Introduction
β-barrel OMP's alleen worden gevonden in het buitenmembraan van mitochondria, chloroplasten, en Gram-negatieve bacteriën 1-3. Terwijl ze gelijkaardige rol dienen als α-helix eiwitten, ze hebben een heel andere plooi bestaande uit een centrale membraan ingebedde β-barrel domein variërend 8-26 antiparallelle β-strengen met elk onderdeel zijn nauw verbonden met de twee aangrenzende strengen (figuren 1 en 2). De eerste en laatste strengen van het β-barrel domein interageren dan met elkaar bijna uitsluitend in een anti-parallelle wijze (behalve mitochondriale VDAC), sluiten en afdichten van de β-barrel domein van de omringende membraan. Alle β-barrel OMP's zijn extracellulaire lussen van verschillende sequentie en lengte die een belangrijke rol ligand interacties en / of eiwit-eiwit contacten spelen met deze loops soms zijn zo groot als 75 resten, zoals in Neisseria transferrine bindende proTein A (TbpA) 4. β-barrel OMP kunnen ook N-terminale of C-terminale periplasmatische extensies, die als extra domeinen dienen voor het eiwit functioneel doel (bijv BAMA 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Hoewel vele soorten β-barrel OMP aanwezig 11 zijn twee van de meest voorkomende hierna beschreven als voorbeeld voor niet-ervaren het veld (1) TonB-afhankelijke transporters en (2) autotransporters.
TonB-afhankelijke transporters (bv, FEPA, TbpA, BTub, Cir, etc.) zijn essentieel voor voedingsstoffen import en bevatten een N-terminaal plug domein bestaande uit ~ 150 resten die gevonden is weggestopt in een C-terminaal 22-stranded β- barrel domein ingebed in de buitenste membraan 12 (figuur 3). Hoewel deze plug domein voorkomt substraat vrijelijk door het vat domein, substraatbinding induceert een conformationele verandering binnen het plug domein thbij leidt tot de vorming van poriën (hetzij door plug herschikking of door gedeeltelijke / volledige uitwerpen van de stop), die vervolgens substraat transport over de buitenste membraan kan faciliteren in het periplasma. TonB-afhankelijke transporteurs zijn vooral belangrijk voor de overleving van sommige pathogene stammen van Gram-negatieve bacteriën zoals Neisseria meningitidis die gespecialiseerde transporteurs die voedingsstoffen kapen zoals ijzer direct uit menselijke gastheer- 4,13,14 geëvolueerd.
Autovrachtwagens behoren tot het type V secretiesysteem van Gram-negatieve bacteriën en zijn P-barrel OMP's die bestaan uit een β-barrel domein (typisch 12-strengen als met ESTA en ESPP) en een passagier domein dat ofwel wordt uitgescheiden en gepresenteerd op de oppervlak van de cel 15,16 (figuur 3). De β-barrel OMP's dienen vaak een belangrijke rol in celoverleving en virulentie bij de passagier domein dienen ofwel als een protease, adhesine, en / of andere effector die bemiddelt pathogenese.
Structurele werkwijzen zoals röntgenkristallografie, NMR-spectroscopie en elektronenmicroscopie (EM) laten modellen bepalen de OMP's bij atomaire resolutie die weer gebruikt kan worden om te ontcijferen hoe ze functioneren in het buitenmembraan. Deze waardevolle informatie kan dan worden gebruikt voor het geneesmiddel en vaccinontwikkeling, indien van toepassing. Bijvoorbeeld, transferrine bindend eiwit A (TbpA) gevonden op het oppervlak van Neisseria en is vereist voor pathogenese omdat het direct bindt humaan transferrine en vervolgens extraheert en invoert ijzer tot zijn eigen overleving. Zonder TbpA, kan Neisseria niet vangen ijzer uit de menselijke gastheer en zijn gemaakt van niet-pathogene. Na de kristalstructuur van humaan transferrine gebonden aan TbpA 4 opgelost, het veel duidelijker hoe de twee eiwitten geassocieerd werden, welke gebieden van TbpA gemedieerde interactie, welke residuen belangrijk ijzer extractie waren door TbpA enhoe men zou kunnen ontwikkelen therapieën tegen Neisseria targeting TbpA. Daarom, gezien het belang van β-barrel OMP's in Gram-negatieve bacteriën om te overleven en pathogenese, en in mitochondria en chloroplasten functie en de behoefte aan aanvullende structurele informatie over deze unieke klasse van membraaneiwitten en de systemen waarin ze functioneren , algemene protocollen worden met de algemene doelstelling van het uitdrukken en zuiveren doel OMP op een hoog niveau voor de karakterisering door structurele methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Klonen en expressie
Opmerking: Om structurele studies schakelen, moet voldoende hoeveelheden zeer zuivere eiwit worden bereid, en dit begint meestal met de klonering en overexpressie van het beoogde β-barrel buitenmembraan proteïne (OMP) in E. coli (Figuur 4). Tot op heden alle β-barrel OMP structuren, waaronder die voor mitochondriale structuren VDAC zijn afgeleid van bacterieel tot expressie gebrachte eiwit 11. Hier worden de algemene protocollen gepresenteerd voor het kloneren en het uiten van β-barrel OMP voor (1) inheemse expressie rechtstreeks in bacteriële membranen en (2) expressie in insluitsels lichamen voor in vitro hervouwen 17.
- Het ontwerpen van een Expression Construct
- Verkrijgen of de aankoop van de codon geoptimaliseerde doel OMP-gen.
- Aankoop of verkrijgen van een T7 expressievector (i) die een periplasmatische localisatie signaalsequentie, een N-terminaal 6x-histidine tag,en een TEV protease plaats 4,18,19 in vivo expressie de membraan of (ii) zonder periplasmatische localisatie signaalsequentie voor expressie insluitingslichamen in vitro opnieuw vouwen.
Opmerking: Een N-terminale protease splitsbare 6x of 10x-histidine tag zou een eenvoudige methode voor zuivering. Zoals met oplosbare eiwitten, variëren de keuze van affiniteitsmerker (Histidine, Strep, GST, etc.), de positie van de affiniteit tag, en het opnemen van een proteaseplaats (TEV, enterokinase, thrombine, etc.) voor daaropvolgende tag verwijderen . - PCR amplificeren van de doelsequentie met geschikte primers en subkloon in de expressievector. Gebruik ligatie onafhankelijke klonen (LIC) 20,21 of conventionele kloontechnieken (restrictie-enzymen / ligatie) te subkloneren. Echter, LIC hoge doorvoer te vergemakkelijken, waardoor een groot aantal verschillende constructen (afknottingen, verschillende markeringen, verschillende promoters) te kloneren parallel moregemakkelijk.
