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Medicine

ex vivoで腸嚢は、胃腸疾患のモデルに粘膜透過性を評価するために

doi: 10.3791/53250 Published: February 9, 2016

Abstract

上皮バリアは、胃腸管の最初の先天的防御であり、選択的基盤となる組織区画に内腔からの輸送を調節し、上皮を通過する小さな分子の輸送を制限し、ほぼ完全に上皮高分子輸送を禁止します。この選択性は、親油性分子との両方の頂端受容体および上皮のタイトジャンクションタンパク質複合体の輸送を制限する粘液ゲル層によって決定される。上皮のin vitro細胞培養モデルは便利であるが、モデルとして、それらが欠け微生物、粘液ゲル、上皮および免疫系の間の相互作用の複雑さ。一方、腸管吸収または浸透性インビボ評価を行うことができるが、これらのアッセイは、部位特異性の兆候と、全体的な消化管吸収を測定する。「腸の嚢」を用いてエクスビボ透過性アッセイ;腸の部位特異性の付加的な利点と、特定の分子の全体的な腸の整合性や比較のトランスポートのいずれかを測定するの迅速かつ高感度な方法です。ここでは、透過性の研究と見かけの透過性(P アプリ )の計算のための腸嚢の調製を記載 腸管バリアを通過する分子の。この技術は、薬物吸収を評価する方法として使用することができる、または胃腸疾患の動物モデルにおける地域上皮バリア機能障害を検討します。

Introduction

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消化管の腸上皮障壁はヒト成人で400メートル2で推定粘膜表面積です。したがって、常に微生物、摂取薬、栄養素や細菌毒素から挑戦にさらされています。ホストが許容共生細菌と潜在的な病原体を区別しなければならないだけでなく、同​​時に、栄養素の吸収を可能にしながら、上皮関門を通過するから、これらの種とそれらの分泌分子を防止しなければなりません。このように、腸上皮の役割は、管腔の内容物1に対する選択的障壁として作用することです。これは部分的に、構成的および誘導機構2からなる反応性生物系を介して作用する粘膜における先天上皮防御システムによって、達成されます。

上皮バリア機能の喪失は、胃腸疾患の多数の特徴的な病理である。 インビボでの上皮のバリア機能の検査は、トレーサー分子およびその後の血清の分析3の強制経口投与を介して評価することができます。しかし、この技術は、バリア機能障害のサイトへなどの兆候を提供していません。 vitroおよびトランスウェルシステム3を使用し、それぞれのチャンバ4,5をアッシング経上皮抵抗のex vivoでの評価では、一般的に上皮のバリア機能の代理マーカーとして使用するが、動物モデル6の貢献疾患の生理機能を欠いています。このプロトコルでは、レベルの数で粘膜バリア機能を評価するために使用され得る腸の完全性との直接及び局所的な評価を可能にするエクスビボ組織標本のモデルが記載されています。重要なことに、この手法は、疾患の動物モデルに適用することができる、または薬理学的に粘膜障壁機能障害の深さ質問に可能にするように操作することができます。

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Protocol

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このプロトコルのすべての動物の作業はニューカッスル大学の動物倫理委員会に厳密に準拠して行われている手順を承認しました。

楽器、文化メディアと皿の作製

  1. プリ暖かいメディア199(TC199)またはダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)メディア37へ °C。 95%O 2/5%CO 2でバブリングすることにより事前含酸素媒体。媒体は7.3の最終pHを持っていることを確認してください。
  2. 各嚢のための2つの5cmのセクションを切断して縫合糸を準備します。ループ閉じられていない結び目に縫合糸。

