Introduction
β-fat OMP kan endast hittas i de yttre membranen hos mitokondrier, kloroplaster, och gramnegativa bakterier 1-3. Medan de tjänar liknande roller som a-spiral proteiner, har de en helt annan veck bestående av en central membran inbäddade β-fat domän som sträcker sig från 8-26 anti-parallella p-strängar med varje sträng är intimt förbunden med de två grann strängarna (figurerna 1 och 2). De första och sista delarna av β-fat-domänen interagerar sedan med varandra, nästan uteslutande i ett anti-parallellt sätt (med undantag för mitokondriell VDAC), för att stänga och försegla β-fat domän från den omgivande membranet. Alla β-fat OMP har extracellulära loopar av varierande sekvens och längd som spelar en viktig roll i ligandinteraktioner och / eller protein-protein-kontakter, med dessa slingor ibland vara så stor som 75 rester, såsom återfinns i Neisserial transferrinbindning protein A (TbpA) 4. β-fat OMP kan också ha N-terminala eller C-terminala periplasmiska tillägg som fungerar som ytterligare domäner för proteinets funktionella ändamål (t.ex. bama 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Medan många typer av β-fat OMP finns 11, två av de vanligaste typerna beskrivs nedan som exempel för de mindre bekanta med området, (1) TonB beroende transportörer och (2) autotransporters.
TonB-beroende transportörer (t.ex., FEPA, TbpA, BtuB, Cir, etc.) är väsentliga för näringsämne import och innehålla en N-terminal plugg domän som består av ~ 150 rester som hittas tucked insida en C-terminal 22-strängat β- fat domän inbäddad i det yttre membranet 12 (fig 3). Även om denna plugg domän förhindrar substrat från fritt passera genom pipan domän, substratbindning inducerar en strukturförändring inom plugg domänen thvid leder till porbildning (antingen genom kontakten ombildning eller genom partiell / full utstötning av pluggen) som sedan kan underlätta substrat transport över det yttre membranet i periplasman. TonB-beroende transportörer är speciellt viktiga för överlevnaden av vissa patogena stammar av gramnegativa bakterier såsom Neisseria meningitidis som har utvecklats specialiserade transportörer som kapar näringsämnen såsom järn direkt från humana värdproteiner 4,13,14.
Autotransporters tillhör den typ V-sekretionssystemet av Gram-negativa bakterier och är p-fat OMP som består av en β-fat domän (typiskt 12-strängar som med ESTA och EspP) och en passagerare domän som antingen utsöndras eller presenteras på cellytan 15,16 (Figur 3). Dessa β-fat OMP tjänar ofta viktiga roller i cellöverlevnad och virulens med passagerar domänen tjänar antingen som ett proteas, adhesin, och / eller annan effector som förmedlar patogenes.
Strukturella metoder såsom röntgenkristallografi, NMR-spektroskopi och elektronmikroskopi (EM) tillåter oss att bestämma modeller för OMP på atomär upplösning som i sin tur kan användas för att dechiffrera exakt hur de fungerar inom det yttre membranet. Denna ovärderlig information kan sedan användas för läkemedel och vaccinutveckling i förekommande fall. Till exempel är transferrinbindande proteinet A (TbpA) som finns på ytan av Neisseria och krävs för patogenesen, därför att den direkt binder humant transferrin och sedan extraherar och importerar järn för sin egen överlevnad. Utan TbpA kan Neisseria inte rensar järn från den mänskliga värden och återges icke-patogena. Efter kristallstrukturen av humant transferrin bundet till TbpA 4 löstes, blev det mycket tydligare hur de två proteinerna associeras vilka regioner av TbpA medierad växelverkan, vilka rester var viktiga för järn utvinning av TbpA, ochhur man kan utveckla läkemedel mot Neisseria riktar TbpA. Med tanke på den betydelse β-fat OMP i gramnegativa bakterier för överlevnad och patogenes, liksom i mitokondrier och kloroplaster funktion och behovet av ytterligare strukturell information om denna unika klass av membranproteiner och de system där de fungerar allmänna protokoll presenteras med det övergripande målet att uttrycka och rena mål OMP på höga nivåer för karakterisering av strukturella metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning och expression
OBS: För att göra det möjligt för strukturstudier, måste tillräckliga mängder högrenat protein framställas, och detta börjar i allmänhet med kloning och överuttryck av mål β-fat yttre membranprotein (OMP) i E. coli (Figur 4). Hittills har alla β-fat OMP strukturer, inklusive de strukturer för mitokondriell VDAC, varit har härletts från bakteriellt uttryckt protein 11. Här är allmänna protokoll presenteras för kloning och uttryck β-fat OMP för (1) nativt uttryck direkt i bakteriemembran och (2) uttryck i inneslutningar organ för in vitro omveckning 17.
- Utforma en expressionskonstruktion
- Erhålla eller köpa kodon optimerade mål OMP-genen.
- Inköp eller erhålla en T7-uttrycksvektor (i) som innehåller en periplasmisk lokalisering signalsekvens, en N-terminal 6x-Histidin-tagg,och en TEV-proteas site 4,18,19 för in vivo expression till membranet eller (ii) utan en periplasmisk lokaliseringssignal-sekvens för expression till inklusionskroppar för in vitro-återveckning.
Notera: En N-terminal proteas klyvbar 6x eller 10x-histidin-tagg skulle ge en enkel metod för rening. Som med lösliga proteiner, variera valet av affinitetsmarkören (histidin, Strep, GST, etc.), positionen för affinitetsmärkning, och införandet av ett proteas ställe (TEV, enterokinas, trombin, etc) för efterföljande tagg avlägsnande . - PCR amplifiera målsekvensen med lämpliga primrar och subklon in i expressionsvektorn. Använd ligering oberoende kloning (LIC) 20,21 eller konventionella kloningstekniker (begränsning enzymer / ligation) för subkloning. Däremot kan LIC lätta hög genomströmning, vilket möjliggör ett stort antal olika konstruktioner (stympningar, olika taggar, olika promotorer) som skall klonas parallellt merlätt.
- In vivo Membran inriktade Expression
- Använda sekvenseringsanalys för att verifiera rikt β-fat OMP klonas nedströms och i ram med en signalsekvens (dvs., pelB, OmpA) i uttryckskonstruktionen.
Notera: Signalsekvensen styr den begynnande kedjan till Sec translocon för utsöndring till periplasman och efterföljande montering i det yttre membranet. - Omvandla konstruktet i en expressionsbakteriestam för expression genom att pipettera 1,0 pl av plasmiden i 50 fil BL21 (DE3) kemiskt kompetenta celler och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ned. Inkubera på is under 30 min.
- Värmepuls vid 42 ° C i 30 sek med användning av ett vattenbad och sedan placera tillbaka på is i 1 min.
- Tillsätt 1 ml förvärmda SOC media och skaka vid 37 ° C under 1 timme vid 1000 rpm med hjälp av en bänk skakinkubator.
- Plattan 100 | il av celler på LB-agarplattor innehållande en lämplig Antibiotic och inkubera över natten vid 37 ° C inverterad.
- Utför småskaliga uttryckstester genom ympning en 5 ml LB + antibiotikum kultur med en enda koloni. Upprepa 5-10 kolonier.
Obs: På grund av den potentiella toxiciteten av en β-fat OMP och beroendet av basala uttrycksnivåer är koloni till koloni variationen ibland observeras. Därför screening flera kolonier rekommenderas för varje konstruktion som testas. För småskaliga expressionstester, snarare än konventionella 5 ml kulturer, som växer 25 ml kulturer i 125 ml bafflade Erlenmeyerkolvar föreslås. Dessa villkor ofta bättre spegla vad som händer i en storskalig tillväxt. Dessutom är det en bra idé att också undersöka olika typer av odlingsmedier (TB, LB, 2xYT, M9, etc.), eftersom olika nivåer av framgång har rapporterats beroende på målproteinet.- Växa vid 37 ° C med skakning till en OD 600 av ~ 0,6.
- Inducera uttryck av målet OMP genom annonsding 5 | il av 1 M isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) till varje odlingsrör och tillåta att växa ytterligare 1-2 h.
- Jämför uttrycksnivåer för alla kolonier genom att centrifugera 1 ml av varje kultur (OD 600 på ~ 0,6) under 1 min vid 15000 x g med användning av en mikrocentrifug.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 200 | il av 1 x SDS-PAGE-laddningsbuffert. Värm vid 100 ° C under 5 min och sedan centrifugera igen vid 15.000 xg under 5 min.
- Analysera proverna med användning av SDS-PAGE genom att pipettera 20 pl i varje brunn i en 10% gel. Kör gelen för 35 minuter vid konstant 200 V.
Obs: Det skulle vara fördelaktigt vid denna tidpunkt för att kunna avgöra om proteinet målet är korrekt vikt eller inte. Detta kan ofta åstadkommas genom att göra småskaliga reningar eller genom analys med avseende värme modifierbarhet.
- Välj kolonin visar det bästa uttrycket och utföra storskaliga uttryck med hjälp av 12-24 L medium.
Notera: Konventionella metoder typiskt odla kulturer vid 37 ° C med skakning till en OD 600 av ~ 0,6 och därefter inducera med en lämplig inducerare (dvs 0,1-1 mM för IPTG eller ~ 0,2% för arabinos) under ytterligare 2-4 h . Om så önskas, före induktion, minska temperaturen till så lågt som 20 ° C och förlänga induktionstiden.- För läckande uttryck metod, växer en 25 ml ympa kulturen vid 37 ° C i LB-medium innehållande lämpligt antibiotikum (s) tills OD 600 når ~ 0,6. Lägg sedan till en ml inokulat till tolv ett L flaskor av TB-medium plus antibiotika (s) och växa vid 20 ° C till mättnad (~ 3 dagar).
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 6000 xg under 10 min.
- Fortsätt till reningssteg § 2.1 eller frysa cellpelleten i flytande kväve för långtidslagring vid -80 ° C.
- Använda sekvenseringsanalys för att verifiera rikt β-fat OMP klonas nedströms och i ram med en signalsekvens (dvs., pelB, OmpA) i uttryckskonstruktionen.
- Uttryck för inklusionskroppar för In Vitro Refolding
- Använda sekvenseringsanalys för att kontrollera expressionskonstruktionen inte innehåller en signalsekvens. Frånvaron av en signalsekvens kommer att styra målproteinet att ackumuleras i cytosolen som inklusionskroppar.
- Transformera expressionskonstruktionen i en expressionsbakteriestam för expression. För integration kropp uttryck, är det bäst att kontrollera expression genom induktion (dvs IPTG, arabinos, etc.) för att minimera eventuella toxiska effekter.
- Plattan 100 | il av transformerade celler på LB-agarplattor innehållande ett lämpligt antibiotikum och inkubera över natten vid 37 ° C inverteras.
- Utför småskaliga uttryckstester genom ympning en 5 ml LB + antibiotikum kultur med en enda koloni.
- Upprepa steg 1.3.4 för 2-4 ytterligare kolonier.
- Växa vid 37 ° C med skakning till en OD 600 av ~ 0,6.
- Inducera med en lämplig inducerare för 1-2 timmar.
- Jämför uttrycksnivåer för alla than kolonier genom analys med användning av SDS-PAGE (se steg 1.2.6). Välj kolonin visar det bästa uttrycket och utföra storskaliga uttryck med hjälp av 12-24 liter medium.
- Odla cellerna vid 37 ° C till en OD 600 av 0,6 till 0,8 och inducerar vid 37 ° C under 3-5 h. Medan uttryck för inklusionskroppar är mer robust än andra typer av uttryck, som med alla proteinexpressionsexperiment, kan uttryck förbättras genom att variera odlingsmedium, induktion, temperatur induktion, och koncentrationen av det inducerande medlet.
- Skörda cellerna genom centrifugering vid 6000 xg under 10 min.
- Fortsätt till reningssteg avsnitt 2.2 eller frysa cellpelleten i flytande kväve för långtidslagring vid -80 ° C.
2. Rening
- Isolering från membranfraktioner
Notera: I motsats till lösliga proteiner, är integrerade membranproteiner inbäddade i lipiddubbelskiktet och därmedkräver rengöringsmedel för att extrahera dem för ytterligare rening och analys (Figur 5). Efter expression, är det första steget vid reningen av en β-fat OMP extraktion från membranfraktionen.- Resuspendera cellerna i Lysis-buffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 | ig / ml AEBSF, 5 | ig / ml DNas I) i ett förhållande av 5 ml / g cellpasta.
- Lyserar cellerna med användning av en fransk press eller cellhomogenisator. Snurra de lyserade cellerna vid 15.000 xg under 30 min vid 4 ° C för att avlägsna olyserade celler och cellrester.
- Överför supernatanten till ett rent rör och centrifugera igen vid hög hastighet (200,000 x g) under 1 timme vid 4 ° C. Den resulterande pelleten är den membranfraktion som innehåller proteinet av intresse.
- Med användning av en Dounce-homogenisator, återsuspendera membranfraktionen, att först överföra membranen och sedan tillsätta solubiliseringsbuffert (50 mM KH 2 PO 4 pH 7,5, 200 mM NaCl, 20 mM imidazol, PH 8,0) (50 ml per 20 g celler) vid 2x koncentration, utan rengöringsmedel.
- Häll resuspenderade membranen in i en liten bägare och tillsätt rengöringsmedel (dvs., n-dodecyl-β-D-maltosid (DDM), lauryldimethylamine-N-oxid (LDAO), n-oktyl-β-D-glukopyranosid (OG), Triton X-100, etc.) långsamt till en slutlig koncentration av ~ 10x kritiska micellkoncentrationen (CMC).
- Fyll med vatten till dess att en slutlig koncentration av 1 x solubiliseringsbuffert. Rör om under 0,5 till 16 h vid 4 ° C, beroende på hur lätt målproteinet extraheras från membranen.
Obs: Tvättmedel används för att långsamt solubilisera membranen för att extrahera målproteinet. Det finns 3 typer av rengöringsmedel som kan användas här: joniska (SDS, deoxicholsyra), icke-joniska (Elugent, tween, Triton X-100, OG, DDM), och zwitterjoniska (LDAO, CHAPS). Ett protein-rengöringsmedel komplex som är stabilt och monodispers under reningssteget kommer att kraftigt underlätta framgången för membranprotein crystallizatJon. Mer information om detergenter, deras egenskaper, CMC informationen, och deras användning vid rening av membranproteiner och andra applikationer kan hittas på kommersiella leverantörs webbplatser. - Centrifugera det solubiliserade provet vid 300.000 xg under 1 h vid 4 ° C. Supernatanten innehåller nu tvättmedel-solubiliserade mål β-fat OMP.
- Fortsätt med avsnitt 2.3 enligt nedan.
- Omveckning från inklusionskroppar
Anm: För in vitro-återveckning, målet β-fat OMP uttrycks direkt i inklusionskroppar. En fördel här är att dessa proteiner kan produceras på höga nivåer. Emellertid är nackdelen att återveckning är ofta ineffektiv och varierar från en återveckningsexperiment till nästa. Fortfarande finns det många exempel på proteiner som har framgångsrikt återveckade för strukturstudier. Efter uttryck i inklusionskroppar, måste man nu isolera inklusionskropparna för återveckning experiments.- Resuspendera cellerna i Lysis-buffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 50 | ig / ml AEBSF, 5 pg / ml DNas I, 4 mM 2-merkaptoetanol (BME)) (5 ml per g cellpasta). Lyse användning av antingen en fransk press, sonikering, eller cellhomogenisator.
- Pelletera inklusionskropparna från en låg hastighet centrifugering vid 6000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Tvätta inklusionskropparna genom återsuspendering i 25 ml 1,0 M urea med användning av en Dounce-homogenisator. Pelle igen av en låghastighetsrotation vid 6000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Upprepa steg 2.2.3 behov.
- Resuspendera de tvättade inklusionskroppama till en slutlig koncentration av 10 mg / ml med användning av buffert innehållande 8,0 M urea (eller 6,0 M guanidin-hydroklorid (GdCl)) plus detergent (dvs DDM eller LDAO) vid 2x CMC eller högre.
Obs: Om så önskas, för membranprotein mål som innehåller en histidin tag, kan utföras immobiliserade metall affinitetskromatografi (IMAC) rening med hjälp av denaturering conditions (i 8,0 M urea eller 6,0 M GdCl) som ett första steg som liknar det som beskrivs nedan i avsnitt 2.3. - Utför återveckningsreaktionen genom att långsamt (över natten) avlägsnande av denatureringsmedel genom dialys i buffert saknar denatureringsmedel.
Obs: Det kan ta flera byten av dialysbuffert för att åstadkomma detta. Alternativt, om inklusionskropparna först bunden till en IMAC-kolonnen, kan man göra den återveckningsreaktionen medan den fortfarande är bunden till kolonnen genom att långsamt utbyta buffertar för avlägsnande av denatureringsmedlet. I båda fallen, komma ihåg att detta är ett membranprotein, därför, måste detergenten vara närvarande för att stabilisera målet. Dessutom, om rengöringsmedlet som används är dialyserbart, måste den läggas till dialysbuffert (ar) samt. - Snurra återveckade proven vid 200.000 xg under 1 timme vid 4 ° C. Supernatanten innehåller återveckade tvättmedel-upplöst mål β-fat OMP.
- Fortsätt med avsnitt 2.3 enligt nedan.
- Rening med användning av IMAC, jonbyte, och Gelfiltrering
Obs: Förutsatt att proteinet har modifierats med en histidin tag, vare inbyggt uttrycks eller återveckas med hjälp av in vitro-metoder, sedan immobiliserade metall affinitetskromatografi (IMAC) utförs för rening mycket som för histidin märkta lösliga proteiner, utom tvättmedel måste hållas i alla efterföljande buffertar för att hålla målet β-fat OMP solubiliserat och stabilt.- Förbered en 1-5 ml IMAC-kolonnen eller använda en förpackad kolonn. Utför efterföljande kromatografisteg vid 4 ° C. Spola med vatten för att avlägsna eventuella spår av konserveringsmedel. Vid användning av ett automatiserat system rening, installera kolonnen enligt tillverkarens instruktioner.
- Bereda 500 ml av IMAC buffert A (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM) och 250 ml IMAC Buffert B (50 mM K 2 HPO 4, pH 7,5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM, och 1,0 M imidazol).
Obs: Andra rengöringsmedel som kan användas include Cymal-6 (0,05%), Triton X-100 (0,03%), och LDAO (0,05%). - Jämvikta IMAC-kolonnen med användning av 10 kolonnvolymer av IMAC Buffert A.
- Lägg imidazol till proteinprovet till en slutlig koncentration av 25 mM och blanda. Ladda provet på den ekvilibrerade IMAC-kolonn vid 2 ml / min. Samla flödet genom.
- Tvätta IMAC-kolonnen med 5 kolonnvolymer vardera av ökande koncentrationer av imidazol med användning av buffert B (det vill säga, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Samla tvättar i 2 ml fraktioner.
- Eluera provet med en slutlig koncentration av 250 mM för 5 kolonnvolymer. Samla det eluerade provet i 2 ml fraktioner.
- Analysera flödet igenom, tvättfraktioner och elueringsfraktionerna med hjälp av SDS-PAGE-analys (se steg 1.2.6) baserat på deras absorbans vid 280 nm. Pool de fraktioner som innehåller målet β-fat OMP vilket skall verifieras genom SDS-PAGE-analys.
- Ta bort 6x-histidin tag genom att tillsätta TEV proteas till den poolade provet (enligttillverkarens protokoll) och inkubation över natten vid 4 ° C med försiktig skakning.
- Ladda provet / proteas lösningen på en IMAC-kolonnen igen för att separera mål β-fat OMP (strömma igenom) från de kluvna taggar och någon ospaltat prov. Flödet genom innehåller den kluvna provet saknar taggen.
Obs: Detta skulle också ta bort eventuella proteas som TEV-His, som också har en icke-klyvbar 6x-histidin tag själv. Annars kommer andra metoder att krävas för att ta bort proteaset efter digerering. - Valfritt, utför jonbyteskromatografi för att ytterligare rena provet. Följ tillverkarens instruktioner för kolumnen som ska användas, var noga med att inkludera tvättmedel i alla buffertar.
- Att förbereda sig för kristallisation, ladda provet på en gelfiltreringskolonn i en buffert innehållande detergenten som skall användas för kristallisation, såsom 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 1% OG.
- Samla 1 ml fraktioner och analysera USIng SDS-PAGE-analys (se Steg 1.2.6) baserat på deras absorbans vid 280 nm. Pool fraktioner med absorbanser vid 280 nm eftersom de innehåller målproteinet. Koncentrera till ~ 10 mg / ml.
Obs: Om så önskas kan korrekt veck bedömas med användning av en värme modifierbarhet analys såsom beskrivs nedan.
- Värme modifierbarhet Assay
Notera: En metod för att övervaka korrekt veckning av renade β-fat OMP är att utföra värme modifierbarhet analyser med användning av en semi-nativ SDS-PAGE 22. Här kommer ouppvärmda prover som korrekt viks typiskt migrera annorlunda än de som värmedenaturerat. Den här egenskapen är unik för p-fat OMP och används i stor utsträckning för att studera denna familj av membranproteiner.- Före framställning av prover, montera gelén apparaten. Till att börja placera bufferttanken i en ishink och omger helt med is. Sätt en egen gjutna eller kommersiell infödda gradientgel i hållaren och placera in i tanken. Fyll than tanken helt med kalla 1x MES rinnande buffert (50 mM 2- [N-morfolino] etansulfonsyra, 50 mM Tris-bas, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,3).
- Pipettera 0,25 pl av provet (10 mg / ml) i två 1,5 ml mikrocentrifugrör. Märk en som "Kokt" och den andra som "RT".
- Lägg 9,75 l provbuffert till varje och blanda genom att pipettera. Till båda proverna, tillsätt 10 pl av 2x SDS laddningsbuffert (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% bromfenolblått, och 20% glycerol) och blanda försiktigt genom pipettering.
- Koka "Kokt" provet vid 95 ° C under 5 min medan den "RT" prov vid RT. Snurra "Kokt" prov kort.
- Belastning 20 pl av båda proven på den förmonterade nativ gel. Kör i 60 minuter vid konstant 150 V. Avlägsna gelen och dra i färglösningen för att visualisera resultaten.
3. Kristallisation
Obs! Kristallisation av bådelösliga och membranprotein mål, är det standardprotokoll för att maximera prov renhet och stabilitet (dvs bästa tvättmedel, ligander, kofaktorer, etc.). Nuvarande metoden för kristallisemembran proteinmål i allmänhet omfattar tre huvudsakliga tillvägagångssätt som uppfyller de amfifila kraven i dubbelskiktsinbäddade proteiner: (1) detergent, (2) bicelle, och (3) lipidisk kubisk fas (LCP) (figur 6) 23. Användning av en nanoliter kristallisationsrobot rekommenderas starkt när det är möjligt i syfte att öka antalet tillstånd som kan screenas för en given provvolym, liksom, att utnyttja de senaste framstegen inom verktyg som syftar till att underlätta strukturbestämning (Figur 7).
- Kristallisa använder rengöringsmedel
- Erhålla en detergent solubiliserat proteinprov som är åtmin ~ 10 mg / ml koncentration. Valfritt lägga tillsatsen 1,2,3-heptanetriol direkt till provet till en slutkoncentration av 3% för att minska detergent micell storlek.
- Filtrera provet med användning av en 0,22 fim centrifugal filter för att avlägsna partiklar och utfällning.
- Med hjälp av en kristallisa robot utför bred matris kristallise screening användning av kommersiellt tillgängliga 96 brunnar skärmar antingen hängande eller sittande droppe förångning metod med droppar bestående av ~ 200 nl proteinprov och ~ 200 nl kristallisa buffert.
- Inkubera kristallisationsplattorna vid ~ 21 ° C. Inspektera plattorna vecka för kristalltillväxt med hjälp av ett stereomikroskop.
- Optimera kristallisations leads genom att variera komponenterna i kristallisationstillstånd på ett systematiskt sätt (ökande / minskande salt eller fällnings koncentrationer, buffert pH, inkubationstemperatur, och / eller proteinkoncentration).
- Kristallisation Använda Bicelles
Obs: En mer detaljerad demonstration av bicelle tekniker har tidigare beskrivits av Ujwal och Abramson 24.- Förbered eller köpa en 35% bicelle blandning bestående av DMPC: CHAPSO vid ett förhållande av 2,8: 1 enligt publicerade protokoll 25. Andra koncentrationer kan också analyseras, liksom, andra lipider och detergenter, såsom nödvändigt.
- Erhålla en detergent solubiliserat proteinprov som är åtmin ~ 10 mg / ml koncentration.
- Tillsätt bicelle blandningen, på is, vid ett utgångsförhållande av 4: 1 volym / volym (protein: bicelle) (t.ex., tillsätt 10 pl av bicelle blandningen till 40 pl av protein och blanda snabbt genom att pipettera).
- Inkubera på is 30-60 min.
Obs: Protein: bicelle lösning bör förbli mestadels klart men kan ofta sväng svagt ogenomskinlig. Men om proteinet: bicelle lösningen blir mjölkvit, vilket indikerar fällning, då andra variabler bör analyseras (dvs., tvättmedel, buffert, etc). För nya prover, göra småskaliga tester (8 pl protein och 2 pl bicelles) rekommenderas att kontrollera stabiliteten innan skala upp för att förhindra onödig provförlust. - Med hjälp av en kristallisa robot utför bred matris kristallise screening användning av kommersiellt tillgängliga 96 brunnar skärmar antingen hängande eller sittande droppe förångning metod med droppar bestående av ~ 200 nl proteinprov och ~ 200 nl kristallisa buffert.
- Inkubera kristallisationsplattorna vid ~ 21 ° C. Inspektera plattorna vecka för kristalltillväxt med hjälp av ett stereomikroskop.
- Optimera kristallisations leads genom att variera komponenterna i kristallisationstillstånd på ett systematiskt sätt (ökande / minskande salt eller fällnings koncentrationer, buffert pH, inkubationstemperatur, och / eller proteinkoncentration).
- Kristallisation Använda lipidiska kubisk fas (LCP)
Obs: En mer detaljerad demonstration av LCP tekniker har tidigare beskrivits av Liu och Cherezov 26,27.- Erhålla en detergent solubiliserat proteinprov som är åtmin ~ 20 mg / ml koncentration.
- Pre-varm i monoolein till ~ 40 ° C. Läsa in60 ^ monoolein i ett gastät spruta 100 | il och 40 jil proteinprovet in i en annan.
- Med hjälp av en blandnings kopplare ansluter sprutorna, försiktigt så att inte införa luft.
- Blanda försiktigt genom att applicera alternerande tryck på sprutkolvama driver blandningen från en spruta till den andra helt tills provet blir genomskinlig och homogen.
- Med hjälp av en kristallisa robot avsedd för LCP metoder, utföra bred matris kristallise screening användning av kommersiellt tillgängliga 96 brunnar skärmar med sandwich-stil kristallisa plattor (0,1 mm väl tjocklek) med droppar bestående av 100 nl proteinprov och 750 nl kristallise buffert.
Obs: Drop förhållanden kan justeras vid behov. Dessutom är fasta omslag (dvs glas eller tjock plast) rekommenderas som stödjer dropparna fint snarare än tunna filmer, som tenderar att tillåta dropparna att röra sig i och plattorna hanteras. - Inkubera kristallisa plates vid ~ 21 ° C. Inspektera plattorna vecka för kristalltillväxt med hjälp av ett stereomikroskop.
- Optimera kristallisations leads genom att variera komponenterna i kristallisationstillstånd på ett systematiskt sätt (ökande / minskande salt eller fällnings koncentrationer, buffert pH, inkubationstemperatur, och / eller proteinkoncentration).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yiur är en TonB beroende järn transportör som är en förmodad vaccin mål mot Yersinia pestis. Det var ursprungligen identifierades med hjälp av en microarray analys. Här är de steg som togs för att bestämma strukturen av yiur med hjälp av röntgenkristallografi som beskrivs (figur 9). För kloning, DNA-sekvensen för yiur (minus den N-terminala signalsekvensen) PCR-amplifierades från genomiskt DNA och subklonades in i en vektor innehållande en N-terminal pelB-signalsekvensen och 10x-histidin affinitetsmarkör, följt av en TEV-proteas webbplats. För expression ades yiur-innehållande plasmid transformerades in i BL21 (DE3) kompetenta celler och en enda koloni användes för att växa en 5 ml startkultur till OD 600 ~ 0,5. Tolv kolvar innehållande 750 ml TB-medium inokulerades sedan med 1 ml av startkulturen och fick växa under 3 d vid 20 ° C (skakning vid 220 varv per minut). Cellerna skördades sedan, vilket ger ca 150-200g totalt cellpasta, vilket var flash kyldes i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C fram till användning.
För rening av yiur ades 20 g celler resuspenderades i 120 ml 1 x PBS (10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7,4) genom omröring vid RT med DNas I och AEBSF läggs. Lys utfördes genom två passager genom en homogenisator. Lysatet centrifugerades därefter vid 12.000 xg under 10 min (för att snurra ner obrutna celler och inklusionskroppar). Supernatanten centrifugerades på nytt vid 235.000 xg under 60 min, med pelleten innehållande den membranfraktion (yiur). Membranen återsuspenderades sedan i 100 ml 1 x PBS med användning av en Dounce-homogenisator. Yiur solubiliserades / utvinns ur membran med hjälp av Elugent på 5% slutlig koncentration, vid 4 ° C under omrörning över natten (upp till 16 timmar). De solubiliserade membran centrifugerades sedan igen vid 371.000 xg under 60 min, med supernatant innehållande den solubiliserade fraktionen inklusive yiur. För att isolera yiur ades IMAC utfördes med användning av buffert A (1 x PBS, 0,1% DDM) och buffert B (1 x PBS, 1 M imidazol, 0,1% DDM), tvättades med imidazol koncentrationer från 30 till 50 mM och eluerades med från 250 till 500 mM . För att ta bort N-terminal 10x-histidin tag, inkubation med TEV HANS proteas utfördes över natten vid 4 ° C under dialys i 1x PBS-buffert. Provet fick därefter passera över en IMAC-kolonnen igen, flödet genom koncentrerades, dialyserades och separerades sedan ytterligare med användning av en 0-1,0 M NaCl-gradient på en jonbytarkolonn i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Fraktionerna innehållande yiur slogs sedan samman, koncentrerades och körde över en gelfiltreringskolonn med användning av 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl och 0,05% LDAO. Fraktionerna innehållande yiur slogs sedan samman och koncentrerades till 10 mg / ml för kristallisation.
Bred matrisscreening utfördes därefter och villkor bestämssom producerade några inledande brytande kristaller. Ytterligare optimering ledde till större kristaller, vilka användes för att samla in nativa röntgendiffraktionsdata data. Kristaller som visas i figur 8 är representativa för kristaller en kan uppnå med användning av de metoder som presenteras här. Kristaller från tvättmedel screening och bicelles kan vara så stor som kristaller typiskt för lösliga proteiner; Men de från LCP är nästan alltid mycket mindre. Uppgifterna var tillräckligt bra för att användas för molekylär ersättning som ledde till strukturbestämning till 2,65 Å upplösning.
Figur 1. De två typerna av helt integrerade membranproteiner är α-helix och β-fat. Här visas exempel på var och en med β2-adrenerga receptorn (PDB kod 2RH1, α-helix) och TonB beroende transportör BtuB (PDB kod 1NQE,p-fat). Den översta raden visar den extracellulära utsikten medan den nedre raden visar membran vyn. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. β-fat OMP tjäna många olika funktioner och kan ha olika strukturer. Medan a-helixmembranproteiner kan innehålla ett eller flera transmembrandomäner, β-fat OMP sträcker sig från 8-26 strängar och varje sträng samverkar intimt med grann strängarna. Yttre rester, som interagerar med membranet, är typiskt hydrofoba medan de inre rester, som interagerar med lösningsmedel, är typiskt polära och hydrofila. Övre raden visar den extracellulära vy visar den mellersta raden membran uppfattning och den nedersta raden visar periplasmic visa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Exempel på två typer av vanliga β-fat OMP. Vänster, strukturen i TonB beroende transportör FEPA (PDB kod 1FEP), som skildrar den extracellulära (överst), membran (mitten) och periplasmatiska (nederst) vyer. Den β-fat domän indikeras i grönt när kontakten domänen är i magenta. Höger, strukturen av autotransporter ESTA (PDB-kod 3KVN), som skildrar den extracellulära (överst), membran (mitten) och periplasmiska (nederst) vyer. Den β-fat domän anges i guld medan passagerar domänen är i blått. Klicka här för att se en större versipå denna siffra.
Figur 4. Schematisk av kloning och uttryck pipeline för produktion av β-fat OMP. Schematisk av rörledningen som används för att klona och uttrycka en mål OMP antingen genom nativ membranuttryck (till vänster) eller genom uttryck i inklusionskroppar för återveckning (till höger). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Schematisk renings pipeline för isolering av β-fat OMP. Schematisk av rörledningen som används för utvinning av OMP som har uttryckts direkt i OM. Här har målet OMP vara extrakted från membranet genom solubilisering med ett lämpligt rengöringsmedel och renades sedan genom IMAC, jonbyteskromatografi och gelfiltrering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Schematisk av kristallisa rörledning för att odla kristaller av β-fat OMP. Tre metoder kan användas för kristallisation av β-fat OMP inklusive tvättmedel screening, bicelles och lipidiska kubisk fas (LCP). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Nya verktyg i kristallografi som väsentligt har bidragit till strukturbestämning av β-fat OMP. Som exempel kan nämnas kristallisa robotar / LCP robotar (A), UV-mikroskop (B), Second Order Nonlinear Imaging av kirala kristaller (SONICC) visualisering (C), robot puckar / robotar (D), rastrering / vektor / spiraldatainsamlingsmetoder (E ), och mikrofokus balkar (F). klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. representativ bild av kristallerna till följd av protokollet. Kristaller från tvättmedel screening och bicelles kan vara så stor som kristallererhålls typiskt för lösliga proteiner; Men de från LCP är nästan alltid mycket mindre. Skalstreck = 100 nm. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Från konstruktioner till kristaller att strukturbestämning för den förmodade vaccin mål yiur från Yersinia pestis. Den totala pipeline användas för strukturbestämning av yiur, illustrerar de åtgärder som vidtagits för att klona, uttrycka, rena, kristallisera och lösa strukturen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
β-fat OMP tjäna viktiga roller i gramnegativa bakterier, mitokondrier och kloroplaster och är viktiga mål för strukturanalys som erbjuder en mängd information om väsentliga molekylära mekanismer vid de yttre membranen hos dessa respektive organeller. Men producera tillräckligt med prov för strukturanalys är inte alltid enkelt och därför är en allmän pipeline presenteras för produktion av tillräckliga mängder av mål β-fat OMP för strukturbestämning, förklarar i detalj processen från konstruktioner till kristaller. Även dessa protokoll har testats och visat sig fungera för de flesta OMP från gramnegativa bakterier, det finns begränsningar i att det finns vissa mål, i synnerhet för mitokondrier och kloroplaster, som kan kräva andra metoder för uttryck och rening. Som sådan bör de metoder som här tillämpas för de flesta projekt som involverar OMP från gramnegativa bakterier, men ändå uttrycksnivåns och mängden av renat prov kommer att variera beroende på målet OMP.
Det finns två generella metoder för uttryck av β-fat OMP för strukturstudier, (1) in vivo uttryck direkt i det yttre membranet och (2) uttryck för inklusionskroppar för in vitro-återveckning. För in vivo expression tillvägagångssätt, är β-fat OMP riktade till yttermembranet hos E. coli där de native vikta och isoleras direkt från membranen. Uttryck för membranet är den föredragna strategi eftersom målen är mer benägna att vara ordentligt vikta. Även om detta tillvägagångssätt ger vanligtvis lägre nivåer av totalt protein, undviker det komplikationer ibland förknippas med in vitro återveckning. Många β-fat OMP har framgångsrikt uttryckts på detta sätt för strukturbestämning 4,5,11. Framgång uppnås ofta med hjälp av ett system som bygger på låg nivå konstitutivt uttryck från en T7 främjarr, men andra system som förlitar sig på induktion (dvs., IPTG, arabinos) för expression är också rutinmässigt används med framgång.
Uttrycket direkt i det yttre membranet kräver målproteinet att ha en N-terminal signalsekvens som styr ribosomen-nascent kedja komplexet till Sec translocon, för sekretion av den begynnande β-fat OMP in i periplasman. Signalsekvensen klyvs på det periplasmatiska sidan av det inre membranet, så det är viktigt att signalsekvensen föregå de N-terminala markörer sattes till målet. Den begynnande β-fat OMP därefter eskorteras av chaperones genom periplasman till BAM-komplexet för insättning i det yttre membranet 2,3.
För mål som inte kan vara överuttryckt i membranet, är ett alternativt tillvägagångssätt uttryck i inklusionskroppar för in vitro omveckning 28-30. Detta tillvägagångssätt resulterar vanligtvis i hög nivå och robust uttryck of målproteinet. Däremot kan det vara svårt att identifiera återveck villkor, som återveckning kan vara ineffektivt. Dessutom kan det vara svårt att analysera när målet β-fat OMP är korrekt vikta. Fortfarande finns det många exempel på proteiner som har framgångsrikt återveckade för strukturstudier inklusive OmpA 31 Ail 19, OmpF 32, och VDAC 33. Med avseende på kloner som inte uttrycker alls (native eller in i inklusionskroppar) eller uttrycker men är inte monterade på rätt sätt in i membranet (native), kunde ett försök att mutera den β-fat till mer liknar den hos E. coli 34,35. Aminosyrasekvensen i den β-signalen av pipan domänen är viktig för igenkänning och montering av BAM-komplexet och variationer i den β-signalsekvensen kan avsevärt påverka både riktiga biogenes och expressionsnivåer av målet β-fat OMP 11,34 , 35. Korrekt integrering av målet β-barrel OMP kan övervakas genom att screena för membranfraktionering och detergent extraherbarhet följt av värme modifierbarhet analyser.
Kristallisation av membranproteiner i närvaro av detergent-miceller är den äldsta tekniken och tillåter enkel anpassning av traditionell lösligt protein kristallisering utrustning och strategier. Genom maskering av membranet inbäddade regioner med tvättmedels molekyler, koncentrerad protein kan behandlas på ett liknande sätt som lösliga proteiner (t.ex., blandat med kristallisationsmoderlutar och inneslutna i ett ångdiffusion apparat som orsakar den långsamma dehydratisering av proteinet droppe). Medan enkel i koncept, tvättmedels kännetecken och egenskaper till ett betydande lager av komplexitet ovanpå den normala kristallisa utmaningar. Specifikt måste den molekylära karaktären av en detergent empiriskt skräddarsys för ett givet målprotein, inkluderande micell storlek, huvudgrupp polaritet (anjoniska, katjoniska, icke-joniska, ellerzwitterjoniska) och kolväte kedjelängd, eftersom var och en av dessa påverkar stabiliteten hos mål-membranproteinet i lösning. Nackdelar med denna metod omfattar icke-nativ kemisk miljö, potentiell fördunklande av ytområden som kan bilda kristall kontakter och frågor tvättmedel koncentration.
Bicelles är en blandning av lipider och amfifiler (t.ex., detergenter eller kortkedjiga lipider) som monterar in i enskilda partiklar som efterliknar ett dubbelskikt struktur liknande membranen som finns i celler 36,37. De amfifila maskerar den hydrofoba kärnan av detta dubbelskikt där den är utsatt vid sina kanter på ett liknande sätt till de miceller i tvättmedelskristallisation. Detta ger en mer nativ-liknande miljö att hjälpa till att stabilisera målproteiner.
Membranprotein mål kan också kristalliseras med lipidisk kubisk fas (LCP) metoder 38. LCP är en mesofas som bildas av blandningen av lipid och vatten, isom en kontinuerlig tvåskiktsmembran genomsyras av två icke-korsande nätverk av lösningsmedel kanaler. Denna tredimensionella struktur tillåter diffusion av lipid inbäddade membranproteiner i en till stor del nativ-liknande miljö och tillåter kristallkontakter för att bilda mellan de hydrofoba och hydrofila ytor av proteinerna och minskar den totala lösningsmedelshalten i kristaller samtidigt förbättra deras beställning. Sedan introduktionen på 1990-talet, har LCP tekniker varit avgörande för att bestämma strukturerna för många svårfångade membranprotein mål, såsom rodopsin 39,40 och GPCR 41-43. Användning av LCP i hög genomströmning skärmar kräver särskilda bestämmelser (dvs. LCP specifika robot, gastäta sprutor, LCP dispense verktyg, smörgås kristalliseplattor, etc.) som den tjocka monoolein vanligen används för LCP kan inte hanteras av traditionell nanoliter vätskehantering robotar.
Gelfiltreringskromatografi är ett oerhört viktigt stegför kristallisation av membranproteiner i allmänhet, därför att den ger information om hur att stabilisera den valda detergenten är för målet membranprotein, som kan visualiseras genom kromatogrammet. Genom att jämföra mängden av provet i voidvolymen, retentionstider, och formerna på topparna, kan nås den övergripande stabiliteten och monodispersitet av provet. En idealisk prov skulle ha mycket liten eller ingen prov förlorade i voidvolymen och skulle ha en enda symmetrisk elueringstoppen med en normalfördelning. Den rengöringsmedel C 8 E 4 (0,8%), OG (1,0%), och LDAO (0,05%) används rutinmässigt för kristallisering av β-fat OMP med framgång och är goda att börja med. Helst är småskaliga experiment jämföra flera tvättmedel eller blandningar av rengöringsmedel för att avgöra vilka som är mest lämplig för kristallisation. De som befinns vara mest stabiliserande används sedan för framställning i stor skala av målet β-barrel OMP och kristallisering prövningar.
När kristaller bildas av målet β-fat OMP, optimering (dvs additiv screening, kryo-screening, tvättmedelstillsats screening, etc.) och andra tekniker som liknar lösliga protein mål kan följas med några skillnader. Det finns dock några senaste framstegen som är extremt användbar vid arbete med membranproteiner. Specifikt kan membranproteinkristaller ofta vara svårt att upptäcka inom deras moderlut för en mängd olika skäl. Membranproteiner utgör ofta relativt små kristaller och falska positiva kan vilseleda kristall optimering. LCP tekniker särskilt närvarande ytterligare utmaningar, med tanke på de mycket viskösa, ofta opaka miljöer där kristallerna odlas. Strategier för att ta itu med dessa frågor inkluderar användning av ultravioletta mikroskop (UV) i samband med ljusmikroskop, vilket naturligtvis fluorescerande proteinkristaller att särskilja from icke-fluorescerande salt och tvättmedel kristaller (Figur 7). Utmaningar kvarstår dock i positiv identifiering av proteinkristaller som bildar inom områdena fällnings. Kristaller kan också upptäckas genom utnyttjande av frekvensdubblings effekten av de flesta kirala kristaller när avbildas av femtosecond scanning laserpulser, som genomförs genom SONICC teknik 44. Denna höga upplösning, kan hög kontrast teknik användas för att skilja submikrona kristallerna från skymmande betingelser.
Skörd membranproteiner görs med hjälp av standardkristtekniker, särskilt för tvättmedel och bicelle kristallisering. Looping utförs för hand med en låg förstoring mikroskop och en kristall-monteringsslinga (dvs., nylonfiber, tråd, eller polymer). Uppsugning av överskott av lösningsmedel och Cryo skydd före störta frysning i kryogen vätska också standardprocedurer vid skörd β-fat OMP kristaller. Emellertid, skördIng av LCP odlade kristaller uppvisar särskilda problem, särskilt om skörd direkt från sandwichplattor, som kristaller kan vara svårt att komma åt och kan inte vara lätt observeras genom mikroskop. Dessutom måste kristaller odlas i LCP ibland skördas i bulk sedan LCP blandning inte lätt kan separeras i slingan.
datainsamling för β-fat OMP kan utföras som med lösliga proteinkristaller med endast ett fåtal ytterligare överväganden. Medan storleken av kristaller som odlas av detergent- och bicelle metoder är ofta jämförbara med de som odlas med lösliga proteiner, kristaller odlas av LCP-metoden är nästan alltid betydligt mindre. Dessutom, eftersom prover skördas från LCP matrisen innehåller ofta flera kristaller som är svåra att observera, måste man utnyttja synkrotron källor som har mini-beam och sling rastrering kapacitet som systematiskt kan skanna hela slingan för att lokalisera positionerna för kristaller baserat på diffraInsatser (Figur 7). Den lilla storleken på LCP kristaller gör dem också särskilt känsliga för strålningsskador. Därför data från flera kristaller ofta samman för att samla in en komplett datauppsättning.
När väl brytande kristaller erhålls och en komplett datamängd samlas, kan strukturbestämning för β-fat OMP åstadkommas med användning på samma sätt som för lösliga proteiner, med tanke på att membranproteinkristaller uppvisar generellt en högre halt av lösningsmedel. Som med alla krist mål, vare sig lösligt protein eller membranprotein, varje erbjuder sina egna utmaningar och därför ingen enskild rörledning kan direkt tillämpas på alla mål. Därför är det en uppgift för den primära forskare (s) för att anpassa dessa allmänna protokoll följaktligen att säkerställa framgång för hans / hennes projekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Crystallization Robot | TTP Labtech, Art Robbins | - | Any should work here, except for LCP crystallization |
| PCR thermocycler | Eppendorf, BioRad | - | |
| Media Shaker | New Brunswick, Infors HT | - | |
| UV-vis spectrometer | Eppendorf | - | |
| SDS-PAGE apparatus | BioRad | 1645050, 1658005 | |
| SDS-PAGE and native gels | BioRad, Life Technologies | 4561084, EC6035BOX (BN1002BOX) | |
| AkTA Prime | GE Healthcare | - | |
| AkTA Purifier | GE Healthcare | - | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | - | |
| Centrifuge (low-medium speed) | Beckman-Coulter | - | |
| Ultracentrifuge (high speed) | Beckman-Coulter | - | |
| SS34 rotor | Sorvall | - | |
| Type 45 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Type 70 Ti rotor | Beckman-Coulter | - | |
| Dounce homogenizer | Fisher Scientific | 06 435C | |
| Emulsiflex | Avestin | - | |
| Dialysis tubing | Sigma | D9652 | |
| LCP tools | Hamilton, TTP Labtech | - | |
| VDX 24 well plates | Hampton Research | HR3-172 | |
| Sandwich plates | Hampton Research, Molecular Dimensions | HR3-151, MD11-50 (MD11-53) | |
| Grace Crystallization sheets | Grace Bio-Labs | 875238 | |
| HiPrep S300 HR column | GE Healthcare | 17-1167-01 | |
| Q-Sepharose column | GE Healthcare | 17-0510-01 | |
| Crystallization screens | Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions | - | |
| Gas-tight syringe (100 ml) | Hamilton |
References
- Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence. Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).
- Ricci, D. P., Silhavy, T. J. The Bam machine: A molecular cooper. Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).
- Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex. Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).
- Noinaj, N., et al. Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria. Nature. 483, 53-58 (2012).
- Noinaj, N., et al. Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins. Nature. 501, 385-390 (2013).
- Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition. Structure. 16, 1873-1881 (2008).
- Kim, S., et al. Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine. Science. 317, 961-964 (2007).
- Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher. Nature. 496, 243-246 (2013).
- Phan, G., et al. Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate. Nature. 474, 49-53 (2011).
- van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL. Science. 304, 1506-1509 (2004).
- Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports. Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).
- Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function. Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).
- Siburt, C. J., et al. Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae. Metallomics. 1, 249-255 (2009).
- Cornelissen, C. N., Hollander, A. TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae. Front in Micro. 2 (117), (2011).
- Dautin, N., Bernstein, H. D. Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway. Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).
- Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane. Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).
- Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. Comprehensive Biophysics. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).
- Buchanan, S. K., et al. Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import. EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).
- Yamashita, S., et al. Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis. Structure. 19, 1672-1682 (2011).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).
- Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
- Rosenbusch, J. P. Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding. J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).
- Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. Curr Prot in Prot Science. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19 (2007).
- Ujwal, R., Abramson, J. High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method. JoVE. , e3383 (2012).
- Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles. Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , e4000 (2012).
- Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. JoVE. , (2011).
- Buchanan, S. K. Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli. Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).
- Buchanan, S. K. Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding. Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).
- Stanley, A. M., Fleming, K. G. The process of folding proteins into membranes: challenges and progress. Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).
- Pautsch, A., Schulz, G. E. Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain. Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).
- Cowan, S. W., et al. The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form. Structure. 3, 1041-1050 (1995).
- Ujwal, R., et al. The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating. PNAS. 105, 17742-17747 (2008).
- Robert, V., et al. Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif. PLoS Bio. 4, e377 (2006).
- Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not? BMC Genomics. 13, 510 (2012).
- Agah, S., Faham, S. Crystallization of membrane proteins in bicelles. Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).
- Ujwal, R., Bowie, J. U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55, 337-341 (2011).
- Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).
- Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution. J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).
- Kato, H. E., et al. Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel. Nature. 482, 369-374 (2012).
- White, J. F., et al. Structure of the agonist-bound neurotensin receptor. Nature. 490, 508-513 (2012).
- Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
- Rasmussen, S. G., et al. Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
