Abstract
Vi har utviklet en protokoll for å forbedre strøm embryoid Body (EB) kulturen som tillater studiet av selv-organisering, symmetri bryte, aksial forlengelse og celle skjebne spesifisering ved bruk av aggregater av mus embryonale stamceller (mESCs) i suspensjonskultur. Små mengder mESCs aggregeres i basal medium i 48 timer i ikke-vev-kultur-behandlet, U-bunnet 96-brønners plater, hvoretter de er i stand til å svare på eksperimentelle signaler. Etter behandling, disse aggregatene begynner å vise tegn til polarisert genekspresjon og gradvis endre sin morfologi fra en sfærisk masse av celler til en langstrakt, velorganisert struktur i fravær av eksterne signaler asymmetri. Disse strukturene er ikke bare i stand til å vise markører for de tre bakterie lag, men aktivt viser gastrulation-lignende bevegelser, dokumentert av en retnings forskyvning av individuelle celler fra aggregatet, som i avgjørende grad skjer på en region av den langstrakte struktur. Dette protocol gir en detaljert metode for reproduserbar dannelsen av disse aggregatene, deres stimulering med signaler som Wnt / β-catenin aktivering og BMP hemming og deres analyse av enkelt tid-punkt eller time-lapse fluorescerende mikroskopi. I tillegg beskriver vi endringer til dagens hel-mount museembryo fargings prosedyrer for immunocytokjemisk analyse av spesifikke markører innenfor faste aggregater. Endringene i morfologi, genekspresjon og lengden av aggregatene kan kvantitativt målt, og gir informasjon om hvordan signaler kan endre aksiale skjebner. Det er tenkt at dette systemet kan brukes både til studiet av tidlige utviklings hendelser som aksial utvikling og organisering, og i videre forstand, prosesser av selvorganisering og celle beslutninger. Det kan også tilveiebringe en passende nisje for generering av celletyper som er tilstede i embryo som er uoppnåelig fra konvensjonell adherent kultur som ryggmarg og motoriske neuroner.
Introduction
Studien og forståelse av celle-skjebne beslutninger tidlig pattedyr utvikling kan gjøre bruk av kulturer av embryonale stamceller (ESCs), klonale populasjoner avledet fra blastocysts som har muligheten til å selv fornye og differensiere til alle celletyper i en organisme ie., de er pluripotent 1,2. Selv om disse kulturene har vært og fortsetter å være nyttig for forståelsen av den molekylære basis for celle-fate beslutninger, er de ikke i stand til å gjengi noen av de romlige arrangementer og globale oppførsel som genereres i embryoer under gastrulation. I embryo, prosessen med gastrulation forvandler et enkelt epitellaget inn i de tre forskjellige bakterie lag og begaver embryoet med en åpen anteroposteriore organisasjon 3-5. Forsøk på å rekapitulere disse hendelsene ex vivo har vært basert på generering av tredimensjonale aggregater av ESCs, referert til som embryoide legemer (EBS), og underkaste dem to differensiering forhold 6,7. Disse aggregater kan lokket til å differensiere til mange forskjellige celletyper, hvorav noen er enten ute av stand til å bli oppnådd eller indusert med lav effektivitet i heft kultur eller kan ikke produseres i det hele tatt, f.eks. Blod, 8 og 9 ur kjønnsceller. En begrensning i bruken av EBS er imidlertid at de ikke er i stand til å vise den morfogenetiske oppførsel, bakterie lag fordeling eller aksial organisasjon som er viktige egenskaper for utvikling av embryo, noe som resulterer i romlig uorden 6,10. I en rapport, behandling av EBS med Wnt fører til en svak polarisering i genuttrykk i noen aggregater, men ingen klar morphogenesis er observert syv. I nyere rapporter, EBS som er blitt dyrket i lengre tid utvikle fremre strukturer som netthinne, cortex og indre øret sensoriske celler, noe som etterligner deres embryoniske motparter, men utvikles uten sammenheng med en aksial organization 11-13.
