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Medicine

Ex vivo-Darm-Sacs zu beurteilen Durchlässigkeit der Schleimhaut in Modelle von Magen-Darm-Krankheit

doi: 10.3791/53250 Published: February 9, 2016

Abstract

Die epitheliale Barriere ist der erste angeborenen Abwehr des Gastrointestinaltraktes und regelt selektiv Verkehr von dem Lumen zu dem darunter liegenden Gewebe Fächer, den Transport von kleineren Molekülen über das Epithel zu beschränken und nahezu vollständig zu verbieten epithelialen makromolekulare Transport. Diese Selektivität wird durch die Schleimhaut Gelschicht bestimmt, die den Transport von lipophilen Molekülen und sowohl den apikalen Rezeptoren und enge Verbindungsprotein-Komplexe des Epithels begrenzt. In-vitro-Zellkulturmodellen des Epithels sind bequem, aber als ein Modell, es fehlt ihnen die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen der Mikroflora, Schleim-Gel, Epithel und Immunsystem. Auf der anderen Seite, in vivo Beurteilung der intestinale Absorption oder Durchlässigkeit kann durchgeführt werden, aber diese Tests insgesamt Magen-Darm-Absorption zu messen, ohne Angabe von Ortsspezifität. Ex-vivo-Durchlässigkeit Tests "Darmsäcken" können; sind eine schnelle und empfindliche Verfahren entweder Gesamtdarm Integrität oder Vergleichs Transport eines spezifischen Moleküls, mit dem zusätzlichen Vorteil der intestinalen Ortsspezifität messen. Hier haben wir die Herstellung von Darmsäcken für Durchlässigkeit Studien und die Berechnung des scheinbaren Durchlässigkeit (P app) beschreiben eines Moleküls durch die Darmbarriere. Diese Technik kann als ein Verfahren zur Beurteilung der Arzneimittelabsorption verwendet werden, oder regional Epithelbarriere Dysfunktion in Tiermodellen von gastrointestinalen Erkrankungen zu untersuchen.

Introduction

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Die intestinale epitheliale Barriere des Gastrointestinaltraktes ist Bereich einer Schleimhautoberfläche bei 400 m 2 in dem erwachsenen Menschen geschätzt. Folglich wird es ständig ausgesetzt von Mikroben, eingenommene Drogen, Nährstoffe und bakterielle Toxine in Frage zu stellen. Der Host muss nicht nur zwischen tolerierbaren kommensalen Bakterien und potentielle Pathogene unterscheiden, aber müssen diese Arten und ihre sezernierten Moleküle vor der Kreuzung die Epithelbarriere, während zur gleichen Zeit ermöglicht die Aufnahme von Nährstoffen zu vermeiden. Somit ist die Rolle des Darmepithels als selektive Barriere zu der luminalen Inhalte 1 zu wirken. Dies wird dadurch erreicht, teilweise durch das angeborene epithelialen Abwehrsystem an der Schleimhaut, die eine reaktions biologischen System wirkt über 2 konstitutiver und induzierbarer Mechanismen aus.

Verlust von epithelialen Barrierefunktion ist eine Pathologie, die charakteristisch für eine Reihe von Magen-Darm-Erkrankungen ist. In vivoPrüfung der epithelialen Barrierefunktion kann durch orale Gabe von Tracer-Molekül und anschließende Serumanalyse 3 bewertet werden. Allerdings bietet diese Technik keinen Hinweis auf den Ort der Schrankenstörung. In-vitro- und Ex-vivo-Bewertung der transepithelialen Widerstand mit Transwell-Systeme 3 und Ussing-Kammern 4,5 bzw. werden als Surrogatmarker der epithelialen Barrierefunktion häufig verwendet, aber nicht über die beitragenden Krankheit Physiologie von Tiermodellen 6. In diesem Protokoll beschreiben wir eine ex vivo Gewebepräparationsmodell, das direkte und lokale Bewertung der Darm-Integrität ermöglicht und die verwendet werden können Schleimhautbarrierefunktion in mehreren Ebenen zu beurteilen. Wichtig ist, kann diese Technik zu Tiermodellen von Krankheiten angewendet werden, oder pharmakologisch manipuliert werden kann, in der Tiefe Abfrage von Schleimhaut-Barriere Dysfunktion zu ermöglichen.

