Abstract
Neurala stamceller (NSCs) i subventrikulära zonen av de laterala ventriklarna (SVZ) upprätthålla luktneurogenes hela livet i däggdjurshjärnan. De genererar successivt transitförstärkande celler (TAC) och neuroblaster som differentierar till neuroner när de integrera lukt glödlampor. Emerging fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) tekniker har möjliggjort isolering av NSCs samt deras avkomma och har börjat att belysa genreglerande nätverk hos vuxna neurogena nischer. Vi rapporterar här ett cellsortering teknik som gör det möjligt att följa och särskilja cellcykel dynamik ovannämnda cellpopulationer från vuxen SVZ med lex / EGFR / CD24 trippel färgning. Isolerade celler stryks sedan ut som vidhäftande celler att utforska i detaljer deras cellcykelprogressionen av tidsförlopp video mikroskopi. För detta ändamål använder vi transgena Fluorescence ubikitinering Cell Cycle Indicator (Fucci) möss i vilka celler är röda fluorescerande During G 1 fas på grund av en G 1 specifik röd-Cdt1 reporter. Denna metod har nyligen avslöjat att prolifererande NSCs successivt förlänga sin G 1 fas under åldrande, vilket leder till nybildning av nervceller nedskrivningar. Denna metod är lätt överföras till andra system och skulle kunna vara av stort intresse för studium av cellcykel dynamik hjärnceller i samband med hjärn patologier.
Introduction
Vilande neurala stamceller (NSCs) är källan för vuxna neurogenes 1 och kan omvandlas till deras proliferativa "aktiverade" formen som uttrycker EGFR (aNSCs) 2. När den är aktiverad, de ger upphov till transit förstärka celler (TAC) 3 och sedan neuroblaster som migrerar till lukt glödlampor (OB) genom ett rör av astrocyter och slutligen differentieras till neuroner 4,5. NSCs och deras avkomma är organiserade i specialiserade "nischer" arkitekturer längs de laterala ventriklarna, blandar en myriad av faktorer som styr deras proliferation 6. Isoleringen och reningen av SVZ neurogena celler är nödvändig för att belysa den komplexa molekylära regleringen av deras spridning, men har förblivit en utmaning för en lång tid på grund av bristen på specifika markörer och anpassade tekniker.
Nya metoder använder flödescytometri har gjort det möjligt att isoleringen av NSCs och their avkomma från den vuxna SVZ 2,7-11. Använda stamcellsmarkören LeX 12 tillsammans med neuroblast markör CD24 13 och en fluorescens EGF att märka EGFR på celler som förökar 2, nyligen utvecklade vi en FACS strategi som möjliggör rening av fem av de viktigaste SVZ neurogena populationer: vilande och aktiverade NSCs, TAC, omogna samt flyttande neuroblaster 9. Här beskriver vi i detalj denna cellsortering teknik och hur lex / EGFR / CD24 triple färgning tillåts för första gången isolering av både vilande och aktiverade NSCs.
Även om neurogenes kvarstår i vuxen ålder, är produktionen av nya nervceller drastiskt minskat i den åldrande hjärnan 14. De flesta studier är överens om en gradvis minskning av antalet förökande stamceller i SGZ och SVZ 15-20. Konsekvenserna är inte oskyldigt som den åldersrelaterade nedgången i neurogenes i SVZ framkallar en minskning av newborn neuroner i luktsinnet lökar av den åldrade hjärnan, vilket slutligen leder till försämring av lukt diskriminering i åldrade möss 18. Belysa cellcykelkinetiken av neurala stamceller är ett viktigt steg för att förstå mekanismerna bakom utvecklingen av vuxna neurogenes under åldrandet. Nyligen genomförda studier har undersökt cellcykeln och härstamning progression av vuxna neurala stamceller in vitro 21 och in vivo 22 men ingen av dem utnyttjade cellsorteringstekniker och genetiskt kodade fluorescerande cellcykel prober för att visualisera cellcykelfaser av isolerade celler vid en enda-cellnivån.
Här beskriver vi ett protokoll som tar fördel av de transgena Fucci möss i vilka celler är fluorescerande under sin cellcykel, vilket gör att skillnaden mellan G 1 och SG 2 / M faser 23. Detta protokoll visar hur blivande isolering av NSCs och deras avkomma från vuxna Fucci mice kombinerad med tidsförlopp videomikroskopi tillåter studiet av cellcykeln dynamiken vid en enkelcellnivån.
Protocol
Detta protokoll har utformats i enlighet med Europeiska gemenskapernas rådets direktiv av den 24 november, har 1986 (86/609 / EEG) och godkänts av vår djurskyddsinstitutionell kommitté (CETEA-CEA DSV IdF).
