Introduction
β-barrel OMPs só pode ser encontrada nas membranas exteriores das mitocôndrias, cloroplastos, e bactérias Gram-negativas 1-3. Enquanto que servem funções semelhantes às proteínas a-helicoidal, que tem uma dobra muito diferente que consiste de um domínio β-barril incorporado na membrana central que varia de 8-26 p-cadeias anti-paralelas com cada filamento sendo intimamente ligados aos dois fios vizinhos (Figuras 1 e 2). Os primeiros e os últimos fios de domínio β-barril então interagir um com o outro, quase exclusivamente de uma forma anti-paralela (excepto para VDAC mitocondrial), para fechar e selar o domínio β-barril a partir da membrana circundante. Todas as OMPs β de barril tem ansas extracelulares de variação de sequência e comprimento, que desempenham um papel importante nas interacções de ligandos e / ou contactos proteína-proteína, com estas laçadas por vezes ser tão grande como 75 resíduos, tais como os encontrados em Neisseria transferrina ligação protein A (TbpA) 4. β-barrel OMPs também pode ter extensões periplásmicas N-terminais ou C-terminais que servem como domínios adicionais para a finalidade funcional da proteína (por exemplo, 5-7 bama, FimD 8,9, fadl 10). Embora muitos tipos de OMPs β-barril existem 11, dois dos tipos mais comuns são descritas abaixo como exemplos para os menos familiarizados com o campo, (1) os transportadores dependentes de TonB e (2) autotransportadores.
Transportadores TonB-dependentes (por exemplo, FepA, TbpA, BtuB, Cir, etc.) são essenciais para a importação de nutrientes e contêm um domínio plugue N-terminal que consiste em aproximadamente 150 resíduos que é encontrado escondido dentro de um C-terminal 22 de cadeia β- domínio barril incorporado na membrana externa 12 (Figura 3). Embora este domínio previne tampão substrato de passar livremente através do domínio de barril, a ligação do substrato induz uma mudança conformacional dentro do domínio bujão them leva a poro formação (quer por rearranjo de tampão ou por ejecção parcial / total do tampão), o que pode, em seguida, facilitar o transporte do substrato através da membrana externa para o periplasma. Transportadores dependentes de Tonb são especialmente importantes para a sobrevivência de algumas estirpes patogénicas de bactérias Gram-negativas, tais como Neisseria meningitidis que evoluíram transportadoras especializadas que roubam nutrientes como o ferro diretamente de proteínas do hospedeiro humanos 4,13,14.
Autotransportadores pertencem ao sistema de secreção V tipo de bactéria Gram-negativas e são OMPs beta-barril, que consistem em um domínio β-barrel (normalmente 12-costas como com ESTA e ESPP) e um domínio de passageiros que é ou secretados ou apresentados no superfície da célula 15,16 (Figura 3). Estes OMPs β-barril muitas vezes servem um papel importante na sobrevivência celular e virulência com o domínio de passageiros que serve tanto como uma protease, adesina, e / ou outro EFfector que medeia a patogénese.
métodos estruturais, tais como cristalografia de raios-X, espectroscopia de RMN, e microscopia eletrônica (EM) nos permitem determinar modelos para as OMPs com resolução atômica, que por sua vez podem ser usadas para decifrar exatamente como eles funcionam dentro da membrana externa. Esta informação valiosa pode então ser usado para drogas e desenvolvimento de vacinas, se aplicável. Por exemplo, a ligação à transferrina de proteína A (TbpA) é encontrado na superfície de Neisseria e é necessária para a patogénese porque se liga directamente a transferrina humana e, em seguida, extrai e importa o ferro para a sua sobrevivência. Sem TbpA, Neisseria não podem eliminar o ferro do hospedeiro humano e são tornados não-patogênico. Depois de a estrutura cristalina da transferrina humano ligado a TbpA 4 foi resolvido, tornou-se muito mais clara a forma como as duas proteínas associadas, que as regiões de TbpA mediada a interacção, o que os resíduos são importantes para a extracção do ferro por TbpA, ecomo se pode desenvolver agentes terapêuticos contra Neisseria segmentação TbpA. Portanto, dada a importância de OMPs β-barril em bactérias Gram-negativas para a sobrevivência e patogénese, bem como nas mitocôndrias e função do cloroplasto, e a necessidade de informação estrutural adicional sobre esta classe única de proteínas de membrana e os sistemas nos quais eles funcionam , protocolos gerais são apresentados com o objetivo geral de expressar e purificar OMPs alvo em níveis elevados para a caracterização por métodos estruturais.
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Protocol
1. Clonagem e Expressão
Nota: Para permitir estudos estruturais, quantidades suficientes de proteína altamente purificada deve ser preparado, e esta é geralmente iniciado com a clonagem e a sobreexpressão da proteína alvo β-barril da membrana externa (OMP) em E. coli (Figura 4). Até à data, todas as estruturas OMP β-barril, incluindo as estruturas de VDAC mitocondrial, foram derivados de proteína expressa em bactérias 11. Aqui, protocolos gerais são apresentados para clonagem e expressão de OMPs β-barril para (1) a expressão nativa directamente nas membranas bacterianas e (2) expressão em corpos de inclusões para redobragem in vitro 17.
- Projetar uma construção de expressão
- Obter ou comprar o gene alvo OMP códon otimizado.
- Aquisição ou obter um vector de expressão de T7 (i) contendo uma sequência de sinal de localização periplasmático, uma etiqueta 6x histidina-N-terminal,e um local de protease de TEV 4,18,19 para a expressão in vivo para a membrana ou (ii) sem uma sequência de sinal de localização para a expressão periplasmática de corpos de inclusão para redobragem in vitro.
Nota: Uma protease do terminal N clivável etiqueta 6x ou 10x-Histidina iria proporcionar um método fácil para purificação. Tal como acontece com as proteínas solúveis, variar a escolha da marca de afinidade (Histidina, Strep, GST, etc.), a posição da marca de afinidade, e a inclusão de um sítio de protease (TEV, enteroquinase, trombina, etc.) para a remoção subsequente marcação . - Amplificar por PCR a sequência alvo com os iniciadores apropriados e subclone no vector de expressão. Use ligadura clonagem independente (LIC) 20,21 ou convencionais técnicas de clonagem (enzimas de restrição / ligadura) para subclonagem. No entanto, pode facilitar LIC elevado rendimento, permitindo um grande número de várias construções (truncagens, a variedade de etiquetas, variedade de promotores) para ser clonado em paralelo maisfacilmente.