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Protocol

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Alle tierischen Arbeit in diesem Protokoll wird bei strikter Einhaltung University of Newcastle Tierethikkommission genehmigten Verfahren durchgeführt.

1. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, Medien und Gerichte

  1. Pre-warmen Medien 199 (TC199) oder Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Medien bis 37 ° C. Pre-Oxygenat das Medium durch mit 95% O 2/5% CO 2 sprudeln. Überprüfen Sie, ob das Medium einen endgültigen pH-Wert von 7,3 hat.
  2. Bereiten Faden durch Schneiden zwei 5 cm Abschnitte für jeden Sack. Schleife die Nähte in eine unverschlossene Knoten.

2. Dissection und Vorbereitung des Gastrointestinaltraktes

  1. Ziehen Sie feste Nahrung 12 Stunden vor der Euthanasie. Falls gewünscht, legen Tiere auf Nährgel Ergänzungen während dieser Zeit.
  2. Euthanize Mäusen durch Natriumpentobarbiton Überdosierung ([200 mg / Kg], intraperitoneale Injektion), gefolgt durch zervikale Dislokation nach Ethik protoSpalten und 70% Ethanol auf den Bauch und Brustkorb sprühen.
  3. Mit einer Schere, einen horizontalen Schnitt in der Mitte des Bauches machen und das Bauchfell aus.
  4. Gehen Sie zu trennen und das Entfernen des Magen-Darm-Trakt, indem der obere Dünndarm aus dem Magen in die Magenpförtner Schneiden und den Dickdarm in den analen Rand schneiden. Verwenden einer Pinzette vorsichtig auf die Gekröse entfernen. Setzen Sie den Darmtrakt in vorgewärmten, sauerstoffreiches Medium.
  5. Identifizieren Sie den Abschnitt des Darms, der für Durchlässigkeit (Abbildung 1) geprüft und schneiden Sie diesen Abschnitt frei von dem Rest des Verdauungstraktes.
    1. Um die Konsistenz zwischen den Tieren zu halten, messen Abschnitte von Duodenum und Jejunum in Bezug auf den Magen, und messen Abschnitte des Dickdarms und Ileum gegenüber dem Blinddarm.
    2. Wenn Gewebesegmente auszuwählen, beachten Sie das Vorhandensein von Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebe wie Peyer-Plaques. Diese können als kleine Anspielung identifiziert werdenules auf der Serosa-Seite des Lumens.
    3. Unter Verwendung einer 1 ml Spritze, spülen sanft die luminalen Inhalte des Darmsegments in eine Petrischale mit vorgewärmtem PBS (37 ° C). Diese fäkal Inhalt kann bei entsorgt oder gelagert werden -80 ° C für zukünftige Analyse wie gewünscht.

3. Herstellung von Darm Sacs

  1. Bereiten einer 1 ml Spritze mit einer 300 ul Volumen der Testverbindung oder Molekül. Zur mukosalen Integrität, einer 1 mg / ml Lösung von FITC-Dextran M.Wt. 4400 verwendet werden. Sonden im Bereich von 4,400-70,000 Da in der Größe kann für eine erhöhte Empfindlichkeit verwendet werden. passen sicher ein kleines Tier Gefäßkatheter auf die Spritze.
  2. Maßnahme 5 cm von der Öffnung des Darm Segment und das Segment binden fest an dieser Stelle mit einer Naht-Schleife geschlossen. Sanft legen Sie eine vorgebunden Naht-Schleife um die Öffnung des Darms und die abgestumpften Katheter einsetzen. Ziehen Sie die Schlinge geschlossen, um die Darmsegment zu sichernund Loslassen der 300 ul-Volumen aus der Spritze in den Darm, so dass die gesamte Lösung eingespritzt wird.
  3. Sie vorsichtig den Katheter zu entfernen, während gleichzeitig die Naht Schlinge ziehen Schließung des Darmsack zu sichern. Schneiden Sie das Darmsack lose aus dem Darm und in einen 50 ml konischen Röhrchen gefüllt mit 20 ml sauerstoffreiches Medium, vorgewärmt auf 37 ° C.

4. Messung der Durchlässigkeit

  1. Platz konische Röhrchen, die die Darmsäcken in einem beheizten Wasserbad enthält, auf 37 ° C. Bei 0, 30, 60, 90 und 120 min Zeitpunkten, nehmen 100 ul Probe aus dem konischen Rohr und in ein 96-Well-Platte, das Volumen mit 100 ul frisches Medium in jedem Fall zu ersetzen.
  2. Nachdem die letzte Probe entnommen wird, aufgeschnitten Säcke an der Stelle der Naht und über die gesamte Länge des Segments, die Schleimhautoberfläche freigelegt wird.
  3. Messen Sie die Länge und Breite jedes Darmsegment. wenn Desirot, einfrieren Schnapp die Segmente und bei -80 ° C für Protein oder biochemischen Analyse oder alternativ Geschäft in RNA-Stabilisierung Lösung für molekulare Tests.
  4. Eine Standardkurve von log-Verdünnungen für FITC-markierte Moleküle von 1 bis 1 x 10 -6 bis hin.
  5. Messen Proben und Standards für FITC auf einem Fluoreszenzplattenlesegerät, FITC Anregungs- / Emissions: 495 nm / 519 nm.

5. Berechnung der Scheindurchlässigkeit für jeden einzelnen Darm-Sac

  1. Konvertieren Zeiteinheiten zu sek.
  2. Für jeden Zeitpunkt berechnen die kumulative Konzentration, Q

    Q t = (C t * V r) + (Q t Summe * V s),
    wo:

    Q t = Kumulative Konzentration zum Zeitpunkt t
    C t = Konzentration zum Zeitpunkt t
    V r = Volumen auf der Empfängerseite
    Q t Summe = Summe aller bisherigen Q t
    Vs =Volumen abgetastet
  3. Plot Q gegen die Zeit (T) und die Berechnung der Steigung: & dgr; Q / & dgr; t
  4. Berechnen Sie die scheinbare Durchlässigkeit (P app)

    P app = (& dgr; Q / & dgr; t) / (A * Co), wo:

    A = Fläche des Gewebes
    C 0 = Anfangskonzentration

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Representative Results

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Dieses Protokoll kann verwendet werden, um regionale Veränderungen in Darmbarrierefunktion in Tiermodellen von gastrointestinalen Erkrankungen untersuchen. Durch Messung des Flusses eines parazellulären Sonde über der Schleimhautoberfläche in unterschiedlichen Bereichen des Gastrointestinaltraktes 7, die Integrität der epithelialen tight junctions beurteilt werden. Außerdem kann durch die Art der parazellulären Sonde von unterschiedlicher Größe (Abbildung 2) oder Hydrophobie (Abbildung 3), der Grad der epithelialen Störung oder die Integrität der Schleimhaut Gelschicht kann auch gemessen werden. Verwendung größeren Molekulargewichtsmarker erlaubt eine empfindlichere Abfrage der parazellulären Permeabilität der Schleimhaut, diskrete Änderungen zu erfassen, die durch elektrophysiologische Messungen wie transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER), die aber parazellulären Transport zu ermöglichen würde ausreichen, möglicherweise nicht offensichtlich sein (Abbildung 2). Mucosal Entzündung kann in der Schutzschleimhaut Gel zu einem Verlust der Becherzellen und die Reduzierung führen, die normalerweise überdeckt und schützt die epitheliale Oberfläche. Verwendung hydrophober Sonden, kann die Integrität der Darmschleim Gelschicht auch (Figur 3) untersucht werden. Darüber hinaus können regionale Integrität der Barriere durch die gezielte Vorbereitung von Darmsäcken aus verschiedenen Darmbereichen untersucht werden. Regionale Veränderungen in Barrierefunktion variieren in verschiedenen Tiermodellen von Krankheiten und somit die Verwendung von Darmsäcken ermöglicht eine lokalisierte Beurteilung der Darmbarrierefunktion (Figur 4), wenn auf orale Gabe von Sonden und anschließende Serum-Assay verglichen.

