Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis

Abstract

Veel micro-organismen kunnen produceren en uitscheiden exopolysaccharides (EPS), die belangrijke gevolgen medische gebieden, voedseltoepassingen of de vervanging van petrochemische derivaten hebben. We beschrijven een analytische platform te automatiseren op een liquid handling systeem dat de snelle en betrouwbare analyse van het type en de hoeveelheid EPS geproduceerd door micro-organismen toestaat. Het stelt de gebruiker in staat om nieuwe natuurlijke microbiële exopolysaccharide producenten te identificeren en het koolhydraat vingerafdruk van de overeenkomstige polymeren binnen een dag analyseren high-throughput (HT). Met behulp van dit platform, kunnen stam collecties evenals bibliotheken van stam varianten die in technische oplossingen zouden kunnen worden verkregen worden gescreend. Het platform heeft een modulaire opbouw, die een scheiding van het protocol in twee grote delen mogelijk maakt. Ten eerste is er een geautomatiseerde screening systeem, dat verscheidene polysaccharide detectiemodules combineert: een semi-kwantitatieve analyse van viscosity vorming door een centrifugatie stap een analyse van polymeervorming via alcoholprecipitatie en de bepaling van het totale koolhydraatgehalte via een fenol-zwavelzuur transformatie. Hier is het mogelijk om op het scherm tot 384 stammen per run. Het tweede deel bevat een gedetailleerde monosaccharide analyse van alle geselecteerde EPS producenten die in het eerste deel door twee essentiële modules: de analyse van de totale monomeersamenstelling via high performance vloeistofchromatografie gekoppeld aan ultraviolet en electrospray ionisatie ionenval detectie ( UHPLC-UV-ESI-MS) en de bepaling van pyruvaat als polymeer substituent (aanwezigheid van pyruvaat ketal) via enzymatische oxidatie die gekoppeld is aan een kleurvorming. Alle analytische modules van deze screening platform kunnen worden gecombineerd op verschillende manieren en aangepast aan de individuele eisen. Bovendien, ze kunnen allemaal worden handmatig verwerkt of uitgevoerd met een vloeistofverwerking systeem. Daarbij, de screening plaTForm maakt een enorme flexibiliteit om verschillende EPS identificeren.

Introduction

Microbiële exopolysaccharides (EPS) zijn structureel zeer diverse groep van polymeren die verschillende biologische functies vervullen. Meestal zijn opgebouwd uit complexe herhalende eenheden, die worden onderscheiden door verschillende typen monomeren (suiker, suikerderivaten, suikerzuren), de bindingen tussen de monomeren en hun vervangingen. De structurele diversiteit van microbiële polysacchariden verleent nogal verschillende kenmerken van de leden van deze molecule klasse, die hun toepassing in verschillende gebieden, zoals voedsel ¹ toelaat, cosmetica ^2,3, bouw chemie ⁴ of waterbehandeling ^5. Om het toepassingsgebied van deze bio- dergelijke duurzame polymeren de identificatie van nieuwe natuurlijke microbiële polysachariden en de engineering van uitvoeringsvarianten vormt werkvorm verder uitbreiden. Hoe dan ook, is een snelle screeningsmethode nodig zijn om snel een groot aantal microbiële stammen voor thei scannenr polysaccharide vormen, en hun producten te analyseren. Daarom hebben wij onlangs een 96-well HT-screening platform voor de analyse van microbiële polysaccharideproductie uit natuurlijke isolaten of aangelegde stamvarianten dat de identificatie van de monomere samenstelling ⁶ omvat.

Toegepast platform voor een eerste screening ronde van ~ 500 natuurlijke isolaten lieten identificeren slechts ongeveer 10 tot 20% van de bekomen stammen als het kunnen produceren EPS (gegevens niet getoond). Dit betekent dat 80-90% van de geanalyseerde stammen niet EPS onder de toegepaste omstandigheden produceerde, en dus een verdere analyse van de gedetailleerde koolhydraat vingerafdruk niet nodig. Aangezien dit zeer verfijnde identificatie van de monomere samenstelling een tijdrovend proces, vooral voor gegevensanalyse, snel pre-screening methode om de stammen positief EPS productie identificeren drastisch de efficiëntie. Voorts reagentia,verbruiksartikelen en meettijd op UHPLC UV-ESI-MS worden verminderd. Bovendien, de verschillende analytische modules, terwijl aan de ene kant maakt de werkwijze zeer betrouwbaar zijn anderzijds complicerende het manueel hanteren van meer dan twee 96-well platen in parallel, en als zodanig het volledige potentieel van de werkwijze beperkt. Om deze redenen hebben we besloten om een ​​geautomatiseerde screening platform te ontwikkelen. Daarom combineerden we de modulaire indeling van de vingerafdruk koolhydraat bestaande techniek van een volledige snelle detectiemethode van het totale suikergehalte, gebaseerd op absorptiemeting.

De fenol-zwavelzuur methode vormt nog steeds de methode van de keuze voor de snelle bepaling van het totale koolhydraatgehalte van bacteriële en plantaardige polysacchariden ^7,8. Deze werkwijze werd eerst beschreven door Dubois et al. ⁹ en aangepast voor verschillende toepassingen en steekproefomvang, zelfs voor kleine schaal in 96-well platen ^10,11. de phenol-zwavelzuur methode meet het totale koolhydraatgehalte één waarde sommeren van alle monomere, oligomere en polymere koolhydraten van de monsters.

Rekening houdend met deze aspecten rekening, de keuze van een geschikt kweekmedium is essentieel om deze methode toe te passen. Complexe media die oligomere of polymere koolhydraten verbindingen zoals gistextract zou kunnen leiden tot een veranderde polymeergehalte en daarom moet absoluut vermeden worden. Bovendien worden grote hoeveelheden suiker als C-bron voor de kweek van de stammen. Hoge niveaus van resterende koolhydraten uit het teeltproces kan negatief interfereren met de meting van de EPS inhoud.

Daarom wordt het gebruik van gedefinieerde en zuivere suikers geadviseerd. In onze experimenten gebruikten we glucose voor het kweken van de cellen. De resterende glucose na kweek werd gereduceerd via een gelfiltratie en bepaald via een glucose-assay. Tenslotte de glucose-equivalents van de polysacchariden werd berekend door de resterende glucose na gelfiltratie van het totale koolhydraatgehalte die waargenomen waren met het fenol-zwavelzuur methode. Gelfiltratie en glucose-assay in combinatie met fenol-zwavelzuur methode betrouwbare resultaten en kunnen zijn onze eerste, volledig geautomatiseerd detectiesysteem.

Twee nieuwe analytische modules in de geautomatiseerde screening platform om de hoeveelheid informatie van de EPS-detectiesysteem verhogen: de neerslag en de waarneming van een toename van de viscositeit.

Vele verschillende EPS - bijvoorbeeld succinoglycan, xanthan en colon acid ¹² - gemeld worden aangepast met een niet-koolhydraat pyruvaat ketaal suiker positie C4 en C6. Die pyruvaat ketalen (net zoals succinyl halfesters en uronzuren) bijdragen aan de polyanionische natuur en daarom de fysieke properties van het polymeer door interactie via tweewaardig kation bruggen ^13. Om deze bepaalde polymeren identificeren de bepaling van pyruvaat werd als een aanvullende analyse module. Hierdoor wordt de informatie over de polysaccharide substituenten en hun potentieel macroscopische eigenschappen.

Combineren van alle modules maakt de identificatie van verschillende EPS evenals een snelle en efficiënte bepaling van EPS producenten. Door dat de aanpak van de screening platform kan worden onderverdeeld in twee grote delen (figuur 1). In de geautomatiseerde screening (deel I) de workflow optreedt volautomatische (tabel 1) om snel preselectie EPS producerende stammen. Het koolhydraat vingerafdrukanalyse (deel II) bepaalt kwantitatief de monomeersamenstelling van de EPS door de vooraf gekozen stammen. Daardoor werd de gegevensanalyse geminimaliseerd teneinde de screening van grote stammenverzamelingen optimaliseren. Dezebiedt de mogelijkheid om 384 stammen in één geautomatiseerde screening run en met twee runs die per dag van 768 stammen per dag mogelijk zijn te analyseren. Bovendien, het koolhydraat vingerafdrukanalyse geeft een nog meer gedetailleerd overzicht van alle geïdentificeerde EPS. Dit maakt de gerichte analyse en identificatie van slechts licht verschillen EPS varianten of geheel nieuwe vergelijking met de reeds beschreven chemische structuren van EPS.