2.解剖および消化管の調製

  1. 安楽死の前に固形食12時間を撤回。必要であれば、この時間の間に栄養ゲルサプリメントに動物を配置します。
  2. 施設内倫理プロトに従って頸椎脱臼に続いてペントバルビタールナトリウムの過剰摂取([200ミリグラム/キログラム]、腹腔内注射)によりマウスを安楽死させますCOLSは、腹部と胸部の上に70%エタノールをスプレーし。
  3. はさみを使用して、腹部の真ん中に横切開を行い、腹膜を露出させます。
  4. 分離し、幽門括約筋で胃から小腸上部を切断し、肛門縁で大腸を切断することにより、消化管を除去するために進んでください。優しく腸間膜を削除するために鉗子を使用します。予め温め、酸素媒体中で腸管を置きます。
  5. 図1)の透過性について評価する腸の部分を特定し、腸管の残りの部分から自由にこのセクションをカット。
    1. 動物間の一貫性を維持する胃十二指腸および空腸の相対的なセクションを測定し、盲腸を結腸及び回腸の相対的なセクションを測定するために。
    2. 組織セグメントを選択する場合、そのようなパイエル板などの粘膜関連リンパ組織の存在に注意してください。これらは小さなうなずきとして同定することができますルーメンの漿膜側のジュール。
    3. 1ミリリットルの注射器を使用して、静かに予熱したPBS(37°C)でペトリ皿に腸セグメントの管腔内容をフラッシュします。これらの糞便内容は-80で廃棄または保存することができます 所望のように将来の分析のためにCを°。

腸嚢の調製

  1. 試験化合物または分子の300μlの容量で1ミリリットル注射器を準備します。粘膜の完全性、FITCデキストランM.Wt.の1mg / ml溶液のための4,400を使用してもよいです。 4,400-70,000ダの大きさの範囲のプローブは、増加した感受性のために使用することができます。安全注射器の上に小さな動物の血管カテーテルにフィット。
  2. メジャー5腸セグメントの開口部からセンチ、セグメントをネクタイはしっかりとこの時点で、縫合糸ループで閉じます。静かに腸の開口部の周囲に予め結んだ縫合糸ループを配置し、鈍化カテーテルを挿入します。腸のセグメントを確保するために、閉じた縄を引いてそして、すべての溶液が注入されることを確認して、腸にシリンジから300μlのボリュームをリリース。
  3. 同時に腸嚢の閉鎖を確保​​するために、縫合糸縄を引きながらゆっくりカテーテルを削除します。腸からの緩い腸嚢をカットし、37に予熱酸素培地20mlを充填した50mlコニカルチューブの中に置きます °C。

透水4.測定

  1. 37に設定された加熱水浴中で腸の嚢を含む場所コニカルチューブ °C。 0、30、60、90および120分の時点で、各インスタンスで新鮮な培地100μlでボリュームを交換し、円錐管および転送から96ウェルプレートに100μlのサンプルを取ります。
  2. 最終的なサンプルが採取された後、粘膜表面を露出させ、縫合糸の時点で、セグメントの長さに沿って開いた嚢をカット。
  3. 各腸のセグメントの長さと幅を測定します。指名打者の場合赤、スナップ-80セグメントと店を凍結 タンパク質または生化学的解析、あるいは、分子アッセイのためのRNA安定化溶液中の店のためのC°。
  4. 1から1×10 -6の範囲内のFITCタグ化分子に対する対数希釈の標準曲線を構築します。
  5. 蛍光プレートリーダー上のFITC用の測定試料および標準、FITCの励起/発光:/ 519 nmの495 nmの。

各個別の腸サックのための見かけ透水5.計算

  1. 時間単位は秒に変換します。
  2. 各時点について、累積濃度、Qを計算します

    Q tの=(C トンの * Vrを)+(Q t * V s)は
    ここで:

    時刻tでのQ トン =累積濃度
    CのT =時間tにおける濃度
    受信機側でのV R =
    以前のすべてのQ tのQ t =合計
    V S =ボリュームをサンプリング
  3. プロット対時間Q(T)と傾きを計算:δQ/ΔT
  4. 見かけの透過性を計算する(P アプリ

    P アプリ =(δQ/ΔT)/(*株)、場所:

