Abstract
Neurale stamceller (NSC) i subventrikulære zone af laterale ventrikler (SVZ) fastholde olfaktoriske neurogenese hele livet i pattedyrs hjerne. De successivt generere transit forstærker celler (TAC'er) og neuroblaster der differentierer til neuroner, når de integrerer de olfaktoriske pærer. Emerging fluorescerende cellesortering (FACS) teknikker har tilladt isoleringen af NSC samt deres afkom og er begyndt at kaste lys over gen regulatoriske netværk i voksne neurogene nicher. Vi rapporterer her en cellesortering teknik, der gør det muligt at følge og skelne cellecyklussen dynamik ovennævnte cellepopulationer fra voksne SVZ'en med lex / EGFR / CD24 triple farvning. Isolerede celler udplades dernæst som adhærente celler at udforske i detaljer deres cellecyklusprogression ved time-lapse video mikroskopi. Til dette formål bruger vi transgene Fluorescens Ubiquitinering Cell Cycle Indikator (Fucci) mus, hvor cellerne er røde-fluorescerende during G 1 fase på grund af en G 1-specifikt røde Cdt1 reporter. Denne metode har for nylig afsløret, at prolifererende NSC'er gradvist forlænge deres G 1 fase under aldring, hvilket fører til neurogenese værdiforringelse. Denne metode er let overføres til andre systemer og kunne være af stor interesse for studiet af cellecyklussen dynamik hjerneceller i forbindelse med hjernen patologier.
Introduction
Hvilende neurale stamceller (NSC) er kilden til voksne neurogenese 1 og kan omdannes til deres proliferative "aktiveret" form, der udtrykker EGFR (aNSCs) 2. Når den er aktiveret, de giver anledning til transit forstærke celler (TAC) 3 og derefter neuroblasts der migrerer til de olfaktoriske pærer (OB) gennem et rør af astrocytter og til sidst differentiere til neuroner 4,5. NSC og deres afkom er organiseret i specialiserede "nicher" arkitekturer langs de laterale ventrikler, implicerer et utal af faktorer, der styrer deres spredning 6. Isoleringen og oprensningen af SVZ neurogene celler er nødvendig for at forstå den komplekse molekylære regulering af deres proliferation, men er forblevet en udfordring for lang tid på grund af manglen på specifikke markører og tilpassede teknikker.
Nye metoder ved hjælp af flowcytometri har muliggjort isoleringen af NSC og their afkom fra den voksne SVZ 2,7-11. Brug af stamcelle markør LeX 12 sammen med neuroblast markør CD24 13 og en fluorescens EGF at mærke EGFR på prolifererende celler 2, vi for nylig udviklet en FACS strategi tillader rensning af fem af de vigtigste SVZ neurogene populationer: hvilende og aktiverede NSC, TAC, umodne såvel som migrerer neuroblaster 9. Her beskriver vi i detaljer denne celle sortering og hvordan en lex / EGFR / CD24 triple farvning tilladt for første gang isolering af både hvilende og aktiverede NSC'er.
Selvom neurogenese fortsætter i voksenalderen, er produktionen af nye neuroner drastisk faldet i den aldrende hjernen 14. De fleste undersøgelser er enige om en gradvis reduktion i antallet af prolifererende progenitorceller i SGZ og SVZ 15-20. Konsekvenserne er ikke uskadelige, da aldersrelaterede fald i neurogenese i SVZ'en fremkalder en formindskelse af newborn neuroner i de olfaktoriske pærer i den gamle hjerne, i sidste ende fører til forringelse i olfaktoriske diskrimination i alderen mus 18. Belyse cellecyklus kinetik neurale stamceller er et vigtigt skridt for at forstå mekanismerne bag udviklingen af voksne neurogenese under aldring. Nylige undersøgelser har undersøgt cellecyklus og slægt progression af voksne neurale stamceller in vitro 21 og in vivo 22, men ingen af dem benyttede sig af cellesortering teknikker og genetisk indkodede fluorescerende celle-cyklus-prober at visualisere cellecyklen faser af isolerede celler på en enkelt-celle niveau.
Her beskriver vi en protokol, der drager fordel af de transgene mus Fucci hvor celler fluorescerende under deres cellecyklus, således at sondringen mellem G 1 og SG 2 / M faser 23. Denne protokol viser, hvordan potentielle isolering af NSC og deres afkom fra voksne Fucci mice kombineret med time-lapse video mikroskopi tillader undersøgelse af cellecyklus dynamik på et enkelt-celleniveau.
Protocol
Denne protokol er designet i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers direktiv af 24. november har 1986 (86/609 / EØF) og er godkendt af vores dyrevelfærd institutionelle udvalg (CETEA-CEA DSV IDF).
1. Grundlæggende opsætning Før Kultur og Videomicroscopy
- Brug glasbund dyrkningsplader eller u-plader for konfokal mikroskopi video. 1 - 5 x 10 3 celler / brønd, bruger 96-brønds plader og plader med 24 brønde i mere end 5 x 10 3 celler / brønd.
- Mindst én dag før påbegyndelse af forsøget, fremstille sterile Poly-D-lysin (PDL) coatede plader for adhærente monolagskulturer. Tilsæt så PDL (10 ug / ml i dH2O) at coate bunden af hver brønd og inkuberes O / N ved 37 ° C. Fjern PDL-opløsning og skylles tre gange med dH2O før de tillader pladen at tørre i hætten i mindst 2 timer under en laminar strømning. Hvis det ikke anvendes straks, opbevares coatede plade på-20 ° C.
- Forbered dyrkningsmediet ved blanding NSC Basal Medium og NSC spredning Supplement ved en 9: 1-forhold (se Materiale tabel) sammen med 2 ug / ml heparin, 20 ng / ml oprenset humant rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF), og 10 ng / ml human rekombinant fibroblastvækstfaktor 2 (FGF-2). Varm op dyrkningsmediet til 37 ° C i et vandbad før brug.
- For SVZ'en dissociation, forberede papainopløsning: 1 mg / ml papain (15 IE / ml) i Earls Balance Salt Solution (EBSS) indeholdende 0,2 mg / ml L-cystein, 0,2 mg / ml EDTA og 0,01 mg / ml DNase I i PBS. Steriliser opløsningen ved passage gennem en 0,2 um filter. Ækvilibrering af opløsningen ved 37 ° C før brug.
- For at stoppe den enzymatiske reaktion, forberede en proteasehæmmer løsning (Ovomucoid): DMEM: F12 medium indeholdende 0,7 mg / ml trypsin inhibitor type II. Opløsningen filtreres under anvendelse af et 0,2 um filter.
- Forbered PBS 0,6% glucoseopløsning til at indsamle hjerner og PBS 0,15% BSA solution for vasketrin og antistoffarvning.
- Forbered dissektion værktøjer: saks, dissekere og binde pincet, skalpel. Suge dem i 70% ethanol.
2. Høst af Voksen Mouse Brains og SVZ Microdissections
- Sacrifice voksen Fucci mus 23 (2 til 3 måneder gamle og / eller 12-måneder gammel til aldrende undersøgelser) udførelse af en cervikal dislokation i overensstemmelse med de relevante institutionelle retningslinier.
- Spray musen hjælp 70% ethanol og skære hovedet fra med skarp saks.
- Lave et snit langs hovedbunden at afsløre kraniet.
- Udfør en langsgående midterlinje snit starter ved bunden af kraniet til de olfaktoriske pærer ved hjælp en lille saks. Sørg for at undgå at beskadige underliggende hjernen med scissor klinger. Fjern det øverste åbne del af kraniet med buede pincet til at udsætte hjernen.
- Saml hjernen i en 15 mm petriskål indeholdende 0,6% glucose i PBS.
- Dissect væk olfaktoriske pærer. Placer hjernen på dorsale overflade og gøre en koronale snit gennem den optiske chiasm hjælp af en skalpel.
- Under et dissektionsmikroskop, placere rostrale del af hjernen sektion med snittet koronale overflade vender opad mod forsøgslederen.
- At dissekere SVZ'en, fjern skillevæggen med en fin buet pincet derefter indsætte en spids af en fin pincet i striatum umiddelbart op til ventriklen og tag SVZ'en fra det omgivende væv. For yderligere detaljer henvises til Azari et al. 24. Placer dissekeret SVZ'en i en petriskål indeholdende 1 ml PBS-0,6% glucose.
3. SVZ Tissue Dissociation
- Hakke det dissekerede SVZ'en i petriskålen, indtil der ikke store stykker tilbage.
- Overfør det hakkede væv sammen med PBS-0,6% glucose til en 15 ml rør og centrifugeres ved 200 xg i 5 min.
- Kassér supernatanten og tilsættes 1 ml forvarmet papain (1mg / ml, fremstillet i trin 1.4) suppleret med 0,01 mg / ml DNase I. Der inkuberes i 10 minutter i et vandbad ved 37 ° C. Brug 1 ml papain pr mus.
- Centrifugeres ved 200 xg i 5 minutter og kassér supernatanten.
- Der tilsættes 1 ml forvarmet ovomucoid (0,7 mg / ml, fremstillet i trin 1.5) for at stoppe papain aktivitet. Mekanisk dissociere det hakkede væv yderligere i en enkelt-cellesuspension ved forsigtigt at pipettere op og ned 20 gange gennem en P1000 mikropipettespids. Undgå luftbobler.
- Pass cellesuspensionen gennem et sterilt 20 um filter i en ny 15 ml rør. Sørg for at vaske cellefilteret med PBS 0,15% BSA at undgå at miste celler.
- Centrifugeres ved 200 xg i 10 min og kassér supernatanten. Resuspender cellerne i 100 pi PBS indeholdende 0,15% BSA.
4. immunfluorescensfarvning for celle Sortering
Til cellesortering hjælp Fucci-Rød mus (figur 2A), skal du bruge følgendeantistoffer: CD24-phycoerythrin-konjugat cyanine7 [PC7]; CD15 / LeX fluoresceinisothiocyanat [FITC] konjugeret og Ax647 konjugeret EGF ligand.
Bemærk: LeX + EGFR + -celler og EGFR + -celler ikke er rigelige i den voksne SVZ: ≈ 600 og 1500 celler / mus henholdsvis 9. Vi anbefaler samle SVZ celler fra 2 til 3 mus for at have nok materiale. Må ikke arbejde med mere end 12 mus på samme dag, så cellen sortering varighed ikke overstiger 3 timer. Husk på, at arbejdet med for mange mus på samme dag vil føre til en øget cellesortering varighed muligvis resulterer i øget celledød og / eller celledifferentiering.
- Udfør FACS-farvning i 100 pi PBS 0,15% BSA pr mus (eller i 200 pi for en gruppe af 2 til 3 mus for optimal farvning).
- Forbered kontrol rør. Brug kompensation perler til at forberede enkelt farve kontrol rør ifølge producenten9; s protokol. Vælg en fraktion af celler (1/10 af cellerne udvundet fra en mus er nok) og adskille den i 4 rør til fremstilling af 1 negativ kontrol rør (umærkede celler) og 3 fluorescens minus én (FMO) kontrolglassene. Resuspender cellerne i 200 pi PBS 0,15% BSA pr rør.
Tip: For LeX-FITC FMO kontrol, mærke cellerne med CD24-PC7 (1:50) og Ax647-konjugeret EGF-ligand (1: 200); til CD24-PC7 FMO kontrol, mærke cellerne med CD15 / LeX-FITC (1:50) og Ax647-konjugeret EGF-ligand (1: 200) og for Ax647-konjugeret EGF-ligand FMO kontrol, mærke cellerne med CD15 / Lexmark FITC (1:50) og CD24-PC7 (1:50). - For rør, der anvendes for celle sortering, bruge følgende antistoffer på det angivne fortynding i PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15 / LeX-FITC (1:50) og Ax647-konjugeret EGF-ligand (1: 200).
- Inkuber i 20 minutter ved 4 ° C i mørke. Vask med 1 ml PBS 0,15% BSA og centrifugeres ved 200 xg i 10 min. Resuspender cellerne i 20081 l PBS 0,15% BSA pr hjernen. Hold cellesortering rørene på is og gå straks til cellen sortering.
- Hvis du bruger Fucci-Green mus, separate LeX-positive og LeX-negative fraktioner ved hjælp af adskillelse kolonner før cellesortering som lex-FITC antistof deler samme emission bølgelængde end Fucci-grøn fluorescens (figur 3A, B).
- Først mærke cellerne med en muse-anti-humant LeX-antistof (1:50) i 15 minutter ved 4 ° C i mørke i 100 pi PBS 0,15% BSA.
- Vask cellerne med 1 ml PBS 0,15% BSA og centrifugeres ved 200 xg i 10 min, derefter mærke cellerne med anti-muse-IgM mikroperler (1:10) i 15 minutter ved 4 ° C i mørke.
- Vask cellerne med 1 ml PBS 0,15% BSA og centrifugeres ved 200 xg i 10 min. Resuspender cellerne i 500 pi PBS 0,15% BSA og hæld cellerne gennem separationskolonnen i magnetfelt som skematiseret i figur 3C. Kolonnen udvaskes med 1 ml PBS 0,15% BSA at opnå LeX negativ fraktion.
- For at opnå LeX-positive fraktion fjernes delingssøjlen fra magnetfeltet og elueres cellerne med 2 ml PBS 0,15% BSA.
- Fortsæt til CD24-PC7 og Ax647-konjugeret EGF-ligand farvning som angivet i 4.2.
5. Cell Sortering
Bemærk: Celler blev sorteret på en FACS sorteringsanlæg ved 40 Psi med en 86 um noozle. Fluorescens blev opsamlet under anvendelse af følgende filtersæt: 520/35 nm (FITC), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) og 740LP (PC7). Kompensation er nødvendigt for at forhindre falske positive signaler, som der findes en overlapning mellem emission spektre af Fucci-rød fluorescens og PC7 farvestof.
- Umiddelbart før cellesortering, tilføje en vitalfarvestof at skelne live fra døde celler. Vi brugte HO (se materiale tabel) ved en 2 ug / ml slutkoncentration. Kør negativ kontrol røret (umærkede celler) gennem FACS sorteringsanlæg og vælge the-celler under anvendelse sidespredning (SSC) og forward scatter (FSC) parametre (figur 1A).
BEMÆRK: Døde celler blev udelukket ved gating kun HO-negative fraktion (figur 1A) og derefter dubletter blev udelukket ved at vælge Pulse Width negative fraktion (figur 1A ''). - Kør de enkelte farveindstillinger forberedt i trin 4.2 og justere fotomultiplikatorrøret (PMT) spændinger om nødvendigt (dvs. negativ befolkning for høje og / eller positive celler fra skalaen). Udfør farve erstatning i kompensation vindue af softwaren.
- Kør FMO styrer forberedt i trin 4.2 (lex-FITC FMO kontrol, CD24-PC7 FMO kontrol og Ax647-konjugeret EGF-ligand FMO kontrol) og drage de sortering porte (Figur 1). Sortere cellerne direkte ind 100 ul dyrkningsmedium i 1,5 ml mikrorør.
6. Fremstilling af celler til Microscopy
- Plate frisk sorteres celles ved en tæthed på 1 - 3 x 10 3 celler / brønd på poly-D-lysin- overtrukne 96-brønds μ-Plade med 300 pi kulturmedium.
- Forud for video mikroskopi, inkuberes dyrkningsplader ved 37 ° C og 5% CO2 i mindst 1 time for at tillade celleadhæsion.
7. Mikroskop Opsætning og Image Acquisition
- Udfør billeddannelse ved hjælp af en plan Apo VC 20x DIC mål (NA: 0,75) på et konfokalt laserscanningmikroskop systemet fastgjort til en omvendt termostateret kammer ved 37 ° C under 5% af CO2-atmosfære.
- Placer 96 brønde μ-Plate inde i forvarmet og afbalanceret termostatstyret kammer og erstatte låget ved et termostateret dækning.
- Åbn NIS-Elements software og klik i menulinjen på "Acquire / Acquisition styrer / ND erhvervelse" for at vælge de indstillinger af time-lapse (længde, fase positioner, konfokale z-sektioner, ...), "Acquire / køb kontrol / Ti Pad221; at vælge de mål og "Acquire / Acquisition kontrol / A1plus Indstillinger" for at vælge PMT for hver fluorescens i menulinjen. Vælg en mappe at gemme datafiler.
- Brug af ND erhvervelse vinduet, sæt midten af hver samt en scene position og vælge det stort billede mulighed for 7 x 7 mm². Dette vil skabe en mosaik billede omkring midten af hver brønd. Indstil overlapningen for stor mosaik billedet til 5%. Tag billeder hver 20 min i 24 timer. Vælg Plan Apo VC 20x DIC målsætning (NA: 0,75) i Ti Pad vinduet.
- I A1plus vinduet Indstillinger erhverve billeder ved hjælp af højhastigheds resonant scanner på en 512 x 512 pixel format med en opløsning på 1,26 um / pixel. Brug lysfelt at visualisere celleformer. I tilfælde af Fucci-Red mus, excitere rød fluorescens ved 561 nm og indsamle anvendelse af et 595/50 nm filter. I tilfælde af Fucci-Green mus, excitere grøn fluorescens ved 488 nm og indsamle anvendelse af et 530/40 nm filter. Bestemme den optimale PMT-niveau, offset og laser strøm til hver bølgelængde.
BEMÆRK: Vi anbefaler at bruge autofokus funktion for brightfield kanal til at gøre det muligt for software til at autofokus på hvert trin, før hver overtagelsen. Tip: En Plan Apo VC 20x DIC målsætning (NA: 0,75) blev anvendt for sine fremragende opløsning uden behov for olie. Andre formål kan anvendes afhængigt af den optiske opløsning ønskes. - Vælg "Kør nu" -knappen på ND erhvervelse vinduet for at starte købet.
Tip: Følg computeren arbejde i 1 loop til at være sikker på, at alt i fungerer korrekt.
8. Billedbehandling og -analyse
- Analysere data direkte på NIS-Elements software ved at spore cellerne individuelt. Tip: Hvis du vil vinde tid, gem hver position i .avi-format ved hjælp NIS-Elements software og analysere film med ImageJ.
- I ImageJ software, spore individuelle celler undergår mindst 2 divisioner (dvs. en celle tilen fire-celle koloni). Beskær et lille område omkring cellen og vælg "Image / Duplicate '.
- Vælg 'Billede / Stacks / Make Montage "i menulinjen for at gøre en montage. Angiv de rammer, der skal medtages, størrelsen af billederne, og gem montage som en .tif-fil for optimal opløsning.
- For at beregne den første SG 2 / M fase længde (figur 2C, D), skal du vælge en enkelt rød fluorescerende celle (i G 1) og derefter indstille t = 0 (S-fase vil begynde, når den røde fluorescens slukker). Tæl antallet af frames indtil cellen deler at estimere SG 2 / M længde.
BEMÆRK: Den beregnede tid afhænger af tidsintervallet mellem hvert billede. - For at beregne følgende G1-fasen (figur 2C, D), fortsat spore celle, der netop delt. Hvis den delte celle træder G1-fasen, vil der være en akkumulering af cdt1 rød-fluorescerende protein. Beregn antallet af billeder, indtil rød-fluorescens slukker AGAi for hver celle.
Tip: I begyndelsen af G 1 rød fluorescens være svagt, så vælg starten af G 1 fasen på rammen, hvor cellen er opdelt for at undgå tilnærmelser.
Representative Results
Evnen til pålideligt at skelne mellem de forskellige celle populationer af den voksne mus SVZ'en stamceller afstamning er ur for at undersøge deres funktionelle egenskaber. Til dette formål har vi udviklet en lex / EGFR / CD24 triple-mærkning strategi tillader rensning af specifikke cellepopulationer fra den voksne SVZ'en: hvilende NSC (lex lyse), aktiverede NSC (lex + EGFR +), TAC (EGFR +) , umodne og migrerer neuroblaster (CD24 + EGFR + og CD24 +, henholdsvis) 9 (figur 1). Anvendt på Fucci transgene mus, at cellesortering teknik tillader billeddannelse af cellecyklussen faser af de forskellige neurogene populationer på enkeltcelle-niveau 25. Fucci-Red mus blev anvendt til at følge G 1 fase med rød fluorescens under anvendelse af time-lapse video mikroskopi (figur 2A). Fucci-Red neg celler repræsenterer cellerne i S-G 2 / M-faser af cellecyklus, Fucci-Red POS celler er G 1-celler og Fucci-Red lyse er celler spændende eller ud af cellecyklussen (figur 2B) 23,26. LeX + EGFR + og EGFR + celler fra unge voksne (figur 2C) og midaldrende mus (figur 2D) blev udpladet som adhærente celler på poly-D-lysin overtrukne dyrkningsplader. Den første SG 2 / M fase blev identificeret på enkelte celler, når den røde fluorescens slukker indtil celle skel. Som tidligere anført SG 2 / M-fase længden viste ingen forskel mellem LeX + EGFR + og EGFR + -celler, enten i unge eller midaldrende mus. Så vi beregnet den næste G 1 fase længde fra første division, indtil den røde fluorescens slukker. Interessant nok blev en G 1 fase forlængelse fundet under aldring i LeX + EGFR + celler, men ikkei EGFR + -celler 25 (figur 2C, D). Som følge heraf neurosfærer opnået 5 dage efter udpladning er mindre i LeX + EGFR + celler opnået fra ældre mus som vist i figur 2E.
Fucci-Green mus kan også anvendes til at visualisere SG 2 / M fase med grøn fluorescens (figur 3A, B), men cellerne skal forsorterede hjælp separeringssøjler lex-FITC-antistof havde samme emissionsbølgelængde end FUCCI- grøn fluorescens (figur 3C). Et eksempel på Fucci-grøn fluorescens for første SG 2 / M-fasen af unge voksne LeX + EGFR + og EGFR + -celler er vist i figur 3D.
Figur 1:. Strategi celle udvælgelse ved FACS (A) Celler blev først udvalgt efter tarving morfologi ved hjælp Side scatter (SSC) versus scatter Fremad (FSC) parametre. For yderligere oplysninger om morfologi gate udvælgelse, henvises til Daynac et al. 9 (A ') Døde celler blev mærket ved hjælp HO markør og udelukket fra valget. (A') Doublets blev udelukket ved hjælp af pulsbredde parameter. For at oprette sortering porte, Fluorescens minus én (FMO) styrer for CD24-PC7 (lex-FITC / Fucci-Rød / EGF-Ax647 mærkning B) og LeX-FITC (Fucci-Rød / EGF-Ax647 / CD24 -PC7 mærkning B ') blev anvendt (C, C.) Derefter blev sortering porte bestemt i LeX-FITC / Fucci-Rød / EGF-Ax647 / CD24-PC7 mærkede rør sammen med FMO kontroller. De gennemsnitlige procentdele af totale celler er repræsenteret i portene. Hvis du vælger CD24 + celler (neuroblaster), være omhyggelig med at udelukke CD24 lyse udtrykkende celler fra porten. Faktisk CD24 lyse svarer til ependymale ceLLS 2,9. C 'betegner CD24-negative celler (sorte firkantede i C). Kun LeX + EGFR + og EGFR + (C ') sortering portene blev anvendt til denne undersøgelse.
Figur 2: Levende analyser af cellecyklus ved hjælp Fucci-Red mus (A) Skematisk repræsentation af Fucci-Red cellecyklus, hvor cellerne er røde-fluorescerende under G1-fasen og farveløs under SG 2 / M faser 23 (B) FACS repræsentation.. Fucci-Rød fluorescens på SVZ celler. (C, D) Video mikroskopi med LeX + EGFR + og EGFR + celler sorteret fra unge (C) og midaldrende (D) Fucci-Rød mus tillader sporing af G 1 fase med rød fluorescens mens SG 2 / M faser kan udledes WHEn rød fluorescens slukker. På hinanden følgende billeder vises med en tidsskala præsenteres i D. (E) Repræsentative billeder af kolonier (neurosfærer) opnået 5 dage efter plating. Målestok:. 10 um (C, D), 30 um (E) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:.. Strategi for levende analyser af cellecyklus ved hjælp Fucci-Green mus (A) Skematisk repræsentation af Fucci-Green cellecyklus, hvor cellerne er grønt under SG 2 / M-fasen og farveløs under G 1 fase 23 (B) FACS repræsentation af Fucci-grøn fluorescens: Fucci-Grønne neg celler repræsenterer cellerne i G 1 fase af cellecyklus, mens Fucci-Green POS er celler i SG 2 / M 23. (C) For at følge den grønne fluorescerende SG 2 / M faser lex + EGFR + og EGFR + -celler, havde SVZ celler, der skal forsorterede med separeringssøjler. Celler blev mærket med anti-muse-antistof og LeX LeX + fraktionen blev tilbageholdt på søjlen under anvendelse af anti-muse mikroperler (se protokol 4.). Derefter LeX + og LeX - fraktioner blev elueres og mærket med EGF-Ax647 og CD24-PC7 antistoffer til FACS sortering (D) Video mikroskopi lex + EGFR + og EGFR + celler sorteret fra unge Fucci-Grøn mus tillader sporing af. den SG 2 / M faser med grøn fluorescens. På hinanden følgende billeder vises med en tidsskala præsenteres i D. Målestokken: 10 um (D).
Discussion
Cellen sortering teknik beskrevet heri tillader pålidelig forskelsbehandling mellem hvilende NSC, aktiverede NSC og deres afkom muliggør studier af deres egenskaber og dynamik i den voksne hjerne 9. Kombineret med Fucci teknologi, som tillader visualisering af cellecyklusprogression i levende celler 23, udviklede vi en hurtig og effektiv teknik til at følge G 1 og SG 2 / M-faser af cellecyklus fra unge voksne og ældre mus hjerneceller.
Cellen sortering teknik, der anvendes i denne protokol var den første validerede kombination af markører tillader rensning af de fem vigtigste neurogene befolkninger fra SVZ'en 9. Det var også det første validerede teknik muliggør skelnen af hvilende og aktiverede NSC. Det er bemærkelsesværdigt, at denne teknik ikke kræver anvendelse af transgene mus per se, som er nødvendig, tilpasset transgene musemodeller sulm som Fucci. Siden da har Codega et al. 10 anvendes en GFAP-GFP / CD133 / EGFR triple mærkning kombination til at skelne hvilende NSC'er fra deres aktiverede modstykke, men det kan ikke tilpasses til Fucci teknologi, idet den kræver anvendelse af GFAP-GFP transgene mus. Mich et al. 11 har udviklet en GLAST / EGFR / CD24 triple mærkning strategi, der deler fælles resultater med den teknik, der anvendes i denne undersøgelse 9. Faktisk blev en høj korrelation mellem Lex og GLAST NSC'er markører allerede observeret i Daynac et al. Studere 9. Imidlertid er GLAST antistof, der anvendes i Mich et al. Teknik koblet til phycoerythrin og kan derfor ikke tilpasses med brugen af Fucci-Red mus.
Der er flere vigtige tekniske punkter, der kræver opmærksomhed før sorteringen SVZ celler. For det første dissociation trin er meget vigtigt, da hjernevævet skal dissocieres til enkeltceller samtidig bevare den strukturelle iintegrity af proteinerne anvendes til antistofmærkning strategi. 0,05% trypsin-EDTA har vist sig at være meget effektive til at dissociere SVZ væv 27, men lex antigen blev fundet at være meget følsomme næsten alle LeX-FITC immunfluorescens var tabt (data ikke vist). Således blev papain anvendt som det var mere effektiv og mindre destruktiv end andre proteaser på hjernevæv. Desuden blev hverken LeX eller EGFR eller CD24 ramt af papain behandling. Det skal bemærkes, at antistoffet mærkning blev ændret, hvis papain behandlingen oversteg 15 min. Vi opnåede optimale resultater med en 10 min papain behandling forbundet med en mekanisk dissociering (pipette op og ned 20 gange).
Poly-D-Lysin belægning tillader dyrkning af adhærerende celler og dannelsen af kolonier efter flere dage i kultur. Det er nu almindeligt accepteret, at in vitro-assays kommer med deres begrænsninger 28,29. Vi anbefaler, at bestemme kun den første celle cyklus forde celler, som undergår mindst en efterfølgende opdeling at holde sig så tæt som muligt på in vivo-fænotype.
Det er værd at nævne, at de Geminin (grøn fluorescens) og Cdt1 (rød fluorescens) proteiner anvendes til at designe Fucci systemet 23 tidligere viste sig at være rigeligt udtrykt ved neurale stamceller under tidlig neurogenese i mus 30 og voksne hjernevæv 9,25 . Selvom mKO2-hCdt1 (30/120) konstruktion hovedsageligt blev anvendt i den foreliggende undersøgelse at følge G1-fasen med rød fluorescens, brugen af begge konstruktioner [mKO2-hCdt1 (30/120) og MAG-hGem (1/110) ] kunne forudses at muliggøre visualisering af de vigtigste faser af cellecyklus (G 1 og SG 2 / M) samt G 1 / S overgangen 23. Den største ulempe ved tofarvet imaging er de begrænsede kompatible sæt af fluorescens, der stadig kan anvendes til mærkning af cellen. En løsning er at bruge separator;på søjler. For eksempel har vi med succes forarmet den CD24-positive fraktion fra celler ved hjælp adskillelse kolonner før celle sortering og leve-imaging, som vi brugte en CD24-PE antistof, der delte den samme emission bølgelængde end Fucci-Rød fluorescens 25.
Kun få studier har undersøgt længden af voksne mus SVZ populationer cellecyklus. Den samlede cellecykluslængden opnået med vores teknik er tæt på en estimeret in vitro af Costa et al. 21, men vi var i stand for første gang til at skelne mellem de forskellige cellecyklus faser. I et in vivo-undersøgelse, Ponti et al. 22 anvendes inkorporeringen af thymidin-analoger for at bestemme spredning dynamik forskellige SVZ cellepopulationer. Imidlertid kunne de hverken foretage en løbende overvågning af cellecyklus eller spore cellerne på enkelt-celle niveau. Dette kunne være et problem, da det blev vist, at en stærk heterogenitet findes within en given SVZ cellepopulation 22,25. Vi beskriver her et alternativ in vitro teknik, let at sætte op, der tillader levende billeder af cellecyklus faser af forskellig voksne neurogene befolkninger på et enkelt-celle niveau.
Fortsat en udfordring for udviklingen af nye terapeutiske tilgange i forbindelse med aldring eller hjernen patologier Forståelse reguleringen af cellens cyklus af neurale stamceller og stamceller. Vores protokol kan således have en bred vifte af anvendelser. I forbindelse med aldring, kan denne teknik også vise sig nyttigt at forstå virkningerne af aldringen på NSC differentiering. Faktisk er det muligt at identificere neurale stam- / progenitorceller ind differentiering som deres røde fluorescerende intensitet væsentligt højere 26. Endelig kunne det også være af interesse at udnytte den vedvarende levende billedbehandling på et enkelt-celle niveau til at studere cellens indre og ydre processer er ansvarlige for afstamning progression af voksne NSC.
Acknowledgments
Vi står i gæld til C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet og alle ansatte i dyrefaciliteter; til J Baijer og N Dechamps for cellesortering; O. Etienne til teknisk bistand, og A. Gouret for hendes administrativ bistand. Flowcytometri og cellesortering blev udført på iRCM flowcytometri delte ressource, oprettet ved tilskud udstyr fra DIM-Stem-polet, INSERM, Fondation ARC, og CEA. Dette arbejde blev støttet af tilskud på Electricité de France (EDF). MD har et stipendium fra La Ligue Contre le Kræft og LM fra region Ile-de-France (DIM bioterapier). Marc-André Mouthon og François D. Boussin aktie co-senior forfatterskab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
| µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
| NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
| Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
| EGF | Millipore | GF144 | |
| FGF-2 | Millipore | GF003 | |
| Papain | Worthington | LS003119 | |
| EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
| L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
| DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
| Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
| DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
| 20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
| Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
| BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
| CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
| CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
| Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
| Alexa647 - conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
| CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
| Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
| INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
| Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
| NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
| Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
| ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
| ImageJ | RBS | ||
| FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
| FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |
References
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97, 703-716 (1999).
- Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).
- Rietze, R. L., et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, 736-739 (2001).
- Fischer, J., et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone. Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).
- Daynac, M., et al. Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage. Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).
- Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82, 545-559 (2014).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
- Capela, A., Temple, S. LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal. Neuron. 35, 865-875 (2002).
- Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult. Neuroscience. 73, 581-594 (1996).
- Pineda, J. R., et al. Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain. EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).
- Lugert, S., et al. Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging. Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).
- Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice. Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).
- Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood. Neuroscience. 173, 135-149 (2011).
- Enwere, E., et al. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).
- Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).
- Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138, 1057-1068 (2011).
- Ponti, G., et al. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).
- Sakaue Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Daynac, M., et al. TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain. Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).
- Roccio, M., et al. Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns. Development. 140, 459-470 (2013).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Spella, M., et al. Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle. Neuroscience. 147, 373-387 (2007).
