Introduction
β-бочка ОМР можно найти только во внешних мембранах митохондрий, хлоропластов и грамотрицательные бактерии 1-3. В то время как они служат аналогичные роли в качестве альфа-спиральных белков, они имеют очень разные складку, состоящий из центральной области β-бочка мембраны встраиваемый в диапазоне от 8-26 антипараллельными бета-нитей с каждой пр дь тесно связан с двумя соседними нитями (фиг.1 и 2). Первый и последний пряди области β-бочка затем взаимодействуют друг с другом, почти исключительно в анти-параллельно (за исключением митохондриальной VDAC), чтобы закрыть и загерметизировать домен β-бочка из окружающей мембраны. Все ОМР β-бочка имеют внеклеточные петли разной последовательности и длины, которые играют важную роль в лигандных взаимодействий и / или белок-белковых контактов, причем эти петли иногда быть как большой, как 75 остатков, например, найти в Neisseria, трансферрин связывания проTein A (TbpA) 4. β-бочка ОМР может также иметь N-концевые или С-концевые периплазмической расширения , которые служат в качестве дополнительных доменов для функционального назначения белка (например, Бама 5-7, FimD 8,9, ФАДЛЬ 10). Хотя многие типы β-ствольных ОМР существует 11, два из наиболее распространенных типов описаны ниже в качестве примеров для тех , кто менее знаком с полем, (1) TonB-зависимых транспортеров и (2) автовозы.
TonB-зависимых транспортеров (например, FEPA, TBPA, BtuB, Cir и т.д.) имеют важное значение для импорта питательных веществ и содержат N-концевой домен подключаемый модуль , состоящий из ~ 150 остатков , который находится внутри , заправленные С-концевой 22-многожильный β- Несколько доменов ствол встроен в наружную мембрану 12 (рисунок 3). В то время как этот плагин домен предотвращает субстрат свободно проходя через домен ствола, связывающий субстрат индуцирует конформационные изменения в домене штекером гопри приводит к образованию пор (либо с помощью штекера перегруппировки или путем частичного / полного выталкивания пробки), который затем может облегчить транспорт субстрата через внешнюю мембрану в периплазму. TonB-зависимых транспортеров особенно важны для выживания некоторых патогенных штаммов грамотрицательных бактерий , таких как менингококк, которые эволюционировали специализированные транспортеры , которые угнать питательные вещества , такие как железо непосредственно из белков человека принимающих 4,13,14.
Автовозы относятся к V системы секреции типа грамотрицательных бактерий и бета-баррель ОМР, которые состоят из области β-бочка (как правило, 12-нитей, как с ЭСТА и ESPP) и домен пассажира, который либо секретируются или представленные на поверхность клеток 15,16 (рисунок 3). Эти β-бочка ОМР часто служат важную роль в выживании клеток и вирулентности с доменом пассажирской обслуживающей либо как протеаза, адгезина, и / или других Е.Ф.Fector, что связующим звеном патогенеза.
Структурные методы, такие как рентгеновская кристаллография, ЯМР-спектроскопии и электронной микроскопии (ЭМ) позволяют определить модели для датчиков OMP с атомным разрешением, которое в свою очередь может использоваться, чтобы расшифровать точно, как они функционируют в пределах внешней оболочки. Эта бесценная информация может быть затем использована для лекарственных средств и вакцин развития, если это применимо. Например, трансферрин - связывающий белок А (TbpA) находится на поверхности Neisseria и необходим для патогенеза , поскольку она непосредственно связывается с человеческим трансферрином , а затем извлекает и импортирует железо для своего собственного выживания. Без TbpA, Neisseria не может продувать железа из человеческого организма и оказываются непатогенные. После того, как была решена кристаллическая структура человеческого трансферрина , связанного с TbpA 4, стало гораздо яснее , как связаны эти два белка, каких регионах TbpA опосредованное взаимодействие, какие остатки играют важную роль для извлечения железа путем TbpA, икак можно было бы разработать терапевтические средства против Neisseria таргетинга TbpA. Поэтому, учитывая важность β-ствольных ОМР в грамотрицательных бактерий для выживания и патогенеза, а также в митохондриях и хлоропластов функции, а также необходимость дополнительной структурной информации об этом уникальном классе мембранных белков и систем, в которых они функционируют общие протоколы представлены с общей целью выражения и очистки целевых ОМР на высоких уровнях для определения характеристик структурными методами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клонирование и экспрессия
Примечание: Для включения структурных исследований, достаточное количество высокоочищенного белка должно быть получено, и это как правило , начинается с клонированием и избыточной экспрессии белка - мишени β-бочка наружной мембраны (OMP) в E. палочки (Рисунок 4). На сегодняшний день все β-бочка OMP структур, в том числе для структур митохондриальной VDAC, были получены от бактериально экспрессируемого белка 11. Здесь, общие протоколы представлены для клонирования и экспрессии β-ствольной ОМР для (1) нативной экспрессии непосредственно в бактериальных мембранах и (2) выражение в включений тел для ин витро рефолдинга 17.
- Проектирование конструкции экспрессии
- Получить или приобрести кодон оптимизированный ген целевой OMP.
- Покупка или получить вектор экспрессии, Т7 (I), содержащий последовательность периплазматической локализации сигнала, N-терминальный 6х-гистидин тег,и сайт протеазы TEV 4,18,19 для экспрессии к мембране или (II) без периплазмической последовательности локализации сигнала для экспрессии телец включения для рефолдинга в пробирке в естественных условиях.
Примечание: N-концевой протеазы расщепляться 6х или 10х-гистидин тег обеспечит простой способ очистки. Как и в случае растворимых белков, варьировать выбор аффинной метки (гистидин, Стрептококковое, GST и т.д.), от положения аффинной метки, а также включение сайта протеазы (ТРВ, энтерокиназы, тромбин и т.д.) для последующего удаления тега , - ПЦР-амплификации последовательности-мишени с соответствующими грунтовками и субклона в вектор экспрессии. Используйте безлигазное клонирование (LIC) 20,21 или обычные способы клонирования (ферменты рестрикции / лигирования) для субклонирования. Однако ЛИК может облегчить высокую пропускную способность, что позволяет для огромного числа различных конструкций (укорочения, разнообразие тегов, разнообразие промоутеров), чтобы быть клонированы параллельно болеебез труда.