En rapport fra Marikawa 14 et al., Mens de arbeider med aggregater av mus P19 Embryo karsinom (EC) celler dannet av hengende dråpe-metoden, rapporterte fremveksten av langstrakte strukturer av mesodermal opprinnelse minner om forlengelsene som blir observert med exogastrulae i amfibier og kråkebolle embryoer og Keller eksplantater 15-18. Ettersom dette ikke hadde blitt observert med mus embryonale stamceller (mESCs), forsøkte vi å gjenskape problemet observert med P19 EC celler ved hjelp av aggregater av mESCs 19 og vi rapporterer kultur forhold som fører til deres symmetri bryte og aksial forlengelse. En viktig forskjell fra arbeidet med P19 celler er at samlings protokoll som er beskrevet her blir utført i en 96-brønns plate, lik den som er beskrevet av Eiraku et al. 20, i stedet for å henge dråper. Denne endringen førte til økt effektivitet i form av samlede utvinning og i beggeintra- og inter-eksperimentell reproduserbarhet. Viktigere, opprettholde aggregater i enkelte brønner sikrer at fusjon mellom aggregater (vanlig når sammenslåing aggregater fra hengende dråper) forekommer ikke. I tillegg har en viktig funksjon i protokollen er 24 timers eksponering for GSK3p inhibitor CHI99021 (Chi), en potent aktivator av Wnt / β-catenin signale, etter aggregering.
Metoden er beskrevet her gir et grunnlag for å forstå prosessene i selvorganisering, aksial organisasjon og bakterie lag spesifikasjon i kultur, slik at slutninger gjøres om aksial utvikling in vivo 19,21. Av disse grunner metoden har potensial til å tillate detaljert mekanistisk analyse av prosesser som kan være vanskelige å studere i embryo. Videre er en potensiell anvendelse i produksjon av vev og organer som ikke er lett tilgjengelige i vedheftende kulturen på grunn av mangelen på en strukturert cellulær nisje såsomryggmarg forløpere 21 og motoriske nevroner. Tredimensjonal aggregat kulturen har en fysisk struktur og signal miljø som er ikke oppnås ved konvensjonelle metoder, som fører til en ny tilnærming for avledning av embryonale linjene i et romlig organisert måte.
Protocol
1. Kultur betingelser Før Aggregation
- Oppretthold mESCs i ESLIF medium (se tabell over spesifikke Materialer og utstyr for formulering) på gelatinbelagte 25 cm 2 vev-kultur-behandlet kolber i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 21-25.
- Grow celler i minst to passeringer poste tining før bruk i denne protokollen; celler ved lavere passasjer er generelt mer vellykket på å generere reproduserbare egenskaper gjennom eksperimentelle replikater (ie., ikke mer enn 15 passeringer i kultur), men liten variasjon mellom ulike ES cellelinjer er å være forventet (se tabell 2 for cellelinjene som ble testet ).
- Grow celler til 40-60% konfluens. Ikke bruk over-konfluent celler for aggregering.
2. generasjon av Aggregater
- Pre-varm PBS (+ Ca 2+, + Mg 2+), ESLIF, N2B27 26,27
- Aspirer kulturmedium fra vevskulturkolbe (trinn 1.3). Skyll kolben forsiktig med 5 ml PBS, to ganger. Aspirer PBS og tilsett 1 til 2 ml forvarmet Trypsin-EDTA (0,25%) for å distansere cellene.
- Plassere kolben i inkubatoren i <5 min eller inntil cellene er fullstendig løsrevet fra overflaten av kolben. Pipetter opp og ned med en 1 ml pipette for å generere enkeltcellesuspensjon for nøyaktig telling og ensartet størrelse aggregatdannelse.
- Nøytralisere Trypsin med 5-10 ml ESLIF; vaske ned vekstoverflate for å maksimere utvinningen celle og overfør til et 50 ml sentrifugerør. Fjerne en 1 ml alikvot fra sentrifugerøret og telle cellene med et hemocytometer.