Protocol

1. Geautomatiseerde Screening

Opmerking: Alle handling stappen vloeistof worden uitgevoerd met een robot liquid handling systeem. De samenstelling van de robot werktafel is weergegeven in figuur 2. Alle hulpstoffen worden opgeslagen in de opslag carrousel, tenzij anders vermeld. Voor alle geautomatiseerde screening stappen een robot manipulator (RM) beweegt de verbruiksgoederen, (deep well plaat (DWP); micro-titer plaat (MTP); polymerase chain reaction plaat (PCR-plaat) en ga zo maar door) tussen de carrousel posities (CP ) en de werktafel posities (WTP). Alle pipet stappen worden uitgevoerd met een 96-kanaals-pipet-arm, tenzij anders is vermeld. Alle stappen worden geprogrammeerd en worden automatisch uitgevoerd in 96-well formaat.

1. Strain Teelt (taak 1 in figuur 1)
   Opmerking: Behandel de inoculatie van de vermeende EPS producerende stammen en de dichtheid van de kweek platen onder steriele omstandigheden (laminaire stroming). de geautomatiseerdesnelle screening kan omgaan met vier 96-well platen per run. Verschillende stammen van verschillende genera reeds geteste ^6.
   1. Handmatig beënt de voorkweek (1 ml EPS-media in een DWP) met een 96-pin replicator van een 96-well plaat glycerol voorraad. Bedek de plaat met een ademende afdichtfilm verdamping plaatsvindt en beluchting mogelijk. Incubeer bij 30 ° C gedurende 48 uur bij 1000 rpm op een MTP-shaker.
   2. Beënten main-kweek (990 pl EPS-media in een DWP) door het overbrengen van 10 pl van de voorkweek met een 50 ui 12-kanaals multi-pipet en incubeer onder dezelfde voorwaarden als de pre-kweek. Noteer alle stammen die niet groeien.
2. Voorbereiding van de Robot Worktable en de Storage Carousel
   1. Helpen verbruiksartikelen materialen en uitrusting vermeld in de juiste positie in de opslag carrousel. Voeg 990 gl dubbel gedestilleerd water (DDH ₂ O) in elk putje van de DWP voor de 1: 100 verdunningen vooe glucose-assay (carousel positie 4-1 naar 4-4).
   2. Schik een trog van 250 ml met 150 ml van DDH ₂ O op de werktafel positie (WTP) 11.
   3. Deponeren een trog 250 ml bevattende 50 ml glucose-reagens-mix (4 ml 500 mM kaliumfosfaat (pH 5,7), 1,5 ml 50 mM 2,2-azinobis- (3ethylbenzthiazoline) -6-sulfonzuur, 2 ml 100 U glucose-oxidase, 10 pl 1000 AL mierikswortelperoxidase en 42,49 ml DDH ₂ O) op positie WTP 1-2.
   4. Plaats twee lege dummy F-bottom MTP op positie WTP 3-1 en 3-2.
   5. Verwijder de ademende afsluitfolie, de hoofd-kweken toewijzen in de carrousel posities (CP) 1-1 tot 1-4 en start het geautomatiseerde robot programma.
3. Evenwichtsinstelling van de gelfiltratie Plates
   Opmerking: De gelfiltratie platen die worden gebruikt bij de screening kan worden hergebruikt. Hiervoor elk met 150 pl DDH ₂ O wassen en centrifugeer drie maal 2000 xg gedurende 2 min bij 20 ° C. Daarna bewaren bij 4° C met 75 ul van 20% ethanol en dek af met een siliconen cap mat.
   1. Verplaats de 250 ml goot (CP 5-7) met 5 mM ammoniumacetaat buffer (pH 5,6) om het WTP 3-3.
   2. Breng de gel-filtratie platen (CP 1-6, 1-7, 2-6 en 2-7) van de carrousel naar de WTPs 4-1 tot 4-4.
   3. Verzamelbak 150 ui ammoniumacetaatbuffer via 200 gl tips en afvullen in het centrum van gelfiltratie platen evenwichtstoestand.
   4. Breng de gel-filtratie platen in de centrifuge (2000 xg gedurende 2 min bij 20 ° C).
   5. Breng de borden terug naar de werktafel, herhaalt u de stappen 1.3.3, 1.3.4 en 1.3.3. Stel het centrifugeren stap om uitdroging van de gel-filtratie platen te vermijden niet herhalen. Bewaar het evenwicht gebracht gelfiltratie borden terug in de carrousel.
4. Verwijdering cel via Centrifugeren (Taak 1 in figuur 1)
   Let op: Om te zorgen voor een lage achtergrond binnen de screening aanpak, cel vrij te analyserenEPS bevattende supernatanten alleen en verwijder cellen via centrifugeren na teelt.
   1. Breng de hoofd-kweek DWP van de carrousel (1-1 tot 1-4) in de centrifuge (4300 xg gedurende 30 min bij 20 ° C).
   2. Bereid de werktafel via de RM naar de belangrijkste cultuur te verwerken.
      Let op: voor de stappen 1.4.2 tot 1.4.3.5 het systeem altijd grepen twee platen parallel en dan herhaalt alle stappen met de volgende twee platen.
      1. Voor de neerslag voor filtratie verplaats de MTP van CP 6-1 en 6-2 te WTP 4-1 en 5-1. Verplaats de pH-indicator MTP's van CP 7-1 en 7-2 te WTP 4-2 en 5-2.
      2. Breng de filtratie plaat samen met de collector plaat uit de CP 2-1 en 2-2 te WTP 4-3 en 5-3. Verplaats de belangrijkste-cultuur DWP 1-1 en 1-2 uit de centrifuge naar WTP 4-4 en 5-4.
      3. Bereid de analytische modules.
         Let op: Neem 200 ul tips van de tip opslag (stand 2-1 naar 2-4). Om de verbruiksgoederen te verminderen, maken gebruik van dezelfde tip-set voor stap 1.4.3.1.
         1. Transfer 180 ul van de belangrijkste-kweeksupernatant aan de filtratie plaat. Aspireren 150 ul van de belangrijkste-kweeksupernatant en afzien 50 ui in de MTP voor het neerslaan vóór filtratie en 100 ul om de pH-indicator plaat.
            Opmerking: de pH-bepaling is niet essentieel; echter na toevoeging 12,5 ml methylroodindicator (50 mg in 50 ml ethanol) in elk putje met een meerstaps pipet betekent hoog-producerende stammen. Deze informatie kan nuttig zijn groeiremming (bij lage pH) voor teelten, bijvoorbeeld voor een tweede screening hogere bufferconcentratie voorkomen. Bovendien kunnen lage pH ook induceren EPS productie om de cel tegen het zure milieu.
         2. Herhaal stap 1.4.3.1 voor de tweede belangrijkste cultuur plaat. Gebruik een nieuwe tip-set.
         3. Verplaats de filtratie platen om de centrifuge en verwijder alle andere borden van de werktafel terug naar hun posities in de carousel.
         4. Herhaal deze stappen 1.4.2.1 naar 1.4.3.3 voor de derde en vierde main-cultuur plaat.
         5. Noteer deze fermentatie bouillons, waarin tonen verminderde sedimentatie na centrifugeren van de belangrijkste kweekplaten, wanneer ze terug worden overgebracht naar de carrousel (viscositeit controle).
5. 96-well filtratie voor complete celverwijdering (Taak 2 in figuur 1)
   Opmerking: Om cel verwijdering uit viskeuze fermentatiebouillon een filtratiestap is opgenomen in de screening te waarborgen.
   1. Centrifugeer de filtratie platen bij 3000 xg gedurende 10 min bij 20 ° C en breng ze terug naar hun uitgangspositie carousel.
   2. Bereid de gelfiltratie platen.
      1. Verplaats de geëquilibreerde gelfiltratie platen van de carrousel naar de centrifuge en centrifugeren bij 1000 g gedurende 2 min bij 20 ° C.
      2. Breng de gel-filtratie platen van de centrifuge WTP 4-1 tot 44.
      3. Beweeg de frisse gel-filtration collector borden van CP (3-1 tot 3-4) naar WTP (5-1 5-4).
      4. Breng de in evenwicht gebracht gelfiltratie platen (WTP 4-1 naar 4-4) verse collector platen (5-1 5-4).
      5. Het schoonmaken van de werktafel, behalve posities 5-1 en 5-2 en verplaats stand 5-1 in de stand 4-1.
   3. Bereid de werktafel via de RM naar de filtraten verwerken.
      Opmerking: Voor stappen 1.5.3 om het systeem 1.6.3.5 grepen twee platen parallel en herhaalt alle stappen met de volgende twee platen.
