Abstract
Нервные стволовые клетки (НСК) в субвентрикулярной зоны боковых желудочков (SVZ) выдержать обонятельный нейрогенез в течение всей жизни в мозге млекопитающих. Они последовательно генерировать транзитные делящиеся клетки (ПВР) и нейробласты, что дифференцируются в нейроны, как только они интегрировать обонятельных луковиц. Новые флуоресцентные активированный сортировки клеток методы (FACS) позволили изоляции НСК, а также их потомство и начали пролить свет на генных регуляторных сетей у взрослых нейрогенные ниш. Мы сообщаем здесь технику сортировки клеток, что позволяет следить и различать динамику клеточного цикла вышеупомянутых клеточных популяций от взрослой СВЗ с / EGFR / CD24 тройной окрашивания LeX. Изолированные клетки затем помещали в прилипшие клетки, чтобы исследовать в подробности их прогрессирование клеточного цикла по покадровой видео микроскопии. Для этого мы используем трансгенных флуоресценции Убиквитинирование Индикатор клеточного цикла (Fucci) мышей, у которых клетки красного флуоресцентного Дуринг G 1 фаза в связи с конкретной G 1 красно-Cdt1 репортера. Этот метод в последнее время выяснилось, что пролиферирующие НСК постепенно удлиняют их G 1 фазу во время старения, что приводит к нейрогенез обесценения. Этот метод легко распространить на другие системы и может представлять большой интерес для изучения динамики клеточного цикла клеток головного мозга в контексте патологий головного мозга.
Introduction
Покоя нервные стволовые клетки (НСК) являются источником взрослого нейрогенеза 1 и может конвертировать их в пролиферации "активируется" форму, выражающего EGFR (aNSCs) 2. После активации, они порождают переходные делящиеся клетки (ПВР) 3, а затем нейробластов, которые мигрируют к обонятельной луковицы (ОВ) через трубку астроцитов и, наконец, дифференцируются в нейроны 4,5. НСК и их потомство организованы в специализированных «нишах» архитектур вдоль боковых желудочков, вовлекая множество факторов, контролирующих их пролиферацию 6. Выделение и очистка SVZ нейрогенных клеток необходимо осветить сложную молекулярную регулирование их пролиферации, но остается проблемой в течение длительного времени из-за отсутствия специфических маркеров и адаптированных методик.
Новые подходы, использующие проточной цитометрии оказали можно изоляцию НСК и Theiг потомство от взрослых SVZ 2,7-11. Использование стволовых клеток маркер Лекс 12 вместе с нейробласта маркера CD24 13 и флуоресценции EGF маркировать EGFR на пролиферирующие клетки 2, мы недавно разработали стратегию FACS, позволяющий очистку пяти основных СВЗ нейрогенных населения: в состоянии покоя и активированного НСК, ПВР, незрелые, а также мигрирующие нейробласты 9. Здесь мы опишем в деталях эту ячейку технику сортировки и как LeX / EGFR / CD24 тройной окрашивание позволило впервые изоляция обоих покоя и активированные НСК.
Несмотря на то, нейрогенез сохраняется во взрослом возрасте, производство новых нейронов резко сократилось в стареющем мозге 14. Большинство исследований согласовать постепенного уменьшения числа пролиферирующих клеток-предшественников в SVZ SGZ и 15-20. Последствия не безобидно, как возрастное снижение нейрогенеза в СВЗ провоцирует уменьшение пewborn нейронов в обонятельных луковиц в возрасте мозга, в конечном итоге приводит к нарушению в обонятельной дискриминации в возрасте мышей 18. Выяснение клеточного цикла кинетики нейронных клеток-предшественников является ключевым шагом, чтобы понять механизмы, лежащие в развитие взрослого нейрогенеза в процессе старения. Недавние исследования исследовали клеточный цикл и развитие клонов взрослых нервных стволовых клеток в пробирке 21 и в естественных условиях 22, но ни один из них не воспользовался методов сортировки клеток и генетически кодируемых флуоресцентных зондов клеточного цикла для визуализации фаз клеточного цикла изолированных клеток на уровне одной клетки.
Здесь мы опишем протокол, который использует трансгенных мышей Fucci, в котором клетки флуоресцентные во время их клеточного цикла, что позволяет различать G 1 и 2 SG / M фазах 23. Этот протокол показывает, как перспективный изоляции НСК и их потомства от взрослого Fucci миCE в сочетании с покадровой видео микроскопии позволяет исследовать динамику клеточного цикла на уровне одной клетки.
