Automatiserad Modular hög genomströmning exopolysackarid Screening Plattform Tillsammans med högkänslig Carbohydrate Fingerprint Analysis

Abstract

Många mikroorganismer är kapabla att producera och utsöndra exopolysackarider (EPS), som har viktiga implikationer i medicinska områden, livsmedelsapplikationer eller i ersättning av oljebaserade kemikalier. Vi beskriver en analytisk plattform som skall automatiseras på ett vätskehanteringssystem som tillåter en snabb och tillförlitlig analys av den typ och den mängd EPS produceras av mikroorganismer. Det gör det möjligt för användaren att identifiera nya naturliga mikrobiella exopolysackarid tillverkare och analysera kolhydrat fingeravtryck av motsvarande polymerer inom en dag i hög genomströmning (HT). Med hjälp av denna plattform, kan stam samlingar samt bibliotek av stamvarianter som kan erhållas i tekniska metoder screenas. Plattformen har en modulär konfiguration, som tillåter en separation av protokollet i två huvuddelar. Första finns det en automatiserad screeningssystem, som kombinerar olika polysackarid detekteringsmoduler: en semikvantitativ analys av viscosity bildning via ett centrifugeringssteg, en analys av polymerbildning via alkoholutfällning och fastställandet av hela kolhydratinnehållet via en fenol-svavelsyra-syra transformation. Här är det möjligt att screena upp till 384 stammar per körning. Den andra delen ger en detaljerad monosackarid analys för alla valda EPS producenter som anges i den första delen genom att kombinera två viktiga moduler: en analys av hela monomerkompositionen via ultra-high performance vätskekromatografi i kombination med ultraviolett och elektro jonisering jonfälla detektering ( UHPLC-UV-ESI-MS) och bestämningen av pyruvat som en polymer substituent (närvaro av pyruvat ketal) via enzymatisk oxidation som är kopplad till en färgbildning. Alla analysmodulerna i detta screening-plattform kan kombineras på olika sätt och anpassas till individuella behov. Dessutom kan de alla hanteras manuellt eller utföras med en vätskehanteringssystem. Därigenom, screening platform möjliggör en stor flexibilitet för att identifiera olika EPS.

Introduction

Mikrobiella exopolysackarider (EPS) är en strukturellt mycket skiftande grupp av polymerer som uppfyller olika biologiska funktioner. De brukar är byggda av komplexa upprepade enheter, som kännetecknas av olika typer av monomerer (socker, sockerderivat, sockersyror), banden mellan dessa monomerer och deras byten. Den strukturella mångfald av mikrobiella polysackarider ger ganska olika egenskaper till medlemmarna i denna molekyl klass, vilket gör att deras tillämpning i olika områden som livsmedel ^1, kosmetika ^2,3, byggkemi ⁴ eller vattenrening ^5. För att ytterligare utvidga tillämpningsområdet för dessa biobaserade och sådana hållbara polymerer identifiering av nya naturliga mikrobiella polysackarider samt konstruktion av strukturella varianter representerar lovande metoder. Hursomhelst, är en snabb screeningmetod som krävs för att snabbt scanna ett stort antal mikrobiella stammar för their polysackarid bildning och att analysera deras produkter. Därför har vi nyligen utvecklat en 96-brunn HT-screening plattform för analys av mikrobiell polysackarid produktion från naturliga isolat eller konstruerade stamvarianter som omfattar identifiering av den monomera sammansättningen ^6.

Att tillämpa denna plattform för en första screeningrunda ~ 500 naturliga isolat tillät oss att identifiera endast omkring 10 till 20% av de isolerade stammarna som kan producera EPS (data visas ej). Detta innebär att 80-90% av de analyserade stammarna inte producera EPS enligt de villkor som gäller, och därför inte var nödvändigt att göra en ytterligare analys av den detaljerade kolhydrat fingeravtryck. Eftersom detta mycket sofistikerad identifiering av den monomera sammansättningen är en tidskrävande process, särskilt för analys av data, till en snabb pre-screeningmetoden identifiera de stammar positiva i EPS-produktion, skulle drastiskt öka effektiviteten. Vidare reagenser,förbrukningsmaterial och mättid på UHPLC-UV-ESI-MS skulle minska. Dessutom, de olika analysmodulerna, medan på ena sidan göra metoden mycket tillförlitlig, är å andra sidan att komplicera manuell hantering av mer än två 96-brunnars plattor parallellt, och som sådan begränsar den fulla potentialen av metoden. Av dessa skäl beslutade vi att utveckla en automatiserad screening plattform. Därför kombinerade vi den modulära formatet för befintliga kolhydratfingeravtrycksteknik med en helautomatisk snabb detekteringsmetod av det totala sockerinnehållet, baserat på absorbans mätning.

Fenol-svavelsyra-syrametoden utgör fortfarande den viktigaste metoden för den snabba bestämningen av hela kolhydratinnehållet av bakterie- och växtpolysackarider ^7,8. Denna metod beskrevs först av et al. Dubois ⁹ och anpassas för olika tillämpningar och provstorlekar, även för småskalig i 96-brunnsplattor ^10,11. den phenol-svavelsyra-syrametoden mäter den totala kolhydrathalten genom ett värde, summerings alla monomera, oligomera och polymera kolhydrater av proverna.

Ta hänsyn till dessa aspekter, är viktigt att välja en lämplig odlingsmedium för att tillämpa denna metod. Komplexa media innehållande oligomera eller polymera kolhydratföreningar såsom jästextrakt kan leda till en förändrad polymerinnehåll och därför bör strikt undvikas. Vidare är höga mängder av sockerarter användas som C-källa för odling av stammarna. Höga nivåer av kvarvarande kolhydrater från odlingsprocessen kan negativt påverka mätningen av EPS innehåll.

Därför är användningen av definierade och rena sockerarter rekommenderas. I våra experiment har vi använt glukos för odling av cellerna. Den återstående glukos efter odling minskades via en gel-filtrering och bestäms via en glukosanalys. Slutligen, glukos motsvarandes av polysackariderna beräknades genom att subtrahera den kvarvarande glukos efter gel-filtrering från den totala kolhydratinnehållet som hade upptäckts med fenol-svavelsyra-syrametoden. Gel-filtrering och glukos-analys i kombination med fenol-svavelsyra-syrametoden garantera tillförlitliga resultat och kan vara vår första, helt automatiserad system för upptäckt.

Två nya analysmodulerna ingick i automatiserad screening plattform för att öka mängden information från systemet EPS-detektion: nederbörden och observation av en ökning i viskositet.

Många olika EPS - t.ex. succinoglykan, xantan och kolonsyra ¹² - rapporteras ändras med en icke-kolhydrat pyruvat ketal socker positioner C4 och C6. Dessa pyruvat ketaler (precis som succinyl halvestrar och uronsyror) bidrar till polyanjoniska natur och därför den fysiska properties av polymeren genom att interagera via divalent katjon bryggor ^13. För att identifiera dessa särskilda polymerer fastställandet av pyruvat bildades som en annan ytterligare analysmodul. Detta ökar information om polysackarid substituenter och deras potentiella makroskopiska egenskaper.

Kombinera alla moduler möjliggör identifiering av olika EPS samt en snabb och effektiv bestämning av EPS producenter. Genom detta tillvägagångssätt screening plattformen kunde delas in i två huvuddelar (Figur 1). Inom automatiserad screening (del I) arbetsflödet sker helautomatisk (tabell 1) för att snabbt förvälja EPS stammar. Kolhydrat fingeravtryck analys (del II) bestämmer kvantitativt monomerkompositionen av EPS som produceras av de förvalda stammar. Därigenom var dataanalysen minimeras för att optimera screening av stora stam samlingar. Dettaerbjuder möjligheten att analysera 384 stammar i en enda automatiserad screeningskörning och med två körningar som möjligt per dag av 768 stammar per dag. Dessutom ger kolhydratfingeravtrycksanalysen en ännu mer detaljerad översikt över alla identifierade EPS. Detta möjliggör den riktade analys och identifiering av endast något olika EPS-varianter eller helt nya jämfört med de redan beskrivna kemiska strukturerna av EPS.

Protocol

1. Automatiserad Screening

Obs: Alla steg vätskehanterings görs med vätskehanteringssystem ett robotsystem. Sammansättningen av robotarbetsbordet presenteras i figur 2. Alla förbrukningsvaror är lagrade i lagringskarusellen, om inte annat nämns. För alla de automatiserad screening stegen a robotmanipulator (RM) förflyttar de förbruknings, (djup brunnsplatta (DWP); mikrotiterplatta (MTP); polymeraskedjereaktion platta (PCR-platta) och så vidare) mellan karusellpositioner (CP ) och arbetsbordet positioner (WTP). Alla pipett steg utförs med en 96-kanal-pipett-arm, utom om det är annat nämns. Alla steg programmeras och utförs automatiskt i 96-brunnsformat.

1. Stam Odling (Uppgift 1 i figur 1)
   Obs: Hantera inokulering av de förmodade EPS stammar och förseglings av odlingsplattor under sterila betingelser (laminärt flöde). den automatiseradesnabb screening kan hantera fyra 96-brunnars plattor per körning. Olika stammar av flera släkten redan testat ^sex.
   1. inokulera manuellt pre-kultur (1 ml EPS-medier i en DWP) med en 96-stifts replikator från en 96-brunnars glycerol moderplatta. Täck plattan med en andningsbar tätningsfilm för att undvika avdunstning och för att möjliggöra luftning. Inkubera vid 30 ° C under 48 h vid 1000 rpm på en MTP-skakanordning.
   2. Ympa huvudkulturen (990 pl EPS-media i en DWP) genom att överföra 10 | il av förodling med hjälp av en 50 ^ 12-kanals multi-pipett och inkubera under samma villkor som pre-kultur. Ta en del av alla de påfrestningar som inte växer.
2. Framställning av roboten bordet och Storage Carousel
   1. Ge alla förbrukningsartiklar som anges i material och utrustning till rätt läge i lagringskarusellen. Lägg 990 pl dubbelt destillerat vatten (DDH ₂ O) i varje brunn i DWP för 1: 100 späd för the glukos-analys (karusell ställning 4-1 till 4-4).
   2. Ordna en 250 ml tråg innehållande 150 ml DDH ₂ O vid arbetsbordet läge (WTP) 11.
   3. Deponera en 250 ml tråg innehållande 50 ml glukos-analysreagens-mix (4 ml 500 mM kaliumfosfat (pH 5,7), 1,5 ml 50 mM 2,2-azinobis- (3ethylbenzthiazoline) -6-sulfonsyra, 2 ml 100 U glukosoxidas, 10 pl 1000 U pepparrotsperoxidas och 42,49 ml DDH ₂ O) vid position WTP 1-2.
   4. Placera två tomma dummy F bottnade MTPs vid position WTP 3-1 och 3-2.
   5. Avlägsna andas tätningsfilmen, fördela de viktigaste kulturer i karusellen positionerna (CP) 1-1 till 1-4 och starta den automatiska robotprogrammet.
3. Utjämning av gelfiltrering Plates
   Notera: gelfiltreringen plattor som används under denna screening kan återanvändas. För detta, tvätta och centrifugera tre gånger vardera med 150 pl av DDH ₂ O vid 2000 xg under 2 minuter vid 20 ° C. Efteråt förvaras vid 4° C med 75 | il av 20% etanol och täck med ett kisellock matta.
   1. Flytta 250 ml tråg (CP 07/05) med 5 mM ammoniumacetatbuffert (pH 5,6) till WTP 3-3.
   2. Överföra gel-filtreringsplattor (CP 1-6, 1-7, 2-6 och 2-7) från karusellen till WTPs 01/04 till 04/04.
   3. Aspirera 150 pl ammoniumacetatbuffert med användning av 200 | il tips och dispensera in i centrum av alla gel-filtreringsplattor för ekvilibrering.
   4. Överföra gel-filtreringsplattor till centrifugen (2.000 x g under 2 minuter vid 20 ° C).
   5. Överför plattorna tillbaka till arbetsbordet, upprepa steg 1.3.3, 1.3.4 och 1.3.3. Upprepa inte centrifugeringssteget för att undvika uttorkning av gel-filtreringsplattor. Förvara ekvilibrerade gel-filtreringsplattor tillbaka i karusellen.
4. Cell borttagning via centrifugering (Uppgift 1 i figur 1)
   Notera: För att säkerställa en låg bakgrund inom screening, analysera cellfrittEPS endast innehållande supernatanter och avlägsna celler genom centrifugering efter odling.
   1. Överföra den huvudsakliga-kulturen DWP från karusellen (1-1 till 1-4) i centrifug (4300 xg under 30 min vid 20 ° C).
   2. Förbereda arbetsbordet via RM att bearbeta huvudkulturen.
      Obs! För steg 1.4.2 till 1.4.3.5 systemet hanterar alltid två plattor parallellt och upprepar alla steg med de närmaste två plattorna sedan.
      1. För utfällning före filtreringen flytta MTP från CP 6-1 och 6-2 till WTP 4-1 och 5-1. Flytta pH-indikator MTPs från CP 7-1 och 7-2 till WTP 4-2 och 5-2.
      2. Överför filtreringsplattan tillsammans med samlingsplattan från CP 2-1 och 2-2 till WTP 4-3 och 5-3. Flytta huvud kultur DWP 1-1 och 1-2 från centrifugen till WTP 4-4 och 5-4.
      3. Förbered analysmodulerna.
         Obs: Ta 200 pl tips från spetsen lagring (position 2-1 till 2-4). För att minska förbruknings använder samma spets-set för steg 1.4.3.1.
         1. Överföra 180 fil av huvud-kultursupernatanten till filtreringsplattan. Aspirera 150 pl från huvud kultursupernatanten och fördela 50 pl in i MTP för fällning före filtrering och 100 pl till pH-indikatorplattan.
            Obs: pH-bestämningen är inte nödvändigt; emellertid, efter tillsats av 12,5 ml metylrött-indikator (50 mg i 50 ml etanol) i varje brunn med en flerstegs pipett den indikerar höga syraproducerande stammar. Denna information kan vara användbar för att undvika tillväxthämning (vid lågt pH) för ytterligare odlingar, t.ex. för en andra screening med högre koncentration buffert. Dessutom kan lågt pH även inducera EPS produktion för att skydda cellen mot den sura miljön.
         2. Upprepa steg 1.4.3.1 för andra huvudodlingsplatta. Använd en ny spets-set.
         3. Flytta filtreringsplattorna till centrifugen och ta bort alla andra plattor från arbetsbordet tillbaka till sina utgångslägen i carousel.
         4. Upprepa steg 1.4.2.1 till 1.4.3.3 för det tredje och fjärde huvudodlingsplatta.
         5. Ta en del av dessa fermentationsbuljonger, som visar minskad sedimentation efter centrifugering av de viktigaste odlingsplattor, när de överförs tillbaka till karusellen (viskositetskontroll) den.
5. 96-brunnars Filtrering för Complete Cell Removal (Task 2 i figur 1)
   Obs! För att säkerställa cell tas bort från viskös fermenteringsbuljong ett filtreringssteg ingår i screeningen.
   1. Centrifugera filtrerings plattorna vid 3000 xg under 10 min vid 20 ° C och föra dem tillbaka till deras karusell hempositionen.
   2. Framställa de gel-filtreringsplattor.
      1. Flytta de ekvilibrerade gel-filtreringsplattor från karusellen till centrifugen och snurra vid 1000 xg under 2 minuter vid 20 ° C.
      2. Överför gel-filtreringsplattor från centrifugen till WTP 4-1 till 44.
      3. Flytta färsk gel-filtration uppsamlingsplattor från CP (3-1 till 3-4) och WTP (5-1 till 5-4).
      4. Överför ekvilibrerade gel-filtreringsplattor (WTP 4-1 till 4-4) till färska uppsamlingsplattor (5-1 till 5-4).
      5. Städa upp arbetsbordet utom positionerna 5-1 och 5-2 och flytta positionen 5-1 till position 4-1.
   3. Förbereda arbetsbordet via RM att bearbeta filtraten.
      Obs! För steg 1.5.3 till 1.6.3.5 systemet hanterar två plattor parallellt och upprepar alla steg med de närmaste två plattorna.