      1. Verplaats 50 ul tips van de carrousel (4-6 en 4-7) te WTP 3-3 en 3-4.
      2. Breng de filtratie platen van CP 3-1 tot 3-2 op de werktafel (4-4 en 5-4).
      3. Verplaats de DWP (1: 100 verdunning) voor de detectie van de glucose verbruik van de CP 4-1 en 4-2 te WTP 4-2 en 5-1.
      4. Verplaats de MTP voor de tweede neerslag na filtratie van CP 8-1 en 8-2 te WTP 4-3 en 5-3.
      5. Til de filtratie platen van de collector plaats (WTP 4-4 en 5-4) en verplaats ze naar WTP 3-1 en 3-2.
   4. Bereid de analytische modules na filtratie. Om de verbruiksgoederen te verminderen, maken gebruik van dezelfde tip-set voor de stappen 1.5.4.1 en 1.5.4.3.
      1. Neem 50 pi tips en Pipetteer 10 pi aliquot van het filtraat DWP (1: 100 verdunning) voor het glucose-assay (glucose consumptie).
      2. Pipetteer 35 ul van het filtraat naar het midden van de geëquilibreerde gelfiltratie plaat en 50 pi de MTP die wordt gebruikt voor precipitatie.
      3. Herhaal stap 1.5.4.1 naar 1.5.4.2 voor de tweede filtratie plaat.
      4. Verplaats de gel-filtratie platen om de centrifuge en verplaats alle andere borden van de werktafel terug naar het huis posities in de carrousel.
      5. Herhaal stap 1.5.3.1 naar 1.5.4.4 voor de derde en vierde filtratie plaat.
      6. Na opslag van alle platen terug in de carrousel te nemen van zeer viskeuze supernatanten, zoals aangegeven door residuen in de filterplaat (high viscosity controle na de filtratiestap). Een gebrek filtraat kan leiden tot vals negatieve resultaten in de volgende analytische modules.
6. Verwijdering van de glucose via 96 putjes gelfiltratie (Taak 3 in figuur 1)
   1. Centrifugeer de gelfiltratie platen bij 1000 g gedurende 2 min bij 20 ° C.
   2. Bereid de werktafel via de robotic manipulator om de gel-filtraten verwerken.
      1. Zorg voor 50 pi tips van de carrousel (5-3 en 5-4) te WTP 3-3 en 3-4.
      2. Voor de bepaling van de resterende glucose na gel-filtratie bewegen twee MTP's van CP 9-1 en 9-2 te WTP 4-1 en 5-1.
      3. Voor de fenol-zwavelzuur methode bewegen twee MTP's van CP 8-5 en 8-6 te WTP 4-2 en 5-2.
      4. Transfer twee gelfiltratie platen van de centrifuge WTP (4-3 en 5-3).
      5. Til de gel-filtratie platen van de collector plaat (4-3 en 5-3) en verplaats ze naar WTP 3-1 en 3-2.
   3. Bereid de werktafel via de robotic manipulator om de gel-filtraten verwerken.
      Let op: Om consumables te verminderen, maken gebruik van dezelfde set-tip voor de stappen 1.6.3.1 en 1.6.3.2.
      1. Om de resterende glucose na gel-filtratie (1:10 verdunning) te detecteren neemt 50 pi tips en breng 25 ul van DDH ₂ O (WTP 1-1) om een frisse MTP. Verzamelbak 20 pl DDH ₂ O (WTP 1-1), 5 ui van lucht en 5 pl gel-filtraat en afvullen in dezelfde plaat.
      2. Voor het fenol-zwavelzuur-werkwijze pipet 20 ul van gel-filtraat MTP.
      3. Herhaal stap 1.6.3.1 en 1.6.3.2 voor de tweede gel-filtraat plaat.
      4. Breng alle borden van de werktafel terug naar het huis posities in hun carrousel.
      5. Herhaal de stappen 1.6.2.1 tot 1.6.3.4 voor de derde en vierde gelfiltratie plaat.
7. Glucose-assay Modules
   1. Bereid de werktafel via de robot manipulator aan de glucose-as uit te voerenzeg.
      1. Verplaats de DWP (1: 100 verdunning) van CP 4-1 en 4-4 te WTP 5-1 en 5-4.
      2. Verplaats alle MTP's van CP 9-5 en 9-8 te WTP 4-1 en 4-4.
      3. Neem 200 ul tips en meng de verdunning door opzuigen en afgeven van tien maal het volume van 180 pl. Dan pipet een 50 ul monster van het MTP.
      4. Herhaal stap 1.7.1.2 en 1.7.1.3 voor alle vier DWPs (1: 100 verdunning).
      5. Verwijder al DWPs (5-1 naar 5-4) vanaf de werktafel.
   2. Bereid de werktafel de glucose-assay starten.
      1. Voor de bepaling van de resterende glucose na gelfiltratie overdracht van alle MTP CP (9-1 tot 9-4) te WTP (5-1 tot 5-4).
      2. Verplaats de glucose-assay kalibratieplaat - die drie keer 50 gl van het volgende glucoseconcentraties (90, 45, 18, 9, 4,5, 1,8, 0,9, 0,45 en 0 mg / L) - van CP 9-9 tot WTP 3- 3.
      3. Neem 200 ul tips en zuig 50 pi glucose-assay reagens-mix van WTP 1-2, de eerste test te starten. Verplaats de MTP in de incubator (30 ° C bij 150 rpm gedurende 30 min).
      4. Stel het tijdschema om het programma te beginnen met 5 minuten vertraging tussen de platen.
      5. Na 30 min incubatie bewegen de platen uit de incubator naar de MTP-lezer en opnemen absorptie bij 418 en 480 nm.
      6. Na de meting bewegen de platen naar hun positie in de carrousel.
8. Bereiding van de neerslag
   Opmerking: Om te beoordelen de EPS productie uitvoeren van een precipitatie van het supernatant met 2-propanol voor en na de eerste filtratiestap. Bovendien evalueren de adsorptie van het polymeer op het filtermembraan door waarneming van vezels en vlokken in de eerste maar niet de tweede neerslag.
   Let op: Hanteer 2-propanol als een brandbare vloeistof strikt onder een zuurkast.
   1. Verwijder alle neerslag platen (CP 6-1 tot 6-4 en 8-1 naar 8-4) uit de carrousel. en voeghandmatig 150 pl 2-propanol aan elk putje met een 12,5 ml pipet meerdere stappen.
   2. Cover MTP's met een siliconen cap mat en schud bij kamertemperatuur (RT) (10 minuten bij 900 rpm). Visueel waarnemen vezel of vlok formaties na het schudden die aangeven EPS productie.
9. Fenol-zwavelzuur Method
   Let op: Hanteer geconcentreerd zwavelzuur en fenol onder een zuurkast. Fenol is een bijtend en mutagene stof.
   1. Voor het fenol-zwavelzuur methode, verwijder de platen (CP 8-5 tot 8-8) van de carrousel en plaats ze in de vloeistofverwerking systeem (positie 4-8). Voeg de calibratie plaat met 20 ul van verschillende glucoseconcentraties (10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25, 0,1, 0,05, 0 g / L) in drievoud.
   2. Plaats een afvalcontainer op positie 1, een 200 ul tip box op positie 2 en een bak 250 ml met 110 ml fenol-zwavelzuur (vers bereid op ijs with18.3 ml fenol 5% (w / v) in DDH ₂ O en 91,7 ml geconcentreerd. sulfuric zuur) op positie 3.
   3. Met een 8-kanaals pipet met 300 ul tips en breng 180 ul fenol-zwavelzuur in elke rij van de platen.
   4. Cover MTP's met deksels, meng ze door schudden (5 min bij 900 rpm, kamertemperatuur) en incubeer ze gedurende 35 minuten bij 80 ° C in een oven kleurreactie. Na het afkoelen onder een zuurkast, het meten van de extinctie bij 480 nm.
10. Selectie van EPS Positieve supernatanten (Taak 4 in figuur 1)
    1. Voor de evaluatie van EPS productie selecteert die stammen uit de geautomatiseerde screening die ten minste twee van de drie criteria voldoen positieven (viscositeitsregelende 2.6.1 en 2.6.2, detectie polymeer 2.6.3, 2.6.5 glucose-equivalent). Draagt ​​de resterende filtraten van de positieve resultaten een nieuwe MTP voor verdere verwerking.
       Opmerking: Als de platen worden afgedekt met een aluminium afsluitfolie ze bij -20 ° C gedurende ten minste één week opgeslagen. In die tijd is de Determinatie van het koolhydraat vingerafdruk moet worden uitgevoerd.

