Abstract
La barrière épithéliale est la première défense innée du tractus gastro-intestinal et régule de manière sélective le transport de la lumière dans les compartiments de tissu sous-jacentes, ce qui limite le transport de petites molécules à travers l'épithélium et presque complètement interdisant le transport macromoléculaire épithéliale. Cette sélectivité est déterminée par la couche de gel muqueux, ce qui limite le transport de molécules lipophiles et les deux récepteurs apical et les complexes protéiques de jonction serrées de l'épithélium. Modèles in vitro de culture de cellules de l'épithélium sont pratiques, mais en tant que modèle, il leur manque la complexité des interactions entre le microbiote, muqueux-gel, l'épithélium et du système immunitaire. D'autre part, l'évaluation in vivo de l'absorption intestinale ou de la perméabilité peut être effectuée, mais ces dosages mesurent absorption gastro-intestinale dans l'ensemble, sans aucune indication de spécificité de site. Ex vivo en utilisant des essais de perméabilité intestinale "sacs"; sont une méthode rapide et sensible de mesurer soit l'intégrité intestinale globale ou le transport comparative d'une molécule spécifique, avec l'avantage supplémentaire de l'intestin spécificité du site. Nous décrivons ici la préparation de sacs intestinaux pour les études de perméabilité et le calcul de la perméabilité apparente (Papp) d'une molécule à travers la barrière intestinale. Cette technique peut être utilisée comme méthode d'évaluation de l'absorption du médicament, ou d'examiner dysfonctionnement de la barrière épithéliale régionale dans des modèles animaux de maladies gastro-intestinales.
Introduction
La barrière épithéliale intestinale du tractus gastro-intestinal est une surface mucosale à environ 400 m 2 chez l'adulte humain. Par conséquent, il est constamment exposé à contester des microbes, des médicaments ingérés, les nutriments et les toxines bactériennes. L'hôte doit non seulement faire la distinction entre les bactéries commensales acceptables et des agents pathogènes potentiels, mais doit empêcher ces espèces et de leurs molécules sécrétées de traverser la barrière épithéliale, tout en permettant en même temps l'absorption des nutriments. Ainsi, le rôle de l'épithélium intestinal est d'agir comme une barrière sélective le contenu luminal 1. Ceci est obtenu, en partie, par le système de défense innée à épithéliale de la muqueuse, ce qui agit à travers un système biologique sensible constitué de mécanismes constitutifs et inductibles 2.
Perte de la fonction barrière épithéliale est une pathologie qui est caractéristique d'un certain nombre de maladies gastro-intestinales. In vivoExamen de la fonction de barrière épithéliale peut être évaluée par gavage oral d'une molécule de traceur et l'analyse subséquente du sérum 3. Toutefois, cette technique présente aucune indication quant à l'emplacement du dysfonctionnement de la barrière. In vitro et ex vivo évaluation de la résistance transepitheliale Transwell en utilisant des systèmes 3 et des chambres d'Ussing 4,5 respectivement, sont couramment utilisés comme marqueurs de substitution de la fonction de barrière épithéliale, mais il leur manque la physiologie de la maladie à part entière de modèles animaux 6. Dans ce protocole, nous décrivons un modèle de préparation des tissus ex vivo qui permet une évaluation directe et localisée de l'intégrité intestinale et qui peut être utilisé pour évaluer la fonction de barrière mucosale à un certain nombre de niveaux. Fait important, cette technique peut être appliquée à des modèles animaux de la maladie, ou peut être manipulée afin de permettre le plan pharmacologique en profondeur interrogation d'un dysfonctionnement de la barrière muqueuse.
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Protocol
Tous les travaux des animaux dans ce protocole est effectuée dans le strict respect de l'Université du comité d'éthique animale Newcastle procédures approuvées.
1. Préparation des instruments, Culture Media et Plats
- Préchauffer médias 199 (TC199) ou Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco médias à 37 ° C. Pré-oxygéner le milieu en faisant barboter avec 95% O 2/5% CO 2. Vérifier que le milieu a un pH final de 7,3.
- Préparer suture en coupant deux 5 sections cm pour chaque sac. Boucle les sutures dans un nœud non fermée.
2. Dissection et préparation de l'appareil gastro-intestinal
- Retirer la nourriture solide 12 h avant l'euthanasie. Si l'on désire placer les animaux sur les suppléments nutritifs de gel au cours de cette période.
- Euthanasier les souris par surdose de pentobarbital de sodium ([200 mg / kg], injection intrapéritonéale), suivie par dislocation cervicale, conformément à l'éthique institutionnelle protocols et pulvériser éthanol à 70% sur l'abdomen et le thorax.
- En utilisant une paire de ciseaux, faire une incision horizontale au milieu de l'abdomen et d'exposer le péritoine.
- Passez à séparer et l'enlever le tractus gastro-intestinal en coupant l'intestin grêle supérieur de l'estomac au niveau du sphincter du pylore et couper le gros intestin à la marge de l'anus. Utilisez une pince pour enlever délicatement le mésentère. Placez le tractus intestinal, milieu oxygéné préchauffé.
- Identifier la section de l'intestin à évaluer la perméabilité (figure 1) et couper cette partie libre du reste du tractus intestinal.
- Afin de maintenir la cohérence entre les animaux, mesurer sections du duodénum et le jéjunum par rapport à l'estomac, et de mesurer les sections du côlon et de l'iléon par rapport au caecum.
- Lors de la sélection des segments de tissus, noter la présence de tissus lymphoïdes associés aux muqueuses telles que les plaques de Peyer. Ceux-ci peuvent être identifiés comme petit hochement de têteules sur la face séreuse de la lumière.
- En utilisant une seringue de 1 ml, rincer doucement le contenu luminal du segment intestinal dans une boîte de Pétri avec du PBS préchauffé (37 ° C). Ces contenus fécaux peuvent être éliminés ou stockés à -80 ° C pour une analyse ultérieure comme souhaité.
3. Préparation de l'intestin Sacs
- Préparer une seringue de 1 ml avec un volume de 300 ul du composé ou de la molécule test. L'intégrité de la muqueuse, une solution à 1 mg / ml de FITC-Dextran M.Wt. 4400 peuvent être utilisés. Sondes allant de 4,400-70,000 Da taille peuvent être utilisés pour augmenter la sensibilité. adapter en toute sécurité d'un petit cathéter vasculaire des animaux sur la seringue.
- Mesure 5 cm de l'ouverture du segment intestinal et attacher le segment bien fermés avec un fil de suture en boucle en ce moment. Placez délicatement une suture en boucle pré-noué autour de l'ouverture de l'intestin et insérer le cathéter émoussé. Tirer la corde fermée de manière à assurer le segment intestinalet libérer le volume de 300 ul de la seringue dans l'intestin, en sorte que toute la solution est injectée.
- Retirez délicatement le cathéter tout en tirant la corde de suture pour assurer la fermeture du sac intestinal. Couper le sac intestinal détacher de l'intestin et le placer dans un tube conique de 50 ml rempli avec 20 ml de milieu oxygéné, préchauffé à 37 ° C.
4. Mesure de la Perméabilité
- des tubes coniques de place contenant les sacs intestinaux dans un bain d'eau chauffée à 37 fixés ° C. À 0, 30, 60, 90 et 120 points de temps min, prendre un échantillon de 100 ul du tube conique et le transfert à une plaque de 96 puits, en remplaçant le volume avec 100 ul de milieu frais dans chaque cas.
- Après l'échantillon final est pris, couper sacs ouverts au point de suture et sur toute la longueur du segment, l'exposition de la surface de la muqueuse.
- Mesurer la longueur et la largeur de chaque segment intestinal. Si desirouge, snap geler les segments et les conserver à -80 ° C pour les protéines ou l'analyse biochimique, ou encore, de stocker dans une solution de stabilisation de l'ARN pour des analyses moléculaires.
- Construire une courbe standard de dilutions de journaux pour des molécules FITC marqués allant de 1 à 1 x 10 -6.
- échantillons et normes Mesure pour FITC sur un lecteur de plaque fluorescente, FITC excitation / émission: 495 nm / 519 nm.
5. Calcul de la perméabilité apparente pour chaque individu intestinale Sac
- Convertir des unités de temps à sec.