- В Vivo Мембранная направленной экспрессии
- С помощью анализа секвенирования для проверки целевого бета-бочка OMP клонирован вниз по течению и в рамке с сигнальной последовательностью (т.е. pelB, OmpA) в конструкции экспрессии.
Примечание: сигнальная последовательность направляет синтезируемой цепью к транслокона сек для секреции в периплазму и последующей сборки в наружную мембрану. - Transform конструкцию в штамм экспрессии бактерий для экспрессии пипеткой 1,0 мкл плазмиды в 50 мкл BL21 (DE3) химически компетентные клетки и осторожно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируют на льду в течение 30 мин.
- Тепловой импульс при 42 ° С в течение 30 секунд с помощью водяной бани, а затем поместить обратно на льду в течение 1 мин.
- Добавьте 1 мл подогретого SOC СМИ и встряхивают при температуре 37 ° С в течение 1 ч при 1000 оборотах в минуту с использованием шейкера инкубатора настольный.
- Пластина 100 мкл клеток на чашках с агаром LB, содержащей соответствующее AntibiotIC и инкубировать в течение ночи при 37 ° С перевернутой.
- Выполните мелкомасштабные тесты экспрессии путем инокуляции + культуру с антибиотиком 5 мл LB с одной колонии. Повторите эти действия для 5-10 колоний.
Примечание: Из-за потенциальной токсичности β-бочка OMP и зависимость от базальных уровней экспрессии, иногда наблюдается колонии к колонии изменчивости. Таким образом, скрининг нескольких колоний рекомендуется для каждой конструкции испытывается. Для малых экспрессии тестов, а не обычные 5 мл культур, растущих в 25 мл культуры в 125 мл колб Эрленмейера с перегородками предлагается. Эти условия часто лучше отражают то, что будет происходить в росте крупномасштабной. Кроме того, это хорошая идея также экран различные виды питательных сред (TB, LB, 2xYT, M9 и т.д.), так как различные уровни успеха были зарегистрированы в зависимости от целевого белка.- Растут при температуре 37 ° С при встряхивании до OD 600 ~ 0,6.
- Индуцируют экспрессию целевой OMP по объявлениюDing 5 мкл 1 М изопропилового бета-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в каждую культуральную пробирку и позволяют выращивать еще 1-2 ч.
- Сравните уровни экспрессии для всех колоний путем центрифугировани 1 мл каждой культуры (OD 600 ~ 0,6) в течение 1 мин при 15000 XG с помощью микроцентрифуге.
- Удалить супернатант и клетки вновь суспендируют в 200 мкл 1x SDS-PAGE буфера загрузки. Нагревают при 100 ° С в течение 5 мин, а затем снова центрифуге при 15000 х г в течение 5 мин.
- Анализ образцов с помощью SDS-PAGE с помощью пипетки 20 мкл в каждую лунку 10% геле. Выполнить гель в течение 35 мин при постоянном 200 В.
Примечание: Было бы полезно, в этот момент, чтобы иметь возможность определить, является ли целевой белок быть сложены надлежащим образом или нет. Это часто может быть достигнуто, делая небольшие очисток или путем опробования для тепла модифицируемость.
- Выберите колонию, показывая лучшее выражение и выполнить широкомасштабную выражение с помощью 12-24 л среды,
Примечание: Традиционные методы , как правило , растут культуры при 37 ° С при встряхивании до OD 600 ~ 0,6 , а затем вызвать с помощью соответствующего индуктора (т.е. 0,1-1 мм для IPTG или ~ 0,2% для арабинозы) еще в течение 2-4 ч , При желании перед индукцией, снизить температуру до минимального 20 ° C и продлить время индукции.- Для метода вытекающей экспрессии, выращивают в 25 мл прививают культуру при 37 ° С в LB среде , содержащей соответствующий антибиотик (антибиотики) , пока OD 600 не достигает ~ 0,6. Затем добавляют 1 мл посевного материала до двенадцати 1 л колбах среды ТВ плюс антибиотик (антибиотики) и расти при температуре 20 ° C до насыщения (~ 3 дня).
- Урожай клетки центрифугированием при 6000 мкг в течение 10 мин.
- Перейдите к шагу очистки раздела 2.1 или заморозить осадок клеток в жидком азоте для длительного хранения при температуре -80 ° С.
- С помощью анализа секвенирования для проверки целевого бета-бочка OMP клонирован вниз по течению и в рамке с сигнальной последовательностью (т.е. pelB, OmpA) в конструкции экспрессии.
- Выражение для телец включения для In Vitro Refolзвенеть
- С помощью анализа секвенирования, чтобы проверить, экспрессирующая конструкция не содержит сигнальную последовательность. Отсутствие сигнальной последовательности направит целевой белок накапливаться в цитозоле в виде телец включения.
- Преобразуем выражение конструкции в штамм экспрессии бактерий для экспрессии. Для экспрессии телец включения, то лучше контролировать экспрессию по индукции (т.е. IPTG, арабинозы и т.д.) , чтобы свести к минимуму возможные последствия , связанные с токсичностью.
- Пластина 100 мкл трансформированных клеток на чашках с агаром LB, содержащей соответствующий антибиотик и инкубировать в течение ночи при 37 ° С перевернутой.
- Выполните мелкомасштабные тесты экспрессии путем инокуляции + культуру с антибиотиком 5 мл LB с одной колонии.
- Повторите шаг 1.3.4 для 2-4 дополнительных колоний.
- Растут при температуре 37 ° С при встряхивании до OD 600 ~ 0,6.
- Индуцируют с соответствующим индуктора в течение 1-2 ч.
- Сравнение уровней экспрессии для всех тон колоний анализа с помощью SDS-PAGE (шаг 1.2.6). Выберите колонию, показывая лучшее выражение и выполнить широкомасштабную выражение с помощью 12-24 л среды.