- Bestemme volumet av suspensjonen som kreves for å gi 10 celler / mikroliter (en hel 96-brønns plate krever 5x10 fire celler i en 5 ml suspensjon). Telle celler nøyaktig, så stor deviationer fra det angitte cellen nummeret kan påvirke responsen på aggregatene til stimuli.
- Legg 5x10 4 celler til 5 ml forvarmet PBS i en frisk 50 ml sentrifugerør og sentrifugering ved 170 xg i ~ 5 min.
- Nøye aspirer PBS og tilsett 5 ml forvarmet PBS forsiktig; ikke forstyrrer pellet på bunnen av røret. Sentrifuger ved ~ 170 xg i 5 minutter.
- Nøye aspirere PBS for andre gang. Fjern så mye PBS som mulig uten å forstyrre pelleten som PBS carry kan påvirke aggregering. Resuspender pelleten først i 1 ml varm N2B27 med en P1000 pipette for å generere en homogen cellesuspensjon, etterfulgt av ytterligere tilsetning av N2B27 til ønsket volum (f.eks, tilsett 4 ml av en 4 5x10 celler / 5 ml suspensjon).
- Overfør cellesuspensjonen til et sterilt reservoar pipetter, og en 40 ul dråpe inn i bunnen av hver brønn av en ikke-vev-kultur behandlet, 'U'-bunnet 96-well plate ved hjelp av en flerkanals pipette. Dekk til 96-brønns plate med det tilsvarende lokket og bekrefte tilstedeværelse av celler med en invertert benk-topp mikroskop (figur 1B).
Merk: Det er viktig at disse platene brukes til å begrense muligheten for cellene fester seg. Ikke belegge bunnen av 96-brønns plate med gelatin, fibronektin eller andre belegg som fremmer celle adhesjon. - Cellene inkuberes i 48 timer i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i aggregering.
3. Bruk av Stimuli og Endre Medium
- Etter 48 timers inkubasjonstid, observere opptreden av mESCs i hver brønn av 96-brønners plate for å bekrefte vellykket aggregering (figur 1E). Merk: Aggregater vises sfærisk i naturen og 150-200 um i diameter. Se i feilsøkingsdelen dersom det oppstår problemer (tabell 1).
- 0; Tilsett 150 ul friskt medium sekundær (3 pM Chi99021 (Chi) i N2B27 19, lager fremstilt ved 10 mM i DMSO) til hver brønn ved anvendelse av en multikanal pipette. Pipetter med nok kraft til å løsne eventuelle aggregater som kan ha begynt å følge bunnen av brønnene. Inkuber aggregater i sekundærmedium i 24 timer i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 (figur 1A).
Merk: reproduserbar langstrakte og polariserte aggregater er generert ved hjelp av denne sekundærmedium. Andre sekundære mellom blandinger kan også anvendes, avhengig av de eksperimentelle betingelser som kreves, og eksempler er vist i Figur 3. - For etterfølgende mellom endringer, bruk av en multikanal pipette holdes i en vinkel (ca. 30 °) til 150 pl av sekundærmediet fjern forsiktig fra siden av hver brønn. Deretter, for å pipettes 150 ul friskt N2B27 i hver brønn med nok kraft løsne eventuelle aggregater som kan ha started å følge bunnen av brønnene.
- Gjenta punkt 3. 3 hver 24 timer til tidsforløpet er ferdig (typisk lengde av et aggregat forsøket er 120 timer).
MERK: Pass på aggregater er fritt bevegelige følgende mellom endringer for å sikre reproduserbarhet og konsistens i og mellom hver 96-brønns plate. Mediet må byttes daglig etter aggregeringen perioden.
4. Utarbeidelse av Aggregater for Farging og analyse av konfokalmikroskopi
- Fiksering og primær antistoff Inkubasjon
Merk: Protokollen beskrevet av AK Hadjantonakis 28 er blitt endret for å passe farging av Mesc aggregater. For de typiske antistoffer som brukes i våre studier og deres fortynninger, se tidligere publisert arbeid 19,21,24,25,29 og tabell 3.- Bruke en multikanal pipette holdes i en vