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Medicine

Ex Vivo intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale

doi: 10.3791/53250 Published: February 9, 2016

Abstract

La barriera epiteliale è la prima difesa innata del tratto gastrointestinale e regola selettivamente trasporto dal lume ai compartimenti sottostanti, limitare il trasporto di molecole più piccole attraverso l'epitelio e quasi completamente vieta epiteliale trasporto macromolecolare. Questa selettività è determinata dallo strato di gel mucoso, che limita il trasporto di molecole lipofile ed entrambi i recettori apicali e stretti complessi proteici giunzionali dell'epitelio. Modelli in vitro su colture di cellule dell'epitelio sono convenienti, ma come un modello, non hanno la complessità delle interazioni tra microbiota, muco-gel, epitelio e il sistema immunitario. D'altra parte, la valutazione in vivo dell'assorbimento intestinale o permeabilità può essere eseguita, ma questi test misurare il grado di assorbimento gastrointestinale, senza alcuna indicazione di specificità del sito. Ex vivo saggi permeabilità utilizzando "sacche intestinali"; sono un metodo rapido e sensibile per misurare sia l'integrità intestinale globale o il trasporto comparativa di una molecola specifica, con l'ulteriore vantaggio di specificità del sito intestinale. Qui si descrive la preparazione di sacche intestinali per gli studi di permeabilità e il calcolo della permeabilità apparente (P app) di una molecola attraverso la barriera intestinale. Questa tecnica può essere utilizzata come un metodo di valutazione assorbimento del farmaco, o per esaminare disfunzione barriera epiteliale regionale in modelli animali di malattia gastrointestinale.

Introduction

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La barriera epiteliale intestinale del tratto gastrointestinale è una superficie mucosa stimato a 400 m 2 nel umano adulto. Di conseguenza, si è costantemente esposto a sfidare da microbi, farmaci ingeriti, nutrienti e tossine batteriche. L'host non solo deve distinguere tra batteri commensali tollerabili e potenziali patogeni, ma deve impedire queste specie e loro molecole secrete di attraversare la barriera epiteliale, mentre allo stesso tempo permette l'assorbimento dei nutrienti. Pertanto, il ruolo dell'epitelio intestinale è di agire come barriera selettiva al contenuto luminale 1. Questo risultato è ottenuto, in parte, dal sistema di difesa epiteliale innato alla mucosa, che agisce attraverso un sistema biologico reattivo costituito da costitutive e inducibili meccanismi 2.

La perdita della funzione barriera epiteliale è una patologia che è caratteristica di un certo numero di malattie gastrointestinali. In vivoesame della funzione di barriera epiteliale può essere valutata attraverso sonda gastrica di una molecola tracciante e la successiva analisi del siero 3. Tuttavia, questa tecnica non offre alcuna indicazione sul sito di disfunzione barriera. In vitro e ex vivo valutazione della resistenza transepiteliale utilizzando sistemi Transwell 3 e ussing rispettivamente camere di 4,5, sono comunemente impiegati come indicatori surrogati di funzione di barriera epiteliale, ma manca la contribuendo malattia fisiologia dei modelli animali 6. In questo protocollo si descrive un modello di preparazione del tessuto ex vivo che permette una valutazione diretta e localizzata dell'integrità intestinale e che può essere utilizzato per valutare la funzione barriera della mucosa a diversi livelli. È importante sottolineare che questa tecnica può essere applicata a modelli animali di malattia, o può essere farmacologicamente manipolato per permettere a fondo interrogatori di disfunzione barriera mucosa.

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Protocol

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Tutti i lavori degli animali in questo protocollo viene eseguita con la stretta aderenza alle Università di Newcastle comitato etico degli animali procedure approvate.

1. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e Piatti

  1. Pre-caldo media 199 (TC199) o Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supporti a 37 ° C. Pre-ossigenare il supporto facendo gorgogliare con il 95% O 2/5% di CO 2. Verificare che il mezzo ha un pH finale di 7,3.
  2. Preparare sutura tagliando due sezioni 5 cm per ogni uscita. Loop i punti di sutura in un nodo non chiusa.