- Grow клетки при 37 ° С до OD 600 0,6-0,8 и индуцируют при 37 ° С в течение 3-5 ч. В то время как выражение в тельцах включения является более устойчивым, чем другие типы выражения, как и во всех экспериментах экспрессии белков, экспрессия может быть улучшена за счет изменения среды роста, время индукции, температуру индукции и концентрацию индуцирующего агента.
- Урожай клетки центрифугированием при 6000 мкг в течение 10 мин.
- Перейдите к шагу очистки Раздел 2.2 или заморозить осадок клеток в жидком азоте для долговременного хранения при -80 ° С.
2. Очистка
- Изоляция от мембранными фракциями
Примечание: В отличие от растворимых белков, интегральными мембранными белками встраиваются в липидный бислой и, следовательно,требуют моющие средства для их извлечения для дальнейшей очистки и анализа (рисунок 5). После экспрессии, первый шаг в очистке β-бочка OMP является извлечение из мембранной фракции.- Ресуспендируют клеток в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 200 мМ NaCl, 10 мМ MgCl 2, 50 мкг / мл AEBSF, 5 мкг / мл ДНКазы I) в соотношении 5 мл / г клеточной пасты.
- Лизировать клетки, используя французскую прессу или клеточную гомогенизатора. Спин лизированных клеток при 15000 х г в течение 30 мин при 4 ° С для удаления unlysed клеток и клеточных остатков.
- Передача супернатант в чистую пробирку и центрифугируют еще раз на высокой скорости (200000 х г) в течение 1 ч при 4 ° С. Полученный в результате осадок является мембранную фракцию, которая содержит белок, представляющий интерес.
- С помощью гомогенизатора Даунса гомогенизатора, ресуспендируют мембранную фракцию, первый перенос мембран , а затем добавление солюбилизационной буфера (50 мМ KH 2 PO 4 рН 7,5, 200 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, РН 8,0) (50 мл на 20 г клеток) при концентрации 2 ×, без моющих средств.
- Налейте ресуспендированные мембраны в небольшой стакан и добавьте моющее средство (то есть, н-додецил-β-D-maltoside (ДДМ), lauryldimethylamine-N-оксид (LDAO), н-октил-бета-D-глюкопиранозид (ОГ), Тритон Х-100 и т.д.) медленно до конечной концентрации ~ 10 - кратным критической концентрации мицеллообразования (ККМ).
- Наполните водой до конечной концентрации буфера 1x солюбилизацию. Перемешивают в течение 0.5-16 часов при температуре 4 ° С, в зависимости от того, насколько легко целевой белок экстрагируют из мембран.
Примечание: моющее средство используется для медленно солюбилизации мембран для извлечения целевого белка. Есть 3 вида моющих средств, которые могут быть использованы здесь: ионная (SDS, деоксихолевую кислоты), неионное (Elugent, ТВИН, Тритон Х-100, О. Г., DDM) и цвиттерионная (LDAO, CHAPS). Белок-моющий комплекс, который является стабильным и монодисперсных во время стадии очистки будет в значительной степени способствовать успеху мембранного белка crystallizatиона. Более подробную информацию о моющих средствах, их свойствах, информация о ККМ, а также их использования в очистке мембранных белков и других приложений можно найти на сайтах коммерческих поставщиков. - Центрифуга солюбилизированного образца при 300000 х г в течение 1 ч при 4 ° С. Супернатант теперь содержит моющую солюбилизированных мишень β-бочка OMP.
- Продолжить с разделом 2.3, как показано ниже.
- Рефолдинга из телец включения
Примечание: Для рефолдинга в пробирке, мишень β-бочке OMP выражается непосредственно в тельцах включения. Одним из преимуществ является то, что эти белки могут быть получены при высоких уровнях. Однако недостатком является то, что рефолдинга часто неэффективно и варьируется от одного рефолдинга эксперимента к другому. Тем не менее, есть много примеров белков, которые были успешно ренатурирован для структурных исследований. После выражения в телец включения, теперь нужно изолировать тельца включения для рефолдинга экспериментs.- Ресуспендируют клеток в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 200 мМ NaCl, 10 мМ MgCl 2, 50 мкг / мл AEBSF, 5 мкг / мл ДНКазы I, 4 мМ 2-меркаптоэтанола (BME)) (5 мл на г пасты клеток). Lyse с использованием либо французская пресса, обработка ультразвуком, или клеточный гомогенизатора.
- Гранул тела включения низкой скорости вращения при 6000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
- Промыть тел включени путем ресуспендирования в 25 мл 1,0 М мочевины с использованием гомогенизатора Даунса гомогенизатора. Гранул снова низкой скорости вращения при 6000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Повторите шаг 2.2.3 по мере необходимости.
- Ресуспендируют промытых телец включения до конечной концентрации 10 мг / мл с использованием буфера , содержащего 8,0 М мочевину (или 6,0 М гуанидин гидрохлорид (GDCL)) плюс моющее средство (то есть, ДДМ или LDAO) на 2х КМЦ или выше.
Примечание: Если желательно, для мембранных белковых мишеней, содержащих гистидин тег, иммобилизованных металл-аффинной хроматографии для очистки (IMAC) может быть выполнена с использованием денатурирующих COnditions (в 8,0 М мочевины или 6,0 М GdCl) в качестве первого шага, аналогичной описано ниже в разделе 2.3. - Выполните Рефолдинг реакцию медленно (в течение ночи) удаление денатурирующего путем диализа в буфере не хватает денатурирующего агента.
Примечание: Это может занять несколько изменений буфера для диализа для достижения этой цели. В качестве альтернативы, если тела включени связанных вначале в колонну IMAC, можно сделать повторную укладку реакцию в то время как все еще привязаны к колонке путем медленного обмена буферов для удаления денатурирующего. В любом случае, помните, что это мембранный белок, поэтому, моющее средство должно присутствовать для стабилизации цели. Кроме того, если моющее средство используется является диализуемый, оно должно быть добавлено к диализного буфера (ов), а также. - Спиновые ренатурирован образцы при 200000 х г в течение 1 ч при 4 ° С. Супернатант содержит ренатурирован моющий солюбилизированных мишень β-бочка OMP.