    組織のA =エリア
    C 0 =初期濃度

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Representative Results

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このプロトコルは、胃腸疾患の動物モデルにおいて腸のバリア機能の地域の変化を調べるために使用することができます。胃腸管7の変化領域に粘膜表面を横切って傍細胞プローブの流量を測定することにより、上皮のタイトジャンクションの完全性を評価することができます。また、大きさ( 図2)または疎水性( 図3)、上皮摂動の程度、または粘液ゲル層の完全性を傍プローブの性質を変化させることによっても測定することができます。より大きな分子量マーカーを用いることが、このような経上皮電気抵抗(TEER)などの電気生理学的測定によって明らかではないかもしれない控えめな変化を、検出、粘膜の傍細胞透過性のより敏感な尋問は可能ですが、その傍細胞輸送を可能にするのに十分である( 図2)。ムコサル炎症は杯細胞と正常に重なり、上皮インターフェースを保護する保護粘液ゲルの減少の損失につながる可能性があります。疎水性のプローブを用いて、腸の粘液ゲル層の完全性は、( 図3)を調べることができます。また、地域の障壁の完全性は、異なる腸地域から腸嚢の具体的な準備を通って検査することができます。バリア機能の地域の変化は、疾患の種々の動物モデル内で変化し、プローブの強制経口投与し、その後の血清アッセイと比較した場合、したがって、腸の嚢の使用は、腸のバリア機能の局所的な評価( 図4)を可能にします。

図1
マウス消化管の図1.図。胃からtまでのC57BL / 6マウスの消化管の概略図、彼は肛門。小腸の接合部は、容易に肉眼で区別することができず、一貫性のあるサンプリングは、マウスの変化にマウスを最小限に抑えることができます。腸の嚢を作成する目的で、幽門括約筋に5cmのセグメントの遠位十二指腸を含むであろう。盲腸から近位に伸びる10cmのセクションでは、回腸を包含します。残りの小腸組織は、空腸を表します。直腸結腸8を表す盲腸まで延び、残りの大腸で、肛門に2cmの近位に位置しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2。  サイズ依存制御における上皮粘膜しかしFITC-デキストラン分子の傍細胞輸送およびDSS大腸炎のアニマLS。腸嚢10日疾患の経過にDSSマウスの結腸から調製しました。嚢は120分にわたって測定したFITCデキストラン透過性マーカーを1mg / FD-4(MW 4400ダ)のミリリットルソリューション、FD-20(MW 20,000Daの)またはFD-70(7万ダ)とフラックスを充填しました。年齢、健康な動物を対照として使用した一致しました。 N = 5、N.あたり2技術的反復**はp <0.01、スチューデントのt検定。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3 :.疎水性化合物に対する障壁の完全性の粘液ゲル層の影響。腸管嚢10日疾患の経過にDSSマウスの結腸から調製しました。年齢、健康な動物を対照として使用した一致しました。負の粘液ゲル制御のため、腸10mMのN-アセチルシステイン(NAC)(腸5cmの当たり300μlの体積)を装填し、37℃でインキュベートしました。 15分間C°と嚢を調製した前に、新鮮な培地でフラッシュ。嚢120分間にわたって測定FD-4(MW 4,400 Da)でフラックスの1mg / mlの溶液を装填しま​​した。 = 3 N、N。*のP <0.05、** P <0.01、スチューデントのt検定につき2技術的反復が。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4.腸の炎症のマウスモデルにおけるFD-4への腸の地域の透磁率。腸嚢は健康な動物、DSS動物または抗生物質誘発性腸内毒素症(AID)動物の空腸、回腸または結腸から調製しました。嚢は、FD-4(MW 4,400 Da)であり、fの1mg / mlの溶液を装填しま​​した。ルクスは、120分かけて測定しました。 = 3 N、N。*のP <0.05、** P <0.01、スチューデントのt検定につき2技術的反復が。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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ここでは、粘膜バリア機能のex vivoで評価するために分離および腸嚢の調製を詳述しています。腸の嚢の調製物は、主に腸を横断候補薬物の吸収を調べ、薬学研究に利用されています。しかし、このアッセイは、腸疾患の研究のためにも同様に適しています。領域と透過性の部位特異的な評価によって大きく異なる場合があります腸の透過性は、消化器疾患における粘膜の整合性の地域の重要性をよりよく理解することができます。アッセイは堅牢であり、適切な生理学的条件の下で、孤立した組織は、最大6時間の死後のための実行可能なままです。安楽死に続いて、組織標本の速度が重要であり、腸は、その内容をフラッシュし、できるだけ迅速に含酸素媒体に転写されるべきです。動物間の一貫性を確保するためには、適切な腸の領域がidentifiであることが不可欠ですED( 図1)。十二指腸と空腸のセグメントは胃から測定されながら、結腸と回腸セグメントは、盲腸から測定されることをお勧めします。異なる株、モデルやトランスジェニック動物が大きくなる可能性があるため、より長いGITSを持っている、それは透過性アッセイに従事する前に、モデル内の平均長または各腸セグメントを特徴づ​​ける価値があります。

