Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ex Vivo Bağırsak Sacs Gastrointestinal Hastalık Modelleri mukozal geçirgenliği Değerlendirmek için

doi: 10.3791/53250 Published: February 9, 2016

Abstract

epitelyal bariyer gastrointestinal sistemin ilk doğal savunma ve seçici küçük epitel boyunca moleküller ve neredeyse tamamen epitel makromoleküler taşıma yasaklayan taşınmasını kısıtlayan, altta yatan doku bölmelerine lümenin ulaşım düzenler. Bu seçicilik, lipofilik moleküller ve hem apikal reseptörleri ve epitelyumun dar kavşak protein kompleksleri taşıma sınırlar mukoza jel tabakası ile tespit edilir. Epitel in vitro hücre kültürü modelleri uygun olmakla birlikte, bir model olarak, bu eksikliği Mikrobiyota, mukoza-jel, epitel ve bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimlerin karmaşıklığı. Öte yandan, alana özgü hiçbir gösterge ile bağırsak emilim veya geçirgenlik in vivo değerlendirilmesi gerçekleştirilebilir, ancak bu deneyler, genel olarak mide-bağırsak absorpsiyonu ölçülür. Ex vivo geçirgenlik deneyleri "intestinal kesesi" kullanılarak; Bağırsak sitesi özgüllük avantajıyla genel bağırsak bütünlüğü veya belirli bir molekülün karşılaştırmalı taşınmasını ya ölçme hızlı ve hassas bir yöntemdir. Burada geçirgenlik çalışmaları için bağırsak keseleri hazırlanması ve belirgin geçirgenlik (P app) hesaplanmasını tarif intestinal bariyer boyunca bir molekülün. Bu teknik değerlendirme ilaç emiliminin bir yöntem olarak kullanılabilir, ya da gastrointestinal hastalıkların hayvan modellerinde bölge epitelyal bariyer yetmezliği incelemek.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mide-bağırsak sisteminin intestinal epitelyal bariyer Yetişkin bir insanda, 400 m2'de yaklaşık mukozal yüzey alanıdır. Sonuç olarak, sürekli mikrop, yutulan ilaç, besin ve bakteriyel toksinler karşı maruz kalmaktadır. ev sahibi sadece tolere ortakçı bakteri ve potansiyel patojenler arasında ayrım olmamalıdır, ama aynı zamanda besinlerin emilimini sağlarken, epitel bariyerini geçen bu türlerin ve salgılanan molekülleri engellemek gerekir. Bu nedenle, bağırsak epiteli rolü lümen içeriği 1 için seçici bir bariyer olarak hareket etmektir. Bu kurucu ve uyarılabilir mekanizma 2 oluşan bir yanıt biyolojik sistem yoluyla hareket mukozada doğuştan gelen epitel savunma sistemi tarafından, kısmen, elde edilir.

Epitelyal bariyer işlevinin kaybı gastrointestinal hastalıkların bir dizi özelliği olan bir patolojidir. In vivoepitelyal bariyer fonksiyonunun incelenmesi bir izleme molekülünün oral sonda ve sonraki serum analizi 3 ile değerlendirilebilir. Ancak, bu teknik bariyer disfonksiyonu siteye hiçbir gösterge sunar. In vitro ve Transwell sistemlerini 3 kullanılarak sırasıyla odaları 4,5 Ussing transepitelyal direnci ex vivo değerlendirmede, yaygın epitelyal bariyer fonksiyonunun taşıyıcı belirteç olarak kullanılan, ancak hayvan modellerinde 6 katkıda hastalık fizyolojisini yoksundur. Bu protokolde düzeylerde bir dizi mukozal bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek bağırsak bütünlüğü ve doğrudan ve lokalize değerlendirmesini sağlayan bir ex vivo doku hazırlama modeli açıklanmaktadır. Önemli olarak, bu teknik, hastalığın hayvan modellerinde de uygulanabilir, veya farmakolojik olarak mukozal bariyer işlev bozukluğu derinliği sorgusunda izin vermek için manipüle edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol tüm hayvan çalışmaları prosedürleri onaylı Newcastle Hayvan Etik Kurulu Üniversitesi'ne sıkı sıkıya bağlı kalmanın ile yapılır.