1. Grund Setup Före kultur och Videomicroscopy
- Använd glas botten odlingsplattor eller | i-plattor för konfokal videomikroskopi. För en - fem x 10 3 celler / brunn, använda 96-brunnars plattor och 24-brunnars plattor i mer än 5 x 10 3 celler / brunn.
- Minst en dag före börjar experimentet, förbereda steril Poly-D-lysin (PDL) belagda plattor för vidhäftande monoskiktkulturer. Tillsätt tillräckligt PDL (10 | ig / ml i dH2O) att belägga botten av varje brunn och inkubera O / N vid 37 ° C. Ta ut PDL lösningen och skölj tre gånger med dH 2 O innan du låter plattan torka i huven under minst två timmar under ett laminärt flöde. Om den inte används omedelbart, förvara den belagda plattan vid-20 ° C.
- Bered odlingsmedium genom att blanda NSC Basal Medium och NSC spridning supplementet på en 9: 1-förhållande (se Material tabell) tillsammans med 2 | j, g / ml heparin, 20 ng / ml renad human rekombinant epidermal tillväxtfaktor (EGF), och 10 ng / ml human rekombinant fibroblasttillväxtfaktor 2 (FGF-2). Värm upp odlingsmediet till 37 ° C i ett vattenbad före användning.
- För SVZ dissociation, förbereda papainlösning: 1 mg / ml papain (15 Ul / ml) i Earls Balans saltlösning (EBSS) innehållande 0,2 mg / ml L-cystein, 0,2 mg / ml EDTA och 0,01 mg / ml DNas I i PBS. Sterilisera lösningen genom att passera genom ett 0,2 pm filter. Jämvikta lösningen vid 37 ° C före användning.
- För att stoppa den enzymatiska reaktionen, bereda en lösning proteashämmare (Ovomucoid): DMEM: F12-medium innehållande 0,7 mg / ml trypsininhibitor typ II. Filtrera lösningen med användning av ett 0,2 pm filter.
- Förbered PBS 0,6% glukoslösning för att samla hjärnor och PBS 0,15% BSA solution för tvättningssteg och för antikroppsfärgning.
- Förbered dissektion verktyg: sax, dissekera och binda pincett, skalpell. Blötlägg dem i 70% etanol.
2. Skörd Adult Mouse Brains och SVZ Microdissections
- Sacrifice vuxen Fucci möss 23 (2-3-månader gamla och / eller 12-månader gammal för åldrande studier) utföra en halsdislokation i enlighet med lämpliga institutionella riktlinjer.
- Spraya musen med 70% etanol och hugga huvudet av med vass sax.
- Gör ett snitt längs hårbotten för att avslöja skallen.
- Utför en längsgående mittlinjen snitt börjar vid basen av skallen mot lukt glödlampor med en liten sax. Se till att undvika att skada den underliggande hjärnan med skärbladen. Ta den övre öppna delen av skallen med böjda pincett för att exponera hjärnan.
- Samla hjärnan i en 15 mm petriskål innehållande 0,6% glukos i PBS.
- Dissect bort lukt glödlampor. Placera hjärnan på dess rygg yta och göra en frontalsektion genom den optiska chiasm med hjälp av en skalpell.
- Under ett dissektionsmikroskop, placera rostralt delen av hjärnan sektionen med den skurna koronala ytan vänd uppåt mot försöksledaren.
- Att dissekera SVZ, ta bort skiljeväggen med en fin böjda pincett sedan in ett tips av en fin pincett i striatum i omedelbar anslutning till kammaren och lossa SVZ från den omgivande vävnaden. För ytterligare information, se Azari et al. 24. Placera dissekerade SVZ i en petriskål innehållande 1 ml PBS-0,6% glukos.
3. SVZ vävnadsdissociering
- Finhacka dissekerade SVZ i petriskålen tills inga stora bitar kvar.
- Överför det malda vävnaden tillsammans med PBS-0,6% glukos till en 15 ml rör och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter.
- Kasta supernatanten och tillsätt 1 ml av förvärmd papain (1mg / ml, framställd i steg 1,4) kompletterat med 0,01 mg / ml DNas I. Inkubera i 10 min i ett vattenbad vid 37 ° C. Använd 1 ml papain per mus.
- Centrifugera vid 200 xg under 5 min och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 1 ml förvärmda ovomucoid (0,7 mg / ml, framställd i steg 1,5) för att stoppa papain aktivitet. Mekaniskt dissociera malda vävnaden vidare in i en enkelcellsuspension genom att försiktigt pipettera upp och ner 20 gånger genom en P1000 mikropipett spets. Undvika luftbubblor.
