Abstract
Neurale stamcellen (NSC's) in de subventriculaire zone van de laterale ventrikels (SVZ) sustain olfactorische neurogenese gehele leven in de hersenen van zoogdieren. Ze achtereenvolgens genereren transit versterken cellen (TAC's) en neuroblasts dat differentiëren in neuronen zodra ze integreren de olfactorische bollen. Opkomende fluorescent geactiveerde celsortering (FACS) technieken hebben toegestaan de isolatie van NSCs en hun nakomelingen en zijn begonnen om licht te werpen op gen-regulatorische netwerken in volwassen neurogene niches. Wij rapporteren hier celsortering techniek waarmee volgen en te onderscheiden van de celcyclus dynamiek van de bovengenoemde cel populaties van de volwassen SVZ een LeX / EGFR / CD24 triple kleuring. Geïsoleerde cellen worden vervolgens verzilverd als hechtende cellen te verkennen in Gegevens hun celcyclusprogressie door time-lapse video microscopie. Daarom gebruiken we transgene Fluorescence Ubiquitinering celcyclus Indicator (Fucci) muizen die cellen rood fluorescerend durinG G 1 fase te wijten aan een G 1 specifieke rood-CDT1 reporter. Deze methode heeft onlangs onthuld dat uitdijende NSCs geleidelijk verlengen hun G 1 fase tijdens het ouder worden, wat leidt tot neurogenese impairment. Deze methode gemakkelijk worden toegepast op andere systemen en van groot belang voor de studie van de celcyclus dynamiek van hersencellen in de context van de hersenen pathologieën kunnen zijn.
Introduction
Rustende neurale stamcellen (NSC's) zijn de bron voor volwassenen neurogenese 1 en om te zetten in hun proliferatieve "geactiveerde" vorm uiting van de EGFR (aNSCs) 2. Eenmaal geactiveerd, geven aanleiding tot transit versterken cellen (TAC's) 3 en vervolgens neuroblasts die migreren naar de olfactorische bollen (OB) door een buis van de astrocyten en uiteindelijk differentiëren tot neuronen 4,5. NSCs en hun nageslacht zijn georganiseerd in gespecialiseerde "niches" architecturen langs de laterale ventrikels, impliceert een groot aantal factoren die hun proliferatie 6. De isolatie en zuivering van SVZ neurogene cellen noodzakelijk om de complexe moleculaire regulatie van hun proliferatie te verlichten, maar een uitdaging lang zijn gebleven door het ontbreken van specifieke markers en aangepaste technieken.
Nieuwe benaderingen met behulp van flowcytometrie hebben mogelijk de isolatie van NSCs en Thei gerenderdr nageslacht van de volwassen SVZ 2,7-11. Met behulp van de stamcel marker LeX 12 samen met neuroblast marker CD24 13 en een fluorescentie EGF aan EGFR label op delende cellen 2, hebben we onlangs een FACS strategie waardoor de zuivering van vijf van de belangrijkste SVZ neurogene populaties: rustige en geactiveerd NSC, TAC's, onrijpe en migreren neuroblasts 9. Hier beschrijven we in detail deze celsortering techniek en hoe een LeX / EGFR / CD24 drievoudige kleuring toegestaan voor het eerst de isolatie van zowel rustende en geactiveerde NSC.
Hoewel neurogenese blijft tijdens de volwassenheid, wordt de productie van nieuwe neuronen drastisch verminderd bij ouder wordende hersenen 14. De meeste studies het eens over een geleidelijke vermindering van het aantal delende voorlopercellen in de SGZ en SVZ 15-20. De gevolgen zijn niet onschadelijk als leeftijdsgerelateerde afname van neurogenese in de SVZ veroorzaakt een vermindering van newborn neuronen in de olfactorische bollen van de oude hersenen, wat uiteindelijk leidt tot verslechtering van de olfactorische discriminatie in de leeftijd van 18 muizen. Ophelderen van de celcyclus kinetiek van neurale voorlopercellen is een belangrijke stap om de onderliggende mechanismen van de evolutie van de volwassen neurogenese tijdens veroudering te begrijpen. Recente studies hebben de celcyclus en lineage progressie van volwassen neurale stamcellen in vitro 21 en in vivo 22 maar geen van hen strafte celsorteertechnieken en genetisch gecodeerde fluorescent celcyclus probes de celcyclus fasen van geïsoleerde cellen zichtbaar op een enkele cel niveau.