地域の一貫性に加えて、それぞれの腸嚢が同じ長さに切断され、嚢が流体の正確な量で満たされることを保証することが重要です。これらの要因の矛盾は、アッセイ間の粘膜の不平等な膨満になります。粘膜表面に管腔内容物の露出を低減するだけでなく、マーカーが移動しなければならないそれを通して組織の厚さを増加させ、アンダー膨満、腸のセグメントだけでなく。過膨張セグメントの組織に損傷を与える可能性または組織におけるストレス応答を活性化、潜在的に協力nfounding結果。 P アプリケーションの計算のため絨毛構造体の表面積を考慮していないことに留意すべきです。これは組織の実際の見かけの透過率を計算する際にエラーにつながる一方で、表面積が一定のように計算されるように、それは、モデル間の比較結果には影響しません。疾患に対する表面積の変化は、上皮の完全性の損失によって相殺され、プロトコルは、疾患の進行6と透過性の変化を識別するために十分に頑強です。

組織培養培地の使用が推奨されます。単純な塩バッファ9と比較した場合バルテらによって行われた研究はTC199の使用は、著しく上皮生存率および組織学的構造の寿命を増加させることが見出されました。我々の研究では、DMEMとTC199両方の媒体が37で維持 °Cは、組織の生存5,6,10のための最適な条件を提供しました。正しいメディアアッセイの間に温度を維持することが不可欠タイトジャンクショ​​ンの完全性と経細胞経路を介した能動輸送を伴​​うアッセイで最適な組織代謝を保証しながら、組織の完全性を維持するために必要な栄養素と上皮を供給する。 37以下の温度 組織の生存率℃の原因損失、傍細胞輸送を増大させ、経細胞輸送11を減少させます 。したがって、最適な条件での組織の生存率を延長することは必須であり、そうすることで、分析地域障壁の完全性を検査するだけでなく、使用することができるとも介入研究および生理学的および転写応答を調べること。