Protocol
Этот протокол был разработан в соответствии с Директивой Совета Европейских Сообществ от 24 ноября 1986 г. (86/609 / ЕЕС) и была одобрена нашего благосостояния животных институциональной комитета (CETEA-ЦЭА ДСВ IDF).
1. Основные настройки Перед культуры и видеомикроскопии
- Используйте стеклянным дном культуры пластин или мю-пластины для конфокальной микроскопии видео. Для 1 - 5 х 10 3 клеток / лунку, используют 96-луночные планшеты и 24-луночных планшетах в течение более чем 5 х 10 3 клеток / лунку.
- По крайней мере, один день до начала эксперимента, подготовить стерильный Поли-Д-лизина (PDL), покрытые пластины для адгезивных культур монослойных. Добавьте достаточно PDL (10 мкг / мл в dH2O), чтобы покрыть дно каждой лунки и инкубируют O / N при 37 ° С. Удалить решение PDL и промыть три раза дН 2 O, прежде чем разрешить пластина сушить в капюшоне в течение, по крайней мере 2 ч в ламинарном потоке. Если не используют сразу, хранить планшетов, покрытых по крайней-20 ° С.
- Подготовка культуральной среды путем смешивания НСК базальной среды и НСК оружия Supplement в соотношении 9: 1 соотношение (смотри таблицу материал) вместе с 2 мкг / мл гепарина, 20 нг / мл очищенного человеческого фактора рекомбинантный эпидермальный ростовой (EGF), и 10 нг / мл Рекомбинантный человеческий фактор роста фибробластов 2 (FGF-2). Нагреть культуральной среде до 37 ° С на водяной бане перед использованием.
- Для SVZ диссоциации, подготовки папаин решение: 1 мг / мл папаин (15 МЕ / мл) в равновесии солевом растворе Эрла (EBSS), содержащего 0,2 мг / мл L-цистеин, 0,2 мг / мл EDTA и 0,01 мг / мл ДНКазы I в PBS. Стерилизацию раствора пропусканием через фильтр 0,2 мкм. Равновесие раствора при 37 ° С перед использованием.
- Чтобы остановить ферментативной реакции, подготовить решение ингибитор протеазы (Овомукоид): DMEM: F12, содержащей 0,7 средний мг / мл ингибитор трипсина типа II. Фильтр решение, используя 0,2 мкм фильтр.
- Подготовка PBS 0,6% раствор глюкозы, чтобы собрать мозги и PBS 0,15% БСА ыеспособность по для стадий промывки и окрашивания антител.
- Подготовка рассечение инструменты: ножницы, рассекая и связывая щипцы, скальпель. Замочите их в 70% этанола.
2. Заготовка взрослых мышей Мозги и СВЗ Microdissections
- Жертва взрослых мышей Fucci 23 (от 2 до 3-месячного и / или 12-месячный старения исследований) выполнение шейки дислокации в соответствии с соответствующими институциональными руководящих принципов.
- Спрей мыши, используя 70% этанола и отрезать голову, используя острые ножницы.
- Сделайте надрез вдоль головы, чтобы показать череп.
- Выполнение продольного разреза по средней линии, начиная у основания черепа к обонятельной луковицы с помощью небольшого ножницы. Убедитесь, чтобы избежать повреждения, лежащий в основе мозга с лезвиями ножниц. Снимите верхнюю открытую часть черепа с изогнутыми щипцами, чтобы разоблачить мозга.
- Собирают мозг в 15 мм чашку Петри, содержащую 0,6% глюкозы, в PBS.
- Dissect от обонятельных луковиц. Поместите мозг на его спинной поверхности, и корональной разрез зрительного перекреста с помощью скальпеля.
- Под микроскопом рассекает, положение ростральной часть секции мозга с разрезом корональной поверхности, обращенной вверх к экспериментатору.
- Рассекать СВЗ, удалить перегородки со штрафом изогнутых щипцов вставьте один кончик пинцетом в мелких стриатуме, непосредственно прилегающей к желудочка и отсоединить СВЗ от окружающей ткани. Для получения дополнительной информации обратитесь к Азари и др. 24. Поместите расчлененный SVZ в чашку Петри, содержащую 1 мл PBS, 0,6% глюкозы.
