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Medicine

예 생체 내 창자 주머 니나는 위장 질환 모델에서 점막 투과성을 평가하는

doi: 10.3791/53250 Published: February 9, 2016

Abstract

상피 장벽 위장관 제 타고난 방어 선택적 작은 상피 걸쳐 분자와 거의 상피 고분자 전송 금지의 이동을 제한하는 하부 조직 구획 루멘으로부터 수송을 조절한다. 이 선택은 친 유성 분자 양쪽 정점 수용체 상피 단단한 접합부 단백질 복합체의 전송을 제한 점액 겔 층에 의해 결정된다. 상피 세포의 시험 관내 세포 배양 모델은 편리하지만, 모델, 그들은 부족한 미생물, 점액 젤, 상피 세포와 면역 체계 사이의 상호 작용의 복잡성. 한편, 사이트 특이성 표시없이 장내 흡수 또는 투과율의 생체 내 평가를 수행 할 수 있지만, 이러한 분석은 전체 위장관 흡수를 측정한다. 생체 외 투과 검정을 "장 주머니"를 사용하여; 장 사이트 특이성의 추가적인 장점으로, 전체 장 무결성 또는 특정 분자의 비교 수송를 측정하는 신속하고 민감한 방법입니다. 여기에서 우리는 투과성 연구를위한 장 주머니의 준비 및 명백한 투자율 (P 응용 프로그램)의 계산을 설명 장 장벽을 가로 지르는 분자. 이 기술은 평가 약물 흡수의 방법으로 사용할 수도 있고, 위장관 질환의 동물 모델에서의 지역 상피 장벽 기능 장애를 조사.

Introduction

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위장관 장 상피 장벽 인간 성인 400 평방 미터로 추정 점막 표면적이다. 따라서, 지속적 미생물 섭취 약물, 영양분 및 박테리아 독소의 도전에 노출된다. 호스트는 허용 공생 박테리아 병원균 구분하지해야하지만 동시에 영양소 흡수를 허용하면서, 상피 장벽을 넘어에서 이러한 종의 분자 및 분비를 방지한다. 따라서, 장 상피 세포의 역할은 내강 내용 1 선택적 장벽으로 작용한다. 이 구성 적 및 유도 메커니즘이 이루어진 반응 시스템을 통해 생물학적 작용 점막 상피에서 타고난 방어 시스템에 의해 부분적으로 달성된다.

상피 장벽 기능의 상실은 위장관 질환의 특징 인 다수의 병리이다. 생체를상피 장벽 기능의 검사는 추적 분자의 구강 투여 이후 혈청 분석 (3)를 통해 평가 될 수있다. 그러나,이 기술은 장벽 기능 장애의 사이트에 같은 징후를 제공하지 않습니다. 생체 외 및 트랜스 웰 시스템 (3)를 사용하여 각각 챔버 4,5 Ussing transepithelial 저항의 생체 평가에서 일반적으로 상피 장벽 기능의 대리 지표로 사용하지만, 동물 모델 (6)의 기여 질병 생리학 부족합니다. 이 프로토콜에서는 다수의 레벨에서 점막 장벽 기능을 평가하는데 사용될 수있다 장 무결성 및 직접 지역화 평가 수 생체 조직 준비 모델을 설명한다. 중요한 것은,이 방법은 질환의 동물 모델에 적용 할 수 있거나, 또는 그의 약학 적 점막 방벽 기능 부전의 깊이 질의에서 허용하도록 조작 될 수있다.

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Protocol

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이 프로토콜의 모든 동물의 작업 절차를 승인 뉴캐슬 동물 윤리위원회의 대학 엄격하게 준수하여 수행됩니다.

악기, 문화 미디어와 요리 1. 준비

  1. 37 미리 따뜻한 미디어 199 (TC199) 또는 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM)는 미디어 기음. 사전 네이트 95 %, O2 / 5 % CO 2로 버블 링하여 매체. 매체가 7.3의 최종 pH가 있는지 확인합니다.
  2. 각 주머니 두 5cm 섹션을 절단하여 봉합을 준비합니다. 루프 닫히지 않은 매듭에 봉합.