- Pour chaque point de temps, calculer la concentration cumulative, Q
Q t = (C t * V r) + (Q t Somme * V s), Où:
Q t = concentration cumulée à l'instant t
C t = concentration à l'instant t
V r = Volume du côté récepteur
Q t = somme Somme de toutes les Q précédente t
S = Vle volume échantillonné - Terrain Q en fonction du temps (T) et de calculer la pente: AQ / AT
- Calculer la perméabilité apparente (Papp)
P app = (AQ / AT) / (A * Co), Où:
A = zone de tissu
C 0 = concentration initiale
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Representative Results
Ce protocole peut être utilisé pour étudier les changements régionaux dans la fonction de barrière intestinale chez des modèles animaux de maladies gastro-intestinales. En mesurant le flux d'une sonde paracellulaire à travers la surface de la muqueuse dans des zones différentes du tractus gastro-7, l'intégrité des jonctions serrées épithéliales peut être évaluée. En outre, en faisant varier la nature de la sonde paracellulaire par la taille (figure 2) ou hydrophobe (figure 3), le degré de perturbation de l'épithélium ou de l'intégrité de la couche de gel muqueux, peut également être mesurée. Employant des marqueurs de poids moléculaire plus permet une interrogation plus sensible de la perméabilité paracellulaire de la muqueuse, la détection des changements discrets, qui peuvent ne pas être apparents par des mesures électrophysiologiques tels que transépithélial résistance électrique (TEER), mais qui serait suffisante pour permettre le transport paracellulaire (Figure 2). mucosal inflammation peut conduire à une perte de cellules caliciformes et la réduction du gel de mucus protecteur qui recouvre et protège normalement l'interface épithéliale. En utilisant des sondes hydrophobes, l'intégrité de la couche de gel muqueux intestinal peut également être consultée (Figure 3). En outre, l'intégrité régionale de barrière peut être examinée par la préparation spécifique de sacs intestinaux provenant de différentes régions intestinales. Changements régionaux dans la fonction de barrière varient dans différents modèles animaux de maladie et, par conséquent, l'utilisation de sacs intestinaux permet une évaluation localisée de la fonction de barrière intestinale (figure 4), par rapport au gavage oral de sondes et le dosage sérique ultérieure.
Figure 1. Diagramme du tractus gastro-intestinal murin. Un schéma du tractus gastro-intestinal d'une souris C57BL / 6, de l'estomac à til anus. Les petites jonctions intestinaux ne peuvent pas être facilement différenciés macroscopiquement uniforme et d'échantillonnage permet de minimiser les souris à une variation de la souris. Aux fins de la création de sacs intestinaux, à 5 cm segment distal du sphincter pylorique englobera le duodénum. Une section de 10 cm étendant de manière proximale à partir du caecum englobera l'iléon. La petite tissu intestinal restant représente le jéjunum. Le rectum est situé à 2 cm au-dessus de l'anus, avec le gros intestin restant, étendant le caecum représentant le colon 8. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Dépendant de la taille de transport paracellulaire de molécules FITC-Dextran si la muqueuse épithéliale dans le contrôle et la colite DSS animals. sacs intestinales ont été préparés à partir des deux points de souris DSS 10 jours dans le cours de la maladie. Sacs ont été chargés avec 1 mg / ml, solution de FD-4 (poids moléculaire 4400 Da), FD-20 (poids moléculaire 20 000 Da) ou FD-70 (70 000 Da) et le flux du marqueur de perméabilité FITC-dextran a été mesurée sur 120 min. L'âge des animaux sains appariés ont été utilisés comme témoins. N = 5, 2 répétitions techniques par N. ** p <0,01, test t de Student. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 :. L'influence de la couche de mucus-gel sur l'intégrité de la barrière à des composés hydrophobes. Sacs intestinaux ont été préparés à partir des deux points de souris DSS 10 jours dans le cours de la maladie. L'âge des animaux sains appariés ont été utilisés comme témoins. Pour le contrôle négatif muqueuse-gel, les intestinsont été chargées avec 10 mM de N-acétylcystéine (NAC) (300 pi par volume de 5 cm de l'intestin) et incubées à 37 ° C pendant 15 minutes et rincé avec du milieu frais avant sacs ont été préparés. Les sacs sont chargés avec une solution 1 mg / ml de FD-4 (poids moléculaire 4400 Da) et le flux mesuré au cours de 120 min. N = 3, 2 répétitions techniques par N. * p <0,05, ** p <0,01, test t de Student. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. La perméabilité de la région de l'intestin de FD-4 dans des modèles murins d'inflammation intestinale. Intestinale sacs ont été préparés à partir du jéjunum, l'iléon ou le côlon des animaux sains, des animaux ou DSS dysbiose antibiotiques induit (AID) animaux. Sacs ont été chargés avec 1 mg / ml de solution de FD-4 (poids moléculaire 4400 Da) et flux mesuré plus de 120 min. N = 3, 2 répétitions techniques par N. * p <0,05, ** p <0,01, test t de Student. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous avons détaillé l'isolement et la préparation des sacs intestinaux pour évaluer la fonction de barrière mucosale ex vivo. Préparations sac intestinal ont principalement été utilisés dans la recherche pharmaceutique, en examinant l'absorption de médicaments candidats à travers l'intestin. Cependant, ce test est également bien adapté à l'étude de la maladie intestinale. la perméabilité intestinale peut varier considérablement d'une région et d'évaluation spécifique au site de la perméabilité permet une meilleure compréhension de l'importance régionale de l'intégrité de la muqueuse dans les maladies digestives. Le test est robuste et dans les conditions physiologiques correctes, tissus isolés restent viables jusqu'à 6 h post-mortem. À la suite de l'euthanasie, la vitesse de la préparation de tissu est importante et l'intestin doit être rincé de son contenu et transférées dans un milieu oxygéné le plus rapidement possible. Afin d'assurer la cohérence entre les animaux, il est essentiel que les régions intestinales correctes sont identified (Figure 1). Il est conseillé que les segments du côlon et de l'iléon sont mesurées à partir du caecum, tandis que les segments du duodénum et le jéjunum sont mesurées à partir de l'estomac. Parce que les différentes souches, des modèles ou des animaux transgéniques peuvent être plus grands, et ont plus TIG, il est intéressant de caractériser la durée moyenne ou chaque segment intestinal dans votre modèle avant de se livrer à des essais de perméabilité.
En plus de l'uniformité régional, il est important de veiller à ce que chaque sac intestinal est coupé à longueur et le sac est rempli avec le volume exact de fluide. Incohérence dans ces facteurs se traduira par une inégalité distension de la muqueuse entre les dosages. Moins de distension du segment intestinal non seulement réduit l'exposition du contenu luminal à la surface de la muqueuse, mais augmente également l'épaisseur du tissu à travers laquelle le marqueur doit se déplacer. Distension excessive du segment peut endommager les tissus ou activer stress-réponses dans le tissu, ce qui pourrait corésultats nfounding. Il est à noter, que pour le calcul de P application ne tient pas compte de la surface de la structure des villosités. Bien que cela conduit à une erreur dans le calcul de la perméabilité apparente réelle du tissu, elle n'a aucune incidence sur les résultats comparatifs entre les modèles, comme la surface spécifique est calculée comme une constante. Toute modification de surface en raison de la maladie sont compensés par la perte de l'intégrité de l'épithélium et le protocole est suffisamment robuste pour identifier les changements de la perméabilité à la progression de la maladie 6.
L'utilisation d'un milieu de culture tissulaire est recommandée. Dans les études effectuées par Barthe et al., L'utilisation de TC199 a été trouvé à augmenter sensiblement la longévité de la viabilité du tissu épithélial et l'architecture histologique, par rapport aux tampons de sels simples 9. Dans nos études moyen à la fois DMEM et TC199 maintenue à 37 ° C, à des conditions optimales pour la survie des tissus 5,6,10. L'exactitude des médiasfournit l'épithélium avec des nutriments nécessaires pour maintenir l'intégrité des tissus, tout en maintenant la température au cours de l'essai assure le métabolisme des tissus optimal qui est l'intégrité de jonction étanche essentiel et essais impliquant le transport actif par l'intermédiaire de voies de transcellulaire. Des températures inférieures à 37 ° C entraîner une perte de la viabilité des tissus, l'augmentation du transport paracellulaire et en diminuant le transport transcellulaire 11. Ainsi, prolonger la viabilité des tissus dans des conditions optimales est essentiel et, ce faisant, le dosage peut être utilisé non seulement pour examiner intégrité de la barrière régionale et mais aussi d'examiner les études d'intervention et les réponses physiologiques et de transcription.