- Em Expressão Vivo Membrane-alvo
- Use análise de sequenciação para verificar o alvo β-OMP barril é clonado a jusante e na mesma grelha com uma sequência de sinal (isto é, pelB, OmpA) na construção de expressão.
Nota: A sequência de sinal dirige a cadeia nascente para o translocon SEC para secreção para o periplasma e subsequente montagem na membrana externa. - Transformar a construção em uma cepa de bactérias para a expressão expressão pipetando 1,0 mL de plasmídeo em 50 ul de BL21 (DE3) células quimicamente competentes e misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo. Incubar em gelo durante 30 min.
- pulso térmico a 42 ° C durante 30 segundos utilizando um banho de água e, em seguida, colocar volta em gelo durante 1 min.
- Adicionar 1 ml de meio SOC pré-aquecido e agitar a 37 ºC durante 1 h a 1000 rpm utilizando um agitador de bancada incubadora.
- Placa 100 uL de células em placas de agar LB contendo uma Antibiot adequadoic e incubar durante a noite a 37 ºC invertido.
- Realizar testes de expressão em pequena escala inoculando a 5 ml LB + cultura antibiótico com uma única colônia. Repita o procedimento para 5-10 colónias.
Nota: Devido ao potencial toxicidade de uma OMP β-barril ea confiança em níveis de expressão basal, a variabilidade colónia-to-colónia é por vezes observada. Por isso, o rastreio várias colónias é recomendado para cada constructo a ser testado. Para os ensaios em pequena escala, em vez de expressão convencionais, 5 ml de culturas que crescem em culturas de 25 ml de 125 ml com deflectores balões Erlenmeyer é sugerido. Estas condições, muitas vezes refletir melhor o que vai acontecer em um crescimento em grande escala. Além disso, é uma boa ideia para rastrear também vários tipos de meios de cultura (TB, LB, 2xYT, M9, etc), uma vez que níveis variados de sucesso foram relatados em função da proteína alvo.- Crescer a 37 ºC com agitação a uma OD 600 de ~ 0,6.
- Induzir a expressão do OMP alvo por anúncioDing 5 ul de 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a cada tubo de cultura e deixa-se crescer uma 1-2 horas adicionais.
- Comparar os níveis de expressão para todos os colónias por centrifugação de 1 ml de cada cultura (OD 600 de ~ 0,6) durante 1 min a 15.000 x g usando uma microcentrífuga.
- Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 200 ul de 1x tampão de carga de SDS-PAGE. Aquece-se a 100 ºC durante 5 min e em seguida centrifugar novamente a 15000 xg durante 5 min.
- Analisar as amostras utilizando SDS-PAGE, pipetando 20 mL para cada poço de um gel a 10%. Submeter o gel durante 35 min a 200 V. constante
Nota: Seria vantajoso, neste ponto, ser capaz de determinar se a proteína alvo está a ser adequadamente ou não dobrada. Isso muitas vezes pode ser realizado fazendo purificações de pequena escala ou através de ensaio para modifiability calor.
- Selecione a colônia mostrando a melhor expressão e executa a expressão em larga escala utilizando 12-24 L de meio.
Nota: Os métodos convencionais tipicamente crescer as culturas a 37 ° C com agitação a uma OD 600 de ~ 0,6 e, em seguida, induzir com um indutor adequado (por exemplo, 0,1-1 mM de IPTG ou ~ 0,2% de arabinose) para um 2-4 horas adicionais . Se desejado, antes da indução, reduzir a temperatura para tão baixo como 20 ° C e prolongar o tempo de indução.- Para o método de expressão gotejante, crescer de 25 ml inocular cultura a 37 ° C em meio LB contendo o antibiótico apropriado (s) até DO600 atinge ~ 0,6. Em seguida, adicionar 1 ml de inóculo de doze frascos de 1 L de meio TB mais antibiótico (s) e crescer a 20 ° C até à saturação (~ 3 dias).
- Colher as células por centrifugação a 6000 xg durante 10 min.
- Prossiga para a etapa de purificação Seção 2.1 ou congelar o pellet celular em nitrogênio líquido para o armazenamento de longo prazo a -80 ºC.
- Use análise de sequenciação para verificar o alvo β-OMP barril é clonado a jusante e na mesma grelha com uma sequência de sinal (isto é, pelB, OmpA) na construção de expressão.
- Expressão de Corpos de Inclusão para In Vitro Refolding
- Use análise de sequenciação para verificar a construção de expressão não contém uma sequência de sinal. A ausência de uma sequência de sinal irá dirigir a proteína alvo a acumular-se no citosol como corpos de inclusão.
- Transformar a construção de expressão numa estirpe de bactérias para expressão de expressão. Para a expressão de corpos de inclusão, que é melhor para controlar a expressão por indução (isto é, IPTG, arabinose, etc), para minimizar os possíveis efeitos de toxicidade.
- Placa de 100 ul de células transformadas em placas de agar LB contendo um antibiótico apropriado e incubar durante a noite a 37 ºC invertido.
- Realizar testes de expressão em pequena escala inoculando a 5 ml LB + cultura antibiótico com uma única colônia.
- 1.3.4 Repita o passo para 2-4 colónias adicionais.
- Crescer a 37 ºC com agitação a uma OD 600 de ~ 0,6.
- Induzir com um indutor apropriado durante 1-2 horas.
- Comparar os níveis de expressão para todos tele colónias por análise utilizando SDS-PAGE (veja o Passo 1.2.6). Selecione a colônia mostrando a melhor expressão e executa a expressão em larga escala utilizando 12-24 L de meio.