- Продолжить с разделом 2.3, как показано ниже.
- Очистка с помощью IMAC, ионообменные и гель-фильтрация
Примечание: Если предположить , что белок был разработан с гистидин тег, то ли изначально выражены или сложила с использованием методов в пробирке, затем иммобилизовали металл-аффинной хроматографии (IMAC) выполняется для очистки так же, как для гистидин помечено растворимые белки, кроме моющего средства должны храниться в все последующие буферы для поддержания целевой β-бочка OMP, растворимое и стабильное.- Подготовить 1-5 мл колонку IMAC или использовать набитых колонку. Выполнение последующей стадии хроматографии при 4 ° С. Промывать водой, чтобы удалить любые следы консервантов. При использовании автоматизированной системы очистки, установки колонки в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Приготовьте 500 мл IMAC буфера А (50 мМ К 2 НРО 4, рН 7,5, 200 мМ NaCl, 0,1% ДДМ) и 250 мл IMAC буфера В (50 мМ К 2 НРО 4, рН 7,5, 200 мМ NaCl, 0,1% ДДМ, и 1,0 М имидазола).
Примечание: Другие моющие средства, которые могут быть использованы INCLUDE Cymal-6 (0,05%), Тритон Х-100 (0,03%), и LDAO (0,05%). - Равновесие колонку IMAC, используя 10 объемами колонки ИАЦ Буфере A.
- Добавить имидазола в образце белка до конечной концентрации 25 мМ и перемешать. Загрузить образец на уравновешенную колонку IMAC при 2 мл / мин. Собирают поток через.
- Промывают колонку IMAC с 5 объемами колонки каждого возрастающих концентраций имидазола с использованием буфера В (то есть, 25 мМ, 50 мМ, 100 мМ). Соберите промывок в 2 мл фракции.
- Элюции образца с конечной концентрацией 250 мМ в течение 5 объемов колонки. Сбор элюированного образца в 2 мл фракции.
- Анализ потока через промывочный фракции и фракции, элюированные с помощью анализа SDS-PAGE (шаг 1.2.6) в зависимости от их оптической плотности при длине волны 280 нм. Объединяют фракции, содержащие целевой бета-баррель OMP, как подтверждают анализом SDS-PAGE.
- Удалите 6х-гистидин тег путем добавления TEV протеазы в объединенном образце (в соответствиис протоколом производителя) и инкубирование в течение ночи при 4 ° С с нежным покачиванием.
- Загрузите раствор образца / протеазы на колонку IMAC еще раз, чтобы отделить целевой бета-бочке OMP (поток через) из расщепленных тегов и любого нерасщепленного образца. Поток через будет содержать расщепляется образца, в которых отсутствует тег.
Примечание: Это также приведет к удалению любого протеазы, как ТРВ-His, который также имеет сам нерасщепляемый 6х-гистидин тег. В противном случае, другие методы будут необходимы для удаления протеазы после переваривания. - При желании выполнить ионообменной хроматографии для дальнейшей очистки пробы. Следуйте инструкциям производителя для колонки, которые будут использоваться, будучи уверенным, что включать моющее средство во всех буферов.
- Для подготовки к кристаллизации загрузить образец в колонку для гель-фильтрации в буфер, содержащий моющее средство, чтобы использоваться для кристаллизации, например, 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 200 мМ NaCl, 1% OG.
- Соберите 1 мл фракции и анализируют USIАнализ нг SDS-PAGE (см Шаг 1.2.6) на основе их оптической плотности при длине волны 280 нм. Бассейн фракции с поглощательной способностью при 280 нм, так как они содержат белок-мишень. Концентрат до ~ 10 мг / мл.
Примечание: При необходимости надлежащего складывания может быть оценена с использованием анализа теплового модифицируемостью, как описано ниже.
- Тепло модифицируемостью Анализ
Примечание: Один из способов , чтобы контролировать надлежащее сгибание очищенной бета-бочке ОМР должен выполнить модифицируемостью анализов тепла с использованием полупроницаемой нативный SDS-PAGE 22. Здесь, неотапливаемые образцы, которые сгибают должным образом, как правило, мигрируют в отличие от тех, что тепло денатурированный. Это свойство является уникальным для бета-баррель ОМР и широко используется для изучения этого семейства мембранных белков.- До начала подготовки образцов, собрать аппарат геля. Для начала, поместите буферный резервуар в ведерке со льдом и полностью окружить со льдом. Вставьте в доме бросание или коммерческий гель родной градиент в держатель и помещают в резервуар. Заполните тон полностью бак с холода 1x MES проточном буфере (50 мМ 2- [N-морфолино] этансульфоновой кислоты, 50 мМ Трис-основание, 1 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, рН 7,3).
- Пипетка 0,25 мкл образца (10 мг / мл) в две 1,5 мл микропробирок. Этикетка один как "Вареные", а другой как «RT».
- Добавить 9,75 мкл буфера для образца к каждому и перемешать с помощью пипетки. Для обоих образцов, добавить 10 мкл 2x SDS буфера для загрузки (100 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 2% SDS, 0,2% бромфенолового синего, и 20% глицерина) и осторожно перемешать с помощью пипетки.
- Вскипятите '' Вареный образца при 95 ° С в течение 5 мин при выходе из образца 'RT' при комнатной температуре. Крутить "Вареные" образца на короткое время.
- Нагрузка 20 мкл обоих образцов на Подготовленный родной гель. Запуск в течение 60 мин при постоянном 150 В. Удалите гель и замочить в растворе для окрашивания, чтобы визуализировать результаты.
3. Кристаллизация
Примечание: Для кристаллизации обоихрастворимые и мембранные белковые мишени, это стандартный протокол , чтобы максимизировать чистоту образца и стабильность (т.е. лучшее моющее средство, лиганды, кофакторов и т.д.). Текущая методология для кристаллизации целей мембранного белка в целом включает в себя три основных подхода , которые удовлетворяют амфифильных требованиям двухслойных встраиваемый белков: (1) моющее средство, (2) bicelle, и (3) липидный кубической фазы (LCP) (рисунок 6) 23. Настоятельно рекомендуется Использование nanoliter кристаллизации робота , когда это возможно , с тем , чтобы увеличить количество условий , которые могут быть подвергнуты скринингу для данного объема выборки, а также с использованием последних достижений в области инструментов , направленных на помощь определения структуры (рисунок 7).