2. Koolhydraten Vingerafdruk

Opmerking: Alle stappen voor de koolhydraten vingerafdruk worden handmatig uitgevoerd.

1. Gelfiltratie van de positieve supernatanten (Taak 5 in figuur 1)
   Opmerking: Gel-filtratie is noodzakelijk omdat er geen filtraat leverde de geautomatiseerde screening. Gelfiltratie met een volume van meer dan 35 pl tot een afname zuiveringsrendement.
   1. Bereid evenwichtsinstelling van de gelfiltratie platen door intrekking 150 ui ammoniumacetaatbuffer in ieder putje 12,5 ml via een meerstaps pipet.
   2. Breng de gel-filtratie plaat in de centrifuge (2000 xg gedurende 2 min bij 20 ° C).
   3. Herhaal stap 2.1.1, 2.1.2 en 2.1.1 opnieuw. Centrifugeer de gelfiltratie plaat bij 1000 g gedurende 2 min bij 20 ° C voor verder gebruik.
   4. Pipetteer 35 ul van het filtraat inhet midden van de plaat gelfiltratie onder toepassing van een 12-kanaals pipet 50 ul.
   5. Centrifugeer de gelfiltratie plaat bij 1000 g gedurende 2 min bij 20 ° C en til deze van de verzamelplaat.
   6. Bereid de glucose-test voor hydrolyse: Voer een 1:10 verdunning door toevoeging van 45 ul van DDH ₂ O en 5 ul van gel-filtraat met een 12-kanaals 50 ul pipet en hebben betrekking op de MTP's met een siliconen cap mat.
      Opmerking: Voor de juiste bepaling van de glucosewaarde van het polymeer, het meten van het glucosegehalte vóór hydrolyse en aftrekken van het glucosegehalte gekwantificeerd na de hydrolyse stap.
   7. Bereid de pyruvaat-assay voor hydrolyse: Voer een 1:20 verdunning met behulp van een 12-kanaals 200 ul pipet tot 95 ul van DDH ₂ O, de overdracht 5 ul van gel-filtraat goed toe te voegen aan elk en sluit de MTP met een siliconen cap mat .
2. 96-well Micro Hydrolyse (Taak 6 in figuur 1)
   Opmerking: Verwarmde incubatie oven (inclusief een zandbad) tot 121 ° C gedurende ten minste 1,5 uur voor gebruik. Een speciale kleminrichting is ontwikkeld om verdamping tijdens de kleinschalige hydrolysestap voorkomen.
   1. Neem een ​​nieuwe PCR-plaat en breng 20 pl van gel-filtraat met een 12-kanaals pipet 50 ul.
      Let op: Trifluorazijnzuur is een bijtend zuur en giftig. Ammonium oplossing is bijtend. Behandel beide stoffen alleen onder een afzuigkap.
   2. Voeg 20 ul van 4 M trifluorazijnzuur met een 1,25 ml meerstaps pipet aan elk putje. Bedek de PCR-plaat met een thermoplastisch elastomeer (TPE) cap mat en plaats de PCR-plaat in de speciale kleminrichting.
   3. Meng de oplossingen via omkeren van de kleminrichting tienmaal. Zet de PCR-plaat in een centrifuge en centrifugeren bij 2000 xg gedurende 2 minuten om de vloeistof op de bodem te verzamelen. Zet de PCR-plaat terug naar de kleminrichting en zet het apparaat met schroeven.
   4. Plaats deBeveiligde kleminrichting in de voorverwarmde zandbad en incubeer gedurende 90 minuten bij 121 ° C.
   5. Verwijder de kleminrichting uit het zand bad en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
   6. Verwijder de schroeven en het draaien in een centrifuge bij 2000 xg gedurende 2 min teneinde al het condensaat aan de onderkant van de putjes verzamelen en kruisbesmetting tijdens het verwijderen van de dop mat voorkomen.
   7. Voeg 3,2% ammonia om de pH op ca. passen. 8 met een 12-kanaals pipet 200 ul. Bedek de PCR-plaat met een TPE kap mat en schud de hand met behulp van de kleminrichting.
   8. Na neutralisatie Centrifugeer de PCR-plaat bij 2000 xg gedurende 2 minuten.
3. High-throughput-1-fenyl-3-methyl-5-pyrazolon (HT-PMP) -derivatization van koolhydraten (Taak 7 in figuur 1)
   1. Pipetteer 25 ul van het geneutraliseerde hydrolysaat in een nieuwe PCR-plaat met een 12-kanaals pipet 50 ul.
      Let op: Na het nemen van het monster, check de neutralization van de resterende vloeistof in de hydrolyse plaat via het toevoegen van 12,5 pi fenolrood indicator (0,05 g fenol rood in 5 ml 20% ethanol) met een 1,25 ml multi-step pipet. Alle putten die niet om te zetten in roze kleur (pH 8) zijn niet correct gederivatiseerd.
   2. Voeg 75 ul derivatiseringsreagens-mix (125 mg PMP, 7 ml methanol, 3,06 ml DDH ₂ O, en 438 ul 3,2% ammonium oplossing) en bedek de plaat met een TPE kap mat.
   3. Na schudden van de PCR-plaat in de kleminrichting centrifuge de plaat bij 2000 xg gedurende 2 minuten om de vloeistof op de bodem accumuleren.
   4. Voor derivatisering plaats de PCR-plaat in een PCR-cycler bij 70 ° C gedurende 100 min gevolgd door afkoeling tot 20 ° C.
   5. Breng 20 pl monster in een nieuwe MTP met behulp van een 12-kanaals pipet 50 ul. Maak dan gebruik van een 12-kanaals 200 ul pipet en voeg 130 ul 19,23 mM azijnzuur (0,962 ml 1 M azijnzuur + 49,038 ml DDH ₂ O) om elke lijn. Meng direct via aspiratING en het afgeven van (minimaal zes keer) en de overdracht van alle de vloeistof naar een 0,2 urn filter plaat met een MTP collector plaat.
   6. Centrifugeer de plaat (1000 g gedurende 5 minuten), verwijder de filterplaat, sluit de MTP met een siliconen cap mat en plaats de MTP in de UHPLC UV-ESI-MS voor de bepaling van het koolhydraat vingerafdruk ^14.
4. Voorbereiding van de Glucose-assay
   1. Voer een 1:10 verdunning via het toevoegen van 45 ul van DDH ₂ O en 5 ui geneutraliseerde hydrolysaat met behulp van een 12-kanaals 50 ul pipet en hebben betrekking op de MTP's met een siliconen cap mat. Voeg driemaal 50 gl van verschillende glucose standaarden (500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2,5 en 0 uM) in nieuw MTP gebruikt voor kalibratie.
   2. Voeg 50 ul van glucose-assay reagens-mix (recept step1.2.3) met een 12-kanaals pipet 50 ul. Bedek de platen met een siliconen cap mat en incubeer bij 30 ° C en 400 rpm gedurende 30 min in een MTP-incubator.
5. Bereiding van de pyruvaat-assay
   1. Voer een 1:20 verdunning onder toepassing van een 12-kanaals pipet 200 ul. Voeg 95 ul van DDH ₂ O en overdracht 5 pl geneutraliseerde hydrolysaat aan elk putje. Bedek de MTP met een siliconen cap mat.
   2. Voeg 100 ul van pyruvaat-assay reagens-mix (3 ml 1 mM N - (carboxymethylamino-carbonyl) -4.4'-bis (dimethylamino) difenylamine natriumzout (DA-64), 300 gl 10 mM thiaminepyrofosfaat, 60 ui 100 mM magnesiumchloride hexahydraat, 2,4 ml 500 mM kaliumfosfaat puffer (pH 5,7), 30 ul 100 E pyruvaat oxidase, 12 ui 1000 AL mierikswortelperoxidase en 24,19 ml DDH ₂ O) met behulp van een 12-kanaals 200 ul pipet.
   3. Bedek de borden met een siliconen cap mat eennd incuberen bij 37 ° C en 150 rpm gedurende 30 min. Direct na de incubatie maatregel absorptie in een MTP-reader bij 727 en 540 nm.
6. Evaluatie van alle resultaten van de geautomatiseerde screening en de Koolhydraten vingerafdrukken.
   1. Kennis te nemen van die monsters die show daalde sedimentatie na de belangrijkste cultuur platen werden gecentrifugeerd en terug opgeslagen in de carrousel (controle van de viscositeit stap 1.4.1). Monsters die niet vorming pellet vertonen positief zijn (criterium 1 voor geautomatiseerde screening).
   2. Kennis te nemen van zeer viskeuze supernatanten, die door resten in de filter plaat worden aangegeven na de filtratiestap (hoge viscositeit controle stap 1.5.4.6). Een gebrek filtraat kan leiden tot een vals negatief resultaat de volgende analytische modules. Monsters die kweeksupernatanten te handhaven in de filter-wells zijn positief (ook criterium 1 voor geautomatiseerde screening).
   3. Visueel waarnemen vezel of vlok formatie na incubatie. Maak notities zoals thwil geeft polysacchariden. Beoordeel geen neerslag met (-); weinig neerslag van vezels of vlokken met (+) en hoge neerslaan met (++). Verder detecteren adsorptie van het polymeer op het filtermembraan door observatie van vezels en vlokken in de eerste maar niet de tweede precipitatie (criterium 2 voor geautomatiseerde screening).
   4. Voer een lineaire kalibratie voor het berekenen van de glucoseconcentratie.
      
      Klik hier om een grotere versie van deze vergelijking te bekijken.
   5. Voer de lineaire kalibratie (absorptie via concentratie) tussen 5 en 0,1 g / l glucose. Berekening van de glucose-equivalent van de gehydrolyseerde polymeren en evalueren volgende parameters: glucose-equivalent:> 700 mg / L = positief; 300-700 mg / L = vermeende positieve; <300 mg / L = negatief ten opzichte van EPS-indelingion (criterium 3 voor geautomatiseerde screening).
      
      Klik hier om een grotere versie van deze vergelijking te bekijken.
   6. Kwantificeren alle koolhydraten bepaald met de HT-PMP methode. Kortom alle hoeveelheden en te evalueren als volgt:> 300 mg / L (positief); 150-300 mg / L (vermeende positief) en <150 mg / L (negatief).
   7. Voor de berekening van de pyruvaat concentratie voeren een lineaire kalibratie (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5 en 0 uM). Om de resterende pyruvaat in de bovenstaande vloeistof uit te sluiten, corrigeer de pyruvaatgehalte na hydrolyse via de pyruvaatgehalte voor hydrolyse.
      
      Klik hier om een grotere versie van deze equat bekijkenion.

Representative Results

De validatie van het fenol-zwavelzuur methode toonde goede resultaten met een coëfficiënt van bepaling (r²) van 0,9998 (tabel 2). Voor de 5 g / L concentratie de variatiecoëfficiënt (CV) en de nauwkeurigheid toonde een goede prestatie met 1,8% en 2,2% fout, maar lagere prestaties voor de 0,25 g / l standaard met 5,3% (CV) en 6,1% fout ( Vooroordeel).

De coëfficiënten van de bepaling van zowel pyruvaat-assay ijkcurves (met en zonder matrix) waren> 0,9999 in een ijkreeks 150 pM (Tabel 3). De variatiecoëfficiënten (CV) voor de hoogste en laagste kalibratieniveau waren <4,6% en de nauwkeurigheid liet een zeer goede prestatie over het volledige kalibratiebereik met minder dan 3,9% fout. Aldus is de matrix van de hydrolysestap vertoonde geen invloed op de enzymatische test, dat derhalve MEAure pyruvaat voor en na hydrolyse.

Tabel 4 toont de gedetailleerde resultaten van drie illustratieve nieuwe stammen evenveel succes geïdentificeerd met de screeningsplatform. Het linkerdeel van de tabel de resultaten van de geautomatiseerde screening modules oprichtingsverklaring viscositeit polymeerproductie en het glucose-equivalent van de totale hydrolyse die werden gebruikt als evaluatie parameters voor gedetailleerde koolhydraten vingerafdrukanalyse. Het koolhydraat vingerafdruk gebaseerd op gekalibreerde suikers onbekende suikers, dimeren en substituenten zijn in het rechterdeel van de tabel. Door gebruik van deze informatie de monomere samenstelling kan worden berekend en vergeleken met reeds bekende polymeerstructuren. Verder kan een gerichte screening interessante monomere samenstellingen en zeldzame koolhydraten worden uitgevoerd.

De hoge prestaties van de microschaal hydrolyse en de HT-PMP-derivatisering werden aangetoond in onze eerdere werk ^14. Bovendien hebben de validatie van de gel-filtratie en het koolhydraat vingerafdruk van verschillende genera beschreven in een andere publicatie ^6. Samenvattend kan de screeningsplatform met de modulaire opbouw eenvoudig worden gewijzigd en aangepast aan de individuele behoeften van de gebruiker. De geautomatiseerde screening van het platform maakt een acht keer hogere doorvoer en geeft betrouwbare resultaten. Nieuwe analytische modules zoals pyruvaat-assay kan worden geïntegreerd en in combinatie met het koolhydraat vingerafdrukanalyse zij zeer gedetailleerde informatie over de geïdentificeerde EPS. Daarbij, de screening platform is van essentieel belang bij het zoeken naar zowel licht gewijzigd en geheel nieuwe EPS varianten.

Figuur 1: Algemeen schema van de modulaire hoge-throughput screening exopolysaccharide platform. De geautomatiseerde screening bestaat uit de eerste drie taken. Na bacteriën in 96-putjes platen gekweekt, worden de cellen afgecentrifugeerd (taak 1) en een 96-well filtratie (opdracht 2). Vervolgens worden de resterende monomere suikers uit het kweekmedium worden verwijderd via een 96-well gelfiltratie (opdracht 3). De EPS-bevattende monsters worden onderzocht in opdracht 4. De koolhydraten vingerafdruk van de screening platform bevat de laatste drie taken. Het resterende filtraat van de positieve hits van taak 2 vormt de basis voor de gel-filtraat task 5. Na hydrolyse in 6 taak het koolhydraat vingerafdruk kan via de HT-PMP methode geanalyseerd (high-throughput 1-fenyl-3-methyl -5-pyrazolon, taak 7). Alle taken worden gevolgd door verschillende analytische modules en / of een controle van de viscositeit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Robot worktable instelling van de screeningsplatform outs van zowel vloeibare handlingrobot werktafels getoond:. (A) robot vloeistofverwerkingsysteem en (B) vloeistof behandelingsstation. (A) De opstelling bestaat uit een microplaat drager met twee posities (posities 1-1 tot 1-2), een drager voor wegwerpnaalden met vier posities (posities 2-1 tot 2-4) en drie microplate dragers met vier posities elk (posities 3-1 tot 3-4, 4-1 tot 4-4 en 5-1 naar 5-4). Daarnaast is er een opslag carrousel met vijf hotel dragers (1-5) elk zeven diepe putjes (DWP) en vier hotel dragers (6-9) elk voor 21 micro-titer platen. De hardware op de liquid handling robot geïnstalleerd is een 96-kanaals-pipet-arm voor gebruik met wegwerp tips en een robot manipulator (RM) die platen / apparatuur beweegt between de werktafel, de opslag carrousel, de MTP-reader, de centrifuge en het schudden-incubator. (B) De vloeistofverwerking station is voorzien van een vloeistofverwerking arm en een 8-kanaals 300 ul pipet, een afvalcontainer op positie 1, een tip adapter met 300 gl tips (stand 2), een hoogte adapter 30 met 250 ml goot (positie 3) en vijf hoogte adapter 60 voor MTP (positie 4-8). De nummering van de posities in dit protocol genoemd. Alternatieve werktafels kunnen ook worden gebruikt als er gelijkwaardige setups beschikbaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: pyruvaatgehalte van 16 commercieel verkrijgbare polymeren bepaald via pyruvaat-assay. Na 1 g / l polymeeroplossings werden gehydrolyseerd en geneutraliseerd werd de pyruvaat-test uitgevoerd vanaf een 1:10 verdunning (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Stroomdiagram van de modulaire high-throughput screening platform. De geautomatiseerde screening systeem, dat verscheidene polysaccharide detectiemodules combineert: analyse van de vorming viscositeit polymeerproductie en bepaling van het totale koolhydraatgehalte. Het tweede deel geeft een gedetailleerde monosaccharide analyse voor alle geselecteerde EPS producenten die in het eerste deel. Alle gegevens van de geautomatiseerde screening en de gegevens van het koolhydraat vingerafdruk via UHPLC-ESI-MS worden verzameld in een database en maken de eenvoudige identificatie van structureel verwante varianten van already bekend EPS of nieuwe EPS en daarom een gerichte screening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Belangrijkste stap / Analytische module	workflow	Observatie / Omschrijving
Teelt van de stammen	1 ml EPS-medium een Pre-cultuur 48 uur, 30 ° C, 1000 rpm een Main-cultuur 48 uur, 30 ° C, 1000 rpm een	Productie van EPS
Cell verwijdering / viscositeit	Centrifugatie: 30 min bij 4300 xg	Geen pellet = verhoogde viscositeit = positief
Detectie van Polymer: Neerslag	50 ui supernatant + 150 pl 2-propanol b Schudden 10 minuten bij kamertemperatuur en 900 rpm b	Visueel: Vezels en schilfers = positieve neerslaan van polymeer
Cell verwijdering / hoge viscositeit	180 ul supernatant van de belangrijkste-cultuur Centrifugatie: 10 min bij 3000 xg 1,0 pm glasvlies	Geen filter passerende = hoge viscositeit = positief
Detectie van Polymer: Neerslag	50 pl filtraat + 150 pl 2-propanol b Schudden 10 minuten bij kamertemperatuur en 900 rpm b	Visueel: Vezels en schilfers = positieve neerslaan van polymeer
Glucose consumptie: Glucose-assay	Verdunning 1: 100: 10 pl filtraat + 990 pl DDH 2 O 50 pi aliquot + 50 pl Reagent-mix Incubatie 30 minuten bij 30 ° C 150 rpm Meting 418-480 nm	Resterende glucose na de teelt
Gelfiltratie	equilibratie: 3 x 150 gl NH 4 -acetat pH 5,6 2 x 2 min bij 2000 xg 1 x 2 min bij 1000 xg Gelfiltratie: 35 pl filtraat, 2 min bij 1000 xg wassen: 3 x 150 pl DDH 2 O, 2 min bij 2000 xg 75 ui 20% ethanol voor opslag	Polymeer zuivering: Verwijdering van zouten, pyruvaat, glucose en andere suiker monomeren uit de teelt bovendrijvende
Resterende glucose na gelfiltratie Glucose-assay	Verwatering 01:10: 25 ul DDH 2 O + 20 pl DDH 2 O en 5 pl filtraat + 50 pi reagens-mix Meting 418-480 nm	Aftrekken resterende glucose na gelfiltratie van het fenol-zwavelzuur methode
Glucose-equivalent: Fenol-zwavelzuur methode c	20 gl gel-filtraat + 180 gl fenol-zwavelzuur (30 ul 5% (w / v) fenol in DDH 2 O + 150 pi geconcentreerd. H 2 SO 4 (ρ = 1,84 g / ml)) Shaking 5 min bij 900 rpm Incubatie 35 minuten bij 80 ° C Meting bij 480 nm	Glucose-equivalent: Δ (fenol-zwavelzuur waarde - resterende glucose na gel-filtratie) <300 mg / l negatief > 300 tot <700 mg / l vermeende positieve > 700 mg / l positief
een Behandeld handmatig onder steriele omstandigheden (laminaire stroming).
b Brandbare vloeistof handmatig verwerkt in het kader van een zuurkast.
c Fenol-zwavelzuur behandeld met Brand Liquid Handling Station (LHS) onder een zuurkast.

Tabel 1:. Volledige workflow van geautomatiseerde prescreening de robot vloeistofverwerkingsysteem en de vloeistofverwerking station Overzicht van alle parameters voor de geautomatiseerde analytische modules.

lineariteit			LOD	LOQ
r² een	helling een	offset een	mg / l	mg / l
0,9998	0,0007	-0,021	50	100
Standaard		Mean b	Precision b	nauwkeurigheid b
mg / l		mg / l	CV%	Bias (% fout)
5000		5112	1.8	2.2
250		265	5.3	6.1
een gemiddelde van acht metingen kalibratie van zes niveaus glucose 0,1 tot 5 g / l
b Uitgevoerd met een t-test van Student (α = 0,05; n = 8).
LOD: bepalingsgrens, LOQ: bepaalbaarheidsgrens, CV: variatiecoëfficiënt.

Tabel 2:Validatie van het fenol-zwavelzuur methode werd uitgevoerd met de vloeistofverwerking station uitgevoerd. De lineariteit werd berekend op basis van een zes puntkalibratie (n = 8). Mean, precisie en nauwkeurigheid van twee exemplarisch gekozen glucose concentraties worden hier gegeven.

	lineariteit			LOQ
	r² een	helling een	offset een	uM
zonder matrix	0,99999	0,0223	-0,0019	1
1:10 verdund matrix	0,99999	0,0221	-0,0011	1
	Standaard	Mean b	Precision b	nauwkeurigheid b
	uM	uM	CV%	Bias (% fout)
zonder matrix	50	49.96	3.05	-0,09
	1	1.04	2.95	3.86
1:10 verdund matrix	50	49.98	0.44	-0.04
	1	1.00	4.58	0.33
een gemiddelde van drie metingen, kalibratie zes concentraties pyruvaat 1 tot 50 uM.
b (n = 3)
LOQ: bepaalbaarheidsgrens, CV: variatiecoëfficiënt.

Tabel 3:. Validatie van de pyruvaat-assay met en zonder een 1:10 verdund geneutraliseerd trifluorazijn- zuur-matrix Twee zes puntkalibraties (n = 3) met en zonder matrix evaluatie van invloeden uitgevoerd. Gemiddelde, precisie en nauwkeurigheid van twee exemplarisch gekozen pyruvaat concentraties zonder effecten van een 1:10 verdunning berekend.

Tabel 4:.. De resultaten van de drie voorbeeldige stammen gescreend met het platform gegevens verzameld uit de geautomatiseerde screening en de koolhydraten vingerafdruk Gelieve clik hier om deze tabel te downloaden als Microsoft Excel-bestand.

Koolhydraat	Absorptie max [nm]	Absorptie bij 480 nm gemiddelde ± SD		Absorptie ten opzichte van glucose [%]
diutangom	470	0,342	± 0.010	187
gellangom	472	0,334	± 0.002	183
guargom	478	0,387	± 0.017	212
Gummi arabisch	476	0,393	± 0.034	215
Hyaluronzuur	484	0,231	± 0,011	126
karayagom	478	0,455	± 0.023	249
konjacgom	480	0,297	± 0,009	163
Larch gum	480	0,337	± 0,032	185
Johannesbroodpitmeel	478	0,354	± 0,033	194
scleroglucan	484	0,168	± 0010	92
Succinoglycan	482	0,168	± 0.005	92
taragom	480	0,318	± 0,016	174
tragacanth	478	0,513	± 0.003	281
welan gum	472	0.226	± 0,016	124
xylan 472	0,567	± 0.007	311
xanthaangom	482	0,245	± 0.021	134
Glucose	484	0,191	± 0,014	100
SD: standaardafwijking

Tabel 5:. Resultaten zoals verkregen door fenol-zwavelzuur methode voor 16 de handel verkrijgbare polymeren en glucose Het absorptiemaximum en absorptie bij 480 nm van 16 commercieel verkrijgbare polymeren (1 g / l) en glucose (1 g / l ) werden gemeten toepassing van fenol-zwavelzuur methode. De absorptie ten opzichte van glucose van de polymeren werd berekend.

	Standaard	Gemiddelde	Precision een	Accuracy een
	mg / l	mg / l	CV%	Bias (% fout)
1:10 verdunning	450	460	1.01	2.14
	45	44.7	1.41	-0,70
1: 100 verdunning	4500	5026	1.19	11.6
	450	471	1.16	4.55
b Uitgevoerd met een t-test van Student (α = 0,05; n = 8).
CV: variatiecoëfficiënt.

Tabel 6:. Validatie van geautomatiseerde verdunning van het glucose-assay De verdunning van het glucose-assay na kweken (1: 100) en na gelfiltratie (01:10) gevalideerd. Twee glucoseconcentraties (n = 8) werden verdund via de vloeistofverwerking systeem en geëvalueerd. Mean, precisie en nauwkeurigheid werden berekend.

Theoretische glucosewaarde	Bedekt met siliconen cap mat			Test van verdamping (onbedekt)
	betekenen	Precision een	Accuracy een	betekenen	Precision een	Nauwkeurigheid a </ Strong>	Verdamping
mg / l	mg / l	CV %	Bias (% fout)	mg / l	CV %	Bias (% fout)	%fout
45.0	45.2	0.69	0.44	46.0	0.66	2.05	1.60
18.0	17.7	0.80	-1,68	18.0	0.72	-0.01	1.69
9.0	8.74	1.20	-2,98	8.92	0.81	-0,95	2.09
4.5	4.50	1.26	-0.04	4.58	1.57	1.76	1.80
1.8	1.85	0.74	2.90	2.01	2.82	11.6	8.48
0.9	1.03	1.43	14.1	1.16	3.52	28.3	12.4
a (n = 4)
CV: variatiecoëfficiënt.

Tabel 7:. Evaluatie van het effect van verdamping en bedekte MTP Zes verschillende glucose standaarden (n = 4) werden in de carrousel gedurende 3,5 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het effect van de verdamping werd geëvalueerd door gebruikmaking als deksel met deksel (silicium mat) standaardmonsters. Mean, precisie, nauwkeurigheid en de verdamping in% fout werden berekend.

Vóór gelfiltratie <td> 25.1

	Na gelfiltratie		Resterende glucose na gelfiltratie
	betekenen	SD een		betekenen	SD een
	mg / l	mg / l	mg / l	mg / l	%
1	8647	110	259	121	3.00
2	5108	56	116	37	2.27
3	2014	12	50.8	14	2.52
4	1015	12	8.1	2.47
5	510	4.9	12.8	4.3	2.51
6	223	8.6	6.6	1.5	2.94
7	122	5.6	4.3	0.9	3.48
8	75	6.0	3.1	0.3	4.18
a (n = 8)
SD: standaardafwijking

Tabel 8:. Resultaten van de gel-filtratie-efficiëntie Acht verschillende glucose standaarden werden bepaald voor en na gelfiltratie om de efficiëntie van de gelfiltratie evalueren. Gemiddelde, standaarddeviatie en resterende glucose na gelfiltratie in% berekend.

Discussion

Polysaccharide detectie met fenol-zwavelzuur methode: Verschillende monosacchariden tonen verschillende absorptiemaxima en molaire extinctie coëfficiënten met behulp van deze methode ^9. Dit resulteert in verschillende absorptiemaxima van polymeren, die verschillende suikers in verschillende hoeveelheden. De verschillende golflengten van absorptiemaxima voor 16 verschillende commerciële polymeren worden in tabel 5. De polymeren werden opgelost (1 g / l) in DDH ₂ O, geroerd (150 rpm) gedurende de nacht en gemeten met fenol-zwavelzuur-werkwijze . Diutangom toonde de laagste absorptiemaxima bij 470 nm en scleroglucan en hyaluronzuur de hoogste bij 484 nm. Op basis van deze resultaten werd 480 nm gekozen voor deze screening platform. De relatieve absorptie van de polymeren werd berekend op basis van de absorptie verkregen met 1 g / l glucose (ingesteld op 100%). De laagste resultaten werden verkregen met scleroglucan en succinoglycan, beide met 92%. Dit was expecteerde omdat scleroglucan bevat alleen glucose en succinoglycan bevat glucose en galactose in een verhouding van 7: 1. Zowel commerciële polymeren hebben verschillende verliezen drogen en verschillende asgehalte, dit is de reden waarom de theoretische waarde van ~ 110% niet bereikt. Xylan toonde de hoogste relatieve absorptie met 311%. De reden hiervoor is de hoge molaire extinctiecoëfficiënt bereikt van xylose door het meer dominante furanose vorm. In een gehalte van 0,1 g / L glucose werd de detectielimiet bereikt, evenals de detectielimiet bij een concentratie <0,05 g / l. De detectielimiet voor positieve spanningen in de screening hoger is dan 0,7 g / L en Aldus was de zuiverheid presteerde goed. Om betrouwbare resultaten, de resterende glucose na gelfiltratie werd bepaald met een glucose-assay en deze waarde werd afgetrokken van de waarde van het fenol-zwavelzuur methode.

Geautomatiseerde glucose-assay verdunning: De voorstellingvan de glucosebepaling na kweken (verdunning 1: 100) werd onderzocht. Hiervoor werden 10 pl supernatant overgebracht naar 990 ul van DDH ₂ O in een diepe put plaat en gemixt via tien keer opzuigen en afgeven van 180 ul van deze verdunning. De tweede kritische stap was het correct pipetteren van slechts 5 pl aliquot van de 1:10 verdunning van de glucose-analyse na gelfiltratie. Om de verdunning 25 pl DDH ₂ O genereren overgebracht met een 50 eerste ul-tip werd vervolgens 20 ul DDH ₂ O en 5 pl gel-filtraat elkaar afgezogen. Dit zorgt voor een betere verwijdering van de 5 pl aliquot uit de punt. Beide verdunningsstappen werden geverifieerd met verschillende glucose standaarden via een glucose-assay. De resultaten van twee voorbeeldige concentraties zijn in tabel 6 de 1:. 100 verdunning voor het bepalen van het glucosegehalte na kweken vertoonden grote nauwkeurigheid voor beide standaarden met een CV & #60; 1,2%. Tegelijkertijd de nauwkeurigheid voor de hogere standaard was tot 11,6 (% fout). Dit is echter verwaarloosbaar als glucosebepaling vertegenwoordigt alleen de resterende glucosegehalte na kweek en daarom niet van belang voor het polymeer detectie. De verdunning van 1:10 voor de resterende glucose na gel-filtratie toonde zeer betrouwbare resultaten met een CV <1,4% en een nauwkeurigheid <2,1% fout.