Hier beschrijven we een protocol dat gebruik maakt van de transgene Fucci muizen welke cellen fluorescentie gedurende de celcyclus, waardoor het onderscheid tussen G 1 en 2 SG / M fasen 23. Dit protocol laat zien hoe potentiële isolatie van NSCs en hun nageslacht uit volwassen Fucci mice gecombineerd met time-lapse microscopie video maakt het onderzoek mogelijk van de celcyclus dynamiek één-celniveau.
Protocol
Dit protocol is ontworpen in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen Richtlijn van de Raad van 24 november heeft 1986 (86/609 / EEG) en goedgekeurd door onze dierenwelzijn institutionele comité (CETEA-CEA DSV IDF).
1. Basic Setup Voorafgaand aan cultuur en videomicroscopie
- Gebruik glazen bodem cultuur platen of μ-platen voor confocale microscopie video. Voor 1 - 5 x 10 3 cellen / putje, gebruikt 96-well platen en 24-putjes meer dan 5 x 10 3 cellen / putje.
- Ten minste één dag vóór het begin van het experiment, voor te bereiden steriele Poly-D-lysine (PDL) gecoate platen voor hechtende monolaag culturen. Voeg genoeg PDL (10 ug / ml in dH2O) het bekleden van de bodem van elk putje en incubeer O / N bij 37 ° C. Verwijder de PDL en spoel driemaal met dH 2 O alvorens de plaat te drogen in de kap gedurende tenminste 2 uur onder een laminaire stroming. Indien niet onmiddellijk gebruikt, slaan de gecoate plaat bij-20 ° C.
- Bereid kweekmedium door menging NSC basismedium en NSC Proliferatie Supplement op een 9: 1 verhouding (zie Material tabel) samen met 2 ug / ml heparine, 20 ng / ml gezuiverd humaan recombinant epidermale groeifactor (EGF), en 10 ng / ml menselijke recombinant fibroblast groeifactor 2 (FGF-2). Warm het cultuurmedium tot 37 ° C in een waterbad vóór gebruik.
- Voor de SVZ dissociatie bereiden papaïne oplossing: 1 mg / ml papaïne (15 UI / ml) in Earl's Balance Salt Solution (EBSS) bevat 0,2 mg / ml L-cysteïne, 0,2 mg / ml EDTA en 0,01 mg / ml DNase I in PBS. Steriliseer de oplossing door het passeren door een 0,2 um filter. Equilibreer de oplossing bij 37 ° C vóór gebruik.
- Om de enzymatische reactie te stoppen, stelt een oplossing proteaseremmer (ovomucoïde): DMEM: F12 medium dat 0,7 mg / ml trypsine remmer type II. Filtreer de oplossing met behulp van een 0,2 urn filter.
- Bereid PBS 0,6% glucoseoplossing naar de hersenen en PBS 0,15% BSA s verzamelenPLOSSING voor wasstappen en antilichaamkleuring.
- Bereid dissectie instrumenten: schaar, ontleden en koppelverkoop pincet, scalpel. Week ze in 70% ethanol.
2. Het oogsten van Adult Mouse Brains en SVZ Microdissections
- Offer volwassen Fucci muizen 23 (2 tot 3 maanden oud en / of 12-maanden oude voor aging studies) uitvoeren van een cervicale dislocatie in overeenstemming met de toepasselijke institutionele richtlijnen.
- Spuit de muis met behulp van 70% ethanol en snijd het hoofd af met een scherpe schaar.
- Maak een insnijding langs de hoofdhuid aan de schedel te onthullen.
- Voer een overlangse middellijn snede begint bij de basis van de schedel naar de olfactorische lampen met een kleine schaar. Zorg ervoor dat u voorkomen dat schade aan de onderliggende hersenen met de schaar messen. Verwijder de bovenste open gedeelte van de schedel met gebogen pincet naar de hersenen bloot.
- Verzamel de hersenen in een 15 mm petrischaal die 0,6% glucose in PBS.
- Dissect de olfactorische bollen weg. Plaats de hersenen op de rugzijde en een coronale doorsnede door de optische chiasma met behulp van een scalpel.
- Onder een microscoop ontleden, de positie van de rostrale deel van de sectie hersenen met de gesneden coronale oppervlak naar boven in de richting van de experimentator.