Araçların, Kültür Medya ve Yemekleri 1. Hazırlık

  1. 37 önceden sıcak Ortam 199 (TC199) veya Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) ortamı ° C. Ön oxygenate% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile köpüren ile orta. Orta 7.3 bir son pH değerine sahip olduğunu kontrol edin.
  2. Her kese için iki adet 5 cm bölümleri keserek dikiş hazırlayın. Döngü kapatılmamış bir düğüme dikişler.

2. Diseksiyon ve gastrointestinal sistemde hazırlanması

  1. Ötenazi önce katı gıda 12 saat çekin. İstenirse, bu süre içinde besin jel takviyeleri hayvanları yerleştirin.
  2. sodyum pentobarbiton aşırı dozda fareler öldürülür ([200 mg / kg], karın içinden enjeksiyon) kurumsal etik proto uygun olarak servikal dislokasyoncols karın ve göğüs üzerine% 70 etanol sprey ve.
  3. Bir makas kullanarak, karın ortasında yatay bir kesi yapmak ve periton maruz kalmaktadır.
  4. ayırmak ve pilor sfinkter de mideden üst ince bağırsak kesme ve anal eşiğinde kalın bağırsak keserek gastrointestinal sistem kaldırmak için devam edin. yavaşça mezenterin kaldırmak için bir forseps kullanın. Önceden ısıtılmış, oksijenli bir ortam içinde bağırsak yerleştirin.
  5. Bağırsak bölümünde tespit geçirgenlik (Şekil 1) için değerlendirilir ve bağırsak geri kalanından bilgilerini bu bölümü kesilecek.
    1. , Hayvanlar arasında tutarlılığı korumak mide duodenum ve jejunum göreli bölümleri ölçmek ve çekum kolon ve ileum göreli bölümleri ölçmek için.
    2. Doku bölümleri seçerken, örneğin Peyer yamaları olarak mukoza ile ilişkili lenfoid doku varlığı not edin. Bu küçük nod olarak tanımlanabilirlümenin serozal tarafında ules.
    3. 1 ml şırınga kullanarak, yavaşça önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) bir petri çanağı içine barsak segmenti luminal içeriği yıkayın. Bu dışkı içeriği atılan veya saklanabilir -80 istediğiniz gibi gelecek analizi için ° C.

Bağırsak Sacs 3. hazırlanması

  1. test bileşiği veya molekül bir 300 ul hacim ile 1 ml şırınga hazırlayın. mukoza bütünlüğü, FITC Dekstran M.Wt. bir 1 mg / ml solüsyon için 4.400 kullanılabilir. 4,400-70,000 Da büyüklüğü arasında değişen Probes artan hassasiyet için kullanılabilmektedir. Güvenli şırınga üzerine küçük bir hayvan damar kateteri uygun.
  2. barsak segmentinin açılması 5 cm ölçün ve segmenti kravat güvenli bu noktada bir dikiş-döngü ile kapattı. Yavaşça bağırsak açılışında etrafında önceden bağlı dikiş-döngü yerleştirin ve küntleşmiş kateter yerleştirin. bağırsak segmenti güvenli şekilde kapalı kement çekinve tüm çözüm enjekte edilir sağlamak, bağırsak içine şırınga 300 ul hacmi bırakın.
  3. Aynı anda bağırsak kesenin kapanmasını sağlamak için dikiş ilmeği çekerken yavaşça kateter kaldırın. bağırsak gevşek bağırsak kese kesin ve 37 ısıtılmış oksijenli ortam, 20 ml ile dolu bir 50 ml'lik konik bir tüp içine yerleştirmek ° C.

Geçirgenlik 4. Ölçümü

  1. ısıtılmış su banyosunda bağırsak keseleri içeren yer konik tüpler 37 ayarlanır ° C. 0, 30, 60, 90 ve 120 dk zaman noktalarında, her bir durumda taze ortam 100 ul hacim değiştirerek, 96 oyuklu bir plaka, konik tüp ve transfer 100 ul numune alın.
  2. son örnek alındıktan sonra, mukozal yüzeyi açığa sütür noktasında ve segmentin uzunluğu aşağı açık keselerini kesti.
  3. Her bağırsak parçasının uzunluğunu ve genişliğini ölçün. desi isekırmızı, çıtçıt -80 ° C'de kesimleri ve mağaza dondurmak Moleküler Yöntemler RNA stabilizasyonu çözelti içinde protein veya biyokimyasal analizler, ya da seçenek olarak, deposu için ° C.
  4. 1 ilâ 1 x 10 -6 kadar FITC etiketli moleküller için log dilüsyonlarda bir standart eğri oluşturmak.
  5. Bir floresan plaka okuyucu üzerinde FITC için numuneleri ölçün ve standartlar, FITC uyarma / emisyon: / 519 nm 495 nm.