2. dissezione e preparazione del tratto gastrointestinale

  1. Ritirare solido cibo 12 ore prima di eutanasia. Se lo si desidera, inserire gli animali sugli integratori gel nutrienti durante questo periodo.
  2. Euthanize topi per overdose pentobarbitone sodio ([200 mg / Kg], iniezione intraperitoneale) seguita da dislocazione cervicale in conformità con l'etica proto istituzionaleCols e spruzzare il 70% di etanolo sul addome e torace.
  3. Usando una forbice, fare una incisione orizzontale nel mezzo dell'addome ed esporre il peritoneo.
  4. Procedere per separare e rimuovere il tratto gastrointestinale tagliando il piccolo intestino superiore dallo stomaco al sfintere piloro e taglio crasso al margine anale. Utilizzare una pinza per rimuovere delicatamente il mesentere. Posizionare il tratto intestinale in pre-riscaldato, medio ossigenato.
  5. Identificare la sezione dell'intestino da valutare per permeabilità (Figura 1) e tagliare questa sezione libera dal resto del tratto intestinale.
    1. Al fine di mantenere la coerenza tra animali, misurare le sezioni di duodeno e nel digiuno rispetto allo stomaco, e misurare le sezioni di colon e dell'ileo rispetto al cieco.
    2. Quando si seleziona segmenti di tessuto, notare la presenza di tessuti linfoidi mucosa-associati, come le placche di Peyer. Questi possono essere identificati come piccolo cenno del capoORME sul lato sierose del lume.
    3. Usando una siringa da 1 ml, lavare delicatamente il contenuto luminale del segmento intestinale in una capsula di Petri con PBS preriscaldato (37 ° C). Questi contenuti fecali possono essere scartati o conservati a -80 ° C per le analisi future, se lo desideri.

3. Preparazione intestinale Sacs

  1. Preparare una siringa da 1 ml con un volume di 300 microlitri del composto di prova o molecola. Per l'integrità della mucosa, un 1 mg / ml soluzione di FITC-destrano M.Wt. 4.400 possono essere utilizzati. Le sonde che vanno da 4,400-70,000 Da dimensioni possono essere utilizzati per una maggiore sensibilità. Trovare e montare un piccolo catetere vascolare animali sulla siringa.
  2. Misura 5 cm dall'apertura del segmento intestinale e legare il segmento completamente chiuse con una sutura-loop a questo punto. Posizionare delicatamente una sutura-loop pre-legata intorno all'apertura dell'intestino e inserire il catetere smussata. Tirare il cappio chiuso in modo da assicurare il segmento intestinalee rilasciare il volume 300 microlitri dalla siringa nell'intestino, assicurando che tutta la soluzione viene iniettata.
  3. Rimuovere delicatamente il catetere e contemporaneamente tirare il cappio di sutura per fissare la chiusura del sacco intestinale. Tagliare il sacco intestinale sciolto dall'intestino e posto in un tubo da 50 ml riempito con 20 ml di terreno ossigenato, preriscaldata a 37 ° C.

4. la misura della permeabilità

  1. Luogo provette coniche contenenti le sacche intestinali in un bagno d'acqua riscaldata impostati su 37 ° C. A 0, 30, 60, 90 e 120 punti min tempo, prelevare un campione di 100 microlitri dalla provetta conica e trasferimento ad una piastra da 96 pozzetti, sostituendo il volume con 100 ml di mezzi freschi in ciascun caso.
  2. Dopo aver prelevato il campione finale, tagliare sacche aperte al punto di sutura e la lunghezza del segmento, esponendo la superficie mucosa.
  3. Misurare la lunghezza e la larghezza di ogni segmento intestinale. Se Desirosso, scatto congelare i segmenti e conservare a -80 ° C per le proteine ​​o l'analisi biochimica, o, in alternativa, conservare in soluzione di stabilizzazione RNA per saggi molecolari.
  4. Costruire una curva standard di diluizioni di registro per le molecole FITC-etichettati da 1 a 1 x 10 -6.
  5. Misure di campioni e standard per FITC su un lettore di piastre a fluorescenza, FITC di eccitazione / emissione: 495 nm / 519 nm.

5. Calcolo di permeabilità apparente per ogni intestinale individuale Sac

  1. Convertire unità di tempo di sec.
  2. Per ogni punto di tempo, calcolare la concentrazione cumulativa, Q

    Q t = (C t * V r) + (Q t somma * V s),
    dove:

    Q t = concentrazione cumulativa al tempo t
    C t = concentrazione al tempo t
    V r = Volume sul lato ricevente
    Q t somma = Somma di tutte le precedenti Q t
    V s =volume campionato
  3. Trama Q in funzione del tempo (T) e calcolare la pendenza: AQ / DT
  4. Calcolare la permeabilità apparente (P app)

    P app = (AQ / T) / (A * Co), dove:

    A = area di tessuto
    C 0 = concentrazione iniziale

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Representative Results

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Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare i cambiamenti regionali in funzione di barriera intestinale in modelli animali di malattie gastrointestinali. Misurando il flusso di una sonda paracellular sulla superficie mucosa in diverse aree del tratto gastrointestinale 7, l'integrità delle giunzioni strette epiteliali può essere valutata. Inoltre, variando la natura della sonda paracellular per dimensione (Figura 2) o idrofobicità (Figura 3), il grado di perturbazione epiteliale o l'integrità dello strato di gel mucoso, possono anche essere misurata. Impiegando marcatori di peso molecolare più grandi consente una interrogazione più sensibile di permeabilità paracellular della mucosa, rilevando le variazioni discrete, che potrebbero non essere evidenti da misure elettrofisiologiche quali transepiteliale resistenza elettrica (TEER), ma che sarebbe sufficiente per consentire il trasporto paracellulare (Figura 2). mucosal infiammazione può portare a una perdita di cellule caliciformi e riduzione gel mucosa protettiva che sovrasta normalmente e protegge l'interfaccia epiteliale. Utilizzando sonde idrofobiche, l'integrità dello strato di gel mucosa intestinale può anche essere esaminato (Figura 3). Inoltre, integrità della barriera regionale può essere esaminato attraverso la preparazione specifica di sacche intestinali provenienti da diverse aree intestinali. Variazioni regionali in funzione di barriera variano all'interno di differenti modelli animali di malattia e, quindi, l'uso di sacche intestinali permette una valutazione localizzata della funzione barriera intestinale (figura 4), ​​rispetto al gavage orale di sonde e dosaggio siero successiva.

Figura 1
Figura 1. Schema del tratto gastrointestinale murino. Uno schema del tratto gastrointestinale di un topo C57BL / 6, dallo stomaco al tegli ano. Le piccole giunzioni intestinali non poter essere facilmente differenziati macroscopicamente e campionamento coerente aiuta a ridurre il mouse a variazioni del mouse. Ai fini della creazione di sacche intestinali, 5 cm di vuoto segmento distale dello sfintere piloro comprenderà duodeno. Una sezione 10 centimetri che si estende prossimalmente dal cieco comprenderà l'ileo. Il piccolo tessuto intestinale restante rappresenta digiuno. Il retto è situato a 2 cm dalla l'ano, mentre il restante intestino crasso, che si estende al cieco che rappresenta i due punti 8. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2.   Taglia-dipendente trasporto paracellular di molecole FITC destrano se la mucosa epiteliale in controllo e DSS colite animals. sacche intestinali sono stati preparati dai due punti di topi DSS 10 giorni nel corso della malattia. Sacs sono stati caricati con 1 mg / ml soluzione di FD-4 (MW 4.400 Da), FD-20 (MW 20,000 Da) o FD-70 (70.000 Da) e il flusso del marcatore permeabilità FITC-destrano è stata misurata oltre 120 min. Età abbinato animali sani sono stati usati come controlli. N = 5, 2 repliche tecniche per N. ** p <0.01, test t. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3 :. L'influenza di strato mucoso-gel sulla integrità della barriera a composti idrofobici. Sacche intestinali sono stati preparati dai due punti di topi DSS 10 giorni nel corso della malattia. Età abbinato animali sani sono stati usati come controlli. Per il controllo di muco-gel negativo, l'intestinosono stati caricati con 10 mM N-acetil cisteina (NAC) (300 pl per volume di 5 cm di intestino) e incubate a 37 ° C per 15 min e lavata con mezzo fresco prima sacche sono stati preparati. Sacs stati caricati con una soluzione 1 mg / ml di FD-4 (MW 4.400 Da) e flusso misurato per 120 min. N = 3, 2 repliche tecniche per N. * p <0.05, ** p <0.01, test t. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. La permeabilità regionale del intestino per FD-4 in modelli murini di infiammazione intestinale. Intestinale sacche sono stati preparati dal digiuno, ileo o colon di animali sani, animali DSS o disbiosi antibiotico-indotta animali (AID). Sacs sono stati caricati con 1 mg / ml soluzione di FD-4 (MW 4.400 Da) e flux misurato oltre 120 min. N = 3, 2 repliche tecniche per N. * p <0.05, ** p <0.01, test t. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Qui, abbiamo descritto l'isolamento e la preparazione di sacche intestinali per valutare la funzione barriera della mucosa ex vivo. preparazioni sac intestinali sono principalmente utilizzati nella ricerca farmaceutica, esaminando l'assorbimento di farmaci candidati attraverso l'intestino. Tuttavia, questo test è ugualmente adatta per lo studio della malattia intestinale. La permeabilità intestinale può variare notevolmente da regione a regione e la valutazione specifica del sito di permeabilità permette una migliore comprensione dell'importanza regionale dell'integrità della mucosa in malattie dell'apparato digerente. Il test è robusto e alle condizioni fisiologiche corrette, tessuti isolati rimangono vitali per un massimo di 6 ore post mortem. Dopo l'eutanasia, la velocità della preparazione dei tessuti è importante e l'intestino deve essere lavata del suo contenuto e trasferito medie ossigenato più rapidamente possibile. Al fine di garantire la coerenza tra gli animali, è indispensabile che le regioni intestinali corrette sono identified (Figura 1). E 'consigliabile che i segmenti del colon e ileo vengono misurate dal cieco, mentre i segmenti del duodeno e digiuno sono misurati dallo stomaco. Poiché diversi ceppi, modelli o animali transgenici possono essere più grandi, e hanno gits più lunghi, vale la pena che caratterizza la lunghezza media o ogni segmento intestinale nel modello prima di impegnarsi in saggi di permeabilità.

Oltre alla coerenza regionale, è importante garantire che ogni sacca intestinale viene tagliata uguali e il sacco viene riempito con la giusta quantità di fluido. Incoerenza in questi fattori si tradurrà in diseguale distensione della mucosa tra i saggi. Sotto-distensione del segmento intestinale non solo riduce l'esposizione del contenuto luminale alla superficie della mucosa, ma aumenta anche lo spessore del tessuto attraverso cui il marcatore deve percorrere. Over-distensione del segmento può danneggiare il tessuto o attivare di stress risposte nel tessuto, potenzialmente corisultati nfounding. Va notato, che per il calcolo di P app non tiene conto di superficie di struttura dei villi. Mentre questo porta ad un errore nel calcolo della permeabilità effettiva apparente del tessuto, non influisce risultati comparativi tra modelli, come la superficie è calcolato come una costante. Eventuali variazioni di superficie a causa di malattia sono compensati dalla perdita di integrità epiteliale e il protocollo è sufficientemente robusto per identificare i cambiamenti di permeabilità con la progressione della malattia 6.

Si raccomanda l'uso di terreni di coltura. In studi eseguiti da Barthe et al. L'uso di TC199 è stato trovato per aumentare significativamente la longevità della vitalità epiteliale e del tessuto architettura istologica, rispetto a semplici buffer di sale 9. Nei nostri studi sia DMEM e TC199 media mantenuta a 37 ° C ha fornito le condizioni ottimali per la sopravvivenza del tessuto 5,6,10. E la correttezza dei mediafornisce l'epitelio con sostanze nutritive necessarie per sostenere l'integrità dei tessuti, mantenendo la temperatura durante il dosaggio assicura metabolismo del tessuto ottimale che è essenziale integrità giunzionale stretto e saggi che coinvolgono trasporto attivo attraverso percorsi transcellulare. Temperature inferiori a 37 ° C causare la perdita di vitalità del tessuto, aumentando il trasporto paracellulare e diminuendo il trasporto transcellulare 11. Così, prolungando la vitalità del tessuto con condizioni ottimali è essenziale e in tal modo, il test può essere utilizzato non solo per esaminare integrità della barriera regionale e, ma anche di esaminare studi di intervento e le risposte fisiologiche e trascrizionali.