      1. Flytta 50 il tips från karusellen (4-6 och 4-7) till WTP 3-3 och 3-4.
      2. Överför filtreringsplattorna från CP 3-1 till 3-2 på arbetsbordet (4-4 och 5-4).
      3. Flytta DWP (1: 100 utspädning) för detektering av glukoskonsumtion från CP 4-1 och 4-2 till WTP 4-2 och 5-1.
      4. Flytta MTP för det andra fällnings efter filtrering från CP 8-1 och 8-2 ​​till WTP 4-3 och 5-3.
      5. Lyft filtreringsplattorna från samlingsplattans (WTP 4-4 och 5-4) och flytta dem till WTP 3-1 och 3-2.
   4. Förbered analysmodulerna efter filtrering. För att minska förbruknings använder samma spets-uppsättning för steg 1.5.4.1 och 1.5.4.3.
      1. Ta 50 ^ tips och pipettera en 10 | il alikvot av filtratet till DWP (1: 100 utspädning) för glukos-analys (glukoskonsumtion).
      2. Pipettera 35 | il av filtratet till centrum av den jämviktade gelén-filtreringsplatta och 50 | j, l till MTP som används för utfällning.
      3. Upprepa steg 1.5.4.1 till 1.5.4.2 för andra filtreringsplattan.
      4. Flytta gel-filtreringsplattor till centrifugen och flytta alla andra plattor från arbetsbordet tillbaka till hemmet positionerna i karusellen.
      5. Upprepa steg 1.5.3.1 till 1.5.4.4 för det tredje och fjärde filtreringsplatta.
      6. Efter lagring av alla plattorna igen i karusellen noterar högviskösa supernatanter, såsom indikeras av residualerna i filterplattan (hög viscosity kontroll efter filtreringssteget). En brist på filtrat kan leda till falskt negativa resultat i följande analysmodulerna.
6. Avlägsnande av glukos via 96-brunnars Gel-filtrering (Task 3 i figur 1)
   1. Centrifugera gel-filtreringsplattor vid 1000 xg under 2 minuter vid 20 ° C.
   2. Förbereda arbetsbordet via robotmanipulator att bearbeta de gel-filtraten.
      1. Ge 50 il tips från karusellen (5-3 och 5-4) till WTP 3-3 och 3-4.
      2. För bestämningen av den återstående glukos efter gel-filtrering flytta två MTPs från CP 9-1 och 9-2 till WTP 4-1 och 5-1.
      3. För fenol svavelsyra-syrametoden flytta två MTPs från CP 8-5 och 8-6 till WTP 4-2 och 5-2.
      4. Överför två gel-filtreringsplattor från centrifugen till WTP (4-3 och 5-3).
      5. Lyfta gel-filtreringsplattor från samlingsplattan (4-3 och 5-3) och flytta dem till WTP 3-1 och 3-2.
   3. Förbereda arbetsbordet via robotmanipulator att bearbeta de gel-filtraten.
      Obs: För att minska förbruknings använder samma spets-set för steg 1.6.3.1 och 1.6.3.2.
      1. För att detektera den återstående glukos efter gelfiltrering (1:10 spädning) tar 50 ^ tips och överför 25 | il DDH ₂ O (WTP 1-1) till ett nytt MTP. Aspirera 20 pl av DDH ₂ O (WTP 1/1), 5 | il av luft och 5 | il av gel-filtratet och fördela i samma platta.
      2. För fenol svavelsyra-syra-metod pipett 20 ul av gel-filtratet till MTP.
      3. Upprepa steg 1.6.3.1 och 1.6.3.2 för andra gel-filtrat platta.
      4. Överför alla plåtar från arbetsbordet tillbaka till utgångslägen i deras karusell.
      5. Upprepa steg 1.6.2.1 till 1.6.3.4 för det tredje och fjärde gel-filtreringsplatta.
7. Glukos-analysmoduler
   1. Förbereda arbetsbordet via robotmanipulator för att utföra den glukos-assäga.
      1. Flytta DWP (1: 100 utspädning) från CP 4-1 och 4-4 till WTP 5-1 och 5-4.
      2. Flytta alla MTPs från CP 9-5 och 9-8 till WTP 4-1 och 4-4.
      3. Ta 200 mikroliter tips och blanda utspädningen genom att aspirera och fördela tio gånger volymen av 180 | il. Överför sedan en 50 pl portion till MTP.
      4. Upprepa steg 1.7.1.2 och 1.7.1.3 för alla fyra DWPs (1: 100 utspädning).
      5. Ta bort alla DWPs (5-1 till 5-4) från arbetsbordet.
   2. Förbereda arbetsbordet för att starta glukos-analysen.
      1. För bestämningen av den återstående glukos efter gel-filtrering överföra alla MTPs från CP (9-1 till 9-4) till WTP (5-1 till 5-4).
      2. Flytta glukos-analysen kalibreringsplatta - innehållande tre gånger 50 pl av följande glukoskoncentrationer (90, 45, 18, 9, 4,5, 1,8, 0,9, 0,45 och 0 mg / L) - från CP 9-9 till WTP 3- 3.
      3. Ta 200 mikroliter tips och aspirera 50 pl glukos-analysreagens-mix från WTP 1-2, för att starta den första analysen. Flytta MTPs i inkubatorn (30 ° C vid 150 rpm under 30 min).
      4. Ställ in tidsplanen för att starta programmet med fem minuters fördröjning mellan plattorna.
      5. Efter 30 min av inkubation flytta plattorna från inkubatorn till MTP-läsaren och spela in absorbans vid 418 och 480 nm.
      6. Efter mätningen flytta plattorna till deras utgångsposition i karusellen.
8. Beredning av Utfällning
   Obs: För att kunna bedöma EPS produktionen utföra en utfällning av supernatanten med 2-propanol före och efter den första filtreringssteget. Vidare utvärdera adsorption av polymeren på filtermembranet genom observation av fibrer och flingor i den första, men inte i det andra utfällning.
   Varning: Hantera 2-propanol som en brandfarlig vätska strikt under ett dragskåp.
   1. Ta bort alla fällningsplattorna (CP 6-1 till 6-4 och 8-1 till 8-4) från karusellen. och lägga tillmanuellt 150 pl 2-propanol till varje brunn med en 12,5 ml flerstegs pipett.
   2. Täcka alla MTPs med en silikonlock matta och skaka vid rumstemperatur (RT) (10 min vid 900 rpm). observera visuellt fiber eller fling formationer efter skakning som indikerar EPS produktion.
9. Fenol-svavelsyra-syra Metod
   Varning: Hantera koncentrerad svavelsyra-syra och fenol i ett dragskåp. Fenol är en frätande och mutagent medel.
   1. För fenol svavelsyra-syrametoden, ta bort plattorna (CP 8-5 till 8-8) från karusellen och placera dem i vätskehanteringssystemet (Position 4-8). Inkludera kalibreringsplattan med 20 pl olika glukoskoncentrationer (10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,25, 0,1, 0,05, 0 g / L) i tre exemplar.
   2. Placera en avfallsbehållare i position 1, en ​​200 l spets rutan vid position 2 och en 250 ml tråg med 110 ml fenol-svavelsyra-syra (nygjord på is with18.3 ml fenol 5% (w / v) i DDH ₂ O och 91,7 ml konc. sulfuric syra) vid position 3.
   3. Använd en 8-kanals pipett med 300 pl tips och överföra 180 ul fenol-svavelsyra-syra i varje rad av alla plattorna.
   4. Täcka alla MTPs med lock, blanda dem genom att skaka (5 min vid 900 rpm, RT) och inkubera dem i 35 min vid 80 ° C i en ugn under färgreaktion. Efter nedkylning i ett dragskåp, mät extinktionen vid 480 nm.
10. Val av EPS Positiv Supernatanter (Task 4 i figur 1)
    1. För utvärderingen av EPS produktion, välja de stammar från den automatiserade screeningen som uppfyller åtminstone två av de tre kriterierna som positiva (viskositetsreglering 2.6.1 och 2.6.2, detektion av polymer 2.6.3, glukos motsvarande 2.6.5). Överför återstående filtraten från de positiva träffar på en ny MTP för vidare bearbetning.
       Anmärkning: När plattorna är täckta med en aluminiumförslutningsfilm de kan lagras vid -20 ° C under minst en vecka. Inom den tiden faststälning av kolhydrat fingeravtryck behöver utföras.

2. Kolhydrat Fingerprint

Obs: Alla steg för kolhydrat fingeravtryck manuellt utförs.

1. Gel-filtrering av Positiv Supernatanter (Task 5 i figur 1)
   Notera: Gel-filtrering är nödvändig eftersom det inte finns något filtrat kvar från den automatiserade screeningen. Gelfiltrering med en volym på mer än 35 il resulterar i minskad effektivitet rening.
   1. Förbered utjämning av gel-filtreringsplattor genom dispense 150 pl ammoniumacetatbuffert i alla brunnar via en 12,5 ml flerstegs pipett.
   2. Överför gelfiltrering plattan i centrifugen (2.000 x g under 2 minuter vid 20 ° C).
   3. Upprepa steg 2.1.1, 2.1.2 och igen 2.1.1. Centrifugera gelfiltrering plattan vid 1000 xg under 2 minuter vid 20 ° C före vidare användning.
   4. Pipett 35 ul filtrat tillcentrum av den gel-filtreringsplattan med användning av en 12-kanals 50 l pipett.
   5. Centrifugera gelfiltrering plattan vid 1000 xg under 2 minuter vid 20 ° C och lyft sedan det från samlingsplattan.
   6. Förbered glukos-analysen före hydrolys: Utför en 1:10 spädning genom att tillsätta 45 | il av DDH ₂ O och 5 | il av gel-filtratet med en 12-kanals 50 | j, l pipett och täcka MTPs med en silikonlock matta.
      Obs: För korrekt bestämning av glukosvärdet av polymeren, mäta glukoshalten innan hydrolys och subtrahera det från glukosinnehållet kvantifieras efter hydrolyssteget.
   7. Förbered pyruvat-analysen innan hydrolys: Utför en 1:20 utspädning med en 12-kanal 200 l pipett för att lägga till 95 l av DDH ₂ O, överföring 5 pl gel-filtratet till varje brunn och försegla MTP med en silikonlock matta .
2. 96-brunnars mikro Hydrolys (Task 6 i figur 1)
   Obs: Värm uppinkubationen ugn (inklusive ett sandbad) till 121 ° C under minst 1,5 h före användning. En speciell klämanordning utvecklades för att undvika avdunstning under den lilla skalas hydrolyssteget.
   1. Ta en ny PCR-plattan och överför 20 | il av gel-filtratet med en 12-kanals 50 l pipett.
      Varning: Trifluorättiksyra är en frätande syra och giftig. Ammoniumlösning är frätande. Hantera både kemikalier endast under ett dragskåp.
   2. Tillsätt 20 | il av 4 M trifluorättiksyra med en 1,25 ml flerstegs pipett till varje brunn. Sedan täcka PCR-platta med en termoplastisk elastomer (TPE) cap matta och placera PCR-plattan i den speciella fastspänningsanordning.
   3. Blanda lösningarna via invertera klämanordningen tio gånger. Sätta PCR-plattan i en centrifug och spinn vid 2000 xg under 2 minuter för att samla all vätska i botten. Sätt PCR-plattan tillbaka till fastspänningsanordningen och säkring av enheten med skruvar.
   4. Placerasäkrade fastspänningsanordning i den förvärmda sandbad och inkubera i 90 minuter vid 121 ° C.
   5. Ta bort klämanordningen från sandbadet och låt den svalna till RT.
   6. Ta bort skruvarna och snurra igen i en centrifug vid 2000 xg under 2 min för att samla in all kondensat i botten av brunnarna och för att förhindra korskontaminering under avlägsnande av locket mattan.
   7. Lägg 3,2% ammoniaklösning för att justera pH till ca. 8 med användning av en 12-kanals 200 l pipett. Täck PCR-plattan med en TPE cap matta och skaka den manuellt med klämanordningen.
   8. Efter neutralisation centrifugera PCR-plattan vid 2000 xg under 2 minuter.
3. High-throughput-1-fenyl-3-metyl-5-pyrazolon (HT-PMP) -derivatization av kolhydraterna (Task 7 i figur 1)
   1. Transfer 25 pl av den neutraliserade hydrolysatet i en ny PCR-platta med hjälp av en 12-kanal 50 l pipett.
      Obs: Efter att ha tagit portionen, kontrollera neutralization av den kvarvarande vätskan i hydrolys plattan via tillsats av 12,5 pl fenolrött indikator (0,05 g fenolrött i 5 ml 20% etanol) med en 1,25 ml flerstegs pipett. Alla brunnar som inte förvandlas till rosa färg (pH 8) är inte korrekt derivatiseras.
   2. Lägg 75 pl derivatisering reagens-blandning (125 mg PMP, 7 ml metanol, 3,06 ml DDH ₂ O och 438 | j, l 3,2% ammonium-lösning) och täcka plattan med en TPE cap matta.
   3. Efter skakning av PCR-plattan i klämanordningen centrifugera plattan vid 2000 xg under 2 minuter för att ackumulera all vätska i botten.
   4. För derivatisering plats PCR-plattan i en PCR-cycler vid 70 ° C under 100 minuter följt av nedkylning till 20 ° C.
   5. Överför en 20 pl alikvot i en ny MTP med en 12-kanal 50 l pipett. Använd sedan en 12-kanal 200 l pipett och tillsätt 130 l 19,23 mM ättiksyra (0,962 ml 1 M ättiksyra + 49.038 ml DDH ₂ O) till varje linje. Blanda direkt via aspirating och dispensering (minst sex gånger) och överföra all vätska till en 0,2 um filterplatta med en MTP samlingsplattan.
   6. Centrifugera plattan (1000 x g under 5 min), ta bort filterplattan, försegla MTP med en silikonlock matta och placera MTP in i UHPLC-UV-ESI-MS för bestämning av kolhydrat fingeravtryck ^14.
4. Framställning av glukos-analysen
   1. Utföra en 1:10 spädning via tillsats av 45 | il av DDH ₂ O och 5 ul av neutraliserat hydrolysat med användning av en 12-kanals 50 | j, l pipett och täcka MTPs med en silikonlock matta. Lägga tre gånger 50 pl av olika glukosstandarder (500, 250, 100, 50, 25, 10, 5, 2,5 och 0 ^ M) i ett annat MTP används för kalibrering.
   2. Tillsätt 50 pl av glukos-analysreagens-mix (recept step1.2.3) med användning av en 12-kanals 50 l pipett. Sedan täcka plattorna med ett kisellock matta och inkubera vid 30 ° C och 400 rpm under 30 min i en MTP-inkubator.
5. Framställning av Pyruvat-analysen
   1. Utför en 1:20 utspädning med en 12-kanal 200 l pipett. Lägg 95 pl av DDH ₂ O och överförings 5 pl av neutraliserat hydrolysat till varje brunn. Täck MTP med en silikonlock matta.
   2. Tillsätt 100 pl av pyruvat-analysreagens-mix (3 ml 1 mM N - (karboximetylamino-karbonyl) -4.4'-bis (dimetylamino) -difenylamin natriumsalt (DA-64), 300 | j, l 10 mM tiaminpyrofosfat, 60 | j, l 100 mM magnesiumklorid-hexahydrat, 2,4 ml 500 mM kaliumfosfat puffer (pH 5,7), 30 | al 100 U pyruvatoxidas, 12 | il 1000 U pepparrotsperoxidas och 24,19 ml DDH ₂ O) med användning av en 12-kanals 200 l pipett.
   3. Täck plattorna med en kisellock matta ennd inkubera vid 37 ° C och 150 rpm under 30 min. Direkt efter inkubation åtgärd absorbans i en MTP-läsare vid 727 och 540 nm.
6. Utvärdering av alla resultat av automatiserad screening och kolhydrater fingeravtryck.
   1. Ta del av de prover som visar minskad sedimentation efter de viktigaste odlingsplattor har centrifugeras och lagras tillbaka till karusellen (viskositetsreglerande steg 1.4.1). Prover som inte visar pelletbildning är positiva (kriterium 1 för automatiserad screening).
   2. Ta del av högviskösa supernatanter, vilka anges med residualer i filterplattan efter filtreringssteget (hög viskositet styrsteget 1.5.4.6). En brist på filtrat kan leda till ett falskt negativt resultat i följande analysmodulerna. Prover som upprätthåller odlingssupernatanter i filter-brunnar är positiva (också kriterium 1 för automatiserad screening).
   3. observerar visuellt fiber eller flinga bildning efter inkubation. Anteckna som thsäga indikerar polysackarider. Betyg ingen fällning med (-); låg utfällning av fibrer eller flingor med (+) och hög utfällning med (++). Vidare detekterar adsorption av polymeren på filtermembranet via observation av fibrer och flingor i den första, men inte i det andra fällnings (kriterium 2 för automatiserad screening).
   4. Utföra en linjär kalibrering för att beräkna glukoskoncentrationen.
      
      Klicka här för att se en större version av denna ekvation.
   5. Utför linjär kalibrerings (absorption över koncentration) mellan 5 och 0,1 g / L glukos. Beräkning av glukos motsvarar de hydrolyserade polymerer och utvärdera genom följande parametrar: glukos motsvarande:> 700 mg / L = positiv; 300-700 mg / L = förmodade positiv; <300 mg / L = negativt med avseende på EPS-formatjon (kriterium 3 för automatiserad screening).
      
      Klicka här för att se en större version av denna ekvation.
   6. Kvantifiera alla kolhydrater bestäms med HT-PMP-metoden. Summera alla mängder och utvärdera enligt följande:> 300 mg / L (positiv); 150-300 mg / L (förmodad positiv) och <150 mg / L (negativ).
   7. För beräkningen av pyruvat koncentrationen utföra en linjär kalibrerings (100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5 och 0 ^ M). För att utesluta de återstående pyruvat i supernatanten, korrigera pyruvat innehåll efter hydrolys via innehållet pyruvat före hydrolys.
      
      Klicka här för att se en större version av denna equatJon.

Representative Results

Valideringen av fenol-svavelsyra-syrametoden visade goda resultat med en graden (R ^) av 0,9998 (tabell 2). För 5 g / L koncentration variationskoefficienten (CV) och noggrannheten visade goda resultat med 1,8% och 2,2% fel, men lägre prestanda för 0,25 g / L standard med 5,3% (CV) och 6,1% fel ( Partiskhet).

Koefficienterna fastställandet av såväl pyruvat-analyskalibreringskurvor (med och utan matris) var> 0,9999 i ett kalibreringsintervall på 150 ^ M (tabell 3). Variationskoefficienterna (CV) för högsta och lägsta kalibreringsnivån var <4,6% och noggrannheten visade en mycket god prestanda över hela kalibreringsintervallet med mindre än 3,9% fel. Sålunda matrisen från hydrolyssteget visade ingen effekt på enzymatisk analys, som alltså kan till measure pyruvat före och efter hydrolys.

Tabell 4 visar de detaljerade resultaten av tre exempel på nya stammar som framgångsrikt identifierats med screening plattform. Den vänstra delen av tabellen visar resultaten av de automatiserade screening moduler om viskositetsbildning, polymerframställning och glukos motsvarande från total hydrolys som användes som utvärderingsparametrar för detaljerad kolhydratfingeravtrycksanalys. Kolhydrat fingeravtryck baserat på kalibrerade sockerarter såväl som okända sockerarter, dimerer och substituentema anges i den högra delen av tabellen. Genom användning av denna information den monomera kompositionen kan beräknas och jämföras med tidigare kända polymerstrukturer. Vidare kan utföras en riktad screening för intressanta mono kompositioner och sällsynta kolhydrater.

Den höga prestandan av mikroskala hydrolys och HT-PMP-derivatisering visades i vårt tidigare arbete ^14. Dessutom har validering av gel-filtrering och kolhydrat fingeravtryck för olika släkten beskrivits i en annan publikation ^sex. Sammanfattningsvis kan screenings plattform med sin modulära struktur lätt modifieras och anpassas till individuella krav på användaren. Den automatiserade screeningen av plattformen möjliggör en åtta gånger högre genomströmning och ger tillförlitliga resultat. Nya analysmoduler i form av pyruvat-analysen kan integreras och i kombination med kolhydratfingeravtrycksanalys de ger mycket detaljerad information om de identifierade EPS. Därigenom är screening plattform viktigt när man söker efter både något modifierade och helt nya EPS varianter.

Figur 1: Övergripande schema över modul hög kapacitet exopolysackarid screening plattform. Den automatiserade screeningen innefattar tre första uppgifterna. Efter bakterier odlas i 96-brunnsplattor, avlägsnas cellerna genom centrifugering (uppgift 1) och en 96-brunnars filtrerings (uppgift 2). Då, är de kvarvarande monomera sockerarter från tillväxtmediet avlägsnades via ett 96-brunnars gelfiltrering (uppgift 3). EPS innehållande prover utvärderas i uppgift 4. Kolhydrat fingeravtryck av screening plattformen innehåller de senaste tre uppgifter. Den återstående filtrat av de positiva träffar från uppgiften 2 utgör grunden för den gel-filtratet i uppgift 5. Efter hydrolys i uppgift 6 kolhydrat fingeravtryck kan analyseras via HT-PMP-metoden (high-throughput en-fenyl-3-metyl -5-pyrazolon, uppgift 7). Alla uppgifter följs av olika analysmoduler och / eller en viskositetskontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Robot arbetsbord setup för screening plattform layouter för både flytande hanteringsrobot arbetsbord visas. (A) robotvätskehanteringssystem och hanteringsstation (B) vätska. (A) Installationen består av en mikrobärare med två lägen (positionerna 1-1 till 1-2), en bärare för engångsspetsar med fyra positioner (positioner 2-1 till 2-4) och tre mikrobärare med fyra lägen vardera (positionerna 3-1 till 3-4, 4-1 till 4-4 och 5-1 till 5-4). Dessutom finns det en lagringskarusell med fem hotellbärare (1 till 5) vardera för sju djupa brunnsplattor (DWP) och fyra hotellbärare (6-9) vardera för 21 mikro titer-plattor. Den installerade på vätskerobothantering hårdvara är en 96-kanal-pipett-arm för användning med engångsspetsar och en robot manipulator (RM) som flyttar plattor / utrustning between arbetsbordet, lagringskarusellen, MTP-läsare, centrifugen och skaka-inkubator. (B) Stationen vätskehanterande är utrustad med en flytande arm hantering och en 8-kanals 300 l pipett, en avfallsbehållare i position 1, en ​​spetsadapter med 300 ul tips (position 2), en höjd adapter 30 med en 250 ml tråg (position 3) och fem höjd adapter 60 för MTPs (position 4-8). Numreringen av positionerna kallas hela detta protokoll. Alternativa arbetsbord kan också användas om det finns motsvarande inställningar tillgängliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Pyruvat innehåll av 16 kommersiellt tillgängliga polymerer bestäms via pyruvat-analys. Efter 1 g / L polymerlösnings hydrolyserades och neutraliserades, var pyruvat-analys utförd av en 1:10 utspädning (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Flödesschema av det modulära high-throughput screening plattform. Den automatiserade screeningsystem som kombinerar olika polysackarid detekteringsmoduler: analys av viskositetsbildning, polymerproduktion och bestämning av det totala kolhydratinnehållet. Den andra delen ger en detaljerad monosackarid analys för alla valda EPS producenter som anges i den första delen. Alla data från den automatiska screening och data från kolhydrat fingeravtryck via UHPLC-ESI-MS samlas i en databas och möjliggöra enkel identifiering av strukturellt besläktade varianter av ALREady kända EPS eller nya EPS och därför en riktad screening. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Huvud steg / Analytisk modul	arbetsflöde	Observation / Beskrivning
Odling av stammarna	1 ml EPS medel en Pre-kultur 48 timmar, 30 ° C, 1000 rpm en Main-kultur 48 timmar, 30 ° C, 1000 rpm en	Produktion av EPS
Cell borttagning / viskositet	Centrifugering: 30 min vid 4300 xg	Ingen pellet = ökad viskositet = positivt
Upptäckt av Polymer: Nederbörd	50 pl SUpernatant + 150 pl 2-propanol B Skakning 10 min vid RT och 900 rpm b	Visuella: Fibrer och flingor = positivt utfällning av polymer
Cell borttagning / hög viskositet	180 pl supernatant av huvud kultur Centrifugering: 10 min vid 3000 xg 1,0 fim glasfibermembran	Inget filter passerar = hög viskositet = positivt
Upptäckt av Polymer: Nederbörd	50 pl filtrat + 150 pl 2-propanol B Skakning 10 min vid RT och 900 rpm b	Visuella: Fibrer och flingor = positivt utfällning av polymer
Glukoskonsumtion: Glukos-analys	Spädning 1: 100: 10 pl filtrat + 990 l DDH 2 O 50 pl alikvot + 50 ^ Reagent-mix Inkubation 30 minuter vid 30 ° C 150 rpm Mätning 418-480 nm	Återstående glukos efter odling
Gelfiltrering	jämviktsinställning: 3 x 150 | il NH 4 -acetat-buffert pH 5,6 2 x 2 min vid 2000 xg 1 x 2 min vid 1000 xg Gelfiltrering: 35 | j, l filtrat, 2 min vid 1000 xg Tvättning: 3 x 150 | j, l DDH 2 O, 2 min vid 2000 xg 75 | il 20% etanol för förvaring	Polymer rening: Borttagning av salter, pyruvat, glukos och andra socker monomerer från odling supernatant
Återstående glukos efter gel-filtrering Glukos-analys	Utspädning 1:10: 25 | j, l DDH 2 O + 20 l DDH 2 O och 5 pl filtrat + 50 ^ il reagens-mix Mätning 418-480 nm	Subtraktion av återstående glukos efter gelfiltrering från fenol-svavelsyra-syrametoden
Glukos motsvarande: Fenol-svavelsyra-syrametoden c	20 | j, l gel-filtrat + 180 | il fenol-svavelsyra-syra (30 | il 5% (vikt / volym) fenol i DDH 2 O + 150 | il konc. H 2 SO 4 (ρ = 1,84 g / ml)) Skakning 5 min vid 900 rpm Inkubation 35 min vid 80 ° C Mätning vid 480 nm	Glukos motsvarande: Δ (fenol-svavelsyra-syratal - återstående glukos efter gel-filtrering) <300 mg / L negativ > 300 och <700 mg / L förmodade positiv > 700 mg / L positiv
en hanteras manuellt under sterila förhållanden (laminärt flöde).
b Brandfarlig vätska hanteras manuellt i ett dragskåp.
c Fenol-svavelsyra-syra hanteras med Brand Vätskehantering Station (LHS) under ett dragskåp.

Tabell 1:. Komplett arbetsflöde av den automatiserade prescreening med vätskehanterings robotsystem och stationen vätskehanterande översikt över alla parametrar för de automatiserade analysmodulerna.

linjäritet			LOD	LOQ
r ^ a	lutningen	kompensera en	mg / L	mg / L
0,9998	0,0007	-0,021	50	100
Standard		betyda b	precision b	noggrannhet b
mg / L		mg / L	CV%	Bias (% fel)
5000		5112	1,8	2,2
250		265	5,3	6,1
ett medelvärde av åtta mätningar, kalibrering med sex nivåer glukos 0,1-5 g / L
b Utförs med ett t-test (α = 0,05, n = 8).
LOD: bestämningsgränsen, LOQ: kvantifieringsgräns, CV: variationskoefficient.

Tabell 2:Validering av fenol-svavelsyra-syrametoden utfördes med stationen vätskehanterande. Lineariteten beräknades baserat på en sex-punktskalibrering (n = 8). Medelvärde, precision och noggrannhet av två exemplariskt valda glukoskoncentrationer ges här.

	linjäritet			LOQ
	r ^ a	lutningen	kompensera en	iM
utan matris	0,99999	0,0223	-0,0019	1
1:10 utspätt matris	0,99999	0,0221	-0,0011	1
	Standard	betyda b	precision b	noggrannhet b
	iM	iM	CV%	Bias (% fel)
utan matris	50	49,96	3,05	-0,09
	1	1,04	2,95	3,86
1:10 utspätt matris	50	49,98	0,44	-0,04
	1	1,00	4,58	0,33
ett medelvärde av tre mätningar, kalibrering med sex koncentrationer av pyruvat från 1 till 50 ^ M.
b (n = 3)
LOQ: kvantifieringsgräns, CV: variationskoefficient.

Tabell 3:. Validering av pyruvat-analysen med och utan en 1:10 utspädd neutraliserad trifluorättiksyra-syra-matris Två sex punkt kalibreringar (n = 3) med och utan utvärdering av matris influenser utfördes. Medelvärde, precision och noggrannhet av två exemplariskt valda pyruvat koncentrationer med och utan effekterna av en 1:10 utspädning beräknades.

Tabell 4:.. Resultat av tre exempel på stammar screenades med plattformen Data som samlats in från den automatiserade screeningen och kolhydrat fingeravtryck Vänligen cslicka här för att ladda den här tabellen som en Microsoft Excel-fil.

Kolhydrat	Absorption max [nm]	Absorptionen vid 480 nm medelvärde ± SD		Absorbans i förhållande till glukos [%]
diutangummi	470	0,342	± 0,010	187
gellangummi	472	0,334	± 0,002	183
guargummi	478	0,387	± 0,017	212
Gummi arabicum	476	0,393	± 0,034	215
Hyaluronsyra	484	0,231	± 0,011	126
karayagummi	478	0,455	± 0,023	249
konjaksgummi	480	0,297	± 0,009	163
lärk gum	480	0,337	± 0,032	185
Johannesbrödkärnmjöl	478	0,354	± 0,033	194
skleroglukan	484	0,168	± 0010	92
succinoglykan	482	0,168	± 0,005	92
taragummi	480	0,318	± 0,016	174
dragant	478	0,513	± 0,003	281
welangummi	472	0,226	± 0,016	124
xylan 472	0,567	± 0,007	311
Xantangummi	482	0,245	± 0,021	134
Glukos	484	0,191	± 0,014	100
SD: standardavvikelse

Tabell 5:. Resultat som erhållits genom fenol-svavelsyra-syrametoden för 16 kommersiellt tillgängliga polymerer och glukos Absorptionsmaximum och absorptionen vid 480 nm av 16 kommersiellt tillgängliga polymerer (1 g / L) samt glukos (1 g / L ) mättes med tillämpning av fenol-svavelsyra-syrametoden. Absorbansen i förhållande till glukos av alla polymererna beräknades.

	Standard	Betyda	precision en	noggrannhet en
	mg / L	mg / L	CV%	Bias (% fel)
1:10 spädning	450	460	1,01	2,14
	45	44,7	1,41	-0,70
1: 100 spädning	4500	5026	1,19	11,6
	450	471	1,16	4,55
b Utförs med ett t-test (α = 0,05, n = 8).
CV: variationskoefficient.

Tabell 6:. Validering av den automatiserade utspädning för glukos-assay Utspädningen för glukos-analys efter odling (1: 100) och efter gel-filtrering (01:10) validerades. Två glukoskoncentrationer (n = 8) späddes via vätskehanteringssystem och utvärderas. Medelvärde, precision och noggrannhet beräknades.

Teoretiskt glukosvärde	Täckt med silikonhättan matta			Test av avdunstning (täckt)
	innebära en	precision en	noggrannhet en	innebära en	precision en	Noggrannhet a </ Strong>	Indunstning
mg / L	mg / L	CV %	Bias (% fel)	mg / L	CV %	Bias (% fel)	%fel
45,0	45,2	0,69	0,44	46,0	0,66	2,05	1,60
18,0	17,7	0,80	-1,68	18,0	0,72	-0,01	1,69
9,0	8,74	1,20	-2,98	8,92	0,81	-0,95	2,09
4,5	4,50	1,26	-0,04	4,58	1,57	1,76	1,80
1,8	1,85	0,74	2,90	2,01	2,82	11,6	8,48
0,9	1,03	1,43	14,1	1,16	3,52	28,3	12,4
a (n = 4)
CV: variationskoefficient.

Tabell 7:. Utvärdering av förångningen effekten av täckta och avtäckt MTP Sex olika glukosstandarder (n = 4) lagrades i karusellen under 3,5 timmar vid rumstemperatur. Effekten av den avdunstning utvärderades genom användning av avtäckt samt täckt (kisel matta) standardprover. Medelvärdet, precision, noggrannhet och avdunstning i% fel beräknades.

Innan gelfiltrering <td> 25,1

	Efter gelfiltrering		Återstående glukos efter gel-filtrering
	innebära en	SD en		innebära en	SD en
	mg / L	mg / L	mg / L	mg / L	%
1	8647	110	259	121	3,00
2	5108	56	116	37	2,27
3	2014	12	50,8	14	2,52
4	1015	12	8,1	2,47
5	510	4,9	12,8	4,3	2,51
6	223	8,6	6,6	1,5	2,94
7	122	5,6	4,3	0,9	3,48
8	75	6,0	3,1	0,3	4,18
a (n = 8)
SD: standardavvikelse

Tabell 8:. Resultat av gelfiltrering effektivitet Åtta olika glukosstandarder bestämdes före och efter gel-filtrering för att utvärdera effektiviteten av gelfiltrering. Medelvärde, standardavvikelse och återstående glukos efter gel-filtrering i% beräknades.

Discussion

Polysackarid detektion med fenol-svavelsyra-syrametoden: Olika monosackarider visar olika absorptionsmaxima och molar extinktionskoefficienter med hjälp av denna metod ^9. Detta resulterar i olika absorptionsmaxima av polymerer, som innehåller flera socker i olika mängder. De olika våglängder av absorptionsmaxima för 16 olika kommersiellt tillgängliga polymerer ges i Tabell 5. Polymerema löstes (1 g / L) i DDH ₂ O, omrördes (150 rpm) över natten och mättes med fenol-svavelsyra-syra-metod . Diutangummi visade lägsta absorptionsmaxima vid 470 nm och skleroglukan och hyaluronsyra den högsta på 484 nm. Baserat på dessa resultat 480 nm valdes för denna screening plattform. Den relativa absorbansen för polymererna beräknades baserat på absorbans som erhölls med 1 g / L glukos (satt som 100%). De lägsta resultat erhölls med skleroglukan och succinoglykan, båda med 92%. Detta var expected eftersom skleroglukan endast innehåller glukos och succinoglykan innehåller glukos och galaktos i ett förhållande av 7: 1. Både kommersiella polymerer har olika förluster av torkning och olika askhalt, är detta anledningen till att det teoretiska värdet på ~ 110% inte nåddes. Xylan visade den högsta relativa absorbansen med 311%. Anledningen till detta är den höga molära extinktionskoefficienten uppnås från xylos på grund av den furanos mer dominerande formen. Vid en nivå av 0,1 g / L glukos kvantifieringsgränsen nåtts, såväl som detektionsgränsen vid en koncentration <0,05 g / L. Emellertid är gränsen för positiva stammar i screening upptäckt högre än 0,7 g / L och därför analysen visade ett bra resultat. För att få tillförlitliga resultat, var den kvarvarande glukos efter gelfiltrering bestämdes med en glukos-analysen och detta värde subtraherades från värdet från fenol-svavelsyra-syrametoden.

Automatiserad glukos-assay utspädning: Föreställningenav glukosbestämning efter odling (spädning 1: 100) undersöktes. För detta var 10 pl supernatant överfördes till 990 | il DDH ₂ O i en djup brunnar och blandas via tio gånger aspire och dispense 180 ul av denna utspädning. Det andra kritiska steget var den korrekta pipettering av endast 5 | j, l alikvot för 1:10 utspädning från den glukos-analysen efter gelfiltrering. För att generera utspädningen 25 | il av DDH ₂ O överfördes med en 50 ^ il-spetsen först, var efteråt 20 | il av DDH ₂ O och 5 | j, l gel-filtrat aspireras tillsammans. Detta säkerställer en bättre avlägsnande av 5 | j, l alikvot av spetsen. Båda spädningssteg verifierades med olika glukosstandarder via en glukosanalys. Resultaten för två exempel på koncentrationer ges i tabell 6. 1: 100 utspädning för bestämning av glukoshalten efter odling visade hög precision för båda standarderna med CV & #60; 1,2%. Samtidigt, var noggrannheten för högre standard upp till 11,6 (% fel). Detta är dock försumbar eftersom glukosbestämning representerar endast den återstående glukoshalten efter odling och därför är inte viktigt för polymeren detektering. 1:10 utspädning för kvarvarande glukos efter gel-filtrering visade mycket tillförlitliga resultat med ett CV <1,4% och en noggrannhet <2.1% fel.

Behandling av avdunstning: Screeningen kräver 3,5 timmar från det första steget till den första glukos-analysen. För att ta reda på, om denna tidsram har en påverkan på icke-begränsade MTP lagring, var 50 pl glukosanalyskalibreringsstandarder lagras med och utan lock under 3,5 timmar i robot karusellen. I kalibreringsintervallet (45 till 4,5 mg / L) provkoncentrationen knappast ökat. En ökning - orsakad av avdunstning - var under 2,1% och endast för de två lägsta koncentrationer (1,8 och 0,9 mg / L) nådde upp till 12,4% (

Gelfiltrering: Höga halter av icke-metaboliseras glukos stör kvantitativ detektion av glukos från den hydrolyserade polymeren. Därför framställdes en gel-filtreringssteg krävs för att avlägsna kvarvarande glukos efter odling. Dessutom renar gelfiltrering polymeren innehållande supernatanten från salter och monomera kolhydratföreningar, andra än glukos, för att minimera den analytiska bakgrund i analysen monomeren. Vid gel-filtreringssteget 35 pl av filtratet placerades i mitten av brunnen. För validering av robustheten gel-filtrering i det automatiserade systemet, åtta kalibreringsstandarder från 0,045 upp till 9 g / L glukos filtreras (n = 8). Glukos av varje koncentration var alltid minskat med mer än 95% av det ursprungliga värdet (tabell 8). I att göra så, gel-filtrering visade mycket goda resultat för olika koncentrationer av glukos. Dessutom, den kvarvarande glukos efter gel-filtration bestämdes också med en glukos-assay och subtraheras från fenol-svavelsyra-syra bestämningen att få rätt mängd glukos motsvarande för den hydrolyserade polymeren.

Pyruvat-analys: Först av allt, var det undersökte huruvida den neutraliserade och utspädda (1:10) TFA-matris från hydrolyssteget stör den enzymatiska reaktionen. Därför var den kompletta assay utfördes två gånger, en gång med och en gång utan matris och visade tillförlitliga resultat. Slutligen är innehållet av 16 kommersiellt tillgängliga polymerer pyruvat lyckades uppmättes och är avbildad i fig 3. Det är allmänt känt att av dessa 16 polymerer endast succinoglykan och xantan naturligt innehålla pyruvat. Med vår pyruvat-analysen båda dessa polymerer identifieras. I skleroglukan var welangummi och xylan pyruvat detekterades också i betydande mängder. Sammantaget var förmågan hos metoden valideras och pyruvat-analysen showed en hög prestanda. Det visade sig kunna detektera pyruvat i olika polymerer efter hydrolys.

Kolhydrater fingeravtryck: Efter att ha utfört samtliga analysmoduler i automatiserad screening, var potentiella EPS producenter ut för kolhydratfingeravtrycksanalys. För detta har flera kriterier tillämpas: 1) Positiva observation av viskositeten efter centrifugering och / eller efter filtrering. 2) Utfällning före och efter filtrering. Observerade fibrer och flingor utvärderades som positiva. 3) Glukos motsvarande värde från fenol-svavelsyra-syrametoden. Värden> 700 mg / L bedömdes som positiv och värden mellan 300 och 700 mg / L bedömdes som förmodade EPS producenter. När två eller tre kriterier utvärderades som positiva, var stammarna ut för ytterligare kolhydratfingeravtrycksanalys. Kriterierna kan anpassas till den enskilde syftet med EPS screening (t.ex. låg viskositet EPS). Vår strategi syftar till att finna efficient EPS producenter. När man söker efter stammar som endast producerar små mängder av EPS utvärderingen gränsen för glukos ekvivalent bör minskas.

Teknisk fördel och framtida tillämpningar: En intressant egenskap hos detta protokoll är modul karaktär av stegen och de olika analysmodulerna. De kan kombineras på olika sätt, justerat till individuella krav och nya moduler kan lätt genomföras. Vidare kan de analysmodulerna användas separat, till exempel hydrolys modulen i kombination med HT-PMP-derivatisering modul är i stånd att utföra en monomer kompositionsanalys från olika polymerlösningar (1 g / L) i 96-brunnsformat. För laboratorier utan att ha tillgång till ett vätskesystem hanterings den kompletta screening kan hanteras manuellt utan några förändringar i pipetteringssystemet. Men med hjälp av ett vätskehanteringssystem ökar genomströmningen upp till 768 stammar (i stället för 192 stammar förekommande screened manuellt) per dag. Protokollet som beskrivs här är i stånd att en screening för olika släkten och därmed för screening av stora stam samlingar för att identifiera nya EPS producenter och analysera deras kolhydrat fingeravtryck i en strategi (Figur 4). Dessutom kan en riktad screening för polysackarider innehållande sällsynta socker som fukos, uronsyror eller även okända socker utföras via detaljerad monosackarid analys. Dessutom kan olika sockerkombinationer i definierade förhållanden detekteras. Detta gör det möjligt att enkelt identifiera strukturellt besläktade varianter av redan kända EPS eller nya EPS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well deep well plate 2.0 ml (DWP)	Greiner Bio-One	780271	Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990 µl of ddH2O
Breathable Sealing Film	Axygen	BF-400-S	Incubation film for pre- and main-culture DWP
Aluminum Sealing Film	Axygen	PCR-AS-200	-80 °C storage film for glycerol-stock plates
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl	TECAN	30038619	Worktable position (WTP 2-1 to 2-4)
A/B glass-filter-plate 1 µm	Pall Corporation	PN 8031	Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well micro titer plate V-Bottom	Greiner Bio-One	651201	Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4)
96-well SpinColumn G-25	Harvard Apparatus	74-5612	Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7)
96-well micro titer plate V-Bottom	Nunc	249944	Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4)
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips	TECAN	30038609	Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6)
Trough 250 ml	Axygen	Res-SW96-HP	Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetate buffer pH 5.6 (CP 5-7)
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)	Greiner Bio-One	655101	precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2)
96-well silicon cap mat	Whatmann	7704-0105	Cover mat for MTP
200 µl pipette tips	Sarstedt	70.760.002	For manually handling
1,000 µl pipette tips	Sarstedt	70.762	For manually handling
96-well-PCR micro titer plate	Brand	781350	Hydrolysis, PMP-derivatisation
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat	Brand	781405	Hydrolysis, PMP-derivatisation
Filter plate 0.2 µm Supor	Pall Corporation	PN 8019	Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate
Pipette Tips LHS 5-300 µl	Brand	732150	Brand LHS system
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133	Glucose-assay
Horseradish peroxidase	Sigma-Aldrich	P6782	Glucose-assay, pyruvat-assay
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt)	Wako Chemicals GmbH	043-22351	Pyruvat-assay
Pyruvate oxidase	Sigma-Aldrich	P4591	Pyruvat-assay
Potassium phosphate dibasic	Carl-Roth	P749.3	Pyruvat- and glucose-assay
Potassium phosphate monobasic	Carl-Roth	3904.3	Pyruvat- and glucose-assay
Thiamine pyrophosphate	Sigma-Aldrich	C8754	Pyruvat-assay
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	31413	Pyruvat-assay
2-Propanol	VWR	20922.466	Precipitation
Phenol	VWR	20599.231	Phenol-sulfuric-acid method
Sulfuric acid	Carl-Roth	4623.4	Phenol-sulfuric-acid method
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	T6508	Hydrolysis
Ammonium solution	Carl-Roth	P093.1	Hydrolysis, PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	Hydrolysis, PMP-derivatization
Phenol red	Alfa Aesar	B21710	Hydrolysis, PMP-derivatization
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone	Sigma-Aldrich	M70800	PMP-derivatization
Methanol LC-MS	VWR	83638.320	PMP-derivatization
Acetonitril LC-MS	VWR	83040.320	PMP-derivatization
Acetic acid	Sigma-Aldrich	338826	PMP-derivatization
Ethanol absolut	VWR	20821.321	PMP-derivatization
Methyl red	Alfa Aesar	36667	pH-value
Robotic liquid handling system	Tecan	Freedom EVO	Worktable setup in Figure 2
Liquid handling station LHS	Brand	709400	Worktable setup in Figure 2
Tip-Adapter	Brand	709434	Worktable setup in Figure 2
Liquid Ends MC 20-300 µl	Brand	709416	Worktable setup in Figure 2
Adapter 60 mm	Brand	709430	Worktable setup in Figure 2