- Om de SVZ ontleden, verwijder het septum met een fijn gebogen pincet steek dan een tip van een fijne tang in het striatum direct grenzend aan het ventrikel en maak de SVZ van het omringende weefsel. Voor meer informatie, zie Azari et al. 24. Plaats de SVZ ontleed in een petrischaaltje met 1 ml PBS-0,6% glucose.
3. SVZ Tissue Dissociatie
- Hak de ontleed SVZ in de petrischaal totdat er geen grote stukken blijven.
- Overdracht gehakt weefsel samen met PBS-0,6% glucose tot een 15 ml buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en voeg 1 ml voorverwarmde papaïne (1mg / ml, bereid in stap 1,4) aangevuld met 0,01 mg / ml DNase I gedurende 10 min in een waterbad bij 37 ° C. Gebruik 1 ml papaïne per muis.
- Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof.
- Voeg 1 ml voorverwarmde ovomucoïde (0,7 mg / ml, bereid in stap 1,5) om papaïne te beëindigen. Mechanisch verder distantiëren het gehakt weefsel in een single-cell suspensie door zachtjes en neer te pipetteren 20 keer via een P1000 micropipet tip. Vermijd luchtbellen.
- Leid de celsuspensie door een steriele 20 urn filter in een nieuwe 15 ml buis. Zorg ervoor dat de cel filter met PBS 0,15% BSA wassen om te voorkomen dat cellen.
- Centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min en de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de cellen in 100 pl PBS met 0,15% BSA.
4. immunofluorescentiekleuring voor celsortering
Voor celsortering met Fucci-Rode muizen (Figuur 2A), gebruikt u de volgendeantilichamen: CD24 fyco-cyanine7 conjugaat [PC7]; CD15 / LeX fluoresceïneisothiocyanaat [FITC] geconjugeerd en Ax647 geconjugeerde EGF ligand.
Opmerking: LeX + EGFR + cellen en EGFR + cellen zijn niet overvloedig in de volwassen SVZ: ≈ 600 en 1500 cellen / muis respectievelijk 9. We raden aan het bundelen van SVZ cellen 2-3 muizen om genoeg materiaal te hebben. Niet met meer dan 12 muizen op dezelfde dag, zodat de celsortering niet langer duren dan 3 uur. Houd in gedachten dat het werken met te veel muizen op dezelfde dag zal leiden tot een verhoogde celsortering duur mogelijk resulterend in een verhoogde celdood en / of celdifferentiatie.
- Voer de FACS kleuring in 100 pl PBS 0,15% BSA per muis (of 200 ul voor een groep van 2-3 muizen voor optimale kleuring).
- Bereid de controle buizen. Gebruik compensatie kralen enkele kleur controle buizen voor te bereiden volgens de fabrikant9; s protocol. Selecteer een fractie van cellen (1/10 van de cellen geëxtraheerd uit één muis is voldoende) en scheiden in 4 buizen 1 negatieve controle buis (alleen cellen) en fluorescentie 3 min één (FMO) controlebuizen bereiden. Resuspendeer de cellen in 200 pl PBS 0,15% BSA per buis.
Hint: Lex-FITC FMO controle, het etiket van de cellen met CD24-PC7 (01:50) en Ax647-geconjugeerde EGF ligand (1: 200); voor CD24-PC7 FMO controle, het etiket van de cellen met CD15 / LeX-FITC (01:50) en Ax647-geconjugeerde EGF ligand (1: 200) en voor Ax647 geconjugeerde EGF ligand FMO controle, het etiket van de cellen met CD15 / Lexmark FITC (01:50) en CD24-PC7 (01:50). - Voor de buizen gebruikt voor het sorteren van cellen, gebruikt u de volgende antilichamen op de aangegeven verdunning in PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (01:50), CD15 / LeX-FITC (01:50) en Ax647-geconjugeerde EGF ligand (1: 200).
- Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker. Wassen met 1 ml PBS 0,15% BSA en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min. Resuspendeer de cellen in 20081; l PBS 0,15% BSA per hersenen. Houd de cel sortering buizen op ijs en onmiddellijk naar de cel sorteren.
- Bij gebruik van Fucci-Green muizen, aparte LeX-positieve en LeX-negatieve fracties met scheidingskolommen voordat celsortering als lex-FITC antilichaam deelt dezelfde emissie golflengte dan de Fucci-groene fluorescentie (figuur 3A, B).
- Ten eerste etiket de cellen met een muis anti-humaan LeX antilichaam (1:50) gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker in 100 pl PBS 0,15% BSA.
