCP i høje throughput skærme kræver særlige bestemmelser (dvs. LCP-specifikke robot, gastætte sprøjter, LCP dispensering værktøj, sandwich krystallisering plader, etc.) som den tykke monoolein almindeligt anvendt til LCP ikke kan håndteres af traditionel nanoliter væskehåndtering robotter.
Gelfiltreringskromatografi er et yderst vigtigt skridttil krystallisation af membranproteiner i almindelighed, fordi den giver information om, hvordan stabilisere den valgte detergent er til membranprotein target, hvilket kan visualiseres ved kromatogrammet. Ved sammenligning af mængden af prøven i hulrumsvolumenet, retentionstider og former af toppene, der er adgang til generel stabilitet og monodispersitet af prøven. En ideel prøve ville have meget lidt til ingen tabt i det tomme volumen prøven og ville have en enkelt symmetrisk eluering top med en Gaussisk fordeling. Den detergenter C 8 E 4 (0,8%), OG (1,0%), og LDAO (0,05%) anvendes rutinemæssigt til krystallisation af β-barrel OMP'er med succes og er gode til at starte med. Ideelt set er eksperimenter i mindre målestok ved at sammenligne flere rengøringsmidler eller blandinger af rengøringsmidler at afgøre, hvilke der er mest hensigtsmæssigt for krystallisering. De, der findes at være mest stabiliserende anvendes derefter til skala præparater af target β-ba storerrel OMP og til krystallisation forsøg.
Når krystaller er dannet af målet β-tønde OMP, bly optimering (dvs. additiv screening, cryo-screening, detergentadditiv screening, etc.) og andre teknikker svarende til opløselige protein-targets kan følges med få forskelle. Der er dog nogle nylige fremskridt, der er ekstremt nyttigt, når der arbejdes med membranproteiner. Specifikt kan membran proteinkrystaller ofte være svært at opdage inden for deres moderlud for en række forskellige årsager. Membranproteiner danner ofte relativt små krystaller og falske positiver kan bortlede krystal optimering. LCP teknikker især tilstedeværende yderligere udfordringer, givet de højviskose, ofte uigennemsigtige miljøer, hvor krystallerne dyrkes. Strategier til at løse disse problemer omfatter brug af ultraviolet mikroskoper (UV), sammenholdt med lys mikroskoper, så naturligt fluorescerende protein krystaller at skelne from ikke-fluorescerende salt og detergent krystaller (figur 7). Udfordringer forbliver dog i positiv identifikation af protein krystaller, der danner inden områderne fældningsmiddel. Krystaller kan også påvises ved udnyttelse af frekvensen fordobling effekt af de fleste chirale krystaller når afbildet af femtosekund scanning laser pulser, som gennemført ved SONICC teknologi 44. Denne høje opløsning, høj kontrast teknik anvendes til at skelne submicron krystaller ud fra tilslører betingelser.
Høst membranproteiner ved anvendelse af standardteknikker krystallografiundersøgelser teknikker, især for vaskemiddel og bicelle krystallisering. Looping udføres i hånden med en lav forstørrelse mikroskop og en krystal-montering løkke (dvs. nylon fiber, tråd, eller polymer). Fugtspredende af overskydende opløsningsmiddel og cryo beskyttelse før styrte frysning i kryogene væske også standardprocedurer, når høst β-tønde OMP krystaller. Imidlertid høsting af LCP vokset krystaller præsenterer særlige problemer, især hvis høst direkte fra sandwich plader, som krystaller kan være svært at få adgang til og kan ikke let iagttages gennem mikroskopet. Desuden skal krystaller dyrket i LCP undertiden høstes i bulk da LCP blandingen ikke let kan adskilles i sløjfen.
Dataindsamling til β-tønde OMP'er kan udføres som med opløselige protein krystaller med kun et par ekstra overvejelser. Mens størrelsen af krystaller dyrket ved detergent og bicelle metoder er ofte sammenlignelige med dem, der dyrkes med opløselige proteiner, krystaller produceret af LCP-metoden er næsten altid betydeligt mindre. Hertil kommer, fordi prøver høstet fra LCP matrix ofte indeholde flere krystaller, som er vanskelige at observere, man skal udnytte synkrotron kilder, der har mini-beam og loop rastering kapaciteter, som systematisk kan scanne hele løkken til at lokalisere positionen af krystaller baseret på diffraktion (figur 7). Den lille størrelse af LCP-krystaller også gør dem særligt modtagelige for skader stråling. Derfor data fra flere krystaller er ofte slået sammen for at samle en komplet datasæt.
Når godt diffrakterende krystaller opnået, og et komplet datasæt opsamles, kan strukturbestemmelse for β-tønde OMP'er opnås ved hjælp af de samme procedurer som for opløselige proteiner, holde sig for øje, at membran protein krystaller udviser generelt et højere indhold af opløsningsmidler. Som med alle krystallografiundersøgelser mål, hvad enten opløseligt protein eller membranprotein, tilbyder hver sine egne udfordringer og derfor ingen enkelt rørledning kan direkte anvendes på alle målene. Det er derfor en opgave for den primære forsker (e) for at tilpasse disse generelle protokoller i overensstemmelse hermed for at sikre succes for hans / hendes projekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | - | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | - | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | - | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | - | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | - | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | - | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | - | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | - | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | - | |
| SS34 rotor | Sorvall | - | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | - | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | - | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | - | |
| Gas-tight syringe (100 ml) | Hamilton |
References
- Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
- Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
- Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
- Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
- Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
- Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
- Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
- van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
- Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
- Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
- Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
- Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
- Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
- Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
- Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
- Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
- Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
- Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
- Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
- Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
- Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
- Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
- Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
- Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
- Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
- Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
- Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
- Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
- Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510 (2012).
- Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
- Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
- Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
- Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
- White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