Her Bireysel Bağırsak Sac için görünen geçirgenliği 5. Hesaplama

  1. sn zaman birimlerini dönüştürün.
  2. Her bir zaman noktası için, kümülatif konsantrasyon, S hesaplanması

    Q t = (C t * V r) + (Q t toplamı * V ler),
    Nerede:

    Q t = t zamanındaki kümülatif konsantrasyon
    C t = t zamanındaki Konsantrasyon
    Alıcı tarafında V r = Hacim
    Önceki tüm Q t Q t toplamı = Sum
    V s =Cilt örneklenmiş
  3. Arsa süresi (T) karşı Q ve eğimi hesaplamak: δQ / ¨t
  4. Belirgin geçirgenliği hesaplayın (P uygulaması)

    P app = (δQ / ¨ t) / (A * Co), Nerede:

    bir doku = Konum
    0 = Başlangıç ​​konsantrasyonu

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol, mide-bağırsak hastalığının hayvan modellerinde intestinal bariyer fonksiyonu bölgesel değişiklikler incelemek için kullanılabilir. Gastrointestinal sistemin 7 değişen alanlarında mukozal yüzeyi boyunca paraselüler prob akışı ölçülerek, epitelyal sıkı bütünlüğü değerlendirilebilir. Buna ek olarak, boyut (Şekil 2) ya da hidrofob (Şekil 3), epitelyal pertürbasyon derecesi ya da mukoza jel tabakasının bütünlüğünün paraselüler prob doğasını değiştirmek suretiyle de ölçülebilir. Daha büyük molekül ağırlıklı işaretleyiciler uygulayan bu transepitelyal elektrik direnci (TEER) halinde elektrofizyolojik ölçümlerle anlaşılacaktır olmayabilir gizli değişiklikleri tespit edilmesi, mukoza paraselüler geçirgenliğinin daha hassas bir sorgulama için sağlar, fakat paraselüler taşıma izin vermek için yeterli olacaktır (Şekil 2). Mucosal inflamasyon normalde örter ve epitel arayüzü koruyan koruyucu mukus jel bir goblet hücrelerinin kaybı ve azalmasına yol açabilir. Hidrofobik problar kullanılarak, bağırsak mukus jel tabakası bütünlüğü de (Şekil 3) incelenebilir. Buna ek olarak, bölgesel bariyer bütünlüğü farklı bağırsak alanlardan bağırsak keseleri özel hazırlık yoluyla incelenebilir. Bariyer fonksiyonu bölgesel değişiklikler, hastalığın farklı hayvan modellerinde içinde değişebilir ve sondaların oral gavaj ve daha sonra, serum tahlile göre, böylece, bağırsak keselerinin kullanımı, intestinal bariyer fonksiyonunun bir lokalize değerlendirmesi (Şekil 4) sağlar.

Şekil 1
Murin gastrointestinal Şekil 1. diyagramı. Bir C57BL / 6 faresinin mide bağırsak yolunun şematik bir mide tO anüs. ince bağırsak kavşaklar kolayca makroskopik ayırt edilemez ve tutarlı örnekleme fare varyasyon için fareyi aza indirmeye yardımcı olur. Bağırsak keseleri oluşturmak amacıyla, pilorik sfinkterin bir 5 cm kademeli bir uzak duodenum içerecektir. çekum proksimal uzanan 10 cm uzunluğunda ileum içerecek. Kalan ince bağırsak doku jejunum temsil eder. Rektum kolon 8 temsil çekum uzanan, kalan kalın bağırsak ile anüs 2 cm proksimalinde yer almaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2.   FITC Dextran'ın moleküllerin büyüklüğü bağımlı parasellüler taşıma kontrol ve DSS kolit anima epitel mukozasında rağmenLS. Bağırsak keseler 10 gün hastalığın seyri DSS farelerin kolon hazırlanmıştır. Keseler 120 dakika boyunca ölçülmüştür FITC Dekstran geçirgenliği marker 1 mg / FD-4 (MW 4,400 Da) ml çözelti, FD-20 (MW 20.000 Da) ya da FD-70 (70,000 Da) ve akı ile yüklendi. Sağlıklı hayvanlar uyumlu Yaş kontroller olarak kullanılmıştır. N = 5, N. başına 2 teknik çoğaltır ** p <0.01, Student t-testi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3 :. Hidrofobik bileşiklerin bariyer bütünlüğünü mukoza-jel tabakasının etkisi. Bağırsak keseler 10 gün hastalığın seyri DSS farelerin kolon hazırlanmıştır. Sağlıklı hayvanlar uyumlu Yaş kontroller olarak kullanılmıştır. Negatif mukus jel kontrolü için, bağırsaklar10 mM N-asetil sistein (NAC) (bağırsak 5 cm başına 300 ul hacim) ile yüklendi ve 37 ° C'de inkübe edildi 15 dakika boyunca C ° ve keseler hazırlandı önce taze ortam ile temizlendi. Keseler 120 dakika boyunca ölçülen 1 mg / ml FD-4 çözeltisi (MW 4.400 Da) ve akı ile yüklendi. N = 3, N. * p <0.05 başına 2 teknik çoğaltır, ** p <0.01, Student t-testi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. bağırsak iltihabı murin modellerinde FD-4 bağırsak bölge geçirgenliği. Bağırsak keseleri sağlıklı hayvanlarda DSS hayvan veya antibiyotik kaynaklı dysbiosis (AID) hayvan jejunum, ileum veya kolon hazırlanmıştır. Keseler 1 mg FD-4 / ml solüsyon ile yüklendi (MW 4.400 Da) ve flux 120 dakika boyunca ölçtü. N = 3, N. * p <0.05 başına 2 teknik çoğaltır, ** p <0.01, Student t-testi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada, mukozal bariyer fonksiyonunu ex vivo değerlendirmek için izolasyon ve bağırsak keselerinin hazırlanmasını ayrıntılı var. Bağırsak kese hazırlıkları öncelikle bağırsak boyunca aday ilaçların emilimini inceleyerek, ilaç araştırma faydalanılmıştır. Bununla birlikte, bu deney, eşit ölçüde iyi barsak hastalığı çalışma için uygundur. bölge ve geçirgenlik sahaya özgü değerlendirilmesi ile büyük ölçüde değişebilir bağırsak geçirgenliği sindirim hastalıklarında mukozal bütünlüğün bölgesel öneminin daha iyi anlaşılmasını sağlar. deney sağlam ve doğru fizyolojik koşullar altında, izole edilmiş dokular kadar 6 saat sonra mortem için geçerli kalır. ötenazi doku, hazırlama hızı önemlidir ve bağırsak içeriğinin temizlendi ve mümkün olduğu kadar hızlı bir şekilde oksijen ortamına transfer edilmelidir. hayvanlar arasındaki tutarlılığı sağlamak amacıyla, doğru bağırsak bölgeleri identifi olması esastırEd (Şekil 1). Duodenum ve jejunum segmentleri mideden ölçülür ise kolon ve ileal segmentler, çekum ölçülür tavsiye edilir. Farklı suşlar, modeller veya transgenik hayvanlar daha büyük ve daha uzun Gits olabilir, çünkü geçirgenlik deneyleri yapmadan önce sizin modelinde ortalama uzunluğu veya her bağırsak segmenti karakterize eden değerdir.

Bölgesel tutarlılık ek olarak, her bir bağırsak kesesi eşit uzunlukta kesilir ve SAC doğru miktarda sıvı ile dolu olduğundan emin olmak için önemlidir. Bu faktörler Tutarsızlık tahliller arasında mukozanın eşitsiz şişkinlik neden olur. Altı şişliği bağırsak segmentinin sadece mukoza yüzeyine lümen içeriğinin maruz kalma azaltır, aynı zamanda işaretleyici seyahat gerekir hangi aracılığıyla doku kalınlığını arttırır. Aşırı şişkinlik dokusunda stres yanıtları dokuya zarar veya aktive edebilir segmenti, potansiyel işbirliğinfounding sonuçlanır. P uygulamasının hesaplama villöz yapının yüzey alanı hesaba katmaz için bu, dikkat edilmelidir. Bu dokunun fiili görünen geçirgenliği hesaplanırken hata yol açarken yüzey alanı sabit olarak hesaplanmaktadır, bu modeller arasında karşılaştırma sonuçlarını etkilemez. Hastalığa bağlı yüzey alanının herhangi bir değişiklik epitel bütünlüğü kaybı telafi edilir ve protokol hastalığın ilerlemesi 6 geçirgenlik değişiklikleri belirlemek için yeterince sağlamdır.