- Passera cellsuspensionen genom ett sterilt 20 ^ m-filter i ett nytt 15 ml rör. Se till att tvätta cell filtret med PBS 0,15% BSA för att undvika att förlora celler.
- Centrifugera vid 200 xg under 10 min och kasta bort supernatanten. Återsuspendera cellerna i 100 | il PBS innehållande 0,15% BSA.
4. immunofluorescerande färgning för cellsortering
För cellsortering använder Fucci-Red möss (Figur 2A), använd följandeantikroppar: CD24 fykoerytrin-cyanine7 konjugat [PC7]; CD15 / LeX fluoresceinisotiocyanat [FITC] konjugerad och Ax647 konjugerade EGF-ligand.
Obs: LeX + EGFR + celler och EGFR + celler inte rikligt i den vuxna SVZ: ≈ 600 och 1500 celler / mus respektive 9. Vi rekommenderar att samla SVZ celler från 2 till 3 möss för att ha tillräckligt med material. Arbeta inte med mer än 12 möss på samma dag så att cellsortering varaktighet inte överstiger 3 timmar. Tänk på att arbeta med alltför många möss på samma dag kommer att leda till en ökad cellsortering varaktighet vilket kan leda till ökad celldöd och / eller celldifferentiering.
- Utför FACS-färgning i 100 pl PBS 0,15% BSA per mus (eller i 200 | il för en grupp av två till 3 möss för optimal färgning).
- Förbered kontrollrören. Använd ersättning pärlor att förbereda enstaka färgkontroll rör enligt tillverkaren9; s-protokoll. Välj en bråkdel av celler (1/10 av cellerna som extraherats från en mus är nog) och separera den i 4 rör för att förbereda en negativ styrröret (omärkta celler) och 3 fluorescens minus en (FMO) kontrollrören. Resuspendera cellerna i 200 pl PBS 0,15% BSA per rör.
Tips: För LeX-FITC FMO kontroll, märka cellerna med CD24-PC7 (1:50) och Ax647-konjugerad EGF-ligand (1: 200); för CD24-PC7 FMO kontroll, märka cellerna med CD15 / LeX-FITC (1:50) och Ax647-konjugerad EGF-ligand (1: 200) och för Ax647-konjugerade EGF-ligand FMO kontroll, märka cellerna med CD15 / Lexmarks FITC (1:50) och CD24-PC7 (1:50). - För rör som används för cellsortering, använd följande antikroppar vid den angivna utspädningen i PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15 / LeX-FITC (1:50) och Ax647-konjugerad EGF-ligand (1: 200).
- Inkubera under 20 minuter vid 4 ° C i mörker. Tvätta med 1 ml PBS 0,15% BSA och centrifugera vid 200 xg under 10 minuter. Resuspendera cellerna i 20081, l PBS 0,15% BSA per hjärna. Håll cellsortering rören på is och fortsätta direkt till cellsortering.
- Om du använder Fucci-gröna möss, separata LeX-positiva och Lex-negativa fraktioner med hjälp av separationskolonner innan cellsortering som Lex-FITC aktier antikropps samma utsläpps våglängd än Fucci-grön fluorescens (Figur 3A, B).
- Först märka cellerna med en mus-anti-human-LeX-antikropp (1:50) under 15 minuter vid 4 ° C i mörker i 100 pl PBS 0,15% BSA.
- Tvätta cellerna med 1 ml PBS 0,15% BSA och centrifugera vid 200 xg under 10 minuter, därefter märka cellerna med anti-mus-IgM-mikropärlor (1:10) under 15 minuter vid 4 ° C i mörker.
- Tvätta cellerna med 1 ml PBS 0,15% BSA och centrifugera vid 200 xg under 10 minuter. Resuspendera cellerna i 500 pl PBS 0,15% BSA och häll cellerna genom separationskolonnen i magnetfält såsom schematiseras i figur 3 C. Tvätta kolonnen med 1 ml PBS 0,15% BSA att få LeX negativ fraktion.
- För att få LeX-positiva fraktionen bort separationskolonnen från magnetfältet och eluera cellerna med 2 ml PBS 0,15% BSA.
- Fortsätt till CD24-PC7 och Ax647-konjugerade EGF-ligand färgning som anges i 4.2.
5. Cell Sortering
Obs: Celler sorterades på en FACS sorterare vid 40 Psi med ett 86 um noozle. Fluorescens samlades med följande filteruppsättningen: 520/35 nm (FITC), 575 / 26nm (PE), 670 / 20nm (Ax647) och 740LP (PC7). Ersättning är nödvändigt för att förhindra falskt positiva signaler som en överlappning finns mellan emissionsspektra av Fucci röda fluorescens och PC7 färgämne.
- Omedelbart före cellsortering, lägg till en vital färgämne för att diskriminera direkt från döda celler. Vi använde HO (se materialtabellen) vid 2 mikrogram / ml slutkoncentration. Kör den negativa kontrollen röret (omärkta celler) genom FACS sorterare och välj the celler med användning av sidospridning (SSC) och framåtspridning (FSC) parametrar (Figur 1A).
OBS: Döda celler uteslöts genom grind endast HO-negativa fraktionen (Figur 1A) och sedan dubletter uteslöts genom att välja Pulse Width negativa fraktionen (Figur 1A ''). - Kör de enskilda färgkontroller som framställts i steg 4,2 och justera fotomultiplikatorrör (PMT) spänningar vid behov (dvs. negativ befolknings för hög och / eller positiva celler utanför skalan). Utför färgkompensationen i fönstret av programvaran ersättning.
- Kör FMO styr beredd i steg 4,2 (LeX-FITC FMO kontroll, CD24-PC7 FMO kontroll och Ax647-konjugerade EGF-ligand FMO kontroll) och dra sorteringsgrindarna (Figur 1). Sortera cellerna direkt i 100 pl odlingsmedium i 1,5 ml mikrorör.
6. Beredning av celler för mikroskopi
- Plate den nyligen sorteras cellens vid en densitet av ett - 3 x 10 3 celler / brunn på poly-D-lysin belagda 96-brunnars μ plätering med 300 ul av odlingsmediet.
- Före videomikroskopi, inkubera odlingsplattor vid 37 ° C och 5% CO2, åtminstone för en timme för att tillåta cellvidhäftning.
7. Mikroskop Setup och Image Acquisition
- Uppträda live avbildning med en plan Apo VC 20x DIC mål (NA: 0,75) på en konfokala laserskanning mikroskopsystem ansluten till en inverterad termostatkammare vid 37 ° C under 5% CO2 atmosfär.
- Placera 96 brunnar μ-Plate inuti förvärmda och jämvikttermostatkammare och byt ut locket genom en termostat lock.
- Öppna NIS-Elements och klicka på menyraden på "Acquire / Förvärv styr / ND förvärv" för att välja alternativ för tidsförlopp (längd, scen positioner, konfokala Z-profiler, ...), "Hämta / Förvärvskontroller / Ti Pad221; att välja mål och "Hämta / Förvärvskontroll / A1plus Inställningar" för att välja PMT nivån för varje fluorescens i menyraden. Välj en mapp för att spara datafiler.
- Använda ND förvärvet fönstret, ställa in mitten av varje samt en scen position och välj den stora bilden alternativet till 7 x 7 mm. Detta kommer att skapa en mosaik bilden runt mitten av varje brunn. Ställ in överlappning för stor mosaik bilden till 5%. Ta bilder var 20 min för 24 timmar. Välj Plan Apo VC 20x DIC mål (NA: 0,75) i Ti Pad fönstret.
- I fönstret A1plus Inställningar förvärva bilder med hjälp av hög hastighet resonant skanner på 512 x 512 pixlar format med en upplösning på 1,26 um / pixel. Använd bright att visualisera cellformer. När det gäller Fucci röda möss, hetsas röd fluorescens vid 561 nm och samla med hjälp av en 595/50 nm filter. När det gäller Fucci-gröna möss, hetsas grön fluorescens vid 488 nm och samla med hjälp av en 530/40 nm filter. Bestäm optimal PMT nivå, offset och lasereffekt för varje våglängd.
OBS: Vi rekommenderar att du använder autofokusfunktionen för bright kanal så att programvaran till autofokus på varje stadium läge innan varje förvärv. Tips: en Plan Apo VC 20x DIC mål (NA: 0,75) användes för sin utmärkta resolution utan behov av olja. Andra mål kan användas beroende på den optiska upplösningen önskas. - Välj "Kör nu" -knappen på ND förvärvet fönstret för att börja förvärvet.
Tips: Följ datorarbete för en slinga för att vara säker på att allt fungerar som det ska.
8. Bildbehandling och analys
- Analysera data direkt på NIS-Elements genom att spåra celler individuellt. Tips: För att vinna tid, spara varje position i .avi-format med NIS-Elements och analysera filmer med ImageJ.
- I ImageJ programvara, spåra enskilda celler som genomgår minst 2 avdelningar (dvs. en cell tillen fyra-cellkoloni). Beskär ett litet område runt cellen och välj "Bild / Duplicera".
- Välj "Bild / Stacks / Make Montage" i menyraden för att göra ett montage. Ange ramarna som skall ingå, storleken på bilderna och spara montage som .tif fil för optimal upplösning.
- För att beräkna den första SG 2 / M fas längd (Figur 2C, D), markera en enda röd fluorescerande cell (i G 1) och ställ sedan in t = 0 (S fasen börjar när röda fluorescens släcks). Räkna antalet ramar tills cellen delar att uppskatta SG 2 / M längd.
OBS: Den beräknade tiden beror på tidsintervallet mellan varje bild. - För att beräkna följande G1 fasen (figur 2C, D), fortsätter att spåra cell som bara delas. Om den delade cellen går in G1-fasen, kommer det att finnas en ackumulering av cdt1 röd-fluorescerande protein. Beräkna antalet ramar tills röda fluorescens stänger agai för varje cell.
Tips: I början av G 1 den röda fluorescens kan vara svag så välj uppkomsten av G 1 fas på ramen där cellen har delat att undvika approximationer.
Representative Results
Förmågan att på ett tillförlitligt sätt skilja mellan de olika cellpopulationer enligt den vuxna musen SVZ stamceller härstamning är primordial att undersöka deras funktionella egenskaper. För detta ändamål har vi utvecklat en LeX / EGFR / CD24 triple-märkning strategi möjliggör rening av specifika cellpopulationer från den vuxna SVZ: vilande NSCs (LeX ljust), aktiverade NSCs (LeX + EGFR +), TAC (EGFR +) , omogna och flyttande neuroblaster (CD24 + EGFR + och CD24 +, respektive) 9 (Figur 1). Tillämpat på Fucci transgena möss, cellsortering teknik medger den levande avbildning av de cellcykelfaser hos de olika neurogena populationer vid enkelcellnivån 25. Fucci röda möss användes för att följa G en fas med röd fluorescens med time-lapse videomikroskopi (Figur 2A). Fucci röda neg celler representerar cellerna i S-G 2 / M-faserna av cellcykeln, Fucci röda pos celler är G 1-celler och Fucci-röda ljusa cellerna celler som lämnar eller ut ur cellcykeln (Figur 2B) 23,26. LeX + EGFR + och EGFR + celler från unga vuxna (Figur 2C) och medelålders möss (Figur 2D) ströks som vidhäftande celler på poly-D-lysin belagda odlingsplattor. Den första SG 2 / M fas identifierades på enstaka celler när röd fluorescens stängs tills cellen delar sig. Som tidigare observerats SG 2 / M fas längd visade ingen skillnad mellan LeX + EGFR + och EGFR + celler, antingen hos unga eller medelålders möss. Då vi beräknat nästa G 1 fas längd från den första divisionen tills den röda fluorescens stängs av. Intressant nog var en G 1 fas förlängning hittades under åldring i LeX + EGFR + celler men intei EGFR + celler 25 (figur 2C, D). Följaktligen neurosfärer erhållna 5 dagar efter utstrykning är mindre i LeX + EGFR + celler erhållna från åldrade möss, såsom visas i fig 2E.
Fucci-Grönt möss kan också användas för att visualisera SG 2 / M-fas med grön fluorescens (figur 3A, B) men celler måste vara pre-sorteras med användning separationskolonner som LeX-FITC-antikropp delade samma emissionsvåglängden än FUCCI- grön fluorescens (fig 3C). Ett exempel på Fucci-grön fluorescens för första SG 2 / M-fas av unga vuxna LeX + EGFR + och EGFR + celler visas i Figur 3D.
Figur 1:. Strategi för cellselektion genom FACS (A) Celler första valda enligt tarvinge morfologi med hjälp av sidospridning (SSC) vs Forward Scatter (FSC) parametrar. För ytterligare information om morfologi gate val, se Daynac et al. 9 (a ') Döda celler märktes med hjälp av HO markör och uteslutna från valet. (A') dubletter uteslöts med hjälp av pulsbredds parameter. För att ställa in sorteringsgrindar, fluorescens minus en (FMO) kontroller för CD24-PC7 (LeX-FITC / Fucci-Röd / EGF-Ax647 märkning, B) och Lex-FITC (Fucci-Röd / EGF-Ax647 / CD24 -PC7 märkning, B ') användes (C, C ".) Då var sorteringsgrindar bestämdes i LeX-FITC / Fucci-Röd / EGF-Ax647 / CD24-PC7 märkta rör tillsammans med FMO kontroller. De genomsnittliga procentsatser av totala celler finns representerade inom grindarna. Om du väljer CD24 + celler (neuroblaster), vara noga med att utesluta CD24 ljusa uttryckande celler från porten. Faktum CD24 ljusa motsvarar ependymala cells 2,9. C "representerar CD24 negativa celler (svart kvadrat i C). Endast LeX + EGFR + och EGFR + (C) sorteringsgrindar användes för denna studie.
Figur 2: Live analyser av cellcykeln med hjälp av Fucci röda möss (A) Schematisk bild av Fucci-röd cellcykeln där celler är röda fluorescerande under G1 fas och färglös under SG 2 / M faser 23 (B) FACS representation.. Fucci-röd fluorescens på SVZ celler. (C, D) Video mikroskopi Lex + EGFR + och EGFR + celler sorterade från unga (C) och medelålders (D) Fucci-Röd möss möjliggör spårning av G 1 fas med röd fluorescens medan SG 2 / M faser kan härledas when röd fluorescens släcks. Successiva bilder visas med en tidsskala som presenteras i D. (E) Representativa bilder av kolonier (neurosfärer) som erhållits 5 dagar efter plätering. Skala bar:. 10 mikrometer (C, D), 30 pm (E) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:.. Strategi för levande analys av cellcykeln med hjälp av Fucci-gröna möss (A) Schematisk bild av Fucci-Grönt cellcykeln där celler är gröna under SG 2 / M fas och färglös under G 1 fas 23 (B) FACS representation av Fucci-Grön fluorescens: Fucci-gröna neg celler representerar cellerna i G 1-fasen av cellcykeln, medan Fucci-Green pos celler är celler i SG 2 / M 23. (C) För att följa den gröna fluorescerande SG 2 / M faser Lex + EGFR + och EGFR + celler, hade SVZ celler som skall försorterade med separationskolonner. Celler märktes med anti-mus LeX antikropp och LeX + -fraktionen kvarhölls på kolonnen med användning av anti-mus-mikropärlor (se protokoll 4.). Sedan Lex + och Lex - fraktioner eluerades och märktes med EGF-Ax647 och CD24-PC7 antikroppar för FACS sortering (D) Video mikroskopi lex + EGFR + och EGFR + celler sorterade från unga Fucci-gröna möss möjliggör spårning av. Generalsekreteraren 2 / M faser med grön fluorescens. Successiva bilder visas med en tidsskala som presenteras i D. Skala bar: 10 m (D).
Discussion
Den cellsortering teknik som beskrivs häri möjliggör tillförlitlig diskriminering mellan vilande NSCs, aktiverade NSCs och deras avkomma som möjliggör studier av deras egenskaper och dynamik i den vuxna hjärnan 9. Tillsammans med Fucci teknik som medger visualisering av cellcykelprogression i levande celler 23, utvecklade vi en snabb och effektiv teknik för att följa G 1 och SG 2 / M-faserna av cellcykeln från unga vuxna och åldrade mus hjärnceller.
Den cellsortering teknik som används i detta protokoll var den första validerade kombination av markörer som möjliggör rening av de fem viktigaste neurogena populationer från SVZ 9. Det var också den första validerade tekniken möjliggör skillnaden av vilande och aktiverade NSCs. Det är anmärkningsvärt att denna teknik inte kräver användning av transgena möss i sig, vilket är nödvändigt efter anpassning till transgena musmodeller SUlm som Fucci. Sedan dess har Codega et al., 10 används en GFAP-GFP / CD133 / EGFR-trippelmärknings kombination för att särskilja vilande NSCs från deras aktiverade motsvarighet men det kan inte anpassas till Fucci teknik eftersom den kräver användning av GFAP-GFP transgena möss. Mich et al. 11 har utvecklat en GLAST / EGFR / CD24 trippel strategi märkning som delar gemensamma resultat med den teknik som används i denna studie 9. I själva verket, en hög korrelation mellan Lex och GLAST NSCs markörer redan observerats i Daynac et al. Studie 9. Emellertid är GLAST antikropp som används i Mich et al., Teknik kopplad till fykoerytrin och således inte kan anpassas med användning av Fucci-Red-möss.
Det finns flera viktiga tekniska frågor som kräver uppmärksamhet innan sortering SVZ celler. För det första är dissociationssteget mycket viktig eftersom hjärnvävnaden måste dissocieras till enstaka celler och samtidigt bevara den strukturella iintegritet av proteiner som används för strategin märkningsantikroppen. 0,05% trypsin-EDTA har visat sig vara mycket effektivt för att dissociera SVZ vävnad 27 men lex-antigenet visade sig vara mycket känsliga eftersom nästan all LeX-FITC-immunfluorescens var förlorad (data ej visade). Således var papain användes som det var mer effektivt och mindre destruktiva än andra proteaser på hjärnvävnad. Dessutom har varken LeX eller EGFR eller CD24 påverkas av papain behandling. Det bör noteras att märkningen antikroppen ändras om papain behandling översteg 15 minuter. Vi fick optimala resultat med en 10 min papain behandling i samband med en mekanisk dissociation (pipett upp och ner 20 gånger).
Poly-D-Lysin beläggning medger odling av vidhäftande celler och bildning av kolonier efter flera dagar i odling. Det är nu allmänt accepterat att in vitro-analyser kommer med sina begränsningar 28,29. Vi rekommenderar att bestämma endast den första cellcykeln förde celler som genomgår åtminstone en efterföljande division bo så nära som möjligt in vivo cellfenotypen.
Det är anmärkningsvärt att nämna att Geminin (grön fluorescens) och Cdt1 (röd fluorescens) proteiner som används för att utforma Fucci systemet 23 tidigare visat sig vara rikligt uttrycks av neurala stamceller under tidig neurogenes hos möss 30 och vuxna hjärnan vävnader 9,25 . Även om mKO2-hCdt1 (30/120) konstruktionen har huvudsakligen använts i denna studie att följa G1 fasen med röd fluorescens, användning av båda konstruktionerna [mKO2-hCdt1 (30/120) och MAG-hGem (1/110) ] skulle kunna förutses för att tillåta visualisering av huvudfaserna i cellcykeln (G 1 och SG 2 / M) såväl som G 1 / S övergång 23. Den huvudsakliga nackdelen med tvåfärgad avbildning är de begränsade kompatibla uppsättningar av fluorescens som fortfarande kan användas för cellmärkning. En lösning är att använda separatipå kolonner. Till exempel har vi framgångsrikt utarmat CD24-positiva fraktion från celler med hjälp av separationskolonner innan cellsortering och live-avbildning som vi använde en CD24-PE-antikropp som delade samma emissions våglängd än Fucci-röda fluorescens 25.
Få studier har undersökt cellcykelns längd av vuxna mus SVZ populationer. Den totala cellcykelns längd erhålles med vår teknik är nära till ett uppskattat in vitro av al. Costa et 21, men vi kunde för första gången för att skilja de olika cellcykelfaser. I en in vivo-studie, al. Ponti et 22 används inkorporering av tymidinanaloger att bestämma proliferations dynamiken i de olika SVZ cellpopulationer. Men de kunde inte utföra en kontinuerlig övervakning av cellcykeln eller spåra celler vid encelliga nivå. Detta kan vara ett problem, eftersom det visade sig att en stark heterogenitet finns within en given SVZ cellpopulation 22,25. Vi beskriver här ett alternativ in vitro teknik, enkel att installera, som gör den levande avbildning av cellcykelfaserna av olika vuxna neurogen populationer på en encelliga nivå.
Förstå regleringen av cellcykeln av neurala stamceller och stamceller fortfarande en utmaning för utvecklingen av nya behandlingsmetoder i samband med åldrande eller hjärn patologier. Vår protokoll kan således ha ett brett spektrum av applikationer. I samband med åldrande, kan denna teknik även vara användbar för att förstå effekterna av åldrande på NSCs differentiering. I själva verket är det möjligt att identifiera neurala stam / progenitorceller in differentiering som deras röda fluorescensintensitet är tydligt högre 26. Slutligen kan det också vara av intresse att utnyttja den kontinuerliga levande avbildning på en enda cellnivå för att studera cellens inre och yttre processer som ansvarar för härstamning prosion av vuxna NSCs.
Acknowledgments
Vi står i tacksamhetsskuld till C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet och all personal av djuranläggningar; till J Baijer och N Dechamps för cellsortering; O. Etienne för tekniskt stöd, och A. Gouret för hennes administrativt stöd. Flödescytometri och cellsortering genomfördes vid iRCM Flow Cytometry delad resurs, som inrättades genom bidrag utrustning från DIM-Stem-Pôle, INSERM, Fondation ARC, och CEA. Detta arbete har finansierats med bidrag från Electricité de France (EDF). MD har ett stipendium från La Ligue Contre le Cancer och LM från Région Ile-de-France (DIM Biothérapies). Marc-André Mouthon och François D. Boussin aktie co-ledande författarskap.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
| µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
| NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
| Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
| EGF | Millipore | GF144 | |
| FGF-2 | Millipore | GF003 | |
| Papain | Worthington | LS003119 | |
| EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
| L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
| 0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
| DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
| Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
| DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
| 20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
| Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
| BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
| CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
| CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] - conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
| Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
| Alexa647 - conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
| CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
| MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
| Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
| Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
| INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
| Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
| NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
| Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
| ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
| ImageJ | RBS | ||
| FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
| FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |
References
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Pastrana, E., Cheng, L. C., Doetsch, F. Simultaneous prospective purification of adult subventricular zone neural stem cells and their progeny. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 6387-6392 (2009).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97, 703-716 (1999).
- Kriegstein, A., Alvarez Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Lois, C., Garcia Verdugo, J. M., Alvarez Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science. 271, 978-981 (1996).
- Fuentealba, L. C., Obernier, K., Alvarez Buylla, A. Adult neural stem cells bridge their niche. Cell stem cell. 10, 698-708 (2012).
- Rietze, R. L., et al. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain. Nature. 412, 736-739 (2001).
- Fischer, J., et al. Prospective isolation of adult neural stem cells from the mouse subependymal zone. Nat Protoc. 6, 1981-1989 (2011).
- Daynac, M., et al. Quiescent neural stem cells exit dormancy upon alteration of GABAAR signaling following radiation damage. Stem Cell Res. 11, 516-528 (2013).
- Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82, 545-559 (2014).
- Mich, J. K., et al. Prospective identification of functionally distinct stem cells and neurosphere-initiating cells in adult mouse forebrain. Elife. 3, e02669 (2014).
- Capela, A., Temple, S. LeX ssea 1 is expressed by adult mouse CNS stem cells identifying them as nonependymal. Neuron. 35, 865-875 (2002).
- Calaora, V., Chazal, G., Nielsen, P. J., Rougon, G., Moreau, H. mCD24 expression in the developing mouse brain and in zones of secondary neurogenesis in the adult. Neuroscience. 73, 581-594 (1996).
- Pineda, J. R., et al. Vascular derived TGF-beta increases in the stem cell niche and perturbs neurogenesis during aging and following irradiation in the adult mouse brain. EMBO Mol Med. 5, 548-562 (2013).
- Lugert, S., et al. Quiescent and active hippocampal neural stem cells with distinct morphologies respond selectively to physiological and pathological stimuli and aging. Cell stem cell. 6, 445-456 (2010).
- Blackmore, D. G., Golmohammadi, M. G., Large, B., Waters, M. J., Rietze, R. L. Exercise increases neural stem cell number in a growth hormone dependent manner augmenting the regenerative response in aged mice. Stem cells. 27, 2044-2052 (2009).
- Bouab, M., Paliouras, G. N., Aumont, A., Forest Berard, K., Fernandes, K. J. Aging of the subventricular zone neural stem cell niche evidence for quiescence associated changes between early and mid adulthood. Neuroscience. 173, 135-149 (2011).
- Enwere, E., et al. Aging results in reduced epidermal growth factor receptor signaling diminished olfactory neurogenesis and deficits in fine olfactory discrimination. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 8354-8365 (2004).
- Maslov, A. Y., Barone, T. A., Plunkett, R. J., Pruitt, S. C. Neural stem cell detection characterization and age related changes in the subventricular zone of mice. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1726-1733 (2004).
- Tropepe, V., Craig, C. G., Morshead, C. M., van der Kooy, D. Transforming growth factor alpha null and senescent mice show decreased neural progenitor cell proliferation in the forebrain subependyma. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 7850-7859 (1997).
- Costa, M. R., et al. Continuous live imaging of adult neural stem cell division and lineage progression in vitro. Development. 138, 1057-1068 (2011).
- Ponti, G., et al. Cell cycle and lineage progression of neural progenitors in the ventricular-subventricular zones of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1045-1054 (2013).
- Sakaue Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
- Daynac, M., et al. TGFbeta lengthens the G1 phase of stem cells in aged mouse brain. Stem cells. 32, 3257-3265 (2014).
- Roccio, M., et al. Predicting stem cell fate changes by differential cell cycle progression patterns. Development. 140, 459-470 (2013).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse two cultures isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of visualized experiments JoVE. , e51225 (2014).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres re evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Pastrana, E., Silva Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open a critical review of sphere formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8, 486-498 (2011).
- Spella, M., et al. Licensing regulators Geminin and Cdt1 identify progenitor cells of the mouse CNS in a specific phase of the cell cycle. Neuroscience. 147, 373-387 (2007).