Abbildung 1
Abbildung 1 Schematische Darstellung der murinen Gastrointestinaltrakt. Eine schematische Darstellung des Magen-Darm-Trakt eines C57BL / 6-Maus, vom Magen bis ter Anus. Die Dünndarmübergänge nicht ohne weiteres makroskopisch unterschieden werden und konsistenten hilft Maus zu Maus Variation zu minimieren. Für die Zwecke der Darmsäcken schaffen, 5 cm Segment distal des Pylorus Sphincter wird das Duodenum umfassen. Eine 10 cm Abschnitt proximal von der Blinddarm Verlängerung wird das Ileum umfassen. Der verbleibende kleine Darmgewebe repräsentiert Leerdarm. Der Mastdarm ist 2 cm proximal gelegen zu den Anus, die restlichen Dickdarm, an der Blinddarm erstreckt, die die Doppelpunkt 8. Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Figur 2.   Größenabhängige parazellulären Transport von FITC-Dextran-Moleküle obwohl die epitheliale Schleimhaut in der Steuerungs- und DSS Colitis animals. Intestinal Säcke wurden aus den Doppelpunkten von DSS-Mäusen 10 Tage in den Verlauf der Krankheit bereit. Beutel wurden mit 1 mg / ml Lösung von FD-4 (MW 4.400 Da), FD-20 (MW 20.000 Da) oder FD-70 (70.000 Da) und Flussmittel der FITC-Dextran Permeabilität Marker geladen wurde über 120 min gemessen. Age gleichaltrigen gesunden Tiere wurden als Kontrollen verwendet. N = 5, 2 technische Wiederholungen pro N. ** p <0.01, T-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3 :. Der Einfluss von Schleim-Gel-Schicht auf der Barrierenintegrität hydrophobe Verbindungen. Intestinal Säcke wurden aus den Doppelpunkten von DSS-Mäusen 10 Tage in den Verlauf der Krankheit. Age gleichaltrigen gesunden Tiere wurden als Kontrollen verwendet. Für Negativkontrolle Schleim-Gel, die Därmewurden mit 10 mM N-Acetylcystein (NAC) (300 & mgr; l Volumen pro 5 cm des Darms) geladen und bei 37 inkubiert ° C für 15 min und gespült mit frischem Medium vor Säcke hergestellt. Beutel wurden mit 1 mg / ml Lösung von FD-4 (MW 4.400 Da) und Flussmittel gemessen über 120 min geladen. N = 3, 2 technische Wiederholungen pro N. * p <0,05, ** p <0,01, t-Test nach Student. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Die regionale Permeabilität des Darms FD-4 in murine Modelle von Darmentzündung. Intestinal Säcke wurden aus dem Jejunum, Ileum oder Colon von gesunden Tieren, Tieren oder DSS Antibiotika-induzierte Dysbiose (AID) Tiere vorbereitet. Beutel wurden mit 1 mg / ml Lösung von FD-4 (MW 4.400 Da) geladen und fLux gemessen über 120 min. N = 3, 2 technische Wiederholungen pro N. * p <0,05, ** p <0,01, t-Test nach Student. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

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Hier haben wir die Isolierung und Herstellung von Darmsäcken detailliert Schleimhautbarrierefunktion ex vivo zu beurteilen. Darmsack Vorbereitungen sind in der pharmazeutischen Forschung genutzt, die Prüfung der Aufnahme von Wirkstoffkandidaten über den Darm in erster Linie ist. Allerdings ist dieser Test gleichermaßen gut für die Untersuchung von Darmerkrankungen geeignet. Darmdurchlässigkeit kann stark von Region und standortspezifische Bewertung der Durchlässigkeit ermöglicht ein besseres Verständnis für die regionale Bedeutung der Integrität der Schleimhaut in Erkrankungen des Verdauungssystems variieren. Der Test ist robust und unter den richtigen physiologischen Bedingungen bleiben isoliert Gewebe lebensfähig für bis zu 6 Stunden post mortem. Nach Euthanasie, ist die Geschwindigkeit der Gewebepräparation und der Darm wichtig sollte so schnell wie möglich der Inhalte und an oxygenierten Medium gespült werden. Um die Konsistenz zwischen den Tieren zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die richtigen Darm-Regionen identifi sinded (Abbildung 1). Es wird empfohlen, dass Dickdarm und Ileum-Segmente aus dem Blinddarm gemessen werden, während Segmente von Zwölffingerdarm und Dünndarm aus dem Magen gemessen werden. Da verschiedene Stämme, Modellen oder transgenen Tieren kann größer und haben längere GITS, lohnt es sich, die durchschnittliche Länge oder jedes Darmsegment in Ihrem Modell charakterisieren, bevor der Durchlässigkeit Tests eingreifen.