doku kültür ortamının kullanılması tavsiye edilir. Barthe ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalarda. TC199 kullanımı basit tuz tamponları 9 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde epitel canlılığı ve doku histolojik mimarisi, uzun ömürlü artırdığı tespit edilmiştir. Çalışmalarımızda DMEM ve TC199 hem orta 37 ° C'de muhafaza ° C doku yaşam 5,6,10 için en uygun şartları sağladı. doğru medyatahlil sırasında sıcaklık muhafaza gerekli sıkı kavşak bütünlüğü ve transselüler yollar aracılığıyla aktif taşıma ile ilgili deneyleri optimal doku metabolizmasını sağlar iken, doku bütünlüğünün sürdürülmesi için gerekli besinleri epitel besler. 37 altındaki sıcaklıklarda Doku canlılığı ° C neden kaybı, parasellüler taşıma artırılması ve transselüler taşıma 11 azalan. Bu durumda, en iyi şartlarda doku canlılığını uzatan esastır ve bu sayede, deney bölge, bariyer bütünlüğünü ve incelemek için sadece kullanılabilir, aynı zamanda bir müdahalesi ve fizyolojik ve transkripsiyonel yanıtlar incelemek.

Esas olarak, ilaç absorpsiyon çalışmaları için kullanılır iken, teknik epitelyal bariyer boyunca bir belirteç molekülünün belirgin geçirgenlik (Papp) incelemek için, bağırsak bütünlüğünün 12-15 çok hassas bir ölçümüdür. Buna karşılık vekil ex vivo ÖlçülmesiBöyle TEER olarak bariyer fonksiyonunun NTS, P uygulaması bağırsak bariyer 4 doğrudan ve son derece hassas ölçüsüdür. Bu işaretleyici moleküllerinin P uygulaması tarafından ölçülen TEER ölçümleri ve geçirgenlik her zaman korele olmadığını fazlalaştı. TEER ölçümleri sıkı kavşaklar ve transselüler paralel dirençlerin 16, hem direncini kapsamaktadır. Bu nedenle TEER sıkı kavşaklar ve hücrelerin kendileri tarafından sunulan birleşik direniş bir ölçüsüdür. hücre-hücre dernekler zayıf ise o zaman bir tek tabaka genel direnci bu katkı düşük olacak (yani, sıkı kavşaklar sızdıran vardır). Böylece sızdıran epiteli için sıkı kavşak dirençler küçük değişiklikler bir bütün olarak epiteli dirençleri ihmal edilebilir değişiklikler olur. Bunun aksine, p APP analizi gerçekten de mukoza engelini 17 çapraz ve bir molekülün yeteneğini al olabilir Papp ölçümlerinin hassasiyetini ölçenFarklı büyüklükteki işaretleyici molekülleri (Şekil 1) seçerek yoluyla Gürler. markör boyutu doğrultusunda incelenen barsak hastalığı modeli ile ilgili olarak önemlidir. Bütünlüğünün kaybı hafif ve orta şiddette olduğu alerji veya fonksiyonel hastalık 18,19, modelleri bağırsak bariyer fonksiyonunun ince değişiklikler tanımlanmasına olanak sağlayacak düşük molekül ağırlıklı belirteçler, daha uygun olabilir. Bunun aksine, bağırsak epiteli soyma içerir DSS kolit gibi modeller ile, daha büyük bir belirteçler bariyer fonksiyonunun nispeten küçük artışlar vurgulanır gibi, mukozal iyileşme değerlendirmek için daha uygun olabilir.

Bağırsak keseler GI bariyer fonksiyonunun fizyolojik ilgili bir model sunarken, göz önünde bulundurulması gereken hayvan modellerinin değişkenliği ile ilgili bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, salgı devlet veya epitel mide- genelinde hem parasellüler taşıma etkileyebilirtine 20 ve mukoza jel tabakası 5 bütünlüğü. Böyle Ussing odası hazırlıkları olarak elektrofizyolojik ölçümler, birleşmeyle ex-vivo deneyler, bu hesap da, bağırsak keseler yok. İkinci olarak, bu dokuda 21 geçirgenliğini etkileyebilir olarak, kese hazırlıkları kapsamında, bu tür Peyer yamalar gibi lenfoid yapılar için hesap gerektiğini bağırsak keseler araştırmacılar hazırlanmasında. Bu düşüncelere rağmen epitel devamlılığını değerlendirmek için kullanılan bir çok hücre kültürü modelleri, farklı olarak, bağırsak keseler bir mukoza jel tabakası ve bir alt lamina propria hem de katkı sunmaktadır. Mukoza jel tabakası katkısı, özellikle, örneğin deksametazon 5,17 gibi N-asetil sistein, veya hidrofobik izleyici moleküller olarak mukolitik maddeler, kullanımı ile değerlendirilebilir. Bu ağ, kanser tedavisi veya enflamatuar bağırsak hastalığı modellerinde barsak geçirgenliğinin değerlendirilmesinde özellikle önemli olabilirBurada mukoza bariyer kaybı mukozal inflamasyon 22,23 erken patoloji olabilir. Benzer bir şekilde, ishal, fonksiyonel gastrointestinal hastalık veya dysbiosis bağırsak mukus üretimi ve genel olarak mukoza jel bütünlüğü modellerinde bölge sitelerinin 5,19,24 de değiştirilebilir. Geçirgenlik belirteçleri ve sonraki serum örnekleme ağızdan sonda in vivo bağırsak geçirgenliğinin değerlendirilmesi için başka bir seçenektir. Bu yöntem dokusu minimal manipülasyon sahipken, bağırsak bariyer fonksiyonunun kompozit ölçüsüdür ve genel bariyer bölgesel katkıları değerlendirmek değildir. GI hastalığın farklı modelleri ağızdan sonda yaklaşımlarla sorumluydu olmayacak nispi öneminin farklı siteleri olması muhtemeldir. Bağırsak kese kullanımı dolayısıyla hastalığın küçük bir hayvan modellerinde, bölgesel bağırsak mukoza bütünlüğünün incelenmesi için de kullanılabilir, bir hızlı, hassas ve fizyolojik açıdan ilgili bir deneydir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dekantel  Non-absorbable Silk suture Braintree Scientific SUT-S 116
Media 199 (TC199)  Life Technologies 11043-023 No phenol red as this interferes with fluorescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 21063-045 No phenol red as this interferes with fluorescence
N-acetylcysteine Sigma Aldrich Use at 10 mM in media
Small animal vascular cathether: Physiocath Data Sciences International 277-1-002
FITC-Dextran 4,400 MW Sigma Aldrich FD-4
FITC-Dextran 20,000 MW Sigma Aldrich FD-20
FITC-Dextran 70,000 MW Sigma Aldrich FD-70

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272 (2013).
  2. Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine. Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).
  3. Robinson, A., et al. Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition. Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).
  4. Feighery, L., et al. Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury. The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).
  5. Keely, S., et al. Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).
  6. Keely, S., et al. Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis. Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).
  7. Sourisseau, T., et al. Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA. Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).
  8. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).
  9. Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).
  10. Marks, E., et al. Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis. Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).
  11. Keely, S., et al. Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia. Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).
  12. Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers. Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).
  13. Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers. Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).
  14. Keely, S., et al. In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers. Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).
  15. Maher, S., et al. Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).
  16. Balda, M. S., et al. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein. The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).
  17. Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells. Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).
  18. Stefka, A. T., et al. Commensal bacteria protect against food allergen sensitization. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).
  19. Keely, S., et al. Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome. Gut microbes. 3, 250-260 (2012).
  20. Barrett, K. E., Keely, S. J. Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects. Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).
  21. Soni, J., et al. Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).
  22. Justino, P. F., et al. Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice. Cancer chemotherapy and pharmacology. (2015).
  23. Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice. Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).
  24. Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota. Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).
<em>Ex Vivo</em> Bağırsak Sacs Gastrointestinal Hastalık Modelleri mukozal geçirgenliği Değerlendirmek için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).More

Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. J. Vis. Exp. (108), e53250, doi:10.3791/53250 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter