Abstract
Nevrale stamceller (NSC) i subventricular sonen av sideventriklene (SVZ) opprett olfactory neurogenesis hele livet i hjernen hos pattedyr. De suksessivt generere transitt forsterke celler (TACS) og neuroblasts som skiller i nerveceller når de integrere olfactory pærer. Emerging fluorescerende aktivert celle sortering (FACS) teknikker har tillatt isolering av NSCs samt deres avkom, og har begynt å belyse genet regulatoriske nettverk i voksen nevrogene nisjer. Vi rapporterer her en cellesortering teknikk som gjør det mulig å følge og skille cellesyklus dynamikken i de ovenfor nevnte cellepopulasjoner fra den voksne SVZ med en lex / EGFR / CD24 trippel farging. Isolerte celler blir deretter belagt som adherente celler til å utforske i detaljer deres cellecyklusprogresjonen etter time-lapse video mikroskopi. For å oppnå dette, bruker vi transgen Fluorescens ubiquitinering Cell Cycle Indicator (FUCCI) mus der cellene er rød-fluorescerende During G en fase på grunn av en G en bestemt rød-Cdt1 reporter. Denne metoden har nylig avslørt at prolifererende NSCs gradvis forlenge sine G en fase under aldring, som fører til neurogenesis verdifall. Denne metoden er lett overførbare til andre systemer, og kan være av stor interesse for studiet av cellesyklus dynamikken i hjerneceller i forbindelse med hjernesykdommer.
Introduction
Hvilende nevrale stamceller (NSC) er kilden for voksen neurogenesis en og kan konvertere til deres proliferative "aktivert" form uttrykker EGFR (aNSCs) 2. Når aktivert, de gir opphav til transitt forsterke celler (TACS) 3 og deretter neuroblasts som migrerer til olfactory pærer (OB) gjennom et rør av astrocytter og til slutt differensiere til neuroner 4,5. NSCs og deres avkom er organisert i spesialiserte "nisjer" arkitekturer langs sideventriklene, impliserer en myriade av faktorene som styrer deres spredning 6. Isoleringen og rensingen av SVZ nevrogene celler som er nødvendig for å belyse den komplekse molekyl reguleringen av deres proliferasjon, men har vært en utfordring for en lang tid på grunn av mangelen på spesifikke markører og tilpasset teknikker.
Nye metoder ved hjelp av flowcytometri har gjort mulig isolering av NSCs og their avkom fra den voksne SVZ 2,7-11. Bruke stamcelle markør Lex 12 sammen med neuroblast markør CD24 13 og en fluorescens EGF å merke EGFR på voksende celler 2, vi nylig utviklet en FACS strategi slik at rensing av fem av de viktigste SVZ nevrogene populasjoner: hvilende og aktivert NSCs, kvoter, umodne samt trekkende neuroblasts 9. Her beskriver vi detaljene i denne cellesortering teknikk, og hvor en lex / EGFR / CD24 trippel farging tillatt for første gang isolering av både hvilende og aktiverte NSCs.
Selv nevrogenesen vedvarer i løpet av voksenlivet, blir produksjonen av nye neuroner drastisk redusert i den aldrende hjernen 14. De fleste studier bli enige om en progressiv reduksjon i antall prolifererende stamceller i SGZ og SVZ 15-20. Konsekvensene er ikke ufarlige som aldersrelatert nedgang i neurogenesis i SVZ provoserer en reduksjon av newborn nevroner i olfactory pærer i alderen hjernen, til slutt fører til svekkelse i olfactory diskriminering i alderen mus 18. Belyse cellecykluskinetikken av nevrale stamceller er et viktig steg for å forstå mekanismene bak utviklingen av voksen nevrogenese under aldring. Nyere studier har undersøkt cellesyklusen og avstamning progresjon av voksen nevrale stamceller in vitro 21 og in vivo 22, men ingen av dem benyttet av cellesorteringsteknikker og genetisk kodede fluorescerende celle-syklus prober for å visualisere celle-syklusfaser isolerte celler ved en enkeltcellenivå.
Her beskriver vi en protokoll som tar nytte av de transgene FUCCI mus der cellene er fluorescerende under cellesyklusen, slik at skillet mellom G 1 og SG 2 / M faser 23. Denne protokollen viser hvordan potensielle isolering av NSCs og deres avkom fra voksen FUCCI mice kombinert med time-lapse videomikroskopi tillater studiet av cellesyklus dynamikken ved en enkelt-celle-nivå.
Protocol
Denne protokollen er utformet i samsvar med den europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 24. november har 1986 (86/609 / EØF) og er godkjent av vår dyrevelferd institusjonelle komité (CETEA-CEA DSV IdF).
1. Basic Setup Før Kultur og Videomicroscopy
- Bruk glassbunn kulturplater eller u-plater for konfokal video mikroskopi. I 1 - 5 x 10 3 celler / brønn ved å bruke 96-brønners plater og 24-brønners plater i mer enn 5 x 10 3 celler / brønn.
- Minst en dag før du starter forsøket, forberede sterile Poly-D-lysin (PDL) belagte plater for heft monolagkulturer. Legg nok PDL (10 ug / ml i dH2O) for å belegge bunnen av hver brønn og inkuberes O / N ved 37 ° C. Fjern det PDL og skyll tre ganger med dH 2 O før tillater platen å tørke i hetten i minst 2 timer under en laminær strømning. Hvis det ikke brukes umiddelbart, lagre belagt plate på-20 ° C.
- Forbered kulturmedium ved å blande NSC Basal Medium NSC Proliferation Supplement til en 9: 1-forhold (se Materiale tabellen) sammen med 2 ug / ml heparin, 20 ng / ml renset human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF), og 10 ng / ml human rekombinant fibroblast-vekstfaktor 2 (FGF-2). Varm opp kulturmedium til 37 ° C i et vannbad før bruk.
- For SVZ dissosiasjon, forberede papain løsning: 1 mg / ml papain (15 UI / ml) i Earls Balance Salt Solution (EBSS) inneholdende 0,2 mg / ml L-cystein, 0,2 mg / ml EDTA, og 0,01 mg / ml DNase I i PBS. Steriliser oppløsningen ved å passere gjennom et 0,2 mikrometer filter. I likevekt i løsningen ved 37 ° C før bruk.
- For å stoppe den enzymatiske reaksjonen, utarbeide en proteasehemmer løsning (Ovomucoid): DMEM: F12 medium inneholdende 0,7 mg / ml trypsin inhibitor type II. Filtrer løsningen ved bruk av en 0,2 pm filter.
- Forbered PBS 0,6% glukoseoppløsning til å samle hjernen og PBS 0,15% BSA solution for vasketrinn og for antistoffarging.
- Forbered disseksjon verktøy: saks, dissekere og knytte tang, skalpell. Suge dem i 70% etanol.
2. Høsting av Adult Mouse Brains og SVZ Microdissections
- Sacrifice voksen FUCCI mus 23 (2 til 3 måneder gamle og / eller 12 måneder gammel for aldring studier) utfører en halshugging i henhold til de aktuelle institusjonelle retningslinjer.
- Spray musen med 70% etanol og kutte hodet av med skarp saks.
- Lag et snitt langs hodebunnen for å avsløre skallen.
- Utføre en langsgående midtlinjen snitt starter ved bunnen av hodeskallen mot olfactory pærer med en liten saks. Sørg for å unngå å skade den underliggende hjerne med saksebladene. Fjern den øvre åpne delen av hodeskallen med buede tang å avsløre hjernen.
- Samle hjernen i en 15 mm petriskål inneholdende 0,6% glukose i PBS.
- Dissect bort olfactory pærer. Plasser hjernen på sin dorsalflaten og gjøre en koronale snitt gjennom chiasma ved hjelp av en skalpell.
- Under en disseksjonsmikroskop, plasserer rostralt delen av hjernen delen med cut koronale flaten vendt oppover mot eksperimentator.
- Å dissekere SVZ, fjerne septum med en fin buet pinsett deretter sette en spiss på en fin pinsett inn i striatum umiddelbar nærhet til ventrikkel og løsne SVZ fra omkringliggende vev. For ytterligere informasjon, se Azari et al. 24. Plasser dissekert SVZ i en petriskål inneholdende 1 ml PBS-0,6% glukose.
3. SVZ Tissue Dissosiasjon
- Hakk dissekert SVZ i petriskålen til det ikke store biter forbli.
- Overfør hakket vevet sammen med PBS-0,6% glukose til et 15 ml rør og sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter.
- Kast supernatanten og tilsett 1 ml forvarmet papain (1mg / ml, fremstilt i trinn 1.4) supplementert med 0,01 mg / ml DNase I. Inkuber i 10 minutter i et vannbad ved 37 ° C. Bruker 1 ml av papain pr mus.
- Sentrifuger ved 200 xg i 5 min, og supernatanten kastes.
- Tilsett 1 ml forvarmet ovomucoid (0,7 mg / ml, fremstilt i trinn 1,5) for å stanse papain aktivitet. Mekanisk dissosiere hakket vevet videre inn i en enkeltcellesuspensjon ved forsiktig pipettering opp og ned 20 ganger gjennom en P1000 mikropipette spiss. Unngå luftbobler.
- Passere cellesuspensjonen gjennom et sterilt 20 mikrometer filter i en ny 15 ml tube. Sørg for å vaske cellen filter med PBS 0,15% BSA å unngå å miste celler.
- Sentrifuger ved 200 xg i 10 min, og supernatanten kastes. Re-suspendere celler i 100 ul PBS inneholdende 0,15% BSA.
4. Immunofluorescent Farging for Cell Sorting
For celle sortering ved hjelp FUCCI-Red mus (Figur 2A), bruker du følgendeantistoffer: CD24 phycoerythrin-cyanine7 konjugerte [PC7]; CD15 / lex fluoresceinisotiocyanat [FITC] konjugert og Ax647 konjugert EGF ligand.
Merk: lex + EGFR + celler og EGFR + celler er ikke rikelig i voksen SVZ: ≈ 600 og 1500 celler / mus henholdsvis 9. Vi anbefaler pooling SVZ celler fra to til tre mus å ha nok materiale. Ikke arbeid med mer enn 12 mus på samme dag, slik at cellen sortering varigheten ikke overstiger 3 hr. Husk at det å jobbe med for mange mus på samme dag vil føre til en økt celle sortering varighet kan føre til økt celledød og / eller celledifferensiering.
- Utfør FACS farging i 100 ul PBS 0,15% BSA per mus (eller på 200 ul i en gruppe på 2 til 3 mus for optimal farging).
- Forbered kontrollrørene. Bruk kompensasjon perler å forberede enkle fargekontroll rør ifølge produsenten9; s protokollen. Velge en fraksjon av celler (1/10 av cellene utvunnet fra en mus er nok) og separere den i 4-rør for å fremstille en negativ kontrollrøret (umerkede celler) og 3 fluorescens minus en (FMO) kontrollrørene. Suspender cellene i 200 pl PBS 0,15% BSA per rør.
Hint: For lex-FITC FMO kontroll, merke celler med CD24-PC7 (01:50) og Ax647-konjugert EGF ligand (1: 200); for CD24-PC7 FMO kontroll, merke celler med CD15 / lex-FITC (01:50) og Ax647-konjugert EGF ligand (1: 200) og for Ax647-konjugert EGF ligand FMO kontroll, merke celler med CD15 / Lexmarks FITC (01:50) og CD24-PC7 (01:50). - For rør som brukes for celle sortering, kan du bruke følgende antistoffer i den angitte fortynning i PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (01:50), CD15 / lex-FITC (01:50) og Ax647-konjugert EGF ligand (1: 200).
- Inkuber i 20 minutter ved 4 ° C i mørket. Vask med 1 ml PBS-0,15% BSA og sentrifuger ved 200 xg i 10 min. Suspender cellene i 20081; l PBS 0,15% BSA per hjernen. Hold celle sortering rørene på is og fortsette umiddelbart til cellesortering.
- Hvis du bruker FUCCI-Grønne mus, separate lex-positive og lex-negative fraksjoner ved hjelp separasjonskolonner før celle sortering som lex-FITC antistoff deler samme utslipp bølgelengde enn FUCCI-grønn fluorescens (figur 3A, B).
- For det første merke cellene med muse-anti-human lex-antistoff (1:50) i 15 minutter ved 4 ° C i mørket i 100 ul PBS 0,15% BSA.
- Vask cellene med 1 ml PBS-0,15% BSA og sentrifuger ved 200 xg i 10 min, deretter merke cellene med anti-mus-IgM-mikroperler (1:10) i 15 minutter ved 4 ° C i mørket.
- Vask cellene med 1 ml PBS-0,15% BSA og sentrifuger ved 200 xg i 10 min. Suspender cellene i 500 pl PBS 0,15% BSA og hell cellene gjennom separasjonskolonnen i magnetfelt som skjematisert i figur 3C. Vask kolonnen med 1 ml PBS 0,15% BSA å få lex negativ brøkdel.
- For å oppnå lex-positive fraksjonen, fjerne separasjonskolonnen fra magnetfeltet og elueres cellene med 2 ml PBS 0,15% BSA.
- Fortsett til CD24-PC7 og Ax647-konjugert EGF ligand flekker som angitt i 4.2.
5. Cell Sorting
Note: Cellene ble sortert på en FACS sorter ved 40 Psi med en 86 mikrometer noozle. Fluorescens ble samlet inn ved hjelp av følgende filter settet: 520 / 35nm (FITC), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) og 740LP (PC7). Kompensasjon er nødvendig for å hindre falske positive signaler som en overlapping er funnet mellom utslipps spektrum av FUCCI-rød fluorescens og PC7 fargestoff.
- Umiddelbart før celle sortering, legge til en vital fargestoff til å diskriminere levende fra døde celler. Vi brukte HO (se tabell materiale) på en 2 pg / ml sluttkonsentrasjon. Kjør den negative kontrollen tube (umerkede celler) gjennom FACS sorter og velge the celler ved hjelp side scatter (SSC) og frem scatter (FSC) parametre (Figur 1a).
MERK: Døde celler ble ekskludert av gating bare HO-negative fraksjonen (figur 1A ') og deretter dubletter ble ekskludert ved å velge Pulse Width negative fraksjonen (figur 1A' '). - Kjør enkle fargekontrollene utarbeidet i trinn 4.2 og juster fotomultiplikatorrøret (PMT) spenninger om nødvendig (dvs. negativ befolknings for høy og / eller positive celler av skalaen). Utfør farge kompensasjon i erstatning vinduet av programvaren.
- Kjør FMO styrer forberedt i trinn 4.2 (lex-FITC FMO kontroll, CD24-PC7 FMO kontroll og Ax647-konjugert EGF ligand FMO kontroll) og trekke sorterings porter (figur 1). Sorter cellene direkte inn 100 mL av kulturmedium i 1,5 ml mikrorør.
6. Utarbeidelse av celler for Mikros
- Plate fersk sortert cellens ved en tetthet på 1 - 3 x 10 3 celler / brønn på poly-D-lysin-belagte 96-brønners μ-Plate med 300 ul kulturmedium.
- Før videomikroskopi, inkuber kulturplater ved 37 ° C og 5% CO2 i minst en time for å tillate celleadhesjon.
7. Mikroskop Oppsett og Image Acquisition
- Utføre levende avbildning ved hjelp av en plan Apo VC 20x objektiv DIC (NA: 0,75) på en konfokal laser scanning mikroskop system er festet til en omvendt termostatert kammer ved 37 ° C under 5% CO2 atmosfære.
- Plasser 96-brønns μ-Plate inne i forvarmet og likevekt termostatert kammeret og erstatte lokket ved et termostatstyrt dekke.
- Åpne NIS-Elements programvare og klikk på menylinjen på "Acquire / Acquisition styrer / ND oppkjøpet" for å velge alternativene i time-lapse (lengde, sceneplassering, konfokale z-seksjoner, ...), "Acquire / Anskaffelses kontroller / Ti Pad221; å velge mål og "Acquire / Anskaffelseskontroll / A1plus Settings" for å velge PMT nivå for hver fluorescens i menylinjen. Velg en mappe for å lagre datafiler.
- Bruke ND oppkjøpet vinduet, satt på midten av hver samt en scene posisjon og velg stort bilde muligheten til 7 x 7 mm². Dette vil skape en mosaikkbildet rundt midten av hver brønn. Still overlapping for det store mosaikkbildet til 5%. Ta bilder hvert 20. min i 24 timer. Velg Plan Apo VC 20x DIC objektiv (NA: 0,75) i Ti Pad vinduet.
- I A1plus vinduet Innstillinger, hente bilder med høy hastighet resonant scanner på en 512 x 512 piksler format med en oppløsning på 1,26 mikrometer / pixel. Bruk lysfelt å visualisere celleformer. I tilfelle av FUCCI-Red mus, eksitere rød fluorescens ved 561 nm og samle ved anvendelse av en 595/50 nm filter. I tilfelle av FUCCI-grønn mus, eksitere grønn fluorescens ved 488 nm og samle ved anvendelse av en 530/40 nm filter. Bestem optimal PMT nivå, offset og laser makt for hver bølgelengde.
MERK: Vi anbefaler at du bruker autofokus funksjon for lysfelt kanal for å la programvaren autofokus på hvert trinn posisjon før hvert kjøp. Hint: En Plan Apo VC 20x DIC objektiv (NA: 0,75) ble brukt for sitt gode vedtak uten behov for olje. Andre mål kan anvendes, avhengig av optisk oppløsning er ønskelig. - Velg "Kjør nå" -knappen på ND oppkjøpet vinduet for å begynne oppkjøpet.
Hint: Følg dataarbeid for en sløyfe for å være sikker på at alt i fungerer.
8. Bildebehandling og analyse
- Analysere data direkte på NIS-Elements programvare ved å spore cellene individuelt. Hint: For å vinne tid, spare hver posisjon i .avi format ved hjelp av NIS-Elements programvare og analysere filmene med ImageJ.
- I ImageJ programvare, spore individuelle celler gjennomgår minst 2 divisjoner (dvs. en celle tilen fire-celle koloni). Beskjære et lite område rundt cellen og velg "Bilde / Duplicate".
- Velg "Bilde / Stacks / Make Montage" i menylinjen for å gjøre en montasje. Spesifisere rammene for å bli inkludert, størrelsen på bilder og lagre den montasjen som en TIF-fil for optimal oppløsning.
- For å beregne den første SG 2 / M fase lengde (figur 2C, D) ved å velge en enkelt rød fluorescerende celle (i G 1), og angir t = 0 (S fase begynner når det røde fluorescens slås av). Tell antall rammer inntil cellen deler for å estimere SG 2 / M lengde.
MERK: Beregnet tid er avhengig av tidsintervallet mellom hver ramme. - For å beregne følgende G1 fasen (figur 2C, D), fortsette å spore cellen som bare deles. Hvis den delte cellen trer G1 fase, vil det være en ansamling av cdt1 rød-fluorescerende protein. Beregne antall rammer til rød-fluorescens slår agai hver celle.
Hint: I begynnelsen av G 1 den røde fluorescens kan være svak, slik velge starten av G en fase på rammen, hvor cellen har delt for å unngå approksimasjoner.
Representative Results
Evnen til å pålitelig diskriminere mellom de ulike celle bestander av den voksne mus SVZ stamcelle avstamning er primordial å undersøke deres funksjonelle egenskaper. For dette formålet, har vi utviklet en lex / EGFR / CD24 trippel-merking strategi slik at rensing av spesifikke cellepopulasjoner fra den voksne SVZ: hvil NSCs (Lex lyse), aktiverte NSCs (lex + EGFR +), totalkvoter (EGFR +) , umodne og trekkende neuroblasts (CD24 + EGFR + og CD24 +, henholdsvis) 9 (figur 1). Anvendt til FUCCI transgene mus, kan cellesorteringsteknikken levende avbildning av cellesyklus fasene av de forskjellige nevrogene populasjoner på enkeltcellenivå 25. FUCCI-Rød mus ble brukt til å følge G en fase med rød fluorescens å bruke time-lapse video mikroskopi (Figur 2A). FUCCI-Røde neg celler representerer cellene i S-G 2 / M-fasene av cellesyklusen, FUCCI-pos Røde celler er G 1-celler og FUCCI-lyse røde celler er celler som kommer ut i eller ut av cellesyklus (figur 2B) 23,26. Lex + EGFR + og EGFR + celler fra ung voksen (figur 2C) og middelaldrende mus (figur 2D) ble platet som heftende celler på poly-D-lysin belagte kulturplater. Den første SG 2 / M fasen ble identifisert på enkeltceller når den røde fluorescens slår seg til cellen deler seg. Som tidligere observert SG 2 / M fase lengde viste ingen forskjell mellom lex + EGFR + og EGFR + celler, enten i små eller middelaldrende mus. Da vi beregnet neste G en fase lengde fra første divisjon til den røde fluorescens slår seg av. Interessant nok var en G en fase forlengelse funnet under aldring i Lex + EGFR + celler, men ikkei EGFR + celler 25 (figur 2C, D). Som følge av neurosfærer oppnådd 5 dager etter utplating er mindre i lex + EGFR + celler oppnådd fra eldre mus som vist i figur 2E.
FUCCI-grønn mus kan også brukes til å visualisere SG 2 / M fase med grønn fluorescens (figur 3A, B), men celler må være forhånds sorteres ved hjelp av separasjonskolonner som lex-FITC antistoff delte samme emisjonsbølgelengden enn FUCCI- grønn fluorescens (Figur 3C). Et eksempel på FUCCI-grønn fluorescens for den første SG 2 / M fasen av unge voksne lex + EGFR + og EGFR + celler er vist i figur 3D.
Figur 1:. Strategy of cell utvalg av FACS (A) Cellene ble først valgt i henhold til tarving morfologi bruker Side scatter (SSC) vs Forward scatter (FSC) parametere. For ytterligere informasjon om morfologi gate utvalg, se Daynac et al. 9 (a ') Døde celler ble merket ved hjelp HO markør og ekskludert fra utvalget. (A' ') Dubletter ble ekskludert ved hjelp av pulsbredde parameter. For å sette opp sortering porter, fluorescens minus én (FMO) kontrollerer for CD24-PC7 (LEX-FITC / FUCCI-Red / EGF-Ax647 merking, B) og lex-FITC (FUCCI-Red / EGF-Ax647 / CD24 -PC7 merking; B ') ble brukt (C, C ".) Deretter ble sortering porter bestemt i lex-FITC / FUCCI-Red / EGF-Ax647 / CD24-PC7 merkede rør sammen med FMO kontroller. De gjennomsnittlige prosentandeler av totale celler er representert innenfor portene. Hvis du velger CD24 + celler (neuroblasts), være forsiktig med å utelukke CD24 lyse uttrykker celler fra gate. Faktisk CD24 lyse tilsvarer ependymal cells 2,9. C 'representerer de CD24 negative celler (svart kvadrat i C). Bare lex + EGFR + og EGFR + (C ') sorterings- porter ble anvendt for denne studien.
Figur 2: Live-analyser av cellesyklus ved hjelp FUCCI-Rød mus (A) Skjematisk fremstilling av FUCCI-Red cellesyklus hvor cellene er rød-fluorescerende under G1 fase og fargeløs under SG 2 / M faser 23 (B) FACS representasjon av.. FUCCI-Red fluorescens på SVZ celler. (C, D) Video mikroskopi med Lex + EGFR + og EGFR + celler sortert fra unge (C) og middelaldrende (D) FUCCI-Red mus tillater sporing av G en fase med rød fluorescens mens SG 2 / M-fasene kan utledes when den røde fluorescens slår seg av. Følgende bilder er vist med en tidsskala presentert i D. (E) Representative bilder av kolonier (Neurosfærer) oppnådde 5 dager etter plating. Skala:. 10 mikrometer (C, D), 30 pm (E) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:.. Strategi for live analyser av cellesyklus ved hjelp FUCCI-Grønne mus (A) Skjematisk fremstilling av FUCCI-grønn celle syklus der cellene er grønne under SG 2 / M fase og fargeløs under G 1 fase 23 (B) FACS representasjon av FUCCI-grønn fluorescens: FUCCI Grønn-neg-celler representerer cellene i G 1 fasen av cellesyklusen, mens FUCCI-Green pos celler er celler i SG 2 / M 23. (C) For å følge den grønne fluorescerende SG 2 / M faser av Lex + EGFR + og EGFR + celler, SVZ cellene måtte være pre-sortert med separasjonskolonner. Celler ble merket med anti-mus-antistoff og lex lex + fraksjonen ble holdt tilbake på kolonnen ved hjelp av anti-mus-mikroperler (se protokoll 4.). Deretter lex + og lex - fraksjoner ble eluert og merket med EGF-Ax647 og CD24-PC7 antistoffer for FACS sortering (D) Video mikroskopi av Lex + EGFR + og EGFR + celler sortert fra ung FUCCI-Grønn mus tillater sporing av. SG 2 / M faser med grønn fluorescens. Følgende bilder er vist med en tidsskala presentert i D. Skala: 10 mm (D).
Discussion
Cellen sortering teknikken beskrevet her gir pålitelig diskriminering mellom hvil NSCs, aktiverte NSCs og deres avkom muliggjør studier av deres egenskaper og dynamikk i den voksne hjernen 9. Sammen med FUCCI teknologi som muliggjør visualisering av cellesyklusutvikling i levende celler 23, har vi utviklet en rask og effektiv teknikk for å følge G 1 og 2 SG / M-fasene av cellesyklusen fra unge voksne og eldre mus hjerneceller.
Den cellesortering teknikk som brukes i denne protokollen var det første validerte kombinasjon av markører som tillater rensing av de fem viktigste nevrogene populasjoner fra SVZ 9. Det var også den første validert teknikk muliggjør æren av hvilende og aktiverte NSCs. Det er bemerkelsesverdig at denne teknikken ikke krever anvendelse av transgene mus per se, noe som er nødvendig når det er tilpasset for å transgene musemodeller such som FUCCI. Siden da Gazzettino et al. 10 er brukt et GFAP-GFP / CD133 / EGFR trippel merking kombinasjon for å skille hvil NSCs fra deres aktiverte motstykke, men det kan ikke tilpasses til FUCCI teknologi da den krever bruk av GFAP-GFP transgene mus. Mich et al. 11 har utviklet en Glast / EGFR / CD24 trippel merking strategi som deler felles resultater med den teknikk som brukes i denne undersøkelsen 9. Faktisk en høy korrelasjon mellom Lex og Glast NSCs markører ble allerede observert i Daynac et al. Studere ni. Imidlertid er Glast antistoff som brukes i Mich et al., Teknikk koplet til fykoerytrin og kan derfor ikke tilpasses med bruk av FUCCI-røde mus.
Det er flere viktige tekniske punkter som krever oppmerksomhet før sortering SVZ celler. For det første er det meget viktig trinn dissosiasjon som hjernevevet har til å bli dissosiert til enkeltceller og samtidig bevare den strukturelle iintegriteten for proteinene som benyttes for merking av antistoffet strategi. 0,05% trypsin-EDTA har vist seg å være svært effektiv i dissociating SVZ vev 27 men lex antigen ble funnet å være svært følsom som nesten alle lex-FITC immunfluorescens var tapt (data ikke vist). Således, papain ble anvendt som det var mer effektiv og mindre ødeleggende enn andre proteaser i hjernevev. Videre ble verken lex eller EGFR heller CD24 påvirket av papain behandling. Det bør bemerkes at antistoffet Merkingen ble endret hvis papain behandling oversteg 15 min. Vi fikk optimale resultater med en 10 min papain behandling assosiert med en mekanisk dissosiasjon (pipette opp og ned 20 ganger).
De poly-D-lysin-belegg lar kultur av adherente celler og dannelsen av kolonier etter flere dager i kultur. Det er nå allment akseptert at in vitro-analyser kommer med sine begrensninger 28,29. Vi anbefaler å bestemme bare den første cellesyklusen forcellene som gjennomgår i det minste en etterfølgende divisjon å holde så nær som mulig til in vivo-celle-fenotype.
Det er bemerkelsesverdig å nevne at Geminin (grønn fluorescens) og Cdt1 (rød fluorescens) proteiner brukes til å designe den FUCCI system 23 ble tidligere vist seg å være klinkende uttrykt av nevrale stamceller under tidlig neurogenesis i mus 30 og i voksen hjerne vev 9,25 . Selv om mKO2-hCdt1 (30/120) konstruksjonen ble hovedsakelig brukt i denne studien å følge G1 fasen med rød fluorescens, bruk av både konstruerer [mKO2-hCdt1 (30/120) og MAG-hGem (1 ett hundre og tiendedel) ] kan forestilles for å tillate visualisering av de viktigste fasene i cellesyklus (G 1 og 2 SG / M), så vel som en G / S overgangen 23. Den største ulempen med dual-color bildebehandling er de begrensede kompatible sett med fluorescens som fortsatt kan brukes til cellen merking. En løsning er å bruke separatipå søyler. For eksempel har vi lykkes utarmet den CD24-positive brøkdel fra celler ved hjelp av separasjonskolonner før celle sortering og live-bildebehandling som vi brukte en CD24-PE antistoff som delte den samme utslipp bølgelengde enn FUCCI-Red fluorescens 25.
Få studier har undersøkt cellesykluslengden av voksne mus SVZ populasjoner. Det totale cellesykluslengde oppnås med vår teknikk ligger i nærheten av en estimert in vitro ved Costa et al. 21, men vi var i stand for første gang for å skille de forskjellige cellesyklusfaser. I en in vivo-undersøkelse, Ponti et al. 22 anvendes inkorporeringen av tymidin-analoger for å bestemme proliferasjons- dynamikken i ulike SVZ cellepopulasjoner. De kan imidlertid verken utføre en kontinuerlig kontroll av cellesyklus og heller ikke spor av cellene på enkeltcellenivå. Dette kan være et problem som det ble vist at en sterk heterogenitet finnes viddhin en gitt SVZ cellepopulasjon 22,25. Vi beskriver her et alternativ in vitro teknikk, enkel å sette opp, som gjør at levende avbildning av cellesyklus faser av forskjellige voksne nevrogene befolkninger i en enkeltcellenivå.
Forståelse av reguleringen av cellesyklusen av nevrale stamceller og progenitorer fortsatt en utfordring for utvikling av nye terapeutiske tilnærminger i forbindelse med aldring eller hjernesykdommer. Vår protokollen kan dermed ha et bredt spekter av applikasjoner. I sammenheng med aldring, kan denne teknikken også være nyttig for å forstå effekten av aldring på NSCs differensiering. Faktisk er det mulig å identifisere neuralstamceller / stamceller påbegynner differensiering som deres røde fluorescerende intensitet er tydelig høyere 26. Til slutt, kan det også være av interesse å utnytte den kontinuerlige levende avbildning på en encellet nivå for å studere celle indre og ytre prosesser som er ansvarlige for avstamning progression av voksne NSCs.
Acknowledgments
Vi står i gjeld til C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet og alle ansatte i dyre fasiliteter; til J Baijer og N Dechamps for celle sortering; O. Etienne for teknisk assistanse, og A. Gouret for henne administrativ bistand. Flowcytometri og cellesortering ble utført ved iRCM flowcytometrisystemer delt ressurs, etablert av utstyrsstipend fra DIM-Stem-pol, INSERM, Fondation ARC, og CEA. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd av Electricité de France (EDF). MD har et fellesskap fra La Ligue Contre le Kreft og LM fra Région Île-de-France (DIM Biothérapies). Marc-André Mouthon og François D. Boussin aksje co-senior forfatterskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
| µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
| NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
| Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
| EGF | Millipore | GF144 | |
| FGF-2 | Millipore | GF003 | |
| Papain | Worthington | LS003119 | |
| EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
| L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
| DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
| Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
| DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
| 20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
| Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
| BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
| CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
| CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
| Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
| Alexa647 - conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
| CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
| Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
| INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
| Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
| NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
| Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
| ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
| ImageJ | RBS | ||
| FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
| FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |
References
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97, 703-716 (1999).
- Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).
- Rietze, R. L., et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, 736-739 (2001).
- Fischer, J., et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone. Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).
- Daynac, M., et al. Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage. Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).
- Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82, 545-559 (2014).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
- Capela, A., Temple, S. LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal. Neuron. 35, 865-875 (2002).
- Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult. Neuroscience. 73, 581-594 (1996).
- Pineda, J. R., et al. Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain. EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).
- Lugert, S., et al. Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging. Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).
- Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice. Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).
- Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood. Neuroscience. 173, 135-149 (2011).
- Enwere, E., et al. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).
- Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).
- Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138, 1057-1068 (2011).
- Ponti, G., et al. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).
- Sakaue Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Daynac, M., et al. TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain. Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).
- Roccio, M., et al. Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns. Development. 140, 459-470 (2013).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Spella, M., et al. Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle. Neuroscience. 147, 373-387 (2007).