- Кристаллизация с помощью Моющие средства
- Получают моющий солюбилизированного образца белка, который при ~ 10 мг / мл концентрации. При желании можно добавить добавку 1,2,3-heptanetriol непосредственно к образцу до конечной концентрации 3%, чтобы уменьшить detergлор размер мицеллы.
- Фильтр образца с использованием 0,22 мкм центробежный фильтр для удаления твердых частиц и осадков.
- С помощью кристаллизации робота, выполняют широкую матрицу кристаллизации скрининга с использованием коммерчески доступных 96 а экраны либо повешение или сидя падение метод испарения с каплями, состоящих из ~ 200 нл образца белка и ~ 200 нл буфера кристаллизации.
- Инкубируют при кристаллизации пластин при ~ 21 ° C. Проверьте пластины еженедельно для роста кристаллов с помощью стереомикроскопа.
- Оптимизация кристаллизации приводит варьируя компоненты условия кристаллизации на систематической основе (увеличение / уменьшение соли или осадитель, концентрации буфера с рН, температуры инкубации, и / или концентрация белка).
- Кристаллизация Использование бицеллах
Примечание: Более подробная демонстрация bicelle методов ранее был описан Ujwal и Абрамсон 24.- Подготовить или приобрести 35% bicelle смесь , состоящую из DMPC: CHAPSO в соотношении 2,8: 1 , в соответствии с опубликованными протоколами 25. Другие концентрации также могут быть проанализированы, а также, другие липиды и моющие средства, по мере необходимости.
- Получают моющий солюбилизированного образца белка, который при ~ 10 мг / мл концентрации.
- Добавляют bicelle смесь, на льду, в качестве исходного в соотношении 4: 1 об / об (белок: bicelle) (например, добавить 10 мкл bicelle смеси до 40 мкл белка и быстро перемешать с помощью пипетки).
- Инкубировать на льду в 30-60 мин.
Примечание: Белок: решение bicelle должно оставаться в основном ясно, но часто может оказаться немного непрозрачным. Тем не менее, если этот белок: bicelle раствор становится молочно - белый, указывающую количество осадков, то другие переменные следует анализировать (то есть моющее средство, буфер, и т.д.). Для новых образцов, делая мелкомасштабные тесты (8 мкл белка и 2 мкл бицеллах) рекомендуется проверить стабильность до расширения, чтобы предотвратить ненужные потери образца. - С помощью кристаллизации робота, выполняют широкую матрицу кристаллизации скрининга с использованием коммерчески доступных 96 а экраны либо повешение или сидя падение метод испарения с каплями, состоящих из ~ 200 нл образца белка и ~ 200 нл буфера кристаллизации.
- Инкубируют при кристаллизации пластин при ~ 21 ° C. Проверьте пластины еженедельно для роста кристаллов с помощью стереомикроскопа.
- Оптимизация кристаллизации приводит варьируя компоненты условия кристаллизации на систематической основе (увеличение / уменьшение соли или осадитель, концентрации буфера с рН, температуры инкубации, и / или концентрация белка).
- Кристаллизация Использование липидной кубической фазы (LCP)
Примечание: Более подробное демонстрация методов LCP была описана ранее Лю и Черезова 26,27.- Получают моющий солюбилизированного образца белка, который при ~ 20 мг / мл концентрации.
- Предварительно прогретом моноолеин до ~ 40 ° С. нагрузка60 мкл моноолеина в одну газонепроницаемой 100 мкл шприца и 40 мкл образца белка в другой.
- Используя смесительную переходник, соедините шприцы, соблюдая осторожность, чтобы не вводить воздух.
- Осторожно перемешать с применением менного давления на шприц плунжеров толкающих смесь из одного шприца в другой полностью, пока образец не станет прозрачным и однородным.
- С помощью кристаллизации робота, предназначенный для методов LCP, выполняют широкую матрицу кристаллизации скрининга с использованием коммерчески доступных 96 экранов также с кристаллизацией пластин сэндвич стиле (0,1 мм толщиной) и с каплями, состоящих из 100 нл образца белка и 750 нл буфера кристаллизации.
Примечание: коэффициенты падения могут быть скорректированы в случае необходимости. Кроме того , твердые покрытия (т.е. стеклянные или толстый пластик) рекомендуется , которые поддерживают капли красиво , а не тонкие пленки, которые , как правило , чтобы капли двигаться хорошо , как пластины обрабатываются. - Выдержите кристаллизации рLates при ~ 21 ° C. Проверьте пластины еженедельно для роста кристаллов с помощью стереомикроскопа.
- Оптимизация кристаллизации приводит варьируя компоненты условия кристаллизации на систематической основе (увеличение / уменьшение соли или осадитель, концентрации буфера с рН, температуры инкубации, и / или концентрация белка).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
YiuR является TonB железа зависит от переносчика , который является предполагаемый целевой вакцины против Yersinia Pestis. Первоначально он был идентифицирован с помощью анализа микрочипов. Вот, шаги , которые были предприняты для определения структуры YiuR с помощью рентгеновской кристаллографии изложены (рисунок 9). Для клонирования ДНК-последовательность YiuR (минус сигнальная последовательность N-концевой) был ПЦР-амплифицирован из геномной ДНК, и субклонируют в вектор, содержащий сигнальную последовательность N-концевого pelB и 10x-гистидин аффинную метку, за которым следует сайт TEV протеазы. Для выражения, то YiuR содержащих плазмиду трансформировали в BL21 (DE3) компетентных клеток и одной колонии , используемой для выращивания культуры 5 мл стартера до OD 600 ~ 0,5. Двенадцать колбах, содержащих 750 мл среды ТВ, затем засевают 1 мл закваски и давали расти в течение 3 дней при 20 ° С (встряхивании при 220 оборотов в минуту). Затем клетки собирают, производя около 150-200г общей клеточной пасты, которая была быстро охлаждают в жидком азоте и хранили при -80 ° С до использования.