- Crescer as células a 37 ° C para uma DO 600 de 0,6-0,8 e induzir a 37 ° C durante 3-5 h. Enquanto a expressão de corpos de inclusão é mais robusta do que outros tipos de expressão, tal como com todas as experiências de expressão da proteína, a expressão pode ser melhorada através da variação meio de crescimento, tempo de indução, temperatura de indução, e a concentração do agente de indução.
- Colher as células por centrifugação a 6000 xg durante 10 min.
- Prossiga para a etapa de purificação Seção 2.2 ou congelar o pellet celular em nitrogênio líquido para o armazenamento de longo prazo a -80 ºC.
2. purificação
- Isolamento de fracções de membrana
Nota: Em contraste com as proteínas solúveis, proteínas de membrana integrais são incorporados na bicamada lipídica e por conseguinterequerem detergentes para extraí-los para posterior purificação e análise (Figura 5). Após expressão, o primeiro passo na purificação de uma OMP β-barril é a extracção da fracção da membrana.- Ressuspender as células em tampão de lise (Tris-HCl a 50, pH 7,4, 200 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 50 ug / mL de AEBSF, 5 ug / ml de DNase I) em uma proporção de pasta de células de 5 ml / g.
- Lyse as células usando uma prensa francesa ou homogeneizador celular. Rodar as células lisadas a 15000 xg durante 30 min a 4 ° C para remover células não lisadas e os detritos celulares.
- Transferir o sobrenadante para um tubo limpo e centrifuga-se de novo a alta velocidade (200000 xg) durante 1 h a 4 ºC. O sedimento resultante é a fracção de membrana que contém a proteína de interesse.
- Utilizando um homogeneizador Dounce, ressuspender a fracção de membrana, transferindo primeiro as membranas e depois adicionando tampão de solubilização (50 mM de KH 2 PO 4, pH 7,5, NaCl 200 mM, imidazol 20 mM, PH 8,0) (50 ml por 20 g de células) a concentração de 2x, sem detergente.
- Pour as membranas ressuspensas para uma pequena proveta e adicionar detergente (ou seja, N-dodecil-β-D-maltósido (DDM), lauryldimethylamine-N-óxido (LDAO), N-octil-β-D-glucopiranósido (OG), o Triton X-100, etc.), lentamente, a uma concentração final de ~ 10 vezes a concentração crítica de micelas (CMC).
- Encha com água até uma concentração final de 1x tampão de solubilização. Agita-se durante 0,5-16 horas a 4 ° C, dependendo isso da facilidade a proteína alvo é extraído das membranas.
Nota: O detergente é usado para solubilizar as membranas lentamente para extrair a proteína alvo. Existem 3 tipos de detergentes que podem ser utilizados aqui: iónico (SDS, ácido desoxicólico), não iónicos (Elugent, Tween, Triton X-100, OG, DDM), e zwitteriónico (LDAO, CHAPS). Um complexo de proteína-detergente que é estável e monodispersas durante o passo de purificação será de grande ajuda no sucesso da proteína de membrana crystallizatíon. Mais informações sobre as suas propriedades detergentes, informações, CMC, e a sua utilização na purificação de proteínas de membrana e outras aplicações pode ser encontrada nos sítios fornecedores comerciais. - Centrifugar a amostra solubilizado em 300.000 xg durante 1 hora a 4 ºC. O sobrenadante agora contém o OMP alvo β-barrel detergente solubilizado.
- Prossiga com a Seção 2.3, conforme descrito abaixo.
- O redobramento de Corpos de Inclusão
Nota: Para a redobragem in vitro, β-barril OMP o alvo é expresso directamente em corpos de inclusão. Uma vantagem aqui é que estas proteínas podem ser produzidas em níveis elevados. No entanto, a desvantagem é que a re-enrolamento é muitas vezes ineficaz e varia a partir de uma experiência de redobragem para o próximo. Ainda assim, existem muitos exemplos de proteínas que foram redobradas com sucesso para estudos estruturais. Após a expressão em corpos de inclusão, deve-se agora isolar os corpos de inclusão para a redobragem experimentos.- Ressuspender as células em tampão de lise (Tris-HCl a 50, pH 7,4, 200 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 50 ug / mL de AEBSF, 5 ug / ml de DNase I, 4 mM de 2-mercaptoetanol (BME)) (5 ml por g de pasta celular). Lyse usando uma prensa, ultra-sons, ou homogeneizador celular francês.
- Sedimentar os corpos de inclusão por centrifugação a baixa velocidade a 6000 xg durante 10 min a 4 ºC.
- Lavar os corpos de inclusão por ressuspensão em 25 ml de ureia 1,0 M, utilizando um homogeneizador Dounce. Sedimentar novamente de uma centrifugação de baixa velocidade a 6000 xg durante 10 min a 4 ºC.
- Repita o passo 2.2.3, se necessário.
- Ressuspender os corpos de inclusão lavados a uma concentração final de 10 mg / ml usando tampão contendo 8,0 M de ureia (ou 6,0 M de hidrocloreto de guanidinio (GdCl)) mais detergente (ou seja, DCM ou LDAO) em 2x CMC ou superior.
Nota: Se desejado, para alvos de proteína de membrana contendo uma etiqueta de Histidina, cromatografia de afinidade de metal-imobilizado (IMAC) a purificação pode ser realizada utilizando co desnaturaçãonditions (em 8,0 M de ureia ou 6,0 M GdCl) como um passo inicial semelhante ao descrito abaixo na Seção 2.3. - Realizar a reação redobrando lentamente (durante a noite) remoção do desnaturante por diálise em tampão sem desnaturante.
Nota: Pode levar várias mudanças do tampão de diálise para alcançar este objetivo. Em alternativa, se os corpos de inclusão são primeiramente ligados a uma coluna de IMAC, pode-se fazer a reacção de re-enrolamento, enquanto ainda ligada à coluna através da troca de tampões lentamente para remover o desnaturante. Em ambos os casos, lembrar que esta é uma proteína de membrana, portanto, o detergente deve estar presente para estabilizar o alvo. Além disso, se o detergente a ser utilizado é dialisável, que deve ser adicionado ao tampão (s) de diálise bem. - Girar as amostras redobradas em 200.000 xg durante 1 hora a 4 ºC. O sobrenadante contém o OMP alvo β-barril detergente solubilizado redobrada.