Mentre utilizzato principalmente per gli studi di assorbimento del farmaco, le tecniche per esaminare permeabilità apparente (P app) di una molecola marcatore attraverso una barriera epiteliale sono una misura altamente sensibile di integrità intestinale 12-15. A differenza di surrogare ex vivo MeasureMenti di funzione di barriera, come TEER, P applicazione è una misura diretta e altamente sensibile della barriera intestinale 4. Vale la pena notare che le misurazioni TEER e permeabilità, misurato con l'applicazione P di molecole marcatori non sono sempre correlate. Misure Teer comprendono la resistenza di entrambe le giunzioni strette e le resistenze in parallelo transcellulare 16. Pertanto TEER è una misura della resistenza combinata offerta da giunzioni strette e le cellule stesse. Se le associazioni cellula-cellula sono deboli (cioè le giunzioni strette sono leaky) allora questo contributo alla resistenza complessiva di un monostrato sarà basso. Così piccole variazioni di resistenze giunzionali strette per un epitelio leaky diventano variazioni trascurabili resistenze dell'epitelio nel suo complesso. Al contrario, saggi app P misurare la capacità di una molecola di attraversare la barriera mucosale 17 e in effetti, la sensibilità di misurazione P app può essere altrato attraverso la selezione diverse molecole marcatori dimensioni (Figura 1). La considerazione di dimensioni marcatore è importante in relazione al modello di malattia intestinale in esame. Tutti i modelli di allergia o funzionale malattia 18,19, dove la perdita di integrità è da lieve a moderata, può essere più adatto ai marcatori basso peso molecolare, che permetteranno l'identificazione di cambiamenti sottili alla funzione di barriera intestinale. Al contrario, con modelli come la colite DSS, che coinvolge denudando dell'epitelio intestinale, i marcatori più grandi possono essere più appropriato per valutare la guarigione della mucosa, come relativamente piccoli aumenti di integrità della barriera saranno evidenziati.

Mentre sacche intestinali offrono un modello fisiologicamente rilevanti della funzione barriera GI, ci sono alcune limitazioni rispetto alla variabilità di modelli animali, che devono essere considerati. Per esempio, lo stato secretoria o l'epitelio possono influenzare sia il trasporto attraverso le paracellular intestine 20 e l'integrità dello strato di gel mucoso 5. Mentre ex vivo saggi che incorporano le misurazioni elettrofisiologiche, come i preparati Camera di Ussing, possono tenere conto di questo, sacche intestinali non lo fanno. In secondo luogo, nel preparare i ricercatori sacche intestinali dovrebbe rappresentare strutture linfoidi, come placche di Peyer, all'interno preparazioni SAC come questi possono influenzare la permeabilità del tessuto 21. Nonostante queste considerazioni, a differenza di molti modelli di coltura cellulare, utilizzati per valutare l'integrità epiteliale, le sacche intestinali offrono il contributo sia uno strato di gel mucoso e una lamina propria sottostante. Il contributo dello strato di gel mucoso, in particolare, può essere valutata mediante l'uso di agenti mucolitici, come N-acetil cisteina, o molecole traccianti idrofobe, come desametasone 5,17. Questo può essere particolarmente importante per valutare la permeabilità intestinale in modelli di terapia del cancro o malattia infiammatoria intestinale, wqui perdita della barriera mucosa può essere una patologia presto la mucosa infiammazione 22,23. Allo stesso modo, in modelli di malattie diarroiche, malattie GI funzionale o disbiosi, produzione di muco intestinale e l'integrità complessiva del gel mucosa possono essere modificate in siti regionali 5,19,24. Sonda gastrica di marcatori di permeabilità e la successiva campionatura siero è un'altra opzione per la valutazione della permeabilità intestinale in vivo. Mentre questo metodo ha manipolazione minima del tessuto, è una misura composita della funzione barriera intestinale e non valutare i contributi regionali alla barriera complessiva. Diversi modelli di malattia GI possono avere vari siti di importanza relativa che non sarà rappresentato da approcci sonda gastrica. L'uso di sacche intestinali, è quindi un saggio rapida, sensibile e fisiologicamente rilevanti che possono essere utilizzati per esaminare l'integrità della mucosa intestinale regionale in piccoli modelli animali di malattia.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dekantel  Non-absorbable Silk suture Braintree Scientific SUT-S 116
Media 199 (TC199)  Life Technologies 11043-023 No phenol red as this interferes with fluorescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 21063-045 No phenol red as this interferes with fluorescence
N-acetylcysteine Sigma Aldrich Use at 10 mM in media
Small animal vascular cathether: Physiocath Data Sciences International 277-1-002
FITC-Dextran 4,400 MW Sigma Aldrich FD-4
FITC-Dextran 20,000 MW Sigma Aldrich FD-20
FITC-Dextran 70,000 MW Sigma Aldrich FD-70

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References

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<em>Ex Vivo</em> intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale
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Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).More

Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).

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