3. СВЗ ткани Диссоциация
- Фарш расчлененный SVZ в чашке Петри до не большие куски остаются.
- Передача измельченной ткани вместе с% глюкозы PBS-0,6 до 15 мл пробирку и центрифугируют при 200 х г в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и добавьте 1 мл подогретого папаин (1мг / мл, полученного на стадии 1.4) с добавкой 0,01 мг / мл ДНКазы I. инкубировать в течение 10 мин на водяной бане при 37 ° С. Используйте 1 мл на мышь папаин.
- Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин и отбросить супернатант.
- Добавить 1 мл подогретого овомукоид (0,7 мг / мл, полученного на стадии 1.5), чтобы остановить папаин активность. Механически отделить фарш ткани дальше в одной клеточной суспензии осторожно пипеткой вверх и вниз 20 раз через кончик P1000 микропипетки. Избегайте воздушных пузырьков.
- Pass клеточной суспензии через стерильный фильтр 20 мкм в новую пробирку 15 мл. Убедитесь, что мыть клеток фильтр с PBS 0,15% BSA, чтобы избежать потери клеток.
- Центрифуга при 200 х г в течение 10 мин и отбросить супернатант. Повторное приостановить клеток в 100 мкл PBS, содержащим 0,15% BSA.
4. Иммунофлуоресцентное Окрашивание для сортировки клеток
Для сортировки клеток с использованием Fucci-красный мышей (2А), используйте следующееантитела CD24: сопряженные фикоэритрином cyanine7 [PC7]; CD15 / LeX флуоресцеинизотиоцианат [FITC] конъюгировали и Ax647 конъюгированного ЭФР лиганд.
Примечание: Лекс + EGFR + клеток и EGFR + клетки не в изобилии во взрослом СВЗ: ≈ 600 и 1500 клеток / мышь, соответственно 9. Мы рекомендуем объединения СВЗ клетки от 2 до 3 мышей, чтобы иметь достаточно материала. Не работать с более чем 12 мышей в тот же день, так что сортировка продолжительность клеток не превышает 3 ч. Имейте в виду, что работы слишком много мышей в тот же день будет приводить к увеличению продолжительности сортировки клеток, возможно, приводит к увеличению гибели клеток и / или дифференцировки клеток.
- Выполните окрашивание FACS в 100 мкл PBS 0,15% BSA на мышь (или в 200 мкл для группы от 2 до 3 мышей для оптимального окрашивания).
- Подготовка управляющих трубы. Используйте компенсационные шарики, чтобы подготовить отдельных трубок управления цветом в зависимости от производителя9, S протокол. Выберите фракцию клеток (1/10 клеток, извлеченных из одной мыши достаточно) и отделить его в 4 пробирки для подготовки 1 негативное трубку управления (без опознавательных знаков клеток) и 3 флуоресценции минус один (FMO) управления трубки. Ресуспендируют клеток в 200 мкл PBS 0,15% BSA в трубке.
Подсказка: Для контроля LEX-FITC ФМО, маркировать клетки с CD24-PC7 (1:50) и Ax647-конъюгированного EGF лиганда (1: 200); для управления CD24-PC7 ФМО, маркировать клетки CD15 / Lex-FITC (1:50) и Ax647-конъюгированного лиганда EGF (1: 200) и Ax647-конъюгированного управления ФМО EGF лиганда, маркировать клетки CD15 / LeX- FITC (1:50) и CD24-PC7 (1:50). - Для труб, используемых для сортировки клеток, используют следующие антитела в указанном разведении в PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15 / Lex-FITC (1:50) и Ax647 конъюгированные с ЭФР лиганд (1: 200).
- Инкубировать в течение 20 мин при 4 ° С в темноте. Промыть 1 мл PBS 0,15% BSA и центрифуге при 200 х г в течение 10 мин. Ресуспендируют клеток в 20081; л PBS 0,15% BSA в мозге. Держите сортировки клеток трубы на льду и сразу же приступить к клеточной сортировки.
- При использовании Fucci-зеленого мышей, отдельные LEX-положительные и отрицательные LEX-фракции с использованием разделительные колонны, прежде чем сортировки клеток, как Lex-FITC антител акций ту же длину волны излучения, чем Fucci-зеленой флуоресценции (рис 3а, б).
- Во-первых, маркировать клетки с мышиного антитела против человеческого LEX-антителом (1:50) в течение 15 минут при 4 ° С в темноте в 100 мкл PBS 0,15% BSA.
- Промыть клеток с 1 мл PBS 0,15% BSA и центрифуге при 200 х г в течение 10 мин, затем маркировать клетки с анти-мышиных IgM-микрошариков (1:10) в течение 15 минут при 4 ° С в темноте.
- Промыть клеток с 1 мл PBS 0,15% BSA и центрифуге при 200 х г в течение 10 мин. Ресуспендируют клеток в 500 мкл PBS, 0,15% BSA и залить клетки через разделительную колонну в магнитном поле, как схематизированы на рисунке 3 C. Промывают колонку 1 мл PBS 0,15% BSA, чтобы получить Лекс негативное фракции.
- Чтобы получить LEX-положительный фракции, удалить столбец отделение от магнитного поля и вымывания клеток 2 мл PBS 0,15% BSA.
- Приступить к CD24-PC7 и Ax647-сопряженного окрашивания ЭФР лиганд, как указано в 4.2.
5. Сотовый Сортировка
Примечание: Клетки отсортированы по сортировщика FACS на 40 Psi с noozle 86 мкм. Флуоресценции была собрана с помощью следующей набор фильтров: 520/35 нм (FITC), 575 / 26nm (ПЭ), 670 / 20nm (Ax647) и 740LP (PC7). Компенсация необходима для предотвращения ложных положительных сигналов, как перекрытие находится между выбросов спектров в Fucci-красной флуоресценции и PC7 красителя.
- Непосредственно перед сортировки клеток, добавить важную краситель различать в прямом эфире из мертвых клеток. Мы использовали HO (см материал таблицу) на 2 мкг / мл конечной концентрации. Запустите негативное трубку управления (без опознавательных знаков) клеток через сортировщик FACS и выберите гое клетки, используя боковую разброс (SSC) и вперед разброс (FSC) параметры (Рис. 1А)
Примечание: Мертвые клетки исключались по стробирования только HO-отрицательных фракции (Фигура 1А '), а затем дублеты были исключены путем выбора длительности импульса отрицательного фракции (Фигура 1А' '). - Запустите отдельные управления цветом, подготовленные в шаге 4.2 и настроить ФЭУ (ФЭУ) напряжения, если это необходимо (например отрицательное население слишком высокие и / или позитивные клетки зашкаливает). Выполните компенсацию цвета в окне компенсации программного обеспечения.
- Выполнить Предприятие контролирует, полученного на стадии 4.2 (Lex-FITC управления FMO, CD24-PC7 управления FMO и Ax647-сопряженного управления FMO ЭФР лиганд) и привлечь сортировки ворота (рисунок 1). Сортировать клетки непосредственно в 100 мкл культуральной среды в 1,5 мл микропробирок.
6. Подготовка клеток для микроскопии
- Табличка отсортированный ячейкус при плотности 1 - 3 х 10 3 клеток / лунку на поли-D-Lysine- покрытием 96-луночного М пластина 300 мкл культуральной среды.
- До видеомикроскопии, инкубировать культуральных планшетах при 37 ° С и 5% CO 2, по крайней мере в течение 1 часа, чтобы позволить адгезию клеток.
Настройка 7. Микроскоп и захвата изображений
- Выполните живого изображения, используя план Апо ВК 20x DIC цель (NA: 0,75) на конфокальной лазерной сканирующей системы микроскопа, прикрепленной к перевернутой термостатируемом камере при 37 ° С в 5% СО 2 атмосферы.
- Поместите 96-луночного М пластины внутри подогретого и уравновешенной термостатированный камеры и заменить крышку, термостатированный крышкой.
- Откройте программное обеспечение NIS-Elements и нажмите на панели меню на "Приобретать / Приобретение контроля / приобретение ND», чтобы выбрать варианты временной промежуток (длина, сценические позиции, конфокальной Z-разделы, ...), "приобретать / управления Приобретение / Ti Pad221; выбрать цели и "Приобретение / управляет приобретением / A1plus Настройки", чтобы выбрать уровень ФЭУ для каждого флуоресценции в строке меню. Выберите папку для сохранения файлов данных.
- Использование окна ND приобретения, установлен в центре каждого также позиции этап и выберите опцию большой изображения на 7 х 7 мм ². Это создаст мозаичное изображение вокруг центра в каждую лунку. Установите перекрытие для большого мозаичного изображения до 5%. Сфотографируйте каждые 20 мин в течение 24 часов. Выберите план Апо ВК 20x DIC цель (NA: 0,75) в окне Ti Pad.
- В окне Настройки A1plus, получать изображения, используя высокоскоростной резонансный сканер на формате 512 х 512 пикселей с разрешением 1,26 мкм / пиксель. Используйте светлого визуализировать клеточные формы. В случае Fucci-красного мышей, возбуждают красную флуоресценцию при 561 нм и собирают, используя 595/50 нм фильтр. В случае Fucci-зеленой мышей, возбуждают зеленую флуоресценцию при 488 нм и собирают, используя 530/40 нм фильтр. Определить оптимальный PMУровень Т, смещение и мощность лазера для каждой длины волны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать функцию автофокуса для светлого канала, чтобы позволить программное обеспечение для автофокус на каждом этапе позицию до каждого приобретения. Подсказка: План Аро VC 20x ДВС цель (NA: 0,75) был использован для его отличным разрешением, без необходимости на нефть. Другие цели могут быть использованы в зависимости от желаемого оптическим разрешением. - Выберите "Выполнить сейчас" кнопку в окне ND приобретения, чтобы начать приобретение.
Подсказка: Следуйте работу компьютера в течение 1 цикла, чтобы убедиться, что все в работает должным образом.
8. Обработка изображений и анализ
- Проанализируйте данные непосредственно от программного обеспечения NIS-Elements путем отслеживания клетки индивидуально. Подсказка: Чтобы выиграть время, сохранить каждую позицию в формате .avi с помощью программного обеспечения NIS-Elements и анализировать фильмы с ImageJ.
- В программном обеспечении ImageJ, отслеживать отдельные клетки пройти по меньшей мере 2 дивизии (т.е. на одну ячейкучетыре ячейки колония). Обрезать небольшую площадь вокруг ячейки и выберите "Копировать изображение / '.
- Выберите "Изображение / Стеки / Сделать Montage» в строке меню, чтобы сделать монтаж. Укажите кадры, которые будут включены, размер изображений и сохранить монтаж в формате TIF файл для оптимального разрешения.
- Для расчета первого SG 2 / M фазе длину (рис 2С, D), выберите один красный флуоресцентный ячейку (в G 1), а затем установить T = 0 (S фазу начнется, как только красно-флуоресценции выключается). Подсчитайте количество кадров, пока клетка не делится, чтобы оценить длину SG 2 / M.
ПРИМЕЧАНИЕ: расчетное время зависит от интервала времени между кадрами. - Для расчета следующий фазу G1 (рис 2С, D), по-прежнему отслеживать ячейку, просто разделенный. Если разделить клетка вступает фазу G1, будет накопление cdt1 красный флуоресцентный белок-. Рассчитать количество кадров до красно-флуоресценции не выключается агаВ для каждой ячейки.
Подсказка: В начале G 1 красной флуоресценции может быть слабым, так выбрать начало фазы G 1 на раме, где клетка разделенной чтобы избежать приближения.
Representative Results
Возможность надежно различать различных клеточных популяций взрослого мыши линии СВЗ стволовых клеток является изначальной, чтобы исследовать их функциональные свойства. Для этой цели, мы разработали / EGFR / CD24 тройной маркировки стратегии Лекс, позволяющий очистку конкретных клеточных популяций из взрослого СВЗ: покоя НСК (LeX ярких), активированных НСК (LeX + EGFR +), ОДУ (EGFR +) незрелые и мигрирующие нейробласты (CD24 + EGFR + CD24 + и, соответственно) 9 (рисунок 1). Применительно к Fucci трансгенных мышей, клетки сортировка технику позволяет живого изображения фаз клеточного цикла различных нейрогенных населения на уровне одной клетки 25. Fucci-красные использовали мышей следовать G 1 фазу с помощью красной флуоресценции покадровой видео микроскопии (рис 2А). Нег клетки Fucci-красные представляют клетки в S-G 2 / M фазы клеточного цикла, Fucci-красные пос клетки G 1 клеток и Fucci-красные яркие клетки клетки, выходящие или из клеточного цикла (рисунок 2В) 23,26. LeX + EGFR + и EGFR + клетки из молодых взрослых (рис 2С) и среднего возраста мышей (рис 2D) высевали в прилипшие клетки на поли-D-лизин покрытием пластин культуры. Первый SG 2 / М фазы была установлена на отдельные клетки, как только красной флуоресценции не выключится, пока клетка делится. Как ранее наблюдали SG 2 / М, продолжительность фазы показали никакой разницы между LeX + EGFR + и EGFR + клеток, либо в молодых или среднего возраста мышей. Затем мы рассчитали на следующий G 1 длину фаз из первого дивизиона, пока красной флуоресценции не выключится. Интересно, что фаза удлинение G 1 был найден во время старения в LeX + EGFR + клеток, но неВ EGFR + клеток 25 (фиг.2с, D). В результате, получен нейросферы 5 дней после посева меньше в LeX + EGFR + клеток, полученных из мышей в возрасте, как показано на рисунке 2Е.
Fucci-зеленый мышей также может быть использован для визуализации СГ 2 / M фазу с зеленой флуоресценцией (3А, Б), но клетки должны быть предварительно отсортированный с использованием в качестве разделительные колонны LEX-FITC антителом одними и теми же длину волны излучения, чем FUCCI- зеленая флуоресценция (3С). Примером Fucci-зеленой флуоресценции для первого SG 2 / M фазе молодых взрослых LeX + EGFR + и EGFR + клеток показано на рис 3D.
Рисунок 1:. Стратегия выбора соты по FACS (A) Клетки сначала выбирается в соответствии с тНаследник морфология, используя боковое рассеивание (SSC) против рассеяния вперед (FSC) параметров. Для получения более подробной информации по выбору ворот морфологии, обратитесь к Daynac др. 9 (а ') Мертвые клетки были помечены с помощью HO маркер и исключены из выборки. (А' ') Дублеты были исключены с помощью параметра ширины импульса. Для того, чтобы настроить сортировки ворота, флуоресценция минус один (FMO) контролирует для CD24-PC7 (Lex-FITC / Fucci-красный / ЭФР-Ax647 маркировки; Б) и Lex-FITC (Fucci-красный / ЭФР-Ax647 / CD24 были использованы) (С, С ". Б) Затем, сортировки ворота были определены в / ЭФР-Ax647 / CD24-PC7 промаркированные пробирки вместе с FMO управления LEX-FITC / Fucci-Red; -PC7 маркировки. Средние процентные от общего числа клеток представлены в ворота. При выборе CD24 + клеток (нейробласты), будьте осторожны, чтобы исключить CD24 яркие клетки, экспрессирующие от ворот. Действительно, CD24 яркий соответствуют эпендимных CEзаполняет 2,9. С "представляет CD24 негативные клетки (черный квадрат в С). Только LeX + EGFR + и EGFR + (С) сортировка ворота были использованы в данном исследовании.
Рисунок 2: Живые анализы клеточного цикла с использованием Fucci-Красные мышей (А) Схематическое представление Fucci-Red клеточного цикла, где клетки красного флуоресцентного во G1-фазе и бесцветный во SG 2 / М фазы 23 (В) FACS представления о.. Fucci-красный флуоресцентный на СВЗ клеток. (С, D) Видео микроскопии с LeX + EGFR + и EGFR + клеток отсортировано из молодых (C) и среднего возраста (D) Fucci-красный мыши позволяет отслеживать фазы G 1 с красной флуоресценции в то время как SG 2 / М фазы могут быть выведены Wheп красной флуоресценции выключается. Последовательные изображения отображаются с временной шкале, представленной в D. (E) Типичные изображения колоний (нейросферы) получены 5 дней после посева. Масштабная линейка:. 10 мкм (С, D), 30 мкм (Е) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3:.. Стратегия для живых анализов клеточного цикла с использованием Fucci-зеленых мышей (А) Схематическое представление Fucci-зеленой клеточного цикла, где клетки являются зеленым во время SG 2 / М фазы и бесцветной при G 1 фазе 23 (Б) представление FACS из Fucci-зеленой флуоресценции: Fucci-зеленые нег клетки представляют клетки в G 1 фазу клеточного цикла, а Fucci-Greeн пос клетки клетки в SG 2 / М 23. (C) Для того, чтобы следовать зелено-флуоресцентный SG 2 / М фазы LeX + EGFR + и EGFR + клеток, СВЗ клетки были предварительно отсортированы с разделительных колонок. Клетки метили анти-мышиного антитела LeX LeX + и фракцию задерживается на колонке с использованием микрошариков против мышиных (см протокол 4.). Затем, Лекс + и Лекс - фракции элюируют и помечены EGF-Ax647 и CD24-PC7 антител для FACS сортировки (D), Видео микроскопия LeX + EGFR + и EGFR + клеток, упорядоченные от молодого Fucci-зеленой мышей позволяет отслеживать. СГ 2 / М фазы с зеленой флуоресценции. Последовательные изображения отображаются с временной шкале, представленной в D. Масштабная линейка: 10 мкм (D).
Discussion
Сортировки клеток техника описано позволяет надежное распознавание между покоя НСК, активированных НСК и их потомства позволяет исследований их свойств и динамики во взрослом мозге 9. В сочетании с технологией, которая позволяет Fucci визуализации клеточного цикла в живых клетках 23, мы разработали быстрый и эффективный метод, чтобы следовать G 1, С. 2 / M фазы клеточного цикла от молодого человека и в возрасте клеток мозга мыши.
Техника сортировки клеток используется в этом протоколе был первым подтверждено сочетание маркеров, позволяющих очистку пяти основных нейрогенных населения от СВЗ 9. Это был также первый подтверждено техника позволяет различие покоя и активированные НСК. Следует отметить, что этот метод не требует использования трансгенных мышей по себе, который необходим, когда адаптирована к трансгенные мыши SU моделич, как Fucci. С тех пор, Codega др. 10 использовали GFAP-GFP / CD133 / EGFR тройной маркировки комбинацию отличать покоящиеся NSCs от их активированного аналога, но он не может быть приспособлен к технологии Fucci как это требует использования GFAP-GFP трансгенных мышей. Мичиган др. 11 разработали / EGFR / CD24 тройной стратегии маркировки Glast, что разделяет общие результаты с техникой, используемой в данном исследовании, 9. Действительно, высокая корреляция между Лекс и Glast НСК маркеров уже наблюдалось в Daynac др. Изучение 9. Однако антитело Glast используется в Мичиган и др. Техники соединен с фикоэритрин и, таким образом, не может быть адаптирована с использованием Fucci-красного мышей.
Есть несколько важных моментов, которые технические требующие внимания перед сортировкой СВЗ клетки. Во-первых, шаг диссоциации очень важно, так как ткани мозга должен быть отделены в одиночных камерах при сохранении структурной вTegrity белков, используемых для стратегии маркировки антител. 0,05% трипсина-ЭДТА, как было показано очень эффективным в диссоциации SVZ ткани 27, но антиген LeX было установлено, что весьма чувствительны, как почти все LEX-FITC иммунофлюоресценции была потеряна (данные не показаны). Таким образом, папаин был использован, как это было более эффективным и менее разрушительным, чем других протеаз на ткани головного мозга. Кроме того, ни LeX ни EGFR, ни CD24 были затронуты папаин лечения. Следует отметить, что маркировка антитела был изменен, если лечение папаин превышала 15 мин. Мы получили оптимальные результаты с 10 мин папаин лечения, связанного с механическим диссоциации (пипетки вверх и вниз 20 раз).
Поли-D-лизин покрытие позволяет культуру адгезивных клеток и образование колоний после нескольких дней в культуре. В настоящее время широко признается, что в анализах пробирке поставляется с их ограничениями 28,29. Мы рекомендуем определения только первый клеточный цикл дляклетки, подвергающиеся по крайней мере, один последующий разделение остаться как можно ближе к естественных клеточного фенотипа в.
Стоит отметить, отметить, что белки Geminin (зеленая флуоресценция) и Cdt1 (красной флуоресценции), используемых для разработки системы Fucci 23 ранее показано, обильно выражается нейронных клеток-предшественников в начале нейрогенеза у мышей 30 и в мозг взрослого тканей 9,25 , Несмотря на то, mKO2-hCdt1 (30/120) конструкция в основном используется в настоящем исследовании следовать фазе G1 с красной флуоресценции, использование обеих конструкций [mKO2-hCdt1 (30/120) и MAG-hGem (1/110) ] может быть предусмотрено, чтобы позволить визуализацию основных фаз клеточного цикла (G 1 и 2 С. / м), а также G 1 / S переход 23. Основным недостатком двойного цветного изображения является ограниченный совместимые наборы флуоресценции, которые все еще могут быть использованы для клеточной маркировке. Одним из решений является использование separatiна колонках. Например, мы успешно исчерпали CD24-положительная часть из клеток с использованием разделительные колонны, прежде чем сортировки клеток и жить-визуализации, как мы использовали антитела CD24-PE, который разделил ту же длину волны излучения, чем Fucci-красной флуоресценции 25.
Несколько исследований исследовали длину клеточного цикла взрослого населения мышь СВЗ. Общая длина клеточного цикла получены с нашей техникой близко к одному оценивается в пробирке Коста и др. 21, но мы смогли впервые отличить различные фазы клеточного цикла. В исследовании в естественных условиях, Понти и др. 22 использовали включение тимидина аналогов для определения динамики пролиферации разных популяций СВЗ клеток. Тем не менее, они не могли ни выполнить непрерывный мониторинг клеточного цикла, ни отслеживать клетки на уровне одной клетки. Это может быть проблемой, как это было показано, что сильная неоднородность существует остроумиегин данную СВЗ клеточной популяции 22,25. Мы опишем здесь альтернативу в пробирке техники, легко настроить, что позволяет в реальном времени визуализации фазах клеточного цикла отличается взрослых нейрогенные населения на уровне одной клетки.
Понимание регуляции клеточного цикла нервных стволовых клеток и клеток-предшественников остается проблемой для развития новых терапевтических подходов в контексте старения или головного мозга патологий. Наш протокол может, таким образом, имеют широкий диапазон применений. В контексте старения, этот метод может оказаться полезным для понимания последствий старения на НСК дифференциации. Действительно, можно определить нейронных стволовых клеток / клеток-предшественников, поступающих дифференциацию в их красный флуоресцентный интенсивности, заметно выше, 26. Наконец, он также может представлять интерес для использования непрерывного живого изображения на уровне одной клетки, чтобы изучить клетки внутренние и внешние процессы, ответственные за клонов пропрогрессирование взрослых НСК.
Acknowledgments
Мы в долгу перед C Жубер, V, V Невиль Barroca, J Tilliet и всех сотрудников объектов животного; в J Baijer и N Dechamps для сортировки клеток; О. Этьен для оказания технической помощи, и А. Gouret за ее административную помощь. Проточной цитометрии и сортировки клеток проводились на IRCM проточной цитометрии разделяемый ресурс, созданный оборудования грантов DIM-Stem-полюсный, INSERM, Fondation АРК и CEA. Эта работа была поддержана грантами Электричество Франции (EDF). MD имеет общение с Ла Ligue Contre ле рака и LM от региона Иль-де-Франс (DIM Biotherapies). Марк-Андре Mouthon и Франсуа Д. Boussin доля со-старший авторство.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
| µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
| NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
| Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
| EGF | Millipore | GF144 | |
| FGF-2 | Millipore | GF003 | |
| Papain | Worthington | LS003119 | |
| EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
| L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
| DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
| Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
| DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
| 20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
| Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
| BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
| CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
| CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
| Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
| Alexa647 - conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
| CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
| Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
| INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
| Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
| NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
| Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
| ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
| ImageJ | RBS | ||
| FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
| FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |
References
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97, 703-716 (1999).
- Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).
- Rietze, R. L., et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, 736-739 (2001).
- Fischer, J., et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone. Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).
- Daynac, M., et al. Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage. Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).
- Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82, 545-559 (2014).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
- Capela, A., Temple, S. LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal. Neuron. 35, 865-875 (2002).
- Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult. Neuroscience. 73, 581-594 (1996).
- Pineda, J. R., et al. Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain. EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).
- Lugert, S., et al. Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging. Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).
- Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice. Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).
- Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood. Neuroscience. 173, 135-149 (2011).
- Enwere, E., et al. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).
- Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).
- Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138, 1057-1068 (2011).
- Ponti, G., et al. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).
- Sakaue Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Daynac, M., et al. TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain. Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).
- Roccio, M., et al. Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns. Development. 140, 459-470 (2013).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Spella, M., et al. Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle. Neuroscience. 147, 373-387 (2007).