- In vivo Membraan-gerichte Expression
- Met sequentieanalyse om de doelstelling β-barrel OMP gekloneerd stroomafwaarts en in frame met een signaalsequentie controleren (bijv pelB, OmpA) in het expressieconstruct.
Opmerking: De signaalsequentie stuurt de ontluikende keten de Sec translocon voor uitscheiding naar het periplasma en de daaropvolgende constructie in de buitenmembraan. - Transformeer de construct in een expressievector bacteriestam voor expressie door pipetteren 1,0 pl plasmide in 50 pl BL21 (DE3) chemisch competente cellen en meng voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer op ijs gedurende 30 min.
- Warmte puls op 42 ° C voor 30 sec met een waterbad en vervolgens terugplaatsen op ijs gedurende 1 minuut.
- Voeg 1 ml voorverwarmde SOC media en schud bij 37 ° C gedurende 1 uur bij 1000 rpm met een benchtop schudder incubator.
- Plaat 100 ul van cellen op LB-agarplaten met een geschikt Antibiotic en incubeer overnacht bij 37 ºC omgekeerd.
- Het uitvoeren van kleinschalige expressie testen door het enten van een 5 ml LB + antibioticum cultuur met een enkele kolonie. Herhaal dit voor 5-10 kolonies.
Opmerking: vanwege de mogelijke toxiciteit van een β-barrel OMP en de afhankelijkheid van basale expressieniveaus wordt kolonie naar kolonie variabiliteit soms waargenomen. Daarom screening meerdere kolonies wordt aanbevolen voor elk construct getest. Voor kleinschalige expressie testen, in plaats van de conventionele 5 ml culturen, groeit 25 ml culturen in 125 ml verbijsterd erlenmeyers wordt gesuggereerd. Deze voorwaarden zijn vaak beter weer te geven wat er zal gebeuren in een grootschalige groei. Daarnaast is het een goed idee om ook screenen verschillende soorten kweekmedia (TB, LB, 2xYT, M9, enz.), Aangezien wisselend succes gemeld afhankelijk van het doeleiwit.- Groeien bij 37 ° C onder schudden tot een OD 600 van ~ 0,6.
- Induceren expressie van het doel OMP door adding 5 ui 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) aan elke kweekbuis en laat nog eens 1-2 uur groeien.
- Vergelijk expressieniveaus van alle kolonies door centrifugeren 1 ml van elke kweek (OD 600 van ~ 0,6) gedurende 1 min bij 15.000 xg behulp van een microcentrifuge.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 200 ui 1 x SDS-PAGE laadbuffer. Verhitting tot 100 ° C gedurende 5 minuten en centrifugeer weer bij 15.000 g gedurende 5 min.
- Analyseer de monsters met behulp van SDS-PAGE pipetteren 20 pl in elk putje van een 10% gel. Voer de gel gedurende 35 min bij een constante 200 V.
Opmerking: Het zou goed op dit punt te kunnen bepalen of het eiwittarget goed wordt gevouwen of niet. Dit kan vaak worden bereikt door het doen van kleinschalige zuiveringen of door te testen op warmte aanpasbaarheid.
- Selecteer de kolonie met de beste uitdrukking en het uitvoeren van grootschalige expressie met behulp van 12-24 L van medium.
Opmerking: Gebruikelijke werkwijzen typisch groeien de kweken bij 37 ° C onder schudden tot een OD 600 van ~ 0.6 en vervolgens te induceren met een geschikte inducer (dat wil zeggen, 0,1-1 mm voor IPTG of ~ 0,2% voor arabinose) voor een extra 2-4 hr . Indien gewenst, voorafgaand aan de inductie, verlagen de temperatuur zo laag als 20 ° C en verlengen de inductietijd.- Voor lekkende expressie methode, groeien een 25 ml te enten cultuur bij 37 ° C in LB medium dat het juiste antibioticum (s) tot OD 600 bereikt ~ 0,6. Voeg vervolgens 1 ml inoculum twaalf 1 L flessen TB medium met antibioticum (en) en groeit bij 20 ° C tot verzadiging (~ 3 dagen).
- Oogst de cellen door centrifugeren bij 6000 xg gedurende 10 min.
- Ga verder met zuiveringsstap paragraaf 2.1 of bevriezen van de cel pellet in vloeibare stikstof voor langdurige opslag bij -80 ºC.
- Met sequentieanalyse om de doelstelling β-barrel OMP gekloneerd stroomafwaarts en in frame met een signaalsequentie controleren (bijv pelB, OmpA) in het expressieconstruct.
- Uitdrukking Inclusion Bodies voor in vitro Refolding
- Met sequentieanalyse om het expressieconstruct verifiëren niet een signaalsequentie bevat. De afwezigheid van een signaalsequentie zal het doeleiwit rechtstreeks te accumuleren in het cytosol als inclusielichamen.
- Transformeer de expressie construct in een uitdrukking bacteriestam voor expressie. Voor opname lichaam expressie, is het het beste om expressie door middel van inductie (dat wil zeggen, IPTG, arabinose, etc.) controleren om mogelijke toxiciteit te minimaliseren.
- Plaat 100 ul van getransformeerde cellen op LB agarplaten met een geschikt antibioticum en incubeer overnacht bij 37 ° C omgekeerd.
- Het uitvoeren van kleinschalige expressie testen door het enten van een 5 ml LB + antibioticum cultuur met een enkele kolonie.
- Herhaal stap 1.3.4 2-4 extra kolonies.
- Groeien bij 37 ° C onder schudden tot een OD 600 van ~ 0,6.
- Induceren met een geschikte inducer voor 1-2 uur.
- Vergelijk expressie niveaus voor alle tHij kolonies door analyse met behulp van SDS-PAGE (zie stap 1.2.6). Selecteer de kolonie met de beste uitdrukking en het uitvoeren van grootschalige expressie met behulp van 12-24 L van medium.
- Groeien de cellen bij 37 ° C tot een OD600 van 0,6-0,8 en induceren bij 37 ° C gedurende 3-5 uur. Terwijl expressie insluitingslichamen is robuuster dan andere vormen van expressie, zoals met alle eiwitexpressie experimenten kan expressie worden verbeterd door het variëren van groeimedium, inductiefase, temperatuur van inductie, en concentratie van het inducerende middel.
- Oogst de cellen door centrifugeren bij 6000 xg gedurende 10 min.
- Ga verder met zuiveringsstap paragraaf 2.2 of bevriezen van de cel pellet in vloeibare stikstof voor langdurige opslag bij -80 ºC.
2. Zuivering
- Isolatie van membraanfracties
Opmerking: In tegenstelling tot oplosbare eiwitten, integrale membraaneiwitten zijn ingebed in de lipide bilaag en duseisen detergentia uitpakken voor verdere zuivering en analyse (figuur 5). Na expressie, de eerste stap bij de zuivering van een β-barrel OMP is extractie van de membraanfractie.- Resuspendeer cellen in lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 ug / ml AEBSF, 5 ug / ml DNase I) in een verhouding van 5 ml / g celpasta.
- Lyse van de cellen met behulp van een Franse pers of cel homogenisator. Spin de gelyseerde cellen bij 15.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C om niet-gelyseerde cellen en celresten te verwijderen.
- Breng de supernatant naar een schone buis en centrifugeer weer met hoge snelheid (200.000 x g) gedurende 1 uur bij 4 ° C. De resulterende pellet is de membraanfractie die het gewenste eiwit bevat.
- Met behulp van een Dounce homogenisator resuspendeer de membraanfractie eerst overbrengen van de membranen en vervolgens het toevoegen oplosbuffer (50 mM KH 2PO 4 pH 7,5, 200 mM NaCl, 20 mM imidazool, PH 8,0) (50 ml per 20 g cellen) en 2x concentratie zonder detergens.
- Giet de geresuspendeerde membranen in een klein bekerglas en wasmiddel (bijvoorbeeld n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), lauryldimethylamine-N-oxide (LDAO), n-octyl-β-D-glucopyranoside (OG), Triton X-100, etc.) langzaam tot een uiteindelijke concentratie van ~ 10x kritische micel concentratie (CMC).
- Vul met water tot een uiteindelijke concentratie van 1x Oplossen buffer. Roer gedurende 0,5-16 uur bij 4 ° C, afhankelijk van het gemak waarmee het doeleiwit wordt gewonnen uit de membranen.
Noot: Detergent wordt gebruikt om langzaam oplosbaar de membranen om het doeleiwit te extraheren. Er zijn 3 soorten wasmiddelen die hier kunnen worden gebruikt: ionische (SDS, deoxycholinezuur), niet-ionische (Elugent, TWEEN, Triton X-100, OG, DDM), en zwitterionische (LDAO, CHAPS). Een eiwit-detergens complex dat stabiel en monodispers is tijdens de zuiveringsstap wordt sterk helpen bij het succes membraaneiwit krision. Meer informatie over detergentia, hun eigenschappen, CMC informatie en hun gebruik bij de zuivering van membraaneiwitten en andere toepassingen zijn te vinden op commerciële leveranciers websites. - Centrifugeer de opgeloste monster bij 300.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Het supernatant bevat nu de detergens gesolubiliseerde doel β-barrel OMP.
- Ga verder met paragraaf 2.3 zoals hieronder beschreven.
- Hervouwing uit Inclusion Bodies
Opmerking: Voor in vitro opnieuw vouwen, het doel β-barrel OMP wordt rechtstreeks uitgedrukt in inclusielichamen. Een voordeel is dat deze eiwitten kunnen worden geproduceerd hoog. Maar het nadeel is dat het opnieuw vouwen vaak inefficiënt en verschilt van hervouwing experiment naar de volgende. Toch zijn er veel voorbeelden van eiwitten die met succes hervouwen voor structurele studies. Na expressie in inclusielichamen moet men nu de inclusielichamen voor hervouwing experiment isolerens.- Resuspendeer cellen in lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 ug / ml AEBSF, 5 ug / ml DNase I, 4 mM 2-mercaptoethanol (BME)) (5 ml per g celpasta). Lyse behulp van een Franse pers, sonificatie of cel homogenisator.
- Pellet de inclusielichamen met een lage snelheid centrifugeren bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Was de inclusielichamen door resuspenderen in 25 ml van 1,0 M ureum met een dounce homogenisator. Pellet opnieuw met een lage snelheid centrifugeren bij 6000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C.
- Herhaal stap 2.2.3 nodig.
- Resuspendeer de gewassen inclusielichamen tot een uiteindelijke concentratie van 10 mg / ml middels buffer bevattende 8,0 M ureum (of 6,0 M guanidine hydrochloride (GdCl)) plus detergens (bijv DDM of LDAO) en 2x CMC of hoger.
Opmerking: Indien gewenst, membraaneiwit targets die een histidine tag, kan geïmmobiliseerde metaal affiniteitschromatografie (IMAC) zuivering worden uitgevoerd met behulp denaturerende conditions (in 8,0 M ureum of 6,0 M GdCl) als een eerste stap vergelijkbaar met die hieronder beschreven in paragraaf 2.3. - Voer de hervouwingsreactie door langzaam (gedurende de nacht) het verwijderen van het denaturerende door dialyse in buffer zonder het denatureringsmiddel.
Opmerking: het kan een aantal wijzigingen van de dialyse buffer te nemen om dit te bereiken. Een defect inclusielichamen eerst worden gebonden aan een IMAC kolom, kan de hervouwingsreactie doen terwijl aan de kolom gebonden door langzaam wisselen buffers aan het denatureringsmiddel te verwijderen. In beide gevallen geldt dat dit een membraaneiwit moeten daarom detergens om het doel te stabiliseren. Ook als het afwasmiddel gebruikt wordt gedialyseerd, moet worden aan de dialyse buffer (fen) toegevoegd. - Draai het hervouwen monsters bij 200.000 xg gedurende 1 uur bij 4 ° C. Het supernatant bevat het hervouwen detergens gesolubiliseerde doel β-barrel OMP.
- Ga verder met paragraaf 2.3 zoals hieronder beschreven.
- Zuivering met behulp van IMAC, Ion-Exchange en Gel Filtration
Opmerking: Uitgaande van het eiwit is ontworpen met een histidine tag, of native uitgedrukt of hervouwen toepassing van in vitro werkwijzen, vervolgens geïmmobiliseerd metaal affiniteitschromatografie (IMAC) wordt uitgevoerd voor het zuiveren net als voor histidine tag oplosbare eiwitten, behalve detergens worden bewaard alle volgende buffers om de doelstelling β-barrel OMP oplosbaar en stabiel.- Bereid een ml IMAC kolom 1-5 of gebruik een voorverpakte kolom. Opeenvolgende chromatografiestappen bij 4 ° C. Spoelen met water om alle sporen van conserveringsmiddelen verwijderen. Bij gebruik van een geautomatiseerd zuiveringssysteem, installeert de kolom volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid 500 ml van IMAC buffer A (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM) en 250 ml van IMAC buffer B (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM en 1,0 M imidazool).
Opmerking: andere detergenten die ik kan worden gebruiktnclude cymal-6 (0,05%), Triton X-100 (0,03%) en LDAO (0,05%). - Equilibreren de IMAC kolom met 10 kolomvolumes buffer A. IMAC
- imidazool toevoegen eiwitmonster tot een eindconcentratie van 25 mM en meng. Plaats het monster op de geëquilibreerde IMAC kolom bij 2 ml / min. Verzamel de doorstroming.
- Was de kolom IMAC met 5 kolomvolumes elk van toenemende concentraties imidazool gebruik buffer B (bijvoorbeeld 25 mM, 50 mM, 100 mM). Verzamel de wassingen in 2 ml fracties.
- Elueer het monster met een eindconcentratie van 250 mM voor 5 kolomvolumes. Verzamel de geëlueerde monster in 2 ml fracties.
- Analyseer door middel van de stroom, het wassen fracties en de elutie fracties middels SDS-PAGE-analyse (zie stap 1.2.6) op basis van hun absorptie bij 280 nm. Verzamel de fracties die het doelwit β-barrel OMP bevestigd door SDS-PAGE-analyse.
- Verwijder de 6x-histidine tag door het toevoegen van TEV protease aan de samengevoegde monster (volgenshet protocol van de fabrikant) en incubatie overnacht bij 4 ° C met zachte wiegen.
- Laad het monster / protease-oplossing op een IMAC kolom weer om de doelstelling β-barrel OMP scheiden (doorstroming) van de gesplitste labels en eventuele ongesplitste monster. De stroming door de gesplitst monster ontbreekt de tag bevatten.
Opmerking: Dit zou ook eventuele protease te verwijderen, zoals TEV-His, die ook een niet-splitsbaar 6x-histidine tag zelf. Anders zullen andere werkwijzen nodig om de protease na digestie verwijderen. - Eventueel voeren ionenuitwisseling chromatografie om het monster verder te zuiveren. De instructies van de fabrikant voor de kolom te gebruiken, waarbij u detergens omvatten alle buffers.
- Ter voorbereiding van kristallisatie, laadt het monster op een gelfiltratiekolom in een buffer die het detergens te gebruiken voor kristallisatie, zoals 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1% OG.
- Verzamel 1 ml fracties en USI analyserenng SDS-PAGE-analyse (zie Stap 1.2.6) op basis van hun absorptie bij 280 nm. Zwembad fracties met absorpties bij 280 nm en ze bevatten het doeleiwit. Concentreer tot ~ 10 mg / ml.
Opmerking: Desgewenst kan juiste vouwing worden beoordeeld met behulp van een warmte aanpasbaarheid test zoals hieronder beschreven.
- Heat aanpasbaarheid Assay
Opmerking: Een methode om juiste vouwing van gezuiverd β-barrel OMP is om warmte aanpasbaarheid assays onder toepassing van een semi-natieve SDS-PAGE 22 voeren bewaken. Hier vindt onverwarmde monsters die goed zijn gevouwen meestal migreren anders degenen die warmte zijn gedenatureerd. Deze eigenschap is uniek voor P-barrel OMP en op grote schaal gebruikt om deze familie van membraaneiwitten te bestuderen.- Voorafgaand aan de voorbereiding van monsters, de montage van de gel apparaat. Om te beginnen, plaats de buffertank in een ijsemmer en omringen volledig met ijs. Plaats een intern gegoten of commerciële natieve gradient gel in de houder en plaats in de tank. Vul tHij tank volledig met koud 1x MES loopbuffer (50 mM 2- [N-morfolino] ethaansulfonzuur, 50 mM Tris base, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,3).
- Pipetteer 0,25 ul van het monster (10 mg / ml) in twee 1,5 ml microcentrifugebuizen. Label een als "gekookte" en de andere als "RT".
- Voeg 9,75 ul van het monster buffer aan elke en meng door pipetteren. Om beide monsters, voeg 10 ul 2x SDS-laadbuffer (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% broomfenol blauw en 20% glycerol) en meng voorzichtig door pipetteren.
- Kook de 'gekookte' monster bij 95 ° C gedurende 5 minuten terwijl het monster 'RT' bij RT. Draai de 'gekookte' sample kort.
- Belasting 20 pi van beide monsters op de voorgemonteerde inheemse gel. Looptijd van 60 minuten bij 150 V constant Verwijder de gel en geniet in kleuroplossing om de resultaten te visualiseren.
3. Kristallisatie
Opmerking: Voor de kristallisatie van beideoplosbaar en membraan eiwit targets, is het standaard protocol om sample zuiverheid en stabiliteit (dat wil zeggen, beste wasmiddel, liganden, co-factoren, etc.) te maximaliseren. Huidige methoden voor het kristalliseren membraaneiwit targets algemeen omvat drie belangrijke benaderingen die voldoen aan de amfifiele eisen van bilaag ingebedde eiwitten: (1) detergens, (2) Bicelle, en (3) lipide kubische fase (LCP) (figuur 6) 23. Toepassing van een nanoliter kristallisatie robot wordt sterk aanbevolen indien mogelijk om het aantal aandoeningen die kunnen worden gescreend op een gegeven monstervolume, evenals gebruikmaking recente vooruitgang in instrumenten ter beschikking waarmee struktuurbepaling (figuur 7) helpen verhogen.
- Kristallisatie met behulp van Wasmiddelen
- Verkrijgen van een detergens gesolubiliseerde eiwit monster dat bij ~ 10 mg / ml concentratie. Eventueel deze direct het additief 1,2,3-heptanetriol het monster tot een eindconcentratie van 3% te verlagen producent micel grootte.
- Filter het monster met behulp van een 0,22 pm centrifugaal filter om deeltjes en neerslag te verwijderen.
- Met behulp van een kristallisatie robot, voert brede matrix kristallisatie screening met in de handel verkrijgbaar 96 en schermen door een hangende of zittend druppel verdamping methode met druppels bestaat uit ~ 200 nl eiwit monster en ~ 200 nl kristallisatie buffer.
- Incubeer de platen bij kristallisatie ~ 21 ° C. Inspecteer de platen per week gedurende kristalgroei met behulp van een stereomicroscoop.
- Optimaliseren leads kristallisatie door het variëren van de componenten kristallisatie toestand op systematische wijze (verhogen / verlagen zout of neerslagmiddel concentratie, pH, incubatietemperatuur en / of eiwitconcentratie).
- Met behulp van kristallisatie Bicelles
Opmerking: Een meer gedetailleerde demonstratie van Bicelle technieken is eerder beschreven door Ujwal Abramson en 24.- Bereid of aankoop van een 35% Bicelle mengsel bestaande uit DMPC: CHAPSO in een verhouding van 2,8: 1 volgens gepubliceerde protocollen 25. Andere concentraties kunnen worden bepaald, evenals andere lipiden en detergenten, indien nodig.
- Verkrijgen van een detergens gesolubiliseerde eiwit monster dat bij ~ 10 mg / ml concentratie.
- Voeg de Bicelle mengsel op ijs bij een beginnend verhouding van 4: 1 v / v (eiwit: Bicelle) (bijvoorbeeld, voeg 10 pl Bicelle mengsel 40 pl proteïne en meng snel door pipetteren).
- Incubeer op ijs 30-60 min.
Opmerking: Het eiwit: Bicelle oplossing moet vooral helder blijven, maar kan blijken vaak enigszins ondoorzichtig. Indien het eiwit: Bicelle omslaat melkwit, precipitatie aangeeft, dan kunnen andere variabelen worden getest (bijv detergens, buffer, etc.). Voor nieuwe monsters, het doen van kleine schaal testen (8 ul-eiwit en 2 pl bicelles) wordt aanbevolen om de stabiliteit te controleren voorafgaand aan de opschaling naar onnodige monster verlies te voorkomen. - Met behulp van een kristallisatie robot, voert brede matrix kristallisatie screening met in de handel verkrijgbaar 96 en schermen door een hangende of zittend druppel verdamping methode met druppels bestaat uit ~ 200 nl eiwit monster en ~ 200 nl kristallisatie buffer.
- Incubeer de platen bij kristallisatie ~ 21 ° C. Inspecteer de platen per week gedurende kristalgroei met behulp van een stereomicroscoop.
- Optimaliseren leads kristallisatie door het variëren van de componenten kristallisatie toestand op systematische wijze (verhogen / verlagen zout of neerslagmiddel concentratie, pH, incubatietemperatuur en / of eiwitconcentratie).
- Met behulp van kristallisatie lipidische Cubic Phase (LCP)
Opmerking: Een meer gedetailleerde demonstratie van LCP technieken is eerder beschreven door Liu en Cherezov 26,27.- Verkrijgen van een detergens gesolubiliseerde eiwit monster dat bij ~ 20 mg / ml concentratie.
- Pre-warm de monooleïne tot ~ 40 ºC. Laden60 ul-oleïne in een gasdichte 100 ul spuit en 40 ul eiwit monster in een andere.
- Met behulp van een mengen koppeling, sluit de spuiten, dat evenwel niet tot de lucht te introduceren.
- Meng voorzichtig door het toepassen afwisselend druk op de spuit plunjers duwen het mengsel van de ene spuit naar de andere volledig totdat het monster doorschijnend en homogeen.
- Met behulp van een kristallisatie robot ontworpen voor LCP methoden uit te voeren brede matrix kristallisatie screening met in de handel verkrijgbaar 96 en schermen met sandwich-stijl kristallisatie platen (0,1 mm en dikte) met druppels bestaat uit 100 nl eiwit monster en 750 nl kristallisatie buffer.
Opmerking: Drop-verhoudingen kan worden aangepast indien nodig. Ook vaste dekking (dwz, glas of dikke plastic) aanbevolen waarbij de druppels mooi dan dunne films, die de neiging om de druppels te bewegen de en de platen worden afgehandeld ondersteunen. - Incubeer de kristallisatie plates bij ~ 21 ° C. Inspecteer de platen per week gedurende kristalgroei met behulp van een stereomicroscoop.
- Optimaliseren leads kristallisatie door het variëren van de componenten kristallisatie toestand op systematische wijze (verhogen / verlagen zout of neerslagmiddel concentratie, pH, incubatietemperatuur en / of eiwitconcentratie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
YiuR een TonB afhankelijk ijzer transporter die een vermeende vaccin doelgroep tegen Yersinia pestis. Het werd oorspronkelijk geïdentificeerd met behulp van een microarray analyse. Hier zijn de stappen die werden genomen om de structuur van YiuR bepalen met X-ray kristallografie worden geschetst (Figuur 9). Voor klonering van de DNA-sequentie YiuR (minus het N-eindstandige signaalsequentie) werd PCR geamplificeerd uit genomisch DNA en gesubkloneerd in een vector die een N-terminale signaalsequentie pelB en 10x-Histidine affiniteit tag gevolgd door een TEV protease plaats. Voor expressie werd de YiuR bevattende plasmide getransformeerd in BL21 (DE3) competent cells en een enkele kolonie gebruikt om een 5 ml startercultuur groeien tot OD600 -0,5. Twaalf kolven die 750 ml TB-medium werden vervolgens geïnoculeerd met 1 ml van de startercultuur en liet men groeien gedurende 3 dagen bij 20 ° C (schudden bij 220 rpm). De cellen werden daarna geoogst, productie van ongeveer 150-200g totaal celpasta, die flash afgekoeld in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot gebruik.
Voor zuivering van YiuR werd 20 g cellen in 120 ml 1x PBS geresuspendeerd (10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4) werd geroerd bij kamertemperatuur onder DNase I en AEBSF worden toegevoegd. Lysis werd uitgevoerd door twee doorgangen door een homogenisator. Het lysaat werd vervolgens gecentrifugeerd bij 12.000 xg gedurende 10 min (om naar beneden draaien ongebroken cellen en insluitingslichamen). Het supernatant werd opnieuw gecentrifugeerd bij 235.000 xg gedurende 60 min, met de pellet met de membraanfractie (YiuR). De membranen werden vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 100 ml 1 x PBS onder toepassing van een dounce homogenisator. YiuR was oplosbaar / onttrokken membranen gebruikt Elugent bij 5% eindconcentratie overnacht roeren (tot 16 uur) bij 4 ° C. De gesolubiliseerde membranen werden vervolgens opnieuw gecentrifugeerd bij 371.000 xg gedurende 60 min, met de supernatant met de opgeloste fractie waaronder YiuR. YiuR te isoleren, werd uitgevoerd onder toepassing IMAC Buffer A (1 x PBS, 0,1% DDM) en Buffer B (1x PBS, 1 M imidazool, 0,1% DDM), gewassen met imidazool concentraties 30-50 mM en werd met 250-500 mM . Aan het N-terminale 10x-Histidine tag te verwijderen, incubatie met TEV protease HIS werd overnacht uitgevoerd bij 4 ° C gedurende dialyse in 1 x PBS-buffer. Het monster werd vervolgens over een IMAC-kolom opnieuw de stroom door geconcentreerd, gedialyseerd en vervolgens gescheiden verder met een 0-1,0 M NaCl gradiënt op een ionenuitwisselingskolom in 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Fracties die YiuR werden vervolgens samengevoegd, geconcentreerd en liep over een gelfiltratiekolom met behulp 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl en 0,05% LDAO. De fracties die YiuR werden vervolgens samengevoegd en geconcentreerd tot 10 mg / ml voor kristallisatie.
Brede matrix screening werd vervolgens uitgevoerd en de voorwaarden bepaalddat de eerste buigingsinrichtingen kristallen geproduceerd. Verdere optimalisatie heeft geleid tot grotere kristallen die werden gebruikt om natieve röntgendiffractie gegevens te verzamelen. Kristallen figuur 8 zijn representatief kristallen kan men bereiken met de hier gepresenteerde werkwijzen. Kristallen van detergent screening en bicelles kan zo groot zijn als kristallen verkregen typisch voor oplosbare eiwitten; echter, die uit LCP bijna altijd veel kleiner. De gegevens waren goed genoeg om te gebruiken voor moleculaire vervanging die tot vaststelling structureren 2,65 A resolutie.
Figuur 1. Beide soorten volledig geïntegreerde membraaneiwitten zijn α-helix en β-barrel. Hier worden voorbeelden van elk van de β2-adrenerge receptor (PDB code 2RH1, α-helix) en de TonB-afhankelijke transporter BTub (PDB code 1NQE,P-barrel). De bovenste rij toont de extracellulaire uitzicht terwijl de onderste rij toont het membraan uitzicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. β-barrel OMP's dienen vele verschillende functies en kunnen verschillende structuren. Terwijl α-helix membraaneiwitten één of meer transmembraandomeinen bevatten, β-barrel OMP's variëren 8-26 strengen en elke streng nauw samenwerkt met het naburige strengen. Outer residuen, die interageren met het membraan, typisch hydrofoob terwijl de inwendige resten die interageren met oplosmiddel, typisch polair en hydrofiel. Bovenste rij toont de extracellulaire uitzicht, de middelste rij toont het membraan uitzicht, en de onderste rij toont de periplasmic uitzicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Voorbeelden van twee typen gemeenschappelijke β-barrel OMP's. Links, de structuur van de TonB-afhankelijke transporter FEPA (PDB code 1FEP), die de extracellulaire (boven), membraan (midden) en periplasmatische (onder) uitzicht. De β-barrel domein wordt aangegeven in groen, terwijl de plug domein in magenta. Rechts, de structuur van de autotransporter Esta (PDB code 3KVN), die de extracellulaire (boven), membraan (midden) en periplasmatische (onder) uitzicht. De β-barrel domein wordt aangegeven in goud, terwijl de passagier domein in het blauw. Klik hier om een grotere versi bekijkenop van dit cijfer.
Figuur 4. Schematische voorstelling van klonering en expressie pijpleiding productie van β-barrel OMP's. Schema van de pijpleiding gebruikt voor het kloneren en expressie van een doelwit OMP door ofwel natief membraanexpressie (links) of door expressie in insluitingslichamen voor hervouwen (rechts). Gelieve klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Schematische zuivering pijpleiding voor isolatie van β-barrel OMP's. Schema van de pijpleiding voor de extractie van OMP's die rechtstreeks in de OM hebben uitgesproken. Hier, het doel OMP moet extracted van het membraan door oplossen met een geschikt reinigingsmiddel en vervolgens gezuiverd door IMAC, ionenuitwisselingschromatografie en gelfiltratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Schematische kristallisatiegraad pijpleiding groeien van kristallen van β-barrel OMP's. Drie werkwijzen kunnen worden gebruikt voor de kristallisatie van β-barrel OMP waaronder detergent screening, bicelles en lipide kubieke fase (LCP). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Nieuwe tools in kristallografie die aanzienlijk hebben bijgedragen aan de bepaling van β-barrel OMP structureren. Voorbeelden hiervan zijn kristallisatie robots / LCP robots (A), UV microscopen (B), de tweede orde niet-lineaire beeldvorming van chirale Crystals (SonicC) visualisatie (C), robotachtig pucks / robots (D), rastering / vector / spiraalvormige dataverzamelingsmethoden (E ), en microfocus balken (F). klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8. representatief beeld van de kristallen als gevolg van het protocol. Kristallen uit detergent screening en bicelles kan zo groot zijn als kristallenverkregen typisch voor oplosbare eiwitten; echter, die uit LCP bijna altijd veel kleiner. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9. Van constructies om kristallen te bepalen structuur van de vermeende vaccin doelwit YiuR van Yersinia pestis. De totale pipeline gebruikt voor de structuur bepaling van YiuR, ter illustratie van de stappen die zijn genomen om kloon, te drukken, te zuiveren, kristalliseren, en het oplossen van de structuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
β-barrel OMP dienen een essentiële rol in Gram-negatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten en zijn belangrijke doelen voor structurele analyse die een schat aan informatie over wezenlijke moleculaire mechanismen die aan de buitenste membranen van deze respectieve organellen bieden. Echter produceert genoeg monster voor structurele analyse is niet altijd eenvoudig en daarom wordt een algemene pijpleiding gepresenteerd voor de productie van voldoende hoeveelheden doelwit β-barrel OMP's voor structuurbepaling, waarin in detail het proces van constructen kristallen. Hoewel deze protocollen zijn getest en werkt voor de meeste OMP's van Gram-negatieve bacteriën zijn er beperkingen doordat er een aantal doelen, met name voor mitochondriën en chloroplasten, die andere methoden voor expressie en zuivering vereisen. Als zodanig moet de methoden hier van toepassing is voor de meeste projecten die OMP betrekken van Gram-negatieve bacteriën, maar de uitdrukking niveaus en hoeveelheid gezuiverd monster zal variëren afhankelijk van het doel OMP.
Er zijn twee algemene benaderingen voor de expressie van β-barrel OMP's voor structurele studies, (1) in vivo expressie direct in de buitenste membraan en (2) expressie insluitlichaampjes in vitro opnieuw vouwen. Voor de in vivo expressie benadering worden β-barrel OMP's gericht op buitenmembraan van E. coli waar native gevouwen en direct geïsoleerd van membranen. Expressie aan het membraan is de beste methode omdat doelen vaker correct gevouwen. Deze aanpak levert meestal lagere totale eiwit, vermijdt de complicaties associatie met in vitro hervouwen. Veel β-barrel OMP's werden met succes tot expressie op deze wijze structuurbepaling 4,5,11. Succes wordt vaak bereikt door een systeem dat is gebaseerd op lage constitutieve expressie van een T7 bevorderenr, maar andere systemen die berusten op inductief (IPTG, arabinose) voor expressie worden ook routinematig gebruikt met succes.
Expressie direct in de buitenmembraan vereist het doeleiwit om een N-terminale signaalsequentie die het ribosoom-ontluikende keten complex doorstuurt naar de Sec translocon voor uitscheiding van het ontluikende β-barrel OMP in het periplasma hebben. De signaalsequentie wordt gesplitst aan de periplasmatische zijde van het binnenste membraan, dus is het belangrijk dat de signaalsequentie voorafgaan elke N-terminale labels toegevoegd aan het doel. De ontluikende β-barrel OMP wordt vervolgens begeleid door chaperones door het periplasma naar het BAM complex voor insertie in de buitenmembraan 2,3.
Voor doelen die niet kunnen worden tot overexpressie gebracht in het membraan, een alternatieve benadering expressie in insluitingslichamen in vitro hervouwen 28-30. Deze aanpak resulteert meestal in hoog niveau en robuust meningsuiting of het doeleiwit. Het kan echter moeilijk te bepalen opnieuw vouwen omstandigheden, zoals opnieuw vouwen inefficiënt kan zijn. Bovendien kan het moeilijk zijn om te testen wanneer het doel β-barrel OMP correct gevouwen. Toch zijn er veel voorbeelden van eiwitten die met succes hervouwen structurele studies zoals OmpA 31, Ail 19, OmpF 32 en 33 VDAC. Voor klonen die niet tot expressie bij alle (native of in insluitingslichamen) of uit te drukken, maar zijn niet goed gemonteerd in het membraan (native), kan men proberen het muteren van het β-barrel om nauwer lijken op die van E. coli 34,35. De aminozuursequentie in het β-signaal van het vat domein belangrijk is voor herkenning en montage van de BAM complex en variaties in het β-signaalsequentie kunnen beïnvloeden zowel goede biogenese en expressie van het beoogde β-barrel OMP 11,34 , 35. Goede integratie van het doel β-barrel OMP kan worden gecontroleerd door te screenen op membraan fractionering en detergens winbaarheid gevolgd door een warmtebehandeling modificeerbaarheid assays.
Kristallisatie van membraaneiwitten in de aanwezigheid van detergens micellen is de oudste techniek en maakt een eenvoudige aanpassing van de traditionele oplosbaar eiwit kristallisatie apparatuur en strategieën. Door het maskeren van de membraan ingebedde gebieden met detergent moleculen geconcentreerd eiwit kunnen op een soortgelijke wijze als oplosbare eiwitten (bijvoorbeeld gemengd met kristallisatie moederloog en ingesloten in een damp diffusie-inrichting dat het langzame dehydratatie van het eiwit veroorzaakt druppel) behandeld. Terwijl eenvoudig in concept, detergens kenmerken en eigenschappen voeg een significant laag complexiteit bovenop de normale kristallisatie uitdagingen. Bepaald moet het moleculaire karakter van een detergens empirisch worden afgestemd op een bepaald doeleiwit, zoals micellen grootte kopgroep polariteit (anionisch, kationisch, niet-ionisch ofzwitterionische) en koolwaterstofketenlengte, omdat elk van deze invloed op de stabiliteit van het doelwit membraaneiwit in oplossing. Nadelen van deze benadering omvatten de niet-natuurlijke chemische omgeving, verduisterende potentiaal van oppervlaktegebieden die kristalcontacten en detergensconcentratie kwesties kunnen vormen.
Bicelles een mengsel van lipiden en amfifielen (bijvoorbeeld, detergentia of korte keten lipiden) die assembleren in afzonderlijke deeltjes die een bilaag structuur die lijkt op de membranen in cellen 36,37 nabootsen. De amfifiele maskers de hydrofobe kern van de dubbellaag waar het wordt blootgesteld aan zijn randen op dezelfde wijze als de micellen in detergens kristallisatie. Hierdoor ontstaat een natieve-achtige omgeving te helpen stabiliseren doeleiwitten.
Membraaneiwit doelen kunnen ook worden gekristalliseerd met lipide kubieke fase (LCP) methoden 38. LCP is een mesofase gevormd door het mengen van vet en water, inwaarbij een continue bilaag wordt doordrongen door twee niet-snijdende netwerken oplosmiddel kanalen. Deze driedimensionale structuur maakt diffusie van lipide ingesloten membraaneiwitten in een grotendeels natieve-achtige omgeving en laat kristalcontacten vormen tussen de hydrofobe en hydrofiele oppervlakken van de eiwitten en vermindert de totale oplosmiddelgehalte van kristallen terwijl het verbeteren hun volgorde. Sinds de introductie in de jaren 1990, hebben LCP technieken van cruciaal belang bij het bepalen van de structuren van de vele ongrijpbare membraaneiwit doelwitten zijn geweest, zoals rodopsine 39,40 en GPCR's 41-43. Gebruik van LCP in high throughput screens vereist speciale bepalingen (bijv LCP-specifieke robot, gasdichte spuiten, LCP afgeven gereedschap, sandwich kristallisatie platen, etc.) als de dikke monooleïne gebruikt voor LCP niet traditionele nanoliter vloeistofverwerking behandeld robots.
Gelfiltratiechromatografie is een uiterst belangrijke stapvoor kristallisatie van membraaneiwitten in het algemeen, omdat het levert informatie over het stabiliseren van het gekozen detergens voor het doel membraaneiwit, die kan worden gevisualiseerd door het chromatogram. Door vergelijken van de hoeveelheid monster in het lege volume, retentietijden en vormen van de pieken, kan de algehele stabiliteit en monodispersiteit van het monster worden bekeken. Een ideaal voorbeeld zou heel weinig tot geen monster verloren in het lege volume en zou een enkele symmetrische elutie piek met een Gauss-verdeling te hebben. De detergentia C 8 E 4 (0,8%), OG (1,0%) en LDAO (0,05%) worden routinematig gebruikt voor kristallisatie van β-barrel OMP's met succes en zijn goed te beginnen. Idealiter worden kleinschalige experimenten uitgevoerd vergelijken van verschillende wasmiddelen of mengsels van wasmiddelen om te bepalen welke het meest geschikt voor kristallisatie zijn. Degenen die blijken het meest stabiliserende worden vervolgens gebruikt voor grootschalige bereiding van de beoogde β-barrel OMP en kristallisatie trials.
Zodra kristallen worden gevormd van de doel β-barrel OMP, lead optimalisatie (dwz additief screening, cryo-screening, wasmiddeltoevoegsels screening, enz.) En andere soortgelijke oplosbare eiwit targets technieken kunnen worden gevolgd met weinig verschillen. Er zijn echter enkele recente vorderingen die zijn uiterst nuttig bij het werken met membraaneiwitten. Specifiek kan membraaneiwit kristallen vaak moeilijk te detecteren in hun moederloog om verschillende redenen. Membraaneiwitten vormen vaak relatief kleine kristallen en valse positieven kunnen kristallen optimalisatie misleiden. LCP technieken vooral voor extra hinderpalen, gezien de zeer viskeuze, vaak ondoorzichtig omgevingen waarin de kristallen worden gegroeid. Strategieën om deze kwesties, zoals het gebruik van ultraviolet microscopen (UV) in combinatie met licht microscopen, waardoor natuurlijk fluorescerend eiwit kristallen te onderscheiden from niet-fluorescerende zout en afwasmiddel kristallen (figuur 7). Uitdagingen blijven, maar in positieve identificatie van eiwit kristallen die vormen binnen de gebieden van de neerslag. Kristallen kunnen ook worden gedetecteerd door de exploitatie van de frequentie verdubbeling effect van de meeste chirale kristallen wanneer afgebeeld door femtoseconde scanning laser pulsen, zoals uitgevoerd door SonicC technologie 44. Deze hoge resolutie, kan een hoge contrast techniek worden gebruikt om submicron kristallen te onderscheiden van verduisterende omstandigheden.
Oogsten membraaneiwitten wordt gedaan met behulp van standaard kristallografie technieken, in het bijzonder voor wasmiddel en Bicelle kristallisatie. Looping wordt uitgevoerd door hand met een lage vergroting microscoop en een kristal montage lus (dat wil zeggen, nylon vezels, draad, of polymeer). Wicking van overmaat oplosmiddel en bescherming cryo voorafgaand aan het duiken het vriespunt in cryogene vloeistof zijn ook standaard procedures bij het oogsten van β-barrel OMP kristallen. Echter, de oogsting van LCP gekweekt kristallen bijzondere problemen oplevert, vooral als rechtstreeks oogsten van sandwichplaten, zoals kristallen moeilijk toegankelijk zijn en niet gemakkelijk worden waargenomen door de microscoop. Ook kristallen gegroeid LCP moet soms worden geoogst in bulk sinds het LCP mengsel niet gemakkelijk binnen de lus gescheiden.
Gegevensverzameling voor β-barrel OMP's kan worden uitgevoerd zoals oplosbare proteïne kristallen met een paar aanvullende overwegingen. Terwijl de grootte van kristallen gegroeid met detergens en Bicelle methoden zijn vaak vergelijkbaar met die gekweekt met oplosbare eiwitten, kristallen gegroeid met de LCP werkwijze zijn bijna altijd aanzienlijk kleiner. Bovendien, omdat monsters van LCP matrix geoogst bevatten vaak meerdere kristallen die moeilijk waar te nemen, moet men gebruik maken van synchrotron bronnen die mini-balk en loop rastering vermogens hebben die systematisch kan scannen het hele lus om de posities van de kristallen te vinden op basis van diffra zijnction (Figuur 7). De geringe omvang van LCP kristallen maakt ze bijzonder gevoelig voor stralingsschade. Dus gegevens uit meerdere kristallen worden vaak samengevoegd om een volledige gegevensset verzamelen.
Eenmaal goed buigen van kristallen verkregen en een volledige dataset wordt verzameld, kan structuurbepaling van β-barrel OMP's worden uitgevoerd volgens dezelfde procedures als voor oplosbare eiwitten, rekening houdend dat membraaneiwit kristallen algemeen een hoger oplosmiddelgehalte vertonen. Zoals bij alle kristallografie doelen gesteld oplosbaar eiwit of membraaneiwit, elk heeft zijn eigen uitdagingen en daarom niet één pijpleiding kan direct op alle doelen. Daarom is het de taak van de primaire onderzoeker (s) van deze algemene protocollen hieraan aan te passen aan het succes van zijn / haar project waarborgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | - | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | - | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | - | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | - | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | - | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | - | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | - | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | - | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | - | |
| SS34 rotor | Sorvall | - | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | - | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | - | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | - | |
| Gas-tight syringe (100 ml) | Hamilton |
References
- Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
- Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
- Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
- Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
- Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
- Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
- Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
- van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
- Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
- Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
- Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
- Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
- Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
- Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
- Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
- Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
- Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
- Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
- Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
- Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
- Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
- Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
- Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
- Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
- Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
- Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
- Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
- Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
- Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510 (2012).
- Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
- Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
- Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
- Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
- White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