主に薬剤吸収研究のために使用しているが、上皮バリアを介してマーカー分子の見かけの透過性(P アプリを )検討する技術は、腸の整合性12-15の高感度測定です。これとは対照的に代理するex vivoで measuremeこのようなTEER、P アプリとしてバリア機能の国税庁は、腸のバリア4の直接的かつ高感度な測定です。これは、マーカー分子のP アプリによって測定されるようにTEERの測定と透過性は必ずしも相関しないことは注目に値します。 TEERの測定は、タイトジャンクション及び経並列抵抗16の両方の抵抗を包含する。したがって、TEERは、密着結合および細胞自体によって提供される合成抵抗の測定値です。細胞間の関連付けが弱い場合には、単層の全体的な抵抗にこの寄与は低くなります(つまり、タイトジャンクショ​​ンは、漏洩しています)。このように漏れやすい上皮のためのタイトジャンクショ​​ン抵抗の小さな変化は、全体としての上皮の抵抗を無視できるの変更になります。対照的に、P アプリアッセイは、粘膜障壁17を通過する分子の能力を測定し、実際に、P アプリ測定の感度は、Alであってもよいです異なるサイズのマーカー分子( 図1)を選択を通して結。マーカーのサイズの考慮が検討されている腸疾患のモデルとの関連で重要です。完全性の損失は、軽度から中等度であり、アレルギーや機能性疾患18,19のモデルは、腸のバリア機能に微妙な変化の同定を可能にする低分子量マーカー、に、より適しているかもしれません。対照的に、腸上皮のdenuding含むDSS大腸炎のようなモデルを用いて、より大きなマーカーは障壁の完全性の比較的小さな増加が強調表示されるように、粘膜の治癒を評価するために、より適切であるかもしれません。

腸嚢がGIバリア機能の生理学的に関連するモデルを提供していますが、考慮される必要がある動物モデルの変動性に関していくつかの制限があります。例えば、分泌状態または上皮はintes全体の両方の傍細胞輸送に影響を与えることができますタイン20と粘液ゲル層5の整合性。このようなウッシングチャンバーの準備として電気生理学的測定を取り入れたex vivoのアッセイは、これを考慮かもしれないが、腸の嚢はしないでください。第二に、これらは組織21の透過性に影響を与える可能性があるとして研究者が、嚢の製剤内で、このようなパイエル板などのリンパ構造、会計処理すべき腸嚢を準備インチこれらの考慮事項にもかかわらず、上皮の完全性を評価するために使用される多くの細胞培養モデルとは異なり、腸の嚢は、粘液ゲル層と下層の粘膜固有層の両方の寄与を提供します。粘液ゲル層の寄与は、特に、例えば、N-アセチルシステインなどの粘液溶解剤、または例えばデキサメタゾン5,17のような疎水性トレーサー分子の使用により評価することができます。これは、wは、癌の治療又は炎症性腸疾患のモデルにおける腸透過性を評価する上で特に重要であり得ますここで粘膜バリアの損失は、粘膜の炎症22,23の初期の病理することができます。同様に、下痢性疾患、機能性胃腸疾患または腸内毒素症のモデルでは、腸の粘液産生および全体的な粘液ゲルの整合性は、地域サイト5,19,24で変更することができます。透過性マーカーとその後の血清サンプリングの強制経口投与 、in vivoで腸透過性を評価するための別のオプションです。この方法は、組織の最小限の操作を持っているが、それは腸のバリア機能の複合尺度であり、それは全体的な障壁に地域貢献を評価しません。 GI疾患の異なるモデルは、強制経口投与アプローチによって考慮されないであろう相対的な重要性の異なるサイトを持っている可能性があります。腸の嚢の使用は、したがって、疾患の小動物モデルにおける地域の腸管粘膜の完全性を検査するために使用することができ、迅速な高感度かつ生理学的に関連するアッセイです。

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Disclosures

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dekantel  Non-absorbable Silk suture Braintree Scientific SUT-S 116
Media 199 (TC199)  Life Technologies 11043-023 No phenol red as this interferes with fluorescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 21063-045 No phenol red as this interferes with fluorescence
N-acetylcysteine Sigma Aldrich Use at 10 mM in media
Small animal vascular cathether: Physiocath Data Sciences International 277-1-002
FITC-Dextran 4,400 MW Sigma Aldrich FD-4
FITC-Dextran 20,000 MW Sigma Aldrich FD-20
FITC-Dextran 70,000 MW Sigma Aldrich FD-70

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References

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<em>ex vivoで</em>腸嚢は、胃腸疾患のモデルに粘膜透過性を評価するために
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Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).More

Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).

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