- Prossiga com a Seção 2.3, conforme descrito abaixo.
- Purificação usando IMAC, Ion-Exchange e Gel Filtration
Nota: cromatografia de metal-afinidade Assumindo que a proteína tem sido concebido com uma cauda Histidina, quer nativa expressa ou redobradas utilizando métodos in vitro, em seguida imobilizado (IMAC) é realizado para a purificação bem como para marcadas com histidina, proteínas solúveis, com excepção de detergente deve ser mantido em todos os tampões subsequentes para manter o OMP alvo β-barrel solubilizado e estável.- Prepara-se uma coluna de 1-5 ml IMAC ou utilizar uma coluna pré-embalada. Execute as etapas de cromatografia subsequentes a 4 ° C. Lave com água para remover qualquer vestígio de conservantes. Se utilizando um sistema automatizado de purificação, instalar a coluna, de acordo com as instruções do fabricante.
- Preparar 500 ml de IMAC tampão A (50 mM de K 2 HPO 4, pH 7,5, 200 mM de NaCl, 0,1% de DDM) e 250 ml de IMAC tampão B (50 mM de K 2 HPO 4, pH 7,5, NaCl 200 mM, 0,1% DDM, e imidazol 1,0 M).
Nota: Outros detergentes que podem ser utilizados include Cymal-6 (0,05%), de Triton X-100 (0,03%), e LDAO (0,05%). - Equilibrar a coluna IMAC usando 10 volumes de tampão de coluna IMAC A.
- Adicionar imidazole para a amostra de proteína para uma concentração final de 25 mM e misturar. Carregar a amostra na coluna IMAC equilibrada a 2 ml / min. Recolhe-se o fluxo através de.
- Lava-se a coluna IMAC com 5 volumes de coluna cada um de concentrações crescentes de imidazole utilizando tampão B (isto é, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Recolher as lavagens em fracções de 2 mL.
- Elui-se a amostra com uma concentração final de 250 mM para 5 volumes de coluna. Recolha da amostra eluída em fracções de 2 mL.
- Analisar o fluxo através de uma das fracções de lavagem e as fracções de eluição utilizando análise de SDS-PAGE (ver Passo 1.2.6) com base na sua absorvância a 280 nm. Reunir as fracções contendo o OMP alvo β-barril como verificado por análise de SDS-PAGE.
- Remover a etiqueta 6x histidina, adicionando-protease TEV a amostra combinada (de acordoo protocolo do fabricante) e incubação durante a noite a 4 ºC com balanço suave.
- Coloque a solução de amostra / protease numa coluna de IMAC novamente para separar o alvo OMP β-barrel (fluir através) das marcadores cortados e qualquer amostra clivada. O fluxo através conterá a amostra clivada falta a marca.
Nota: Isto também iria remover qualquer protease TEV como-His, que também tem em si uma etiqueta 6x histidina-não clivável. Caso contrário, outros métodos que serão necessários para remover a protease, após a digestão. - Opcionalmente, realizar cromatograf ia de permuta iónica para purificar ainda mais a amostra. Siga as instruções do fabricante para a coluna a ser utilizado, tendo a certeza de incluir detergente em todos os tampões.
- Para preparar para a cristalização, carregar a amostra numa coluna de filtração em gel em tampão contendo o detergente a ser utilizado para a cristalização, tal como Tris-HCl a 25, pH 7,5, NaCl 200 mM, 1% de OG.
- Recolher fracções de 1 ml e analisar usianálise ng SDS-PAGE (veja Passo 1.2.6) com base na sua absorvância a 280 nm. As fracções de associação com absorvências a 280 nm, uma vez que contêm a proteína alvo. Concentra-se para ~ 10 mg / ml.
Nota: Se se desejar, a dobragem correcta pode ser avaliada utilizando um ensaio a mutabilidade de calor, conforme descrito abaixo.
- Calor Modificabilidade Assay
Nota: Um método para monitorar a dobragem correcta da purificada β-barrel OMPs é a realização de ensaios modifiability calor usando um semi-nativa SDS-PAGE 22. Aqui, as amostras não aquecidas que são dobradas adequadamente irá tipicamente migrar de forma diferente daqueles que são desnaturadas por calor. Esta propriedade é exclusivo para beta-barril OMPs e amplamente utilizado para estudar esta família de proteínas da membrana.- Antes de preparação de amostras, montar o aparelho de gel. Para começar, coloque o tanque de reserva em um balde de gelo e envolver completamente com gelo. Insira um elenco em casa ou em gel com gradiente nativa comercial no suporte e colocar no tanque. Encha tele tanque completamente com 1x frio tampão de corrida MES (50 mM de ácido 2- [N-morfolino] etanossulfónico, Tris base 50 mM, EDTA 1 mM, SDS a 0,1%, pH 7,3).
- Pipeta 0,25 ul de amostra (10 mg / ml) para dois tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Rotular um como 'fervido' eo outro como 'RT'.
- Adicionar 9,75 mL de tampão de amostra para cada um e misture por pipetagem. Para ambas as amostras, adicionar 10 ul de tampão de carga DSS 2X (Tris-HCl a 100, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% de azul de bromofenol e glicerol a 20%) e agitar suavemente por pipetagem.
- Ferva a amostra 'fervido' a 95 ºC durante 5 min, deixando a amostra 'RT' à temperatura ambiente. Spin the brevemente sample 'cozido'.
- Carga 20 ul de ambas as amostras no gel nativo de pré-montagem. Corra por 60 minutos a constante de 150 V. Retire o gel e mergulhar na solução de coloração para visualizar os resultados.
3. A cristalização
Nota: Para a cristalização de ambosalvos de proteína solúvel e de membrana, é o protocolo padrão para maximizar a pureza da amostra e a estabilidade (isto é, melhor detergente, ligandos, cofactores, etc.). Metodologia atual para cristalizar proteínas alvo de membrana em geral engloba três abordagens principais que satisfazem os requisitos anfifílicas das proteínas embebidas em bicamada: (1) de detergente, (2) bicelle, e (3) fase cúbica lipídica (LCP) (Figura 6) 23. A utilização de um robô nanolitros cristalização é fortemente recomendada quando possível, a fim de aumentar o número de condições que podem ser rastreadas para um determinado volume de amostra, bem como, utilizando os recentes avanços em ferramentas destinadas a auxiliar a determinação da estrutura (Figura 7).