Behandeling verdamping: The screening vereist 3,5 h uit de eerste stap om de eerste glucose-assay. Om te weten te komen, of dit tijdsbestek heeft een invloed op de afgetopte MTP opslag, 50 pi glucose-assay kalibratienormen werden opgeslagen met en zonder dekking voor 3,5 uur in de robot carrousel. In de kalibratie bereik (45 tot 4,5 mg / l) nauwelijks gestegen het monster concentratie. Een toename - door verdamping - was onder 2,1% en alleen de twee laagste concentraties (1,8 en 0,9 mg / l) reikte tot 12,4% (

Gelfiltratie: hoge hoeveelheden niet-gemetaboliseerd glucose verstoren de kwantitatieve detectie van glucose uit het gehydrolyseerde polymeer. Daarom werd een gel-filtratiestap vereist om de resterende glucose na kweek te verwijderen. Bovendien, de gelfiltratie zuivert het polymeer bevattende supernatant van zouten en koolhydraten monomere verbindingen, andere dan glucose, de analytische achtergrond in het monomeer analyse te minimaliseren. Voor deze gelfiltratie stap 35 pl van het filtraat werden in het midden van de put. Om waarmerking van de robuustheid van gelfiltratie in het automatische systeem werden acht kalibratienormen van 0,045 tot 9 g / l glucose gefiltreerd (n = 8). Het glucosegehalte van elke concentratie werd steeds met meer dan 95% van de oorspronkelijke waarde (Tabel 8). Daarbij de gel-filtratie vertoonde zeer goede resultaten in verschillende concentraties glucose. Daarnaast is de resterende glucose na gel-filtration werd ook bepaald met een glucose-assay en afgetrokken van het fenol-zwavelzuur wil om de juiste hoeveelheid glucose-equivalent te ontvangen voor het gehydrolyseerde polymeer.

Pyruvaat-assay: Ten eerste werd onderzocht of het geneutraliseerd en verdund (1:10) TFA-matrix van de hydrolysestap interfereert met de enzymatische reactie. Daarom werd de volledige test tweemaal uitgevoerd, eenmaal met en eenmaal zonder matrix en toonde betrouwbare resultaten. Tenslotte werd de pyruvaatgehalte van 16 commercieel verkrijgbare polymeren succes gemeten en is weergegeven in figuur 3. Het is algemeen bekend dat uit deze 16 polymeren alleen succinoglycan en xanthaan bevatten van nature pyruvaat. Met onze pyruvaat-assay beide polymeren werden correct geïdentificeerd. In scleroglucan werd welan gom en xylaan pyruvaat ook gedetecteerd in significante hoeveelheden. Kortom, het vermogen van de werkwijze werd gevalideerd en pyruvaat-assay showed een high performance. Het bleek te kunnen detecteren pyruvaat verschillende polymeren na hydrolyse.

Koolhydraten vingerafdruk: Na het uitvoeren van alle analytische modules in de geautomatiseerde screening, werden potentiële EPS producenten geselecteerd voor de koolhydraten vingerafdruk analyse. Hiervoor zijn verschillende criteria toegepast: 1) positieve waarneming van viscositeit na centrifugeren en / of na filtratie. 2) Neerslag vóór en na filtratie. Waargenomen vezels en vlokken werden beoordeeld als positief. 3) Glucose tegenwaarde van de fenol-zwavelzuur methode. Waarden> 700 mg / l werden als positieve waarden tussen 300 en 700 mg / l werden als vermeende EPS producenten. Wanneer twee of drie criteria werd beoordeeld als positief werden de stammen geselecteerd voor verdere koolhydraten vingerafdrukanalyse. De criteria kunnen worden aangepast op de individuele doel van de EPS screening (bijvoorbeeld lage viscositeit EPS). Onze aanpak gericht op het vinden efficient EPS producenten. Bij het zoeken naar stammen die alleen produceren kleine hoeveelheden EPS de evaluatie grens van het glucose-equivalent te verlagen.

Technische voordeel en toekomstige toepassingen: Een interessante eigenschap van dit protocol is het modulaire karakter van de stappen en de verschillende analytische modules. Ze kunnen worden gecombineerd op verschillende manieren, aangepast aan de individuele behoeften en nieuwe modules kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd. Bovendien kan de analytische modules afzonderlijk worden gebruikt, bijvoorbeeld de hydrolyse module in combinatie met de HT-PMP-derivatisatie module kan een monomere samenstelling analyse uit te voeren van verschillende polymeeroplossingen (1 g / l) in 96-well formaat. Laboratorium zonder toegang tot een vloeistofverwerking moet de gehele screening kan handmatig worden verwerkt zonder enige veranderingen in de regeling pipetteren. Het gebruik van een vloeistofverwerking verhoogt de doorvoersnelheid tot 768 stammen (in plaats van 192 stammen als Screened handmatig) per dag. Het protocol dat hier wordt beschreven, kan een screening voor verschillende genera en derhalve voor het screenen van grote stammenverzamelingen op nieuwe EPS producenten te identificeren en analyseren hun koolhydraat vingerafdruk in een benadering (figuur 4). Bovendien kan een doelgerichte screening op polysacchariden met zeldzame suikers zoals fucose, uronzuren of onbekende suikers worden uitgevoerd via de gedetailleerde monosaccharide analyse. Ook kunnen verschillende combinaties suiker in gedefinieerde verhoudingen worden gedetecteerd. Dit maakt de eenvoudige identificatie van structureel verwante varianten van reeds bekende of nieuwe EPS EPS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well deep well plate 2.0 ml (DWP)	Greiner Bio-One	780271	Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990 µl of ddH2O
Breathable Sealing Film	Axygen	BF-400-S	Incubation film for pre- and main-culture DWP
Aluminum Sealing Film	Axygen	PCR-AS-200	-80 °C storage film for glycerol-stock plates
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl	TECAN	30038619	Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)
A/B glass-filter-plate 1 µm	Pall Corporation	PN 8031	Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well micro titer plate V-Bottom	Greiner Bio-One	651201	Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well SpinColumn G-25	Harvard Apparatus	74-5612	Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)
96-well micro titer plate V-Bottom	Nunc	249944	Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips	TECAN	30038609	Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)
Trough 250 ml	Axygen	Res-SW96-HP	Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetate buffer pH 5.6 (CP 5-7)
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)	Greiner Bio-One	655101	precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)
96-well silicon cap mat	Whatmann	7704-0105	Cover mat for MTP
200 µl pipette tips	Sarstedt	70.760.002	For manually handling
1,000 µl pipette tips	Sarstedt	70.762	For manually handling
96-well-PCR micro titer plate	Brand	781350	Hydrolysis, PMP-derivatisation
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat	Brand	781405	Hydrolysis, PMP-derivatisation
Filter plate 0.2 µm Supor	Pall Corporation	PN 8019	Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate
Pipette Tips LHS 5-300 µl	Brand	732150	Brand LHS system
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133	Glucose-assay
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich	P6782	Glucose-assay, pyruvat-assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt)	Wako Chemicals GmbH	043-22351	Pyruvat-assay
Pyruvate oxidase	Sigma-Aldrich	P4591	Pyruvat-assay
Potassium phosphate dibasic	Carl-Roth	P749.3	Pyruvat- and glucose-assay
Potassium phosphate monobasic	Carl-Roth	3904.3	Pyruvat- and glucose-assay
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Pyruvat-assay
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	31413	Pyruvat-assay
2-Propanol	VWR	20922.466	Precipitation
Phenol	VWR	20599.231	Phenol-sulfuric-acid method
Sulfuric acid	Carl-Roth	4623.4	Phenol-sulfuric-acid method
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508	Hydrolysis
Ammonium solution	Carl-Roth	P093.1	Hydrolysis, PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	Hydrolysis, PMP-derivatization
Phenol red	Alfa Aesar	B21710	Hydrolysis, PMP-derivatization
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone	Sigma-Aldrich	M70800	PMP-derivatization
Methanol LC-MS	VWR	83638.320	PMP-derivatization
Acetonitril LC-MS	VWR	83040.320	PMP-derivatization
Acetic acid	Sigma-Aldrich	338826	PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	PMP-derivatization
Methyl red	Alfa Aesar	36667	pH-value
Robotic liquid handling system	Tecan	Freedom EVO	Worktable setup in Figure 2
Liquid handling station LHS	Brand	709400	Worktable setup in Figure 2
Tip-Adapter	Brand	709434	Worktable setup in Figure 2
Liquid Ends MC 20-300 µl	Brand	709416	Worktable setup in Figure 2
Adapter 60 mm	Brand	709430	Worktable setup in Figure 2