2. 해부 및 위장관의 제조

  1. 안락사 전에 고체 음식을 12 시간 인출. 원하는 경우,이 기간 동안 영양 젤 보충에 동물을 배치합니다.
  2. 나트륨 펜토 바르비 과다 복용에 의한 쥐를 안락사 ([200 ㎎ / ㎏, 복강 내 주사) 기관 윤리 프로토에 따라 자궁 경부 전위 다음COLS는 복부와 흉부에 70 % 에탄올을 스프레이.
  3. 가위 사용하여 복부의 중앙에 수평 절개를하고 복막을 노출.
  4. 분리 유문 괄약근의 위의 상부 소장을 절단하고 항문에서 대장을 절단하여 위장관을 제거하기 위해 진행합니다. 부드럽게 장간막을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 미리 예열, 산소 매체의 창자를 놓습니다.
  5. 소장의 부분을 식별하는 투과성 (그림 1)에 대한 평가 및 장관의 나머지에서 무료로이 부분을 절단한다.
    1. 동물 사이의 일관성을 유지 위장, 십이지장 및 소장의 상대적인 부분을 측정하고, 맹장 및 결장 회장 상대적인 부분을 측정하기 위해.
    2. 조직 세그먼트를 선택하는 경우, 이러한 패치 파이어 등 점막 - 관련 림프 조직의 존재를 참고. 이러한 작은 끄덕임으로 식별 될 수있다루멘의 장막 측 ules.
    3. 1 ML의 주사기를 사용하여 부드럽게 예열 PBS (37 ° C)와 페트리 접시에 장 세그먼트의 내강 내용을 세척하십시오. 이 대변 내용에 폐기되거나 저장 될 수 -80 원하는대로 향후 분석을 위해 C를 °.

장내 주머 니나 3. 준비

  1. 시험 화합물 또는 분자의 300 μL 부피 1 mL를 주사기를 준비한다. 점막의 무결성, FITC - 덱스 트란 M.Wt.의 1 ㎎ / ㎖ 솔루션 4400이 사용될 수있다. 4,400-70,000 다에서 크기에 이르기까지 프로브가 증가 감도를 사용할 수있다. 안전하게 주사기에 작은 동물 혈관 카테터를 장착한다.
  2. 장 세그먼트의 오프닝에서 5cm 측정 및 세그먼트를 묶어 안전하게이 시점에서 봉합 루프로 마감했다. 조심스럽게 소장의 개구부 주위에 미리 연결 봉합 루프를 배치하고 무딘 카테터를 삽입합니다. 장 세그먼트를 확보 할 수 있도록 폐쇄 올가미를 당겨모든 용액을 주입 보장, 소장에 주사기에서 300 μl의 볼륨을 놓습니다.
  3. 동시에 장 낭의 폐쇄를 고정 봉합 올가미를 잡아 당기면서 부드럽게 카테터를 제거합니다. 소장에서 느슨한 장 주머니를 잘라 37로 예열 산소 매체의 20 ㎖로 가득 50 ML 원뿔 관에 배치 기음.

투수 4. 측정

  1. 가열 된 물을 욕조에 장 주머니를 포함 장소 원뿔 튜브는 37로 설정 기음. 0, 30, 60, 90 및 120 분의 시점에서, 각각의 인스턴스에 신선한 매체와 함께 100 ㎕의 부피를 대체하는 96 웰 플레이트 원뿔 튜브 및 전송에서 100 μL 샘플을 취할.
  2. 최종 샘플을 취한 후, 점막 표면을 노출시키는, 봉합사 시점과 세그먼트의 길이 아래로 열린 주머니를 잘랐다.
  3. 각 장 세그먼트의 길이 및 폭을 측정한다. 다목적 경우빨강, 스냅 -80에서 세그먼트 저장을 동결 분자 분석을위한 RNA 안정화 용액에서 단백질 또는 생화학 적 분석, 또는 대안 적으로, 상점에 대한 C를 °.
  4. 1 1 × 10 -6까지 FITC-태그 분자 로그 희석의 표준 곡선을 구축합니다.
  5. 형광 플레이트 리더에 FITC에 대한 측정 시료와 표준, FITC 여기 / 방출 / 519 내지 495 나노 미터.

각 개인 소장 골목에 대한 명백한 투수 5. 계산

  1. 초에 시간 단위로 변환합니다.
  2. 각 타임 포인트에 대한 누적 농도, Q를 계산할

    Q의 t = (C t의 *의 V r에) + (Q t 합 * V s의),
    장소 :

    Q의 t = 시간 t에서 누적 농도
    C의 t = 시간 t에서의 농도
    수신 측에서 V의 R = 볼륨
    이전의 모든 Q의 t의 Q T는 합계 = 합계
    V S =볼륨 샘플링
  3. 플롯 시간 (T) 대 Q 및 기울기를 계산 : δQ / ΔT
  4. 명백한 투과성을 계산 (P 응용 프로그램)

    P = (δQ / ΔT) / (A * 공동), 장소 :

    조직의 면적 A =
    C 0 = 초기 농도

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Representative Results

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이 프로토콜은 위장 질환의 동물 모델에서 장 장벽 기능 지역적 변화를 조사하기 위하여 사용될 수있다. 위장관 (7)의 다양한 영역에서의 점막 표면에 걸쳐 paracellular 프로브의 유량을 측정함으로써, 상피 꽉 접합 무결성을 평가할 수있다. 또한, 크기 (도 2) 또는 소수성 (도 3), 상피 섭동의 정도 또는 점막 겔층의 무결성을 paracellular 프로브의 특성을 변화시킴으로써,도 측정 할 수있다. 더 큰 분자량 마커를 사용하는 등 transepithelial 전기 저항 (봉사자) 등의 전기 생리 측정에 의해 명백하지 않을 수 있습니다 신중한 변화를 감지, 점막의 paracellular 침투성의 더 민감한 심문을 허용하지만, 어떤 paracellular 전송을 허용하기에 충분하다 (그림 2). 뮤코샐 염증은 일반적으로 위에 놓 및 상피 인터페이스를 보호하는 보호 점액 젤의 배 세포의 손실 감소로 이어질 수 있습니다. 소수성 프로브를 사용하여, 장내 점막 겔층의 무결성도 (도 3)을 조사 할 수있다. 또한, 지역 장벽 완전성 다른 장 영역에서 장내 주머니의 특정 제제를 통해 조사 할 수있다. 장벽 기능의 지역 변경 질환의 다양한 동물 모델 내에서 변화 및 프로브의 구강 투여 이후 혈장 분석에 비해 따라서, 장내 낭의 사용은, 장 장벽 기능의 국부적 평가 (도 4)을 허용한다.

그림 1
쥐 위장관 그림 1. 다이어그램. C57BL / 6 마우스의 위장관의 개략도, 위장에서이 t합니다그는 항문. 소장 접합 쉽게 육안으로 구별 할 수없는 일관된 샘플링은 마우스의 변화에​​ 마우스를 최소화하는 데 도움이됩니다. 장내 주머니를 만드는 목적 유문 괄약근에 5cm 세그먼트 말단은 십이지장을 포함한다. 맹장에서 근위 연장 10cm 섹션은 회장을 포함합니다. 나머지 소장 조직은 공장을 나타냅니다. 직장은 대장 (8)을 나타내는 맹장까지 연장, 나머지 대장과 항문에 2cm의 근위부에 위치해 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2.   FITC-덱스 트란 분자의 크기에 의존 paracellular 전송 제어 및 DSS 대장염의 애니 마에서 상피 점막하지만LS. 창자 주머니는 십일 질병의 과정에 DSS 마우스의 콜론에서 제조 하였다. 주머니는 120 분에 걸쳐 측정 된 FITC-덱스 트란 투과성 마커의 1 밀리그램 / FD-4 (MW 4400 다) ml의 용액, FD-20 (MW 20,000 다) 또는 FD-70 (70,000 다) 및 플럭스로드되었다. 건강한 동물 유사한 연령 대조군으로 사용 하였다. N = 5, N. 당 2 기술 복제 ** p <0.01, 학생의 t-test를. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 :. 소수성 화합물에 대한 장벽의 무결성 점액 - 겔 층의 영향. 소장 주머니는 십일 질병의 과정에 DSS 쥐의 결장에서 제조 하였다. 건강한 동물 유사한 연령 대조군으로 사용 하였다. 음의 점액 - 겔 제어를 위해, 창자10 mM의 N- 아세틸 시스테인 (NAC) (소장의 5cm 당 300 μL 볼륨)와로드 (37)에서 배양 하였다 15 분 동안 C를 °와 주머니가 준비되기 전에 신선한 매체와 플러시. 주머니는 120 분에 걸쳐 측정 1 ㎎ / ㎖의 FD-4의 용액 (MW 4400 다) 및 플럭스로드되었다. N = 3, N.의 *의 P <0.05 당 2 기술 복제, ** p <0.01, 학생의 t-test를. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. 장 염증의 쥐 모델에서 FD-4 장의 지역 침투성. 소장 낭은 건강한 동물, DSS 동물 또는 항생제 유발 dysbiosis (AID) 동물의 공장, 회장 또는 결장에서 제조 하였다. 주머니가 1 mg의 FD-4 / ㎖의 용액으로로드 된 (MW 4400 다)와 F럭스는 120 분에 걸쳐 측정했다. N = 3, N.의 *의 P <0.05 당 2 기술 복제, ** p <0.01, 학생의 t-test를. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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여기서는 점막 장벽 기능 생체을 평가 단리 장내 주머니의 제조 상세한있다. 소장 SAC 제제는 주로 소장 전체 후보 약물의 흡수를 시험하는 제약 연구에서 사용되어왔다. 그러나 이러한 분석은 동일하게 장 질환의 연구를 위해 적합하다. 지역 및 투과성의 사이트에 특정 평가에 따라 크게 다를 수 있습니다 장 투과성은 소화 질환 점막의 무결성의 지역 중요성에 대한 이해를 할 수 있습니다. 분석은 강력하고 정확한 생리 학적 조건에서, 고립 된 조직은 최대 6 시간의 사후에 대한 실행 가능한 남아있다. 안락사 후, 티슈 제조 속도가 중요하며, 소장은 그 내용 플러시 가능한 한 신속하게 산소 매체에 전사한다. 동물들 사이의 일관성을 확보하기 위해서는 정확한 장 영역 identifi 것을 필수에드 (그림 1). 십이지장과 공장의 세그먼트가 뱃속에서 측정하는 동안 대장과 회장 세그먼트, 맹장에서 측정하는 것이 좋습니다. 다른 균주 또는 형질 전환 동물 모델이 커야하고 GITS 이상을 가질 수 있기 때문에, 투과 검정에 참여하기 전에 모델의 평균 길이 또는 각각의 장 구간 특성을 가치가있다.

지역 일관성 또한, 각 장 SAC가 동일 길이로 절단되어 SAC가 유체의 정확한 부피 충전하는 것이 중요하다. 이러한 요소의 불일치는 분석 사이의 점막의 불평등 팽창가 발생합니다. 밑에 팽창 장 세그먼트뿐만 점막 표면 내강 콘텐츠 노출을 줄일뿐만 아니라, 마커 이동해야되는 조직의 두께를 증가시킨다. 오버 팽창 조직에 스트레스 반응을 조직을 손상 시키거나 활성화시킬 수있다 세그먼트, 잠재적으로 공동의nfounding 결과. P 앱의 계산은 융모 구조의 표면적을 고려하지 않습니다에 대한 것을 주목해야한다. 이 조직의 실제 명백한 투과성을 계산 오차로 연결하면서 표면적 상수로 계산 될 때, 그것은 모델 간의 비교 결과에 영향을 미치지 않는다. 인한 질병 표면적 변경 상피 완전성 상실로 상쇄되고 프로토콜 질병 진행 (6) 투과율의 변화를 식별하기에 충분히 견고하다.

조직 배양 배지의 사용을 권장합니다. 바르 등의 연구가 수행된다. TC199의 사용은 단순 염 버퍼 (9)에 비해 유의하게 생존 상피 조직 학적 구조의 수명을 증가시킬 것으로 밝혀졌다. 우리의 연구에서 DMEM과 TC199 두 매체는 37로 유지 ° C는 조직의 생존 5,6,10-을위한 최적의 조건을 제공했다. 올바른 미디어분석 기간 동안 온도를 유지하는 것이 필수적 꽉 접합부 무결성 및 세포 횡단 경로를 통해 능동 수송과 관련된 분석이다 최적의 조직 신진 대사를 보장하면서, 조직의 무결성을 유지하는 데 필요한 영양소와 상피를 제공합니다. 37 이하의 온도 조직 생존의 ° C 원인 손실, paracellular 전송을 증가시키고 세포 횡단 수송 (11)을 감소시킨다. 따라서, 최적의 조건으로 조직 생존을 연장하는 것이 필수적이며, 그렇게함으로써, 분석은 지역 배리어 무결성을 검사 할뿐만 아니라 이용 될 수 있지만, 또한 간섭 연구 및 생리적 전사 반응을 조사.

주로 약물 흡수 연구에 사용하지만, 기술은 상피 장벽을 가로 질러 마커 분자의 명백한 침투성 (P 앱) 검사 장 무결성 12-15의 고감도 측정합니다. 반면 대리하는 생체 방식 측정같은 봉사자 등의 장벽 기능의 국세청, P 앱은 장 장벽 (4)의 직접적이고 매우 민감한 측정합니다. 이 마커 분자의 P 의해 측정 티이 측정 및 투과율이 항상 상관하지 않는 것이 주목할 가치가있다. 티이 측정 단단한 접합부 및 세포 횡단 병렬 저항기 (16) 양자의 저항을 포함한다. 따라서 티이 단단히 접합 및 세포 자체에 의해 제공되는 합성 저항의 측정이다. 세포 간 연결이 약한 경우, 단분자막의 전체 저항이 기여도가 낮은 것 (즉, 엄격한 접합 누설이있다). 따라서 누설 상피 타이트 접합부 저항의 작은 변화가 전체 상피의 저항을 무시할 변경된다. 반면, P 분석은 실제로 점막 장벽 (17)을 통과하고있는 분자의 능력을 알 수있다 P 측정의 민감도를 측정다른 크기의 마커 분자를 (그림 1) 선택을 통해이 거행. 마커 크기 고려 대상인 장 질환 모델에 관하여 중요하다. 무결성의 손실은 중간에 온화 알레르기 또는 기능적 질환 18, 19, 모델은 장 장벽 기능에 미묘한 변화의 확인을 수 저 분자량 마커에 더 적합 할 수있다. 대조적으로, 같은 장내 상피 denuding 포함 DSS 대장염과 같은 모델 큰 마커 배리어 무결성 비교적 작은 증가가 강조되는 바와 같이, 점막 치유를 평가하는 것이 더 적절할 수있다.

장내 주머니가 GI 보호막 기능의 생리 학적 관련성 모델을 제공하지만, 고려해야 할 동물 모델의 변동에 대한 일부 제한이있다. 예를 들어, 분비 된 상태 또는 상피 INTES 걸쳐 모두 paracellular 수송에 영향을 미칠 수있다가지 (20) 및 점막 겔 층 (5)의 무결성. 이러한 Ussing 챔버 준비 등의 전기 생리 측정을 통합 생체 분석은,이 차지하고 수 있지만, 장 낭하지 않습니다. 둘째, 이들 조직 (21)의 투과성에 영향을 미칠 수 있으므로, SAC 제제 내에 그러한 파이어 패치 등 림프 구조를 설명한다 장내 주머니 연구자 준비. 이러한 고려 사항에도 불구하고, 상피 완전성을 평가하는 데 많은 세포 배양 모델 달리 장 점액 낭은 겔 층 및 하부 고유 층 양쪽의 기여를 제공한다. 점액 겔층의 기여는, 특히, 덱사메타손 5,17와 같은 N- 아세틸 시스테인 또는 트레이서 소수성 분자로서 mucolytic 에이전트의 사용을 통해 평가 될 수있다. 이 승, 암 치료 또는 염증성 장 질환의 모델에서 장 투과성을 평가하는데 특히 중요 할 수있다여기 점막 장벽의 손실은 점막 염증 22, 23의 초기 병리 될 수 있습니다. 마찬가지로, 설사 질환, 기능성 위장관 질환이나 dysbiosis, 장 점액 생산 및 전체 점액 젤의 무결성 모델에서 지역 사이트 5,19,24에서 변경 될 수있다. 투과성 마커 이후의 혈청 샘플의 구강 투여는 생체 내에서 장 투과성을 평가하기위한 또 다른 방법입니다. 이 방법은 조직의 최소 조작을 하였지만, 그것은 장내 장벽 기능의 복합 계수이며 전체 장벽 지역 기여도를 평가하지 않는다. GI 질환의 다른 모델은 구강 투여 방법에 의해 설명 될 수 없습니다 상대적 중요성의 다른 사이트가있는 것 같다. 장내 주머니를 사용하므로 작은 동물 질환 모델에서의 지역 장 점막의 무결성을 검사하는데 사용될 수있는 신속한 감지 및 관련 생리 학적 검정이다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dekantel  Non-absorbable Silk suture Braintree Scientific SUT-S 116
Media 199 (TC199)  Life Technologies 11043-023 No phenol red as this interferes with fluorescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 21063-045 No phenol red as this interferes with fluorescence
N-acetylcysteine Sigma Aldrich Use at 10 mM in media
Small animal vascular cathether: Physiocath Data Sciences International 277-1-002
FITC-Dextran 4,400 MW Sigma Aldrich FD-4
FITC-Dextran 20,000 MW Sigma Aldrich FD-20
FITC-Dextran 70,000 MW Sigma Aldrich FD-70

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References

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<em>예 생체 내</em> 창자 주머 니나는 위장 질환 모델에서 점막 투과성을 평가하는
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Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).More

Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).

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