- Was de cellen met 1 ml PBS 0,15% BSA en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min, vervolgens etiket de cellen met anti-muis IgM microkorrels (01:10) gedurende 15 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Was de cellen met 1 ml PBS 0,15% BSA en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 min. Resuspendeer de cellen in 500 pi PBS 0,15% BSA en giet de cellen door scheidingskolom in het magnetisch veld zoals schematisch in figuur 3C. Was de kolom met 1 ml PBS 0,15% BSA Lex negatieve fractie te verkrijgen.
- Lex-positieve fractie te verkrijgen, verwijder de scheidingskolom vanuit het magnetische veld en elueer de cellen met 2 ml PBS 0,15% BSA.
- Ga verder met CD24-PC7 en Ax647 geconjugeerde EGF ligand vlekken zoals aangegeven in 4.2.
5. Cell Sorting
Opmerking: De cellen werden gesorteerd op een FACS sorter 40 Psi met een 86 micrometer noozle. Fluorescentie werd verzameld met behulp van de volgende filter set: 520/35 nm (FITC), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) en 740LP (PC7). Compensatie is nodig om vals-positieve signalen te voorkomen als een overlap is gevonden tussen de emissie spectra van de Fucci-rode fluorescentie en de PC7 kleurstof.
- Onmiddellijk voorafgaand aan celsortering, voeg een vitale kleurstof voor levende onderscheiden van dode cellen. We gebruikten HO (zie materiaal tabel) in een 2 ug / ml uiteindelijke concentratie. Voer de negatieve controle buis (ongemerkte cellen) door de FACS sorter en selecteer the cellen met behulp van zijwaartse verstrooiing (SSC) en voorwaartse verstrooiing (FSC) parameters (Figuur 1A).
OPMERKING: Dode cellen werden uitgesloten door het poorten alleen HO-negatieve fractie (Figuur 1A) en vervolgens werden doubletten uitgesloten door het selecteren van de Pulse Width negatieve fractie (Figuur 1A ''). - Voer de enkele kleur controles bereid in stap 4.2 en pas de fotomultiplicatorbuis (PMT) spanningen indien nodig (dwz negatieve bevolking te hoog en / of positieve cellen uit schaal). Voeren kleurcompensatie in de vergoeding raam van de software.
- Run FMO controleert bereid in stap 4.2 (LEX-FITC FMO controle, CD24-PC7 FMO controle en Ax647 geconjugeerde EGF ligand FMO controle) en trek de sortering poorten (figuur 1). Sorteer de cellen direct in 100 ul kweekmedium in 1,5 ml microbuisjes.
6. Bereiding van Cellen voor Microscopie
- Plate de vers naargelang cels bij een dichtheid van 1 - 3 x 10 3 cellen / putje op met poly-D-lysine beklede 96 putjes μ-plaat met 300 pl kweekmedium.
- Vóór videomicroscopie Incubeer kweekplaten bij de 37 ° C en 5% CO2 gedurende ten minste 1 uur tot celadhesie laten.
7. Microscoop Setup en Image Acquisition
- Live beeldvorming met behulp van een Plan Apo VC DIC 20x objectief (NA: 0,75) op een confocale laser scanning microscoop systeem verbonden met een omgekeerde thermostaatregeling kamer bij 37 ° C onder 5% CO2 atmosfeer.
- Plaats de 96-well μ-plaat in de voorverwarmde en in evenwicht thermostaat is ruimte en plaats de deksel door een thermostaat deksel.
- Open de NOS-Elements software en klik in de menubalk op 'Acquire / Acquisition regelt / ND overname "om de opties van de time-lapse (lengte, podium posities, confocale z-profielen, ...)," Ophalen / Acquisition controles selecteren / Ti Pad221; om de doelstellingen te selecteren en "Acquire / Acquisition controles / A1plus Settings" om het PMT voor elk fluorescentie in de menubalk te selecteren. Selecteer een map om de data bestanden op te slaan.
- Met behulp van de ND overname venster, stelt het midden van elk putje als podium positie en selecteer de grote afbeelding optie om 7 x 7 mm². Dit mozaïekbeeld rond het centrum van elk putje te creëren. Stel de overlap voor de grote afbeelding mozaïek tot 5%. Foto's nemen elke 20 minuten gedurende 24 uur. Selecteer het Plan Apo VC 20x DIC objectief (NA: 0,75) in het venster Ti Pad.
- In het venster Instellingen A1plus verwerven beelden met hoge snelheid resonante scanner op een 512 x 512 pixels formaat met een resolutie van 1,26 micrometer / pixel. Gebruik helderveld naar cel vormen visualiseren. Bij Fucci-Red muizen prikkelen rode fluorescentie bij 561 nm en laat met behulp van een 595/50 nm filter. Bij Fucci-Green muizen prikkelen groene fluorescentie bij 488 nm en laat met behulp van een 530/40 nm filter. Bepaal de optimale PMT level, offset en laservermogen voor elke golflengte.
OPMERKING: Wij raden het gebruik van de autofocus functie voor de helderveld kanaal om de software naar automatische scherpstelling in elke fase positie voor elke overname. Hint: Een Plan Apo VC DIC 20x objectief (NA: 0,75) werd gebruikt om de uitstekende resolutie zonder olie. Andere doelstellingen kunnen worden gebruikt afhankelijk van de gewenste optische resolutie. - Selecteer het 'nu Run "knop op de ND overname venster om acquisitie te beginnen.
Hint: Volg de computer werken voor 1 lus om zeker te zijn dat alles in goed werkt.
8. beeldverwerking en analyse
- Analyseer de gegevens rechtstreeks op de NOS-Elements software door het bijhouden van de cellen individueel. Tip: om tijd te winnen, bespaart elke positie in .avi-formaat met behulp van NOS-Elements software en analyseren van de films met ImageJ.
- In ImageJ software, volgen individuele cellen ondergaan ten minste 2 divisies (dwz één celeen vier-cel kolonie). Bijsnijden een klein gebied rond de cel en selecteer 'Afbeelding / Duplicate'.
- Selecteer 'Beeld / Stacks / Maak Montage' in de menubalk om een montage te maken. Geef de frames worden opgenomen, de grootte van de afbeeldingen en sla de montage als een .tif-bestand voor optimale resolutie.
- Om de eerste SG 2 / M faselengte (figuur 2C, D) te berekenen, selecteer een enkele rode fluorescerende cellen (in G 1) en stelt t = 0 (S-fase begint zodra de rode fluorescentie uitgeschakeld). Tel het aantal frames totdat de cel deelt de SG 2 / M lengte schatten.
OPMERKING: De berekende tijd is afhankelijk van het tijdsinterval tussen elke frame. - De volgende G1 fase (figuur 2C, D) te berekenen, blijft de cel die gewoon verdeeld volgen. Als de verdeelde cel binnenkomt G1 fase zal een accumulatie van CDT1 rood fluorescerend eiwit. Bereken het aantal frames tot rood-fluorescentie schakelt agaVoor elke cel.
Hint: Begin G 1 de rode fluorescentie zwak kunnen zijn dus kies het begin van de G 1 fase van het frame waar de cel onderverdeeld om benaderingen te voorkomen.
Representative Results
De mogelijkheid om op betrouwbare wijze onderscheid te maken tussen de verschillende celpopulaties van de volwassen muis SVZ stamcel lineage is primordiaal om hun functionele eigenschappen te onderzoeken. Daartoe hebben we een lex / EGFR / CD24 triple-labeling strategie waardoor de zuivering van specifieke celpopulaties van de volwassen SVZ ontwikkeld: rustig NSC (LeX helder), geactiveerde NSC (LEX + EGFR +), TAC (EGFR +) onvolgroeide en migreren neuroblasts (CD24 + EGFR + en CD24 +, respectievelijk) 9 (figuur 1). Toegepast op Fucci transgene muizen, de celsortering techniek kan de levende beeldvorming van de celcyclus fasen van de verschillende populaties neurogene de single-cell level 25. Fucci-Red muizen werden gebruikt voor de G 1 fase met rode fluorescentie met behulp van time-lapse microscopie video (figuur 2A) volgen. Fucci-Rode neg cellen vertegenwoordigen de cellen in de S-G2 / M fasen van de celcyclus, Fucci-Red pos cellen G 1 cellen en Fucci-rode heldere cellen zijn cellen verlaten of niet in de celcyclus (Figuur 2B) 23,26. LeX + EGFR + en EGFR + cellen van de jonge volwassene (figuur 2C) en middelbare leeftijd muizen (figuur 2D) werden uitgezet als hechtende cellen op poly-D-lysine gecoate kweekplaten. De eerste SG 2 / M fase werd geïdentificeerd op enkele cellen zodra de rode fluorescentie uitgeschakeld totdat de cel deelt. Zoals eerder opgemerkt de SG 2 / M-fase lengte vertoonde geen verschil tussen LeX + EGFR + en EGFR + cellen, zowel in jonge en middelbare leeftijd muizen. Dan berekend we de volgende G 1 fase lengte van de eerste divisie tot de rode fluorescentie uitgeschakeld. Interessant, werd een G 1 fase verlenging gevonden tijdens veroudering in LeX + EGFR + cellen, maar nietin EGFR + cellen 25 (figuur 2C, D). Bijgevolg neurosferen verkregen 5 dagen na uitplaten kleiner zijn LeX + EGFR + cellen verkregen van oudere muizen zoals in figuur 2E.
Fucci-Green muizen kunnen ook worden gebruikt voor het visualiseren SG 2 / M-fase met groene fluorescentie (figuur 3A, B) maar cellen worden voorgesorteerd behulp separatiekolommen als LeX-FITC antilichaam deelden dezelfde emissiegolflengte dan FUCCI- groene fluorescentie (Figuur 3C). Een voorbeeld van Fucci-groene fluorescentie van de eerste SG 2 / M-fase van jonge volwassen LeX + + EGFR en EGFR + cellen is getoond in figuur 3D.
Figuur 1:. Strategie van celselectie door FACS (A) De cellen werden eerst geselecteerd op terfgenaam morfologie met zijwaartse verstrooiing (SSC) versus voorwaartse verstrooiing (FSC) parameters. Voor meer informatie over de morfologie poort selectie, zie Daynac et al. 9 (A ') Dode cellen werden gelabeld met behulp van HO marker en uitgesloten van de selectie. (A' ') Doublets werden uitgesloten met behulp van pulse width parameter. Met het oog op het opzetten van de sortering poorten, Fluorescentie min één (FMO) controles voor CD24-PC7 (LEX-FITC / Fucci-Rood / EGF-Ax647 labeling, B) en LeX-FITC (Fucci-Rood / EGF-Ax647 / CD24 -PC7 labeling; B ') werden gebruikt (C, C'.) Vervolgens sorteerden gates bepaald LeX-FITC / Fucci-rood / EGF-Ax647 / CD24-PC7 gelabelde buizen met FMO controles. De gemiddelde percentages van de totale cellen vertegenwoordigd binnen de poorten. Als de selectie van CD24 + cellen (neuroblasts), wees voorzichtig aan CD24 helder uitdrukken cellen uit te sluiten van de poort. Inderdaad, CD24 heldere overeen met ependymale cells 2,9. C 'staat voor de CD24 negatieve cellen (zwart vierkant in C). Slechts LeX + + EGFR en EGFR + (C) sortering poorten werden gebruikt voor deze studie.
Figuur 2: Live-analyses van de celcyclus met Fucci-Rode muizen (A) Schematische weergave van Fucci-Rode celcyclus waar de cellen zijn rood-fluorescerende tijdens de G1 fase en kleurloos tijdens SG 2 / M fasen 23 (B) FACS voorstelling van.. Fucci-Rode fluorescentie op SVZ cellen. (C, D) Video microscopie bij Lex + EGFR + en EGFR + cellen gesorteerd van jonge (C) en middelbare leeftijd (D) Fucci-Rode muizen maakt het volgen van de G 1 fase rode fluorescentie terwijl de SG 2 / M fasen kan worden afgeleid when de rode fluorescentie uitgeschakeld. Opeenvolgende beelden worden getoond met een tijdschaal die in D. (E) Representatieve beelden van de kolonies (neurospheres) verkregen 5 dagen na plating. Schaal bar:. 10 micrometer (C, D), 30 urn (E) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:.. Strategie voor live-analyses van de celcyclus met Fucci-Green muizen (A) Schematische weergave van Fucci-Green celcyclus waar de cellen zijn groen tijdens SG 2 / M fase en kleurloos tijdens G 1 fase 23 (B) FACS vertegenwoordiging van Fucci-groene fluorescentie: Fucci-Green neg cellen zijn de cellen in G1 fase van de celcyclus tijdens Fucci-Green pos zijn cellen in SG 2 / M 23. (C) Om de groen fluorescerende SG volgen 2 / M fasen van LeX + EGFR + en EGFR + cellen SVZ cellen moesten worden voorgesorteerd met scheidingskolommen. De cellen werden gemerkt met anti-muis antilichaam en LeX LeX + fractie werd de kolom met anti-muis microbolletjes behouden (zie protocol 4). Dan Lex + en LeX - fracties werden geëlueerd en gelabeld met EGF-Ax647 en CD24-PC7 antilichamen voor FACS sortering (D) Video microscopie van LeX + EGFR + en EGFR + cellen gesorteerd van jonge Fucci-Green muizen maakt het volgen van. de SG 2 / M fasen met groene fluorescentie. Opeenvolgende beelden worden getoond met een tijdschaal die in D. Schaal bar: 10 micrometer (D).
Discussion
De celsortering techniek hierin beschreven maakt betrouwbaar onderscheid tussen latente NSC, geactiveerd NSCs en hun nageslacht waardoor studies hun eigenschappen en dynamiek in de volwassen hersenen 9. In combinatie met de Fucci technologie die de visualisatie van de celcyclus in levende cellen 23 toestaat, ontwikkelden we een snelle en doeltreffende techniek om de G 1 en 2 SG / M fasen van de celcyclus voort uit jong volwassen muis hersencellen leeftijd.
De celsortering techniek die in dit protocol was het eerste gevalideerde combinatie van merkers waardoor de zuivering van de vijf neurogene populaties van de SVZ 9. Het was ook de eerste gevalideerde techniek waardoor het onderscheid van rustende en geactiveerde NSC. Het is opmerkelijk dat deze techniek het gebruik van transgene muizen per se, die nodig is wanneer aangepast om transgene muismodellen su niet vereistch als Fucci. Sindsdien zijn Codega et al. 10 een GFAP-GFP / CD133 / EGFR triple labeling combinatie gebruikt om zwakke NSCs onderscheiden van hun geactiveerde tegenhanger maar kan niet worden aangepast aan Fucci technologie, en vereist het gebruik van GFAP-GFP transgene muizen. Mich et al. 11 hebben GLAST / EGFR / CD24 triple labeling strategie die gemeenschappelijk resultaten met de techniek uit deze studie 9 deelt ontwikkeld. Er werd een sterke correlatie tussen LeX en GLAST NSC markers reeds in Daynac et al. Studie 9. Echter, de GLAST antilichaam dat bij de Mich et al. Techniek gekoppeld aan fycoerythrine en kan dus niet worden aangepast met gebruik van Fucci-Red muizen.
Er zijn een aantal belangrijke technische punten die aandacht vragen voor het sorteren van SVZ cellen. Ten eerste, de dissociatie stap is zeer belangrijk omdat het hersenweefsel te worden gedissocieerd in enkele cellen met behoud van de structureleTegrity van de eiwitten die voor de antilichaam labeling strategie. 0,05% trypsine-EDTA is zeer effectief gebleken in het dissociëren SVZ weefsel 27 maar LeX antigen bleek zeer gevoelig aangezien bijna alle LeX-FITC immunofluorescentie werd verloren (data niet getoond) te zijn. Aldus werd papaïne als het efficiënter en minder destructief dan andere proteasen op hersenweefsel. Bovendien, noch LeX noch EGFR noch CD24 werden beïnvloed door papaïne behandeling. Opgemerkt wordt dat het antilichaam labeling werd gewijzigd wanneer de papaïne behandeling overschreed 15 min. We kregen een optimaal resultaat met een 10 min papaïne behandeling geassocieerd met een mechanische dissociatie (pipet op en neer 20 keer).
De poly-D-lysine coating geeft kweek van hechtende cellen en de vorming van kolonies na enkele dagen in kweek. Het wordt nu algemeen aanvaard dat in vitro assays geleverd met hun beperkingen 28,29. We raden aan het bepalen van alleen de eerste celcyclus voorde cellen die ten minste een volgend divisie zo dicht mogelijk bij de in vivo cel fenotype blijven.
Het is vermeldenswaard dat de Geminin (groene fluorescentie) en CDT1 (rode fluorescentie) proteïnen gebruikt voor het Fucci systeem 23 zijn eerder aangetoond overvloedig tot expressie worden gebracht door neurale voorlopercellen gedurende de vroege neurogenese in muizen 30 en volwassen hersenweefsel 9,25 ontwerpen . Hoewel de mKO2-hCdt1 (30/120) construct voornamelijk gebruikt in dit onderzoek naar de G1 fase rode fluorescentie volgen, het gebruik van beide constructen [mKO2-hCdt1 (30/120) en MAG-hGem (1/110) ] kan overwogen worden om de visualisatie van de belangrijkste fasen van de celcyclus (G 1 en SG 2 / M) en de G1 / S overgang 23 toestaan. Het belangrijkste nadeel van de dubbele-kleurenkit is de beperkte compatibel reeksen fluorescentie die nog kunnen worden gebruikt voor de cel labeling. Een oplossing is om separati gebruikenop kolommen. Zo hebben we met succes uitgeput het CD24-positieve fractie uit cellen gebruiken separatiekolommen voor celsortering en live-beeldvorming als we een CD24-PE antilichaam dat dezelfde emissiegolflengte dan Fucci-rode fluorescentie 25 gemeenschappelijk gebruikt.
Weinig studies hebben de lengte van de celcyclus van de volwassen muis SVZ populatie onderzocht. De totale lengte van de celcyclus verkrijgbaar onze techniek lijken op de in vitro geschat door Costa et al. 21, maar we konden voor het eerst de verschillende fasen van de celcyclus te onderscheiden. In een in vivo studie Ponti et al. 22 gebruikt de opname van thymidine analogen de proliferatie dynamiek van de verschillende SVZ celpopulaties te bepalen. Echter, konden ze niet uitvoeren van een continue monitoring van de celcyclus noch volgen de cellen op de single-cell niveau. Dit kan een probleem zijn als het werd aangetoond dat een sterke heterogeniteit bestaat within een gegeven SVZ celpopulatie 22,25. We beschrijven hier een alternatieve in vitro-techniek, eenvoudig in te stellen, dat de live-imaging van de celcyclus fasen van verschillende volwassen neurogene bevolking maakt op een single-cell niveau.
Het begrijpen van de regulering van de celcyclus van neurale stamcellen en voorlopers blijft een uitdaging voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen in verband met veroudering of de hersenen pathologieën. Ons protocol kan dus een groot aantal toepassingen. In de context van veroudering, kan deze techniek ook nuttig zijn om de effecten van veroudering op NSC differentiatie begrijpen. Inderdaad is het mogelijk om neurale stamcellen / voorlopercellen differentiatie invoeren identificeren als de rode fluorescentie-intensiteit is duidelijk hoger 26. Tenslotte kan het ook van belang zijn voor de continue live-imaging op een single-cell niveau te benutten om de cel intrinsieke en extrinsieke processen die verantwoordelijk zijn voor de lijn pro bestuderenprogressie van volwassen NSC.
Acknowledgments
We zijn dank verschuldigd aan C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet en alle medewerkers van dierlijke faciliteiten; J Baijer en N Dechamps voor celsortering; O. Etienne voor technische bijstand, en A. Gouret voor haar administratieve bijstand. Flowcytometrie en celsortering werden uitgevoerd bij de IRCM Flowcytometrie Shared Resource uitgevoerd, opgericht door subsidies apparatuur van DIM-Stem-Pôle, INSERM, Fondation ARC en CEA. Dit werk werd ondersteund door subsidies van Electricité de France (EDF). MD heeft een beurs van La Ligue Contre le Cancer en LM van de regio Ile-de-France (DIM Biotherapies). Marc-André Mouthon en François D. BOUSSIN aandeel senior co-auteurschap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
| µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
| NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
| Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
| EGF | Millipore | GF144 | |
| FGF-2 | Millipore | GF003 | |
| Papain | Worthington | LS003119 | |
| EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
| L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
| DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
| Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
| DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
| 20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
| Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
| BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
| CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
| CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
| Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
| Alexa647 - conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
| CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
| Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
| INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
| Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
| NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
| Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
| ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
| ImageJ | RBS | ||
| FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
| FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |
References
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97, 703-716 (1999).
- Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).
- Rietze, R. L., et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, 736-739 (2001).
- Fischer, J., et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone. Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).
- Daynac, M., et al. Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage. Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).
- Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82, 545-559 (2014).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
- Capela, A., Temple, S. LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal. Neuron. 35, 865-875 (2002).
- Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult. Neuroscience. 73, 581-594 (1996).
- Pineda, J. R., et al. Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain. EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).
- Lugert, S., et al. Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging. Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).
- Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice. Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).
- Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood. Neuroscience. 173, 135-149 (2011).
- Enwere, E., et al. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).
- Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).
- Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138, 1057-1068 (2011).
- Ponti, G., et al. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).
- Sakaue Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Daynac, M., et al. TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain. Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).
- Roccio, M., et al. Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns. Development. 140, 459-470 (2013).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Spella, M., et al. Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle. Neuroscience. 147, 373-387 (2007).