- Cristalização usando Detergentes
- Obter uma amostra de proteína solubilizada em detergente que é a ~ 10 mg de concentração / ml. Opcionalmente, adicionar o aditivo 1,2,3-heptanotriol directamente à amostra a uma concentração final de 3% para reduzir detergtamanho de micelas ent.
- Filtrar a amostra através de um filtro centrífugo de 0,22 um para remover as partículas e precipitação.
- Usando um robô cristalização, realizar ampla cristalização matriz de rastreio utilizando comercialmente disponíveis 96 telas assim por qualquer suspensão ou sentado método de vaporização queda com gotas compostas de 200 amostra de proteína nl ~ e ~ 200 tampão de cristalização nl.
- Incubar as placas de cristalização a ~ 21 ° C. Inspeccionar as placas semanais para o crescimento de cristal usando um microscópio estereoscópico.
- Optimizar ligações de cristalização variando os componentes da condição a cristalização de uma forma sistemática (aumentando / diminuindo sal ou concentrações precipitantes, pH, temperatura de incubação, concentração e / ou proteína).
- A cristalização Usando bicelles
Nota: Uma demonstração mais detalhada das técnicas de bicelle foi previamente descrito por Abramson e Ujwal 24.- Preparar ou comprar um 3Mistura bicelle 5% consistindo de DMPC: CHAPSO em uma proporção de 2,8: 1, de acordo com protocolos publicados 25. Outras concentrações podem também ser ensaiadas, assim como, outros lípidos e detergentes, como necessário.
- Obter uma amostra de proteína solubilizada em detergente que é a ~ 10 mg de concentração / ml.
- Adicionar a mistura bicelle, em gelo, a uma proporção inicial de 4: 1 v / v (proteína: bicelle) (por exemplo, adicionar 10 ul de mistura bicelle a 40 uL de proteína e misturar rapidamente por pipetagem).
- Incubar em gelo de 30-60 min.
Nota: A proteína: solução bicelle deve permanecer na sua maioria clara, mas muitas vezes pode virar ligeiramente opaca. No entanto, se a proteína: bicelle solução vira branca leitosa, indicando a precipitação, em seguida, outras variáveis que devem ser ensaiados (isto é, detergentes, tampão, etc.). Para novas amostras, fazendo testes de pequena escala (proteína 8 mL e 2 bicelles ul) é recomendado para verificar a estabilidade antes da ampliação para evitar a perda de amostra desnecessário. - Usando um robô cristalização, realizar ampla cristalização matriz de rastreio utilizando comercialmente disponíveis 96 telas assim por qualquer suspensão ou sentado método de vaporização queda com gotas compostas de 200 amostra de proteína nl ~ e ~ 200 tampão de cristalização nl.
- Incubar as placas de cristalização a ~ 21 ° C. Inspeccionar as placas semanais para o crescimento de cristal usando um microscópio estereoscópico.
- Optimizar ligações de cristalização variando os componentes da condição a cristalização de uma forma sistemática (aumentando / diminuindo sal ou concentrações precipitantes, pH, temperatura de incubação, concentração e / ou proteína).
- A cristalização Usando fase cúbica lipídico (LCP)
Nota: Uma demonstração mais detalhada das técnicas de LCP foi previamente descrito por Liu e Cherezov 26,27.- Obter uma amostra de proteína solubilizada em detergente que é a ~ 20 mg de concentração / ml.
- Pré-aquecer o mono-oleína a ~ 40 ºC. Carga60 ul de monooleína em uma seringa de 100 ul à prova de gás e 40 ul de amostra de proteína para outra.
- Usando um acoplador mistura, ligar as seringas, tomando cuidado para não introduzir ar.
- Misturar suavemente através da aplicação de pressão alternada sobre os êmbolos das seringas que empurram a mistura a partir de uma seringa para o outro completamente até que a amostra torna-se translúcido e homogénea.
- Usando um robô projetado para cristalização métodos LCP, execute ampla cristalização matriz de rastreio utilizando comercialmente disponíveis 96 telas bem com placas de cristalização de estilo sanduíche (espessura bem 0,1 mm) com gotas compostas de 100 amostra de proteína nl e 750 tampão de cristalização nl.
Nota: rácios de queda pode ser ajustada, se necessário. Além disso, capas de sólidos (isto é, de vidro ou de plástico de espessura) são recomendados que suportam as gotas bem em vez de filmes finos, que tendem a permitir que as gotas para se mover sobre a bem como as placas são manipulados. - Incubar a cristalização plates a ~ 21 ° C. Inspeccionar as placas semanais para o crescimento de cristal usando um microscópio estereoscópico.
- Optimizar ligações de cristalização variando os componentes da condição a cristalização de uma forma sistemática (aumentando / diminuindo sal ou concentrações precipitantes, pH, temperatura de incubação, concentração e / ou proteína).
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Representative Results
Yiur é um transportador de ferro dependente TonB que é um alvo da vacina putativa contra Yersinia pestis. Ele foi originalmente identificados utilizando um ensaio de microarray. Aqui, as medidas que foram tomadas para determinar a estrutura de yiur utilizando cristalografia de raios-X são descritas (Figura 9). Para a clonagem, a sequência de ADN de yiur (menos a sequência de sinal N-terminal) foi amplificado por PCR a partir de ADN genómico e sub-clonado num vector contendo uma sequência de sinal N-terminal pelB e tag de afinidade 10x-Histidina seguido por um local de protease de TEV. Para a expressão, o plasmídeo contendo yiur foi transformado em BL21 (DE3) células competentes e uma única colónia utilizada para crescer uma cultura de 5 ml de arranque, para OD600 ~ 0,5. Doze frascos contendo 750 ml de meio TB foram em seguida inoculado com 1 ml da cultura de arranque e deixadas a crescer durante 3 d a 20 ° C (agitação a 220 rpm). As células foram então colhidas, produzindo cerca de 150-200g de pasta celular total, o que foi flash arrefecida em azoto líquido e armazenado a -80 ºC até à utilização.
Para a purificação de yiur, 20 g de células foram ressuspensas em 120 ml de 1x PBS (10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, 2,7 mM de KCl, 137 mM de NaCl, pH 7,4) por agitação à temperatura ambiente com ADNase I e AEBSF sendo adicionado. A lise foi realizada por duas passagens através de um homogeneizador. O ligado foi então centrifugado a 12000 xg durante 10 min (para girar para baixo as células não rompidas e corpos de inclusão). O sobrenadante foi novamente centrifugado a 235.000 xg durante 60 min, com o sedimento contendo a fracção de membrana (yiur). As membranas foram em seguida ressuspensas em 100 ml de 1x PBS usando um homogeneizador Dounce. Yiur foi solubilizado / extraiu-se a partir de membranas utilizando Elugent a uma concentração final de 5%, agitar durante a noite (até 16 horas) a 4 ºC. As membranas solubilizadas foram então centrifugado novamente a 371.000 xg durante 60 min, com o supernatant contendo a fracção solubilizada incluindo yiur. Para isolar yiur, IMAC foi realizada utilizando o Tampão A (1x PBS, 0,1% de DDM) e Tampão B (1x PBS, imidazolo 1 M, 0,1% de DDM), lavou-se com concentrações de imidazole de 30-50 mM e eluiu-se com 250-500 mM . Para remover a etiqueta de 10x-Histidina N-terminal, a incubação com TEV SUA protease foi realizada durante a noite a 4 ° C durante a diálise em tampão de PBS 1x. A amostra foi então passada sobre uma coluna de IMAC novamente, o fluxo através concentrada, dialisada e, em seguida separou ainda mais usando um gradiente de 0-1,0 M de NaCl em uma coluna de permuta iónica em Tris-HCl a 50, pH 7,5. As fracções contendo yiur foram então reunidas, concentradas e correu numa coluna de filtração em gel, utilizando Tris-HCl a 25, pH 7,5, NaCl a 200 mM e 0,05% LDAO. As fracções contendo yiur foram então reunidas e concentradas para 10 mg / ml para a cristalização.
triagem matriz Broad foi então realizada e as condições determinadasque produziu alguns cristais de difração iniciais. Otimização levou a cristais maiores que foram usados para recolher dados de difração de raios-X nativas. Os cristais mostrados na Figura 8 são representativas de cristais pode-se alcançar utilizando os métodos aqui apresentados. Cristais a partir de rastreio de detergente e bicelles pode ser tão grande como cristais obtidos tipicamente para as proteínas solúveis; no entanto, os de LCP são quase sempre muito menor. Os dados foram bons o suficiente para ser usado para a substituição molecular que levou a estruturar determinação de 2,65 Å de resolução.
Figura 1. Os dois tipos de proteínas de membrana são totalmente integrados α-helicoidal e β-barril. Mostrado aqui são exemplos de cada um com o receptor β2-adrenérgico (código PDB 2RH1, α-helicoidal) e que o transportador dependente de TonB BtuB (código PDB 1NQE,P-barril). A linha superior mostra a vista extracelular, enquanto a linha inferior mostra a vista membrana. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. OMPs β-barril servem muitas funções diferentes e pode ter diversas estruturas. Embora as proteínas de membrana a-helicoidal pode conter um ou mais domínios transmembranares, OMPs β-barril variar de 8-26 fios de cada fio e intimamente interage com os fios vizinhos. resíduos exterior, que interagem com a membrana, são normalmente hidrofóbica ao passo que os resíduos de interiores, que interagem com o solvente, são tipicamente polar e hidrofílica. Linha superior mostra a vista extracelular, a linha do meio mostra a vista de membrana, ea linha inferior mostra os periplasmic vista. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Exemplos de dois tipos de OMPs β-barril comuns. Esquerda, a estrutura do transportador dependente de TonB FepA (código PDB 1FEP), descrevendo a extracelular (em cima), a membrana (meio) e vistas peripl�micos (em baixo). O domínio β-barrel é indicado em verde enquanto o domínio plugue está em magenta. Certo, a estrutura do Autotransporter ESTA (código PDB 3KVN), descrevendo a extracelular (em cima), a membrana (meio) e vistas peripl�micos (em baixo). O domínio β-barrel é indicado em ouro enquanto o domínio de passageiros é em azul. Por favor clique aqui para ver uma versi maioresem dessa figura.
Figura 4. Esquema de clonagem e expressão para produção de tubagem OMPs β-barril. Esquemático da tubagem utilizada para clonar e expressar uma OMP alvo por qualquer uma das expressões de membrana nativa (esquerda) ou por expressão em corpos de inclusão para o re-enrolamento (à direita). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Representação esquemática da tubagem de purificação para o isolamento de OMPs β-barril. Esquemático da tubagem utilizada para a extracção de OMPs que foram expressos directamente na OM. Aqui, o alvo OMP tem que ser extratoed da membrana por solubilização com detergente apropriado e, em seguida, purificado por IMAC, cromatografia de troca iônica e gel filtração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Representação esquemática de tubagem de cristalização para o crescimento de cristais de OMPs β-barril. Três métodos podem ser utilizados para a cristalização de OMPs β-barril incluindo o rastreio de detergente, bicelles e fase cúbica lipídica (LCP). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. As novas ferramentas do cristalografia que têm contribuído significativamente para estruturar a determinação de OMPs β-barril. Exemplos incluem robôs de cristalização / robôs LCP (A), microscópios UV (B), Segunda Ordem não-linear de imagem de cristais quirais (SONICC) visualização (C), discos robóticos / robots (D), os métodos A varredura / vetor / helicoidal de coleta de dados (E ), e vigas microfoco (F). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Imagem representativa dos cristais resultantes a partir do protocolo. Cristais de rastreio detergente e bicelles pode ser tão grande como cristaisobtidos tipicamente para as proteínas solúveis; no entanto, os de LCP são quase sempre muito menor. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9. A partir de construções de cristais para estruturar a determinação para o alvo da vacina putativa yiur de Yersinia pestis. O gasoduto geral utilizado para a determinação da estrutura de yiur, ilustrando as medidas tomadas para clone, expressar, purificar, cristalizar e resolver a estrutura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
β-barrel OMPs servir papéis essenciais em bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos e são alvos importantes para a análise estrutural que oferecem uma riqueza de informações sobre mecanismos moleculares essenciais nas membranas externas desses respectivos organelas. No entanto, a produção de amostra suficiente para análise estrutural nem sempre é fácil e, portanto, um gasoduto geral é apresentado para a produção de quantidades suficientes de alvo OMPs β-barril para determinação da estrutura, explicando em detalhes o processo a partir de construções de cristais. Embora estes protocolos têm sido testado e está a trabalhar para a maioria das OMPs de bactérias Gram-negativas, existem limitações em que existem algumas metas, em particular para mitocôndrias e cloroplastos, que podem exigir outros métodos para a expressão e purificação. Como tal, os métodos aqui deve ser aplicável para a maioria dos projectos que envolvem OMPs a partir de bactérias Gram-negativas, mas o nível de expressãos e a quantidade de amostra purificada irá variar dependendo da OMP alvo.
Existem duas abordagens gerais para a expressão de OMPs β-barril para estudos estruturais, (1) a expressão in vivo directamente na membrana externa e (2) expressão de corpos de inclusão para redobragem in vitro. Para o vivo abordagem expressão, OMPs β-barril são direcionados a membrana externa de E. coli onde são dobradas de forma nativa e isolado directamente a partir de membranas. Expressão à membrana é a abordagem preferida desde alvos são mais prováveis de estar correctamente dobrados. Embora esta abordagem normalmente produz níveis mais baixos de proteína total, que evita as complicações associadas às vezes com a redobragem in vitro. Muitos OMPs β-barril foram expressos com sucesso desta forma para a determinação da estrutura 4,5,11. O sucesso é muitas vezes conseguida usando um sistema que se baseia em baixo nível de expressão constitutiva de um T7 promovemR, mas outros sistemas que se baseiam na indução (isto é, IPTG, arabinose) para expressão também são rotineiramente utilizados com sucesso.
Expressão directamente na membrana externa requer a proteína alvo ter uma sequência de sinal N-terminal que dirige o complexo de ribossoma cadeia nascente para o translocon Sec, para a secreção da OMP β-barril nascente para o periplasma. A sequência de sinal é clivado no lado periplasmático da membrana interior, por isso, é importante que a sequência de sinal precedem qualquer tag N-terminal adicionado ao alvo. A OMP β-barril nascente é, em seguida, acompanhados por chaperonas através do periplasma para o complexo BAM para inserção na membrana exterior 2,3.
Para alvos que não pode ser sobre-expressas na membrana, uma abordagem alternativa é a expressão em corpos de inclusão para o re-enrolamento in vitro 28-30. Esta abordagem geralmente resulta em alto nível e robusta expressão oF a proteína alvo. No entanto, ele pode ser um desafio para identificar as condições de redobragem, a redobragem como pode ser ineficiente. Além disso, ela pode ser difícil de ensaio, quando o alvo β-OMP barril está correctamente dobrada. Ainda assim, existem muitos exemplos de proteínas que foram redobradas com sucesso para estudos estruturais, incluindo OmpA 31, 19 Ail, OmpF 32, e VDAC 33. Para os clones que não expressam a todos (nativa ou em corpos de inclusão) ou expressa, mas não estão montadas correctamente na membrana (nativa), pode-se tentar a mutação β-barril para se assemelhar mais de perto a do E. coli 34,35. A sequência de aminoácidos no sinal-β do domínio barril é importante para o reconhecimento e montagem pelo complexo de BAM e variações na sequência de sinal-β pode afectar significativamente tanto biogênese e expressão de níveis adequados de OMP 11,34 alvo β-barril , 35. integração adequada do alvo β-barrEL OMP pode ser monitorizada por rastreio para fraccionamento de membrana e a extractabilidade de detergente seguido por ensaios de modifiability calor.
A cristalização de proteínas de membrana na presença das micelas de detergente é a técnica mais antiga e permite a fácil adaptação do equipamento de cristalização de proteínas solúveis e estratégias tradicionais. Ao mascarar a membrana regiões incorporados com moléculas de detergente, concentrada de proteína pode ser tratada de uma forma semelhante às proteínas solúveis (por exemplo, misturado com licores-mãe de cristalização e fechados num aparelho de difusão de vapor que provoca a lenta desidratação da queda de proteína). Embora simples em termos de conceito, características e propriedades detergentes adicionar uma camada significativa de complexidade no topo dos desafios de cristalização normais. Especificamente, o carácter molecular de um detergente deve ser empiricamente adaptado a uma dada proteína alvo, incluindo o tamanho da micela, a polaridade do grupo da cabeça (aniónico, catiónico, não iónico, ouzwitteriónico), e comprimento de cadeia de hidrocarboneto, como cada um destes afectar a estabilidade da proteína de membrana alvo em solução. Desvantagens dessa abordagem incluem o ambiente químico não-nativo, o potencial de obscurecimento das regiões superficiais que poderiam formar contatos de cristal, e as questões de concentração de detergente.
Bicelles são uma mistura de lípidos anfifílicos e (por exemplo, detergentes ou lípidos de cadeia curta) que se reúnem em partículas individuais que imitam uma estrutura em bicamada semelhante ao das membranas encontrados em células 36,37. As máscaras de anfifilo do núcleo hidrofóbico da presente bicamada onde é exposto nas suas extremidades de uma forma semelhante às micelas em cristalização detergente. Isso proporciona um ambiente mais semelhante à nativa para ajudar a estabilizar proteínas-alvo.
Alvos de proteína de membrana pode também ser cristalizado com fase cúbica lipídica (LCP) métodos 38. LCP é uma mesofase formados pela mistura de lípido e água, emque uma bicamada contínua é permeada por duas redes não-interseção de canais de solventes. Esta estrutura tridimensional permite a difusão de proteínas de membrana de lípidos incorporado em um ambiente em grande parte semelhante à nativa e permite que os contactos de cristal para formar entre as superfícies hidrofóbicas e hidrofílicas das proteínas e diminui o teor de solvente total de cristais enquanto aumentando a sua encomenda. Desde a sua introdução na década de 1990, as técnicas LCP têm sido fundamentais na determinação das estruturas de muitos alvos de proteína de membrana indescritíveis, como rodopsinas 39,40 e GPCRs 41-43. Uso de LCP em telas de alto rendimento exige disposições especiais (ou seja, robô específico do LCP, Seringas de gás, ferramenta de distribuição de LCP, placas sanduíche de cristalização, etc.) como o mono-oleína de espessura comumente usado para LCP não podem ser manipulados pelo manuseio nanoliter líquido tradicional robôs.
cromatografia de filtração em gel é um passo extremamente importantepara a cristalização de proteínas de membrana em geral porque produz informações sobre a forma como a estabilização do detergente é escolhido para o alvo a proteína da membrana, que pode ser visualizado por o cromatograma. Comparando a quantidade de amostra no volume vazio, tempos de retenção, e as formas dos picos, a estabilidade global e monodispersity da amostra pode ser acedido. Uma amostra ideal teria muito pouca ou nenhuma amostra perdeu no volume vazio e teria um único pico de eluição simétrica com uma distribuição de Gauss. O detergentes C 8 E 4 (0,8%), OG (1,0%), e LDAO (0,05%) são rotineiramente utilizados para a cristalização de OMPs β-barril com sucesso e são bons para começar. Idealmente, as experiências de pequena escala são realizadas comparando vários detergentes ou misturas de detergentes para determinar quais são os mais adequados para a cristalização. Aqueles que são encontrados para ser mais estabilização são então utilizados para preparações em grande escala do alvo β-baOMP rrel e para ensaios de cristalização.
Uma vez que os cristais são formados da OMP alvo β-barril, a optimização de chumbo (ou seja, rastreio aditivo, Cryo-rastreio, rastreio aditivo detergente, etc.) e outras técnicas semelhantes para alvos de proteína solúvel pode ser seguido com poucas diferenças. No entanto, existem alguns avanços recentes que são extremamente úteis quando se trabalha com proteínas de membrana. Especificamente, os cristais de proteína de membrana pode muitas vezes ser difícil de detectar no seu licor mãe por uma variedade de razões. proteínas da membrana muitas vezes formam relativamente pequenos cristais e falsos positivos podem desorientar otimização de cristal. técnicas LCP especialmente apresentam desafios adicionais, tendo em conta os ambientes altamente viscosos, muitas vezes pouco claras em que os cristais são crescidos. Estratégias para abordar estas questões incluem o uso de microscópios ultravioleta (UV) em conjunto com microscópios de luz, permitindo cristais de proteínas naturalmente fluorescentes a ser distinguido fROM sal não-fluorescente e cristais de detergente (figura 7). Os desafios permanecem, no entanto, na identificação positiva de cristais de proteínas que formam dentro de campos de precipitante. Os cristais também podem ser detectados pela exploração do efeito da maior parte dos cristais quirais freqüência dupla quando fotografada por pulsos laser de femtossegundos de digitalização, como implementado pela tecnologia SONICC 44. Esta alta resolução, alto contraste técnica pode ser utilizada para distinguir os cristais de submícron a partir de condições que obscureciam.
proteínas de membrana de colheita é feita utilizando técnicas de cristalografia de padrão, em particular para o detergente e a cristalização bicelle. Looping é realizada à mão usando um microscópio de ampliação baixa e um circuito de montagem do cristal (isto é, fibras de nylon, fio, ou polímero). Absorção de excesso de solvente e proteção crio antes de mergulhar congelamento em líquido criogénico são também procedimentos padrão quando a colheita cristais OMP β-barril. No entanto, a colheitação de cristais LCP cultivadas apresenta problemas particulares, especialmente se a colheita directamente a partir de placas em sanduíche, como cristais podem ser de difícil acesso e não pode ser facilmente observado através do microscópio. Além disso, os cristais crescidos em LCP vezes têm de ser colhidas em grandes quantidades uma vez que a mistura de LCP não podem ser facilmente separados no interior do circuito.
A coleta de dados para OMPs β-barril pode ser realizada como com cristais de proteínas solúveis com apenas algumas considerações adicionais. Embora o tamanho dos cristais crescidos por métodos detergentes e bicelle são muitas vezes comparáveis às cultivadas com proteínas solúveis, cristais crescidos pelo método LCP são quase sempre significativamente menor. Além disso, porque as amostras colhidas a partir da matriz de LCP muitas vezes conter vários cristais que são difíceis de observar, deve-se utilizar fontes sincrotrão que têm capacidades A varredura de mini-feixe e laço que pode digitalizar sistematicamente o ciclo inteiro para localizar as posições de cristais baseados em diffraCÇÃO (Figura 7). O pequeno tamanho dos cristais de LCP também os torna especialmente susceptível a danos por radiação. Portanto dados de vários cristais são frequentemente fundidos a fim de recolher um conjunto de dados completo.
Uma vez assim cristais de difração são obtidos e um conjunto de dados completo é recolhido, para a determinação da estrutura OMPs β-barril pode ser realizada utilizando os mesmos procedimentos como para as proteínas solúveis, tendo em mente que os cristais de proteína de membrana apresentam geralmente um elevado teor de solvente. Tal como acontece com todos os alvos de cristalografia, se a proteína solúvel ou proteína de membrana, cada um oferece seus próprios desafios e por isso há um único gasoduto pode aplicar diretamente para todos os destinos. Portanto, é o trabalho do pesquisador primário (s) para adequar esses protocolos gerais de acordo para garantir o sucesso da sua / seu projeto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | - | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | - | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | - | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | - | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | - | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | - | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | - | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | - | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | - | |
| SS34 rotor | Sorvall | - | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | - | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | - | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | - | |
| Gas-tight syringe (100 ml) | Hamilton |
References
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