Bien qu'il soit principalement utilisé pour les études d'absorption de la drogue, les techniques d'examiner perméabilité apparente (P app) d'une molécule de marqueur à travers une barrière épithéliale sont une mesure très sensible de l'intégrité intestinale 12-15. Contrairement à la substitution La ex vivo MeasureMents de la fonction de barrière, comme TEER, P app est une mesure directe et très sensible de la barrière intestinale 4. Il est à noter que les mesures de TEER et de la perméabilité mesurée par l'application P de molécules marqueuses ne correspondent pas toujours. Mesures de TEER englobent la résistance des deux jonctions serrées et des résistances parallèles transcellulaire 16. Par conséquent TEER est une mesure de la résistance combinée offerte par des jonctions serrées et les cellules elles-mêmes. Si les associations cellule-cellule sont faibles (à savoir, les jonctions serrées sont fuit) puis cette contribution à la résistance globale d'une monocouche sera faible. Ainsi, de petits changements dans les résistances de jonction étanches pour épithélium leaky changements deviennent négligeables pour les résistances de l'épithélium dans son ensemble. En revanche, P app tests mesurent la capacité d'une molécule à traverser la barrière muqueuse 17 et en effet, la sensibilité des mesures P app peut être alnominatives grâce à la sélection des molécules différentes de marqueurs de taille (Figure 1). La prise en compte de la taille du marqueur est important en ce qui concerne le modèle de la maladie intestinale en cours d'examen. Les modèles de l'allergie ou fonctionnelle maladie 18,19, où la perte de l'intégrité est légère à modérée, peuvent être plus adapté à des marqueurs de poids moléculaire plus faible, ce qui permettra l'identification des changements subtils à la fonction de la barrière intestinale. En revanche, avec des modèles tels que la colite DSS, qui consiste à dénuder de l'épithélium intestinal, des marqueurs plus grands peuvent être plus appropriés pour évaluer la cicatrisation des muqueuses, comme des augmentations relativement faibles intégrité de la barrière seront mises en évidence.
Alors que sacs intestinaux offrent un modèle physiologiquement pertinents de la fonction GI barrière, il y a certaines limites par rapport à la variabilité des modèles animaux qui doivent être pris en considération. Par exemple, l'état de sécrétion ou l'épithélium peuvent influencer à la fois le transport paracellulaire à travers les intesOutil 20 et l'intégrité de la couche de gel muqueuse 5. Bien que des dosages ex vivo comprenant des mesures électrophysiologiques, telles que des préparations de Ussing chambre, peuvent expliquer cela, des sacs intestinaux non. Deuxièmement, dans la préparation des chercheurs ZSC intestinaux devraient représenter structures lymphoïdes, tels que les plaques de Peyer, dans la préparation du sac, car ils peuvent influencer la perméabilité du tissu 21. En dépit de ces considérations, contrairement à de nombreux modèles de culture de cellules, utilisées pour évaluer l'intégrité de l'épithélium, les sacs intestinaux offrent la contribution à la fois une couche de gel muqueux et une lamina propria sous-jacente. La contribution de la couche de gel muqueux, en particulier, peut être évaluée par l'utilisation d'agents mucolytiques tels que la N-acétyl-cystéine, ou des molécules de traceur hydrophobes, tels que la dexaméthasone 5,17. Ceci peut être particulièrement important dans l'évaluation de la perméabilité intestinale dans des modèles de thérapie du cancer ou des maladies inflammatoires de l'intestin, wici la perte de la barrière muqueuse peut être une pathologie au début de l'inflammation de la muqueuse 22,23. De même, dans les modèles de maladies diarrhéiques, les maladies gastro-intestinal fonctionnel ou dysbiose, la production de mucus intestinal et l'intégrité globale du gel de mucus peut être modifié dans les sites régionaux 5,19,24. Gavage oral de marqueurs de perméabilité et de l'échantillonnage de sérum suite est une autre option pour l'évaluation de la perméabilité intestinale in vivo. Bien que cette méthode a une manipulation minimale du tissu, il est une mesure composite de la fonction de la barrière intestinale et ne pas évaluer les contributions régionales à la barrière globale. Différents modèles de maladies gastro-intestinales sont susceptibles d'avoir des sites d'importance relative qui ne sera pas représenté par des approches de gavage oral. L'utilisation de sacs intestinaux, est donc un test rapide, sensible et physiologiquement pertinente qui peut être utilisée pour examiner l'intégrité de la muqueuse intestinale dans la région des petits modèles animaux de la maladie.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10 mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4,400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
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