Для очистки YiuR, 20 г клеток ресуспендировали в 120 мл 1х PBS (10 мМ Na 2 HPO 4, 1,8 мМ KH 2 PO 4, 2,7 мМ KCl, 137 мМ NaCl, рН 7,4) при перемешивании при комнатной температуре с ДНКазы I и AEBSF добавляются. Лизис проводили два прохода через гомогенизатор. Затем лизат центрифугировали при 12000 мкг в течение 10 мин (спин вниз неразрушенных клеток и телец включения). Супернатант снова центрифугировали при 235000 х г в течение 60 мин, с таблеткой, содержащей мембранную фракцию (YiuR). Затем мембраны ресуспендировали в 100 мл 1x PBS с использованием гомогенизатора Даунса гомогенизатора. YiuR было растворено / извлечена из мембран с использованием Elugent при конечной концентрации 5%, перемешивают в течение ночи (до 16 ч) при температуре 4 ° С. Растворенные мембраны затем снова центрифугировали при 371,000 мкг в течение 60 мин, с суpernatant, содержащий растворенную фракцию, содержащую YiuR. Чтобы изолировать YiuR, ИАЦ проводили с использованием буфера А (1X PBS, 0,1% DDM) и буфера В (1X PBS, 1 М имидазола, 0,1% DDM), промывали с концентрацией имидазола от 30-50 мм и элюированный с 250-500 мМ , Для удаления N-концевой 10x-гистидин тег, инкубация с ТРВ HIS протеазы проводили в течение ночи при 4 ° С во время диализа в буфере 1X PBS. Образец затем пропускают через колонку с IMAC снова, поток через концентрированную, диализуют, и затем отделяют далее с использованием 0-1,0 М NaCl градиентом на колонке с ионообменной в 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5. Фракции, содержащие YiuR затем объединяли, концентрировали и наехал на колонку для гель-фильтрации с использованием 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 200 мМ NaCl и 0,05% LDAO. Фракции, содержащие YiuR затем собирали и концентрировали до 10 мг / мл для кристаллизации.
Широкая матрица скрининга Затем проводили и на условиях, определяемыхкоторый произвел некоторые начальные Дифрагирующие кристаллы. Дальнейшая оптимизация привела к более крупных кристаллов, которые были использованы для сбора данных собственные дифракции рентгеновских лучей. Кристаллы , показанные на рисунке 8 являются репрезентативными кристаллов можно достигают , используя методы , представленные здесь. Кристаллы из скрининга и бицелл моющего средства может быть столь же большим, как кристаллы, полученные, как правило, для растворимых белков; Тем не менее, те из LCP почти всегда намного меньше. Данные были достаточно хороши, чтобы быть использованы для молекулярной замены, которая привела к структуре определения до 2,65 Å резолюции.
Рисунок 1. Два типа полностью интегрированных мембранных белков являются α-спиральные и β-бочка. Здесь показаны примеры каждого с & beta; 2-адренергических рецепторов (PDB код 2RH1, α-спирали) и TonB-зависимого переносчика BtuB (PDB код 1NQE,бета-бочка). Верхняя строка показывает внеклеточный вид в то время как нижняя строка показывает вид мембраны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. β-бочка ОМР выполняют много различных функций и могут иметь разнообразные структуры. В то время как альфа-спиральную мембранные белки могут содержать один или несколько трансмембранных доменов, β-бочка ОМР в диапазоне от 8-26 нитей и каждая прядь тесно взаимодействует с соседними нитями. Внешние остатки, которые взаимодействуют с мембраной, как правило, гидрофобными в то время как внутренние остатки, которые взаимодействуют с растворителем, как правило, полярные и гидрофильными. Верхняя строка показывает внеклеточный вид, средний ряд показывает вид мембраны, а нижний ряд показывает periplasmiC View. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Примеры двух типов общих ОМР β-баррель. Левая, структура TonB-зависимого переносчика FEPA (PDB код 1FEP), изображающие внеклеточный (сверху), мембрана (средний) и вид (внизу) периплазматические. Домен β-бочка обозначается зеленым цветом в то время как домен плагин находится в пурпурного. Правильно, структура Автовоз ЭСТА (PDB код 3KVN), изображающие внеклеточный (сверху), мембрана (средний) и периплазматические вид (внизу). Домен β-бочка указывается в золоте в то время как домен пассажира в синий цвет. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное Versiна этой фигуре.
Рисунок 4. Схема клонирования и экспрессии трубопровода для получения β-ствольных ОМР. Схема трубопровода , используемого для клонирования и экспрессии целевого OMP либо нативной экспрессии мембранного (слева) или путем экспрессии в тельцах включения для рефолдинга (справа). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Схема трубопровода очистки для выделения β-ствольных ОМР. Схема трубопровода , используемого для добычи ОМР, которые были выражены непосредственно в ОМ. Здесь, цель ОМР должен быть экстрактред из мембраны путем солюбилизации с соответствующим моющим средством , а затем очищают с помощью IMAC, ионообменной хроматографии и гель - фильтрации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Схема кристаллизации трубопровода для выращивания кристаллов β-ствольных ОМР. Существует три метода могут быть использованы для кристаллизации β-ствольных ОМР в том числе моющих средств скрининга, бицеллах и липидный кубической фазы (LCP). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7. Новые инструменты в кристаллографии , которые внесли значительный вклад в структуру определения β-ствольных ОМР. Примеры включают кристаллизационные роботов / LCP роботов (A), УФ - микроскопов (B), второго порядка Нелинейные Визуализация хиральных кристаллов (SONICC) визуализация (C), роботизированные Шайбы / роботы (D), методы растеризацией / вектор / винтовая сбора данных (E ), и Microfocus балки (F). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8. Представитель изображения кристаллов в результате протокола. Кристаллы из скрининга и бицелл моющего средства могут быть любого размера в виде кристалловполучены, как правило, для растворимых белков; Тем не менее, те из LCP почти всегда намного меньше. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 9. Из конструкций к кристаллам структурировать определение для целевой предполагаемой вакцины YiuR от Yersinia Pestis. Общей трубопровода , используемого для определения структуры YiuR, иллюстрирующая шаги , предпринятые для клона, экспресс, очищают, кристаллизуются, и решить структуру. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
β-бочка ОМР выполняют важные роли в грамотрицательные бактерии, митохондрии и хлоропласты и являются важными объектами для структурного анализа, которые предлагают огромное количество информации о существенных молекулярных механизмов на внешних мембран этих соответствующих органелл. Тем не менее, производит достаточно образца для структурного анализа не всегда просто и, следовательно, общий трубопровод представлен для производства достаточного количества целевых ОМР β-ствола для определения структуры, объясняя подробно процесс от конструкций до кристаллов. В то время как эти протоколы были проверены и нашли работу для большинства ОМР из грамотрицательных бактерий, существуют ограничения в том, что есть некоторые цели, в частности, для митохондрий и хлоропластов, которые могут потребовать другие методы для экспрессии и очистки. Таким образом, методы здесь должны быть применимы для большинства проектов, которые включают ОМР из грам-отрицательных бактерий, тем не менее уровень экспрессииs и количество очищенного образца будет варьироваться в зависимости от целевого OMP.