Neben regionalen Konsistenz, ist es wichtig, sicherzustellen, dass jeder Darmsack gleiche Länge geschnitten wird und der Sack mit dem richtigen Volumen der Flüssigkeit gefüllt. Inkonsistenz in dieser Faktoren wird in ungleiche Ausdehnung der Schleimhaut zwischen Assays führen. Unter Distension des Darmsegments reduziert nicht nur die Belichtung der luminalen Inhalte an die Schleimhautoberfläche, sondern erhöht auch die Dicke des Gewebes, durch die der Marker zurücklegen muss. Überdehnung des Segments, das Gewebe oder aktivieren Stress-Reaktionen im Gewebe schädigen können, möglicherweise confounding Ergebnisse. Es sollte beachtet werden, dass für die Berechnung von P app nicht zur Oberfläche von villous Struktur nicht berücksichtigen. Während dies auf Fehler führt die tatsächliche scheinbare Durchlässigkeit des Gewebes bei der Berechnung, hat dies keine Auswirkungen Vergleichsergebnisse zwischen den Modellen, wie der Oberflächenbereich als eine Konstante berechnet wird. Alle Änderungen in der Oberflächenbereich aufgrund von Krankheit durch den Verlust der Integrität epithelialen versetzt und das Protokoll ist ausreichend robust Veränderungen zu identifizieren, der Durchlässigkeit mit Fortschreiten der Krankheit 6.

Die Verwendung von Gewebekulturmedium wird empfohlen. In Studien der Barthe et al. Die Verwendung von TC199 gefunden wurde deutlich die Langlebigkeit der epithelialen Gewebe Lebensfähigkeit und histologischen Architektur erhöhen, wenn 9 auf einfache Salzpuffer verglichen. In unseren Studien sowohl DMEM und TC199-Medium bei 37 gehalten ° C vorgesehen optimale Bedingungen für die Gewebeüberlebens 5,6,10. Die richtige Medienliefert das Epithel mit Nährstoffen zu unterstützen Gewebeintegrität erforderlich, während die Temperatur optimal Gewebe sorgt für Stoffwechsel während des Tests beibehalten, die über transzelluläre Signalwege wesentlich Tight Junction Integrität und Tests beteiligt aktiven Transport ist. Temperaturen unter 37 ° C Ursache Verlust der Gewebelebensfähigkeit, parazellulären Transport zu erhöhen und transzellulären Transport 11 abnimmt. Somit ist die Lebensfähigkeit des Gewebes mit optimalen Bedingungen verlängert wesentliche und dabei kann der Test verwendet werden, nicht nur regionale Barriere Integrität zu prüfen und zu aber auch Interventionsstudien und physiologische und Transkriptions-Reaktionen zu untersuchen.

Während in erster Linie für die Arzneimittelabsorption Studien verwendeten Techniken eine hochempfindliche Messung der intestinalen Integrität 12-15 scheinbare Durchlässigkeit (P app) eines Markermoleküls in einer epithelialen Barriere sind zu untersuchen. Im Gegensatz zum Surrogat ex vivo measurements der Barrierefunktion, wie TEER ist P app eine direkte und hochempfindliche Messung der intestinalen Barriere 4. Es ist erwähnenswert, dass TEER-Messungen und Durchlässigkeit, wie durch die P app von Markermolekülen gemessen nicht immer korrelieren. TEER-Messungen umfassen den Widerstand sowohl der tight junctions und transParallelWiderstände 16. Daher ist TEER eine Messung der Gesamtwiderstand von tight junctions und den Zellen selbst angeboten. Wenn die Zell-Zell-Verbände schwach sind (das heißt, sind die Tight Junctions undicht) dann diese Beitrag zum Gesamtwiderstand von einer Monoschicht niedrig sein wird. So kleine Änderungen in engen junctional Widerstände für undichte Epithel vernachlässigbar Änderungen der Widerstände des Epithels als Ganzes. Im Gegensatz dazu messen P App Assays, die die Fähigkeit eines Moleküls, die Schleimhautbarriere 17 und in der Tat zu durchqueren, um die Empfindlichkeit von P App Messungen sein kann altered durch verschieden große Markermoleküle (Abbildung 1) auswählen. Die Berücksichtigung der Markergröße ist wichtig in Bezug auf das Modell des Darmerkrankung untersucht. Alle Modelle aus Allergie oder funktionellen Erkrankung 18,19, wo Verlust der Integrität leichter bis mittelschwerer ist, kann mehr auf niedrigerem Molekulargewichtsmarker, die eine Identifizierung der subtilen Änderungen Darmbarrierefunktion ermöglicht. Im Gegensatz dazu, mit Modellen wie DSS Kolitis, die aus dem Darmepithel beinhaltet denuding kann größere Markierungen besser geeignet sein Mukosaheilung zu bewerten, als relativ kleine Erhöhungen der Barriere Integrität hervorgehoben.

Während Darmsäcken ein physiologisch relevantes Modell der GI Barrierefunktion bieten, gibt es einige Einschränkungen in Bezug auf die Variabilität von Tiermodellen, die berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel können sowohl parazellulären Transport beeinflussen die sekretorischen Zustand oder das Epithel über die intesZinke 20 und die Integrität der Schleimhaut Gel-Schicht 5. Während Ex-vivo-Tests elektrophysiologischen Messungen enthalten, wie zum Beispiel Präparate Ussingkammer, dies zu berücksichtigen kann, tun Darmsäcken nicht. Zweitens, in der Darmsäcken Forscher Vorbereitung für lymphatischen Strukturen, wie Peyer-Plaques zu bilanzieren, im Sack Vorbereitungen, da diese die Durchlässigkeit des Gewebes 21 beeinflussen können. Trotz dieser Überlegungen, im Gegensatz zu vielen Zellkulturmodellen verwendet, um epithelialen Integrität beurteilen zu können, bieten die Darmsäcken den Beitrag sowohl einer Schleim Gel-Schicht und einer darunter liegenden Lamina propria. Der Beitrag der Schleimhaut Gelschicht, insbesondere kann durch den Einsatz von schleimlösende Mittel, wie N-Acetylcystein oder hydrophoben Tracermolekülen, wie Dexamethason 5,17 bewertet werden. Dies kann besonders wichtig sein, in Darmdurchlässigkeit in Modellen der Krebstherapie oder entzündliche Darmerkrankung beurteilen, wHier Verlust der Schleimhautbarriere kann eine frühe Pathologie in der Schleimhautentzündung 22,23 sein. Auch in Modellen von Durchfallerkrankungen, funktionelle GI Krankheit oder Dysbiose, Darmschleimproduktion und die allgemeine Schleimhaut Gel Integrität an regionalen Standorten kann 5,19,24 verändert werden. Orale Gabe von Durchlässigkeit Marker und anschließende Serumprobennahme ist eine weitere Option für die Darmdurchlässigkeit in vivo zu beurteilen. Während dieses Verfahren eine minimale Manipulation des Gewebes hat, ist es ein zusammengesetztes Maß der Darmbarrierefunktion und die regionalen Beiträge zur Gesamt Barriere nicht beurteilen. Verschiedene Modelle von GI Krankheit wahrscheinlich verschiedenen Stellen der relativen Bedeutung zu haben, die durch orale Gabe Ansätze werden nicht berücksichtigt. Die Verwendung von Darmsäcken, ist daher eine schnelle, empfindliche und physiologisch relevanten Assay, der verwendet werden kann regional Darmschleimhaut Integrität in kleine Tiermodellen der Krankheit zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dekantel  Non-absorbable Silk suture Braintree Scientific SUT-S 116
Media 199 (TC199)  Life Technologies 11043-023 No phenol red as this interferes with fluorescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 21063-045 No phenol red as this interferes with fluorescence
N-acetylcysteine Sigma Aldrich Use at 10 mM in media
Small animal vascular cathether: Physiocath Data Sciences International 277-1-002
FITC-Dextran 4,400 MW Sigma Aldrich FD-4
FITC-Dextran 20,000 MW Sigma Aldrich FD-20
FITC-Dextran 70,000 MW Sigma Aldrich FD-70

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References

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Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).More

Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).

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