Существуют два основных подхода к экспрессии β-ствольных ОМР для структурных исследований, (1) в естественных условиях экспрессии непосредственно в наружную мембрану и (2) выражение для телец включения для рефолдинга в пробирке. Для естественных условиях экспрессии подхода, β-бочка ОМР ориентированы на внешней мембране Е. палочка , где они изначально сложены и выделены непосредственно из мембран. Выражение для мембраны является предпочтительным подходом, поскольку цели, более вероятно, будут правильно уложенный. Хотя такой подход , как правило , дает более низкие уровни общего белка, что позволяет избежать осложнений , иногда связанные с рефолдинга в пробирке. Многие ОМР β-бочонка были успешно экспрессированы таким образом для определения 4,5,11 структуры. Успех часто достигается с помощью системы, которая опирается на конститутивной экспрессии низкого уровня из Т7 содействияг, но и другие системы , которые основаны на индукции (т.е. IPTG, арабинозы) для экспрессии также обычно используются с успехом.
Экспрессия непосредственно в наружную мембрану требует белок-мишень, чтобы иметь сигнальную последовательность N-концевой, который направляет рибосомами синтезируемой цепью комплекса к транслокона сек, для секреции формирующегося β-бочка OMP в периплазму. Сигнальная последовательность отщепляется на периплазматическому стороне внутренней мембраны, таким образом, важно, что последовательность сигналов предшествовать любому N-концевые теги добавлены к цели. Создаваемый в β-бочка ОМР затем в сопровождении шаперонов через периплазме к комплексу BAM для вставки в наружную мембрану 2,3.
Для целей , которые не могут быть избыточно экспрессируется в мембрану, альтернативный подход является выражение в тельцах включения для ин витро рефолдинга 28-30. Такой подход, как правило, приводит к высокому уровню и надежной экспрессии OF белок-мишень. Тем не менее, она может быть сложной задачей, чтобы определить условия рефолдинга, поскольку рефолдинга может быть неэффективным. Кроме того, это может быть трудно для анализа, когда мишень β-ствола ОМР правильно сложенном состоянии. Тем не менее, есть много примеров белков , которые были успешно ренатурирован для структурных исследований , включая OmpA 31, д'Ай 19, OmpF 32 и VDAC 33. Для получения клонов , которые не экспрессируют совсем (изначально или в тельцах включения) или выразить , но не собранными должным образом в мембрану (родной), можно было бы попробовать мутирует & beta; дуло к более близко напоминают , что Е. 34,35 палочка. Последовательность аминокислот в бета-сигнала домена ствола имеет важное значение для распознавания и сборки комплексом БАМ и вариации в последовательности β-сигнала может существенно влиять как надлежащий уровень биогенезом и экспрессии OMP 11,34 целевого бета-баррель , 35. Правильная интеграция целевых бета-Баррэль-OMP можно контролировать с помощью скрининга мембранного фракционирования и моющего средства экстрагируемости с последующей тепловой модифицируемостью анализов.
Кристаллизация мембранных белков в присутствии детергента мицелл является старейшей метод и позволяет легко адаптировать традиционные растворимого протеина кристаллизационного оборудования и стратегий. Маскировкой Мембрана внедренных участки с молекулами детергентов, концентрированный белок может быть обработан таким же образом в растворимые белки (например, смешанные с кристаллизационных маточных растворов и вложен в диффузионного аппарата из паровой фазы , что вызывает медленное обезвоживание капли белка). В то время как простая концепция, моющие характеристики и свойства добавить значительный уровень сложности поверх обычных проблем кристаллизации. В частности, молекулярный характер моющего средства должна быть эмпирически с учетом данного белка-мишени, в том числе размер мицелл, головная группа полярности (анионные, катионные, неионные, илицвиттерионная), а длина углеводородной цепи, как каждый из них влияет на стабильность белка мишени мембраны в растворе. Недостатки этого подхода включают неродного химическую среду, потенциал затемнение участков поверхности, которые могут образовывать кристаллические контакты, а также вопросы концентрации моющего средства.
Бицелл представляют собой смесь липидов и амфифильных веществ (например, моющие средства или коротких липидов цепи) , которые собирают на отдельные частицы , которые имитируют двухслойную структуру , аналогичную структуре мембран , обнаруженных в клетках 36,37. Амфифила маски гидрофобное ядро этого бислой, где она открыта на его краях аналогичным образом в мицеллах в производстве моющих средств кристаллизации. Это обеспечивает более нативный-среде, чтобы помочь стабилизировать белки-мишени.
Мембрана белковые цели также можно кристаллизовать с липидной кубической фазы (LCP) методов 38. МПУ мезофазы, образованный смешением липида и воды, вкоторый непрерывным двухслойная пронизана двумя непересекающихся сетей каналов растворителя. Эта трехмерная структура позволяет диффузию липидных внедренный мембранных белков в значительной степени нативной-среде и позволяет хрустальные контакты с образованием между гидрофобными и гидрофильными поверхностями белков и уменьшает общее содержание растворителя кристаллов при одновременном повышении их упорядочения. С момента своего появления в 1990 - е годы, методы LCP были решающим фактором при определении структуры многих неуловимых целей мембранного белка, такие как родопсины 39,40 и GPCRs 41-43. Использование LCP в больших экранах пропускной способности требует специальных положений (т.е. LCP конкретного робота, газонепроницаемые шприцы, LCP инструмент дозирования, сэндвич кристаллизации пластин и т.д.), толстого моноолеина обычно используется для LCP не могут быть обработаны с помощью традиционной обработки nanoliter жидкости роботы.
Гель-фильтрационная хроматография является чрезвычайно важным шагомдля кристаллизации мембранных белков в целом, так как она дает информацию о том, как стабилизировать выбранное моющее средство для целевого мембранного белка, который может быть визуализированы на хроматограмме. Путем сравнения количества образца в свободном объеме, времени удерживания и формы пиков, общая стабильность и монодисперсностью образца могут быть доступны. Идеальный образец будет иметь очень мало, чтобы не образец потерял в пустом объеме и будет иметь один симметричный пик элюции с распределением Гаусса. Моющие средства C 8 E 4 (0,8%), OG (1,0%), и LDAO (0,05%) , которые обычно используются для кристаллизации β-ствольных ОМР с успехом и являются хорошими , чтобы начать с. В идеале, малые Проведены эксперименты сравнения нескольких моющих средств или смесей моющих средств, чтобы определить, какие являются наиболее подходящими для кристаллизации. Те, которые оказались наиболее стабилизирующим затем используются для крупномасштабных препаратов целевых бета-баrrel OMP и для кристаллизации испытаний.
После того, как кристаллы образуются из мишени бета-баррель OMP, свинец оптимизации (то есть, добавка скрининга, крио-скрининг, моющая добавка скрининга и т.д.) и другие методы , подобные растворимых белковых мишеней могут следовать с некоторыми отличиями. Тем не менее, есть некоторые недавние успехи, которые чрезвычайно полезны при работе с мембранными белками. В частности, кристаллы белков мембраны часто может быть трудно обнаружить в пределах их маточного раствора по разным причинам. Мембранные белки часто образуют относительно небольшие кристаллы и ложных срабатываний может неправильно направлять оптимизацию кристалла. Методы LCP особенно создает дополнительные проблемы, учитывая высоковязких, часто непрозрачные условия, в которых выращиваются кристаллы. Стратегии для решения этих проблем включают использование ультрафиолетовых микроскопов (УФ) в сочетании со световыми микроскопами, что позволяет естественным образом флуоресцентные кристаллы протеина следует отличать пром , не флуоресцирующего соль и кристаллы моющего средства (рисунок 7). Проблемы остаются, однако, в положительной идентификации белковых кристаллов, которые образуют в области осадителя. Кристаллы могут быть также обнаружены путем эксплуатации удвоения частоты эффекта большинства хиральных кристаллов при изображается с помощью фемтосекундных лазерных импульсов сканирования, как это реализовано с помощью технологии SONICC 44. Это высокое разрешение, высокая контрастность метод может быть использован, чтобы отличить кристаллы субмикронных от заслоняя условий.
Сбор мембранных белков осуществляется с использованием стандартных способов кристаллографии, в частности, для моющих средств и bicelle кристаллизации. Циклическое осуществляется вручную с помощью малом увеличении микроскопа и кристаллом-монтажный цикл (то есть, волокна нейлона, проволока или полимер). Влагоотведение избыточного растворителя и защиты крио до окунуться замораживания в криогенной жидкости также стандартные процедуры при сборе кристаллов OMP β-баррель. Тем не менее, урожайING ЖКП выращенных кристаллов представляет собой особые проблемы, особенно если заготовки непосредственно из трехслойных пластин, в виде кристаллов может быть трудно получить доступ, и не может быть легко обнаружить с помощью микроскопа. Кроме того, кристаллы, выращенные в LCP иногда должны быть собраны в массе, так как ЖКП смесь не может быть легко отделена внутри цикла.
Сбор данных для β-ствольных ОМР может быть выполнена с растворимых белковых кристаллов с лишь несколько дополнительных соображений. В то время как размер кристаллов, выращенных моющими и bicelle методы часто сопоставимы с теми, выращенных с растворимыми белками, кристаллы, выращенные методом LCP почти всегда значительно меньше. Кроме того, поскольку образцы собирали из LCP матрицы часто содержат несколько кристаллов, которые трудно обнаружить, необходимо использовать источники синхротронного, которые имеют мини-лучевые и петли возможности растрирования, которые могут систематически сканировать весь цикл, чтобы локализовать позиции кристаллов на основе Диффрефикция (рисунок 7). Небольшой размер кристаллов LCP также делает их особенно чувствительными к радиационному воздействию. Поэтому данные из нескольких кристаллов часто объединены для того, чтобы собрать полный набор данных.
После того, как хорошо дифракционные кристаллы получаются и полный набор данных собирается, определение структуры для β-ствольных ОМР может быть выполнена с использованием тех же процедур, как для растворимых белков, имея в виду, что кристаллы белков мембраны обычно обладают более высоким содержанием растворителя. Как и со всеми целями кристаллографии, является ли растворимого белка или мембранного белка, каждая из них предлагает свои собственные проблемы и по этой причине ни один трубопровод не может непосредственно применяться ко всем целям. Таким образом, это работа первичного исследователя (ей) адаптировать эти общие протоколы соответствующим образом, чтобы обеспечить успех его / ее проекта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | - | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | - | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | - | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | - | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | - | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | - | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | - | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | - | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | - | |
| SS34 rotor | Sorvall | - | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | - | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | - | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | - | |
| Gas-tight syringe (100 ml) | Hamilton |
References
- Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
- Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
- Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
- Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
- Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
- Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
- Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
- van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
- Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
- Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
- Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
- Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
- Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
- Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
- Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
- Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
- Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
- Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
- Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
- Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
- Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
- Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
- Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
- Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
- Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
- Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
- Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
- Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
- Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510 (2012).
- Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
- Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
- Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
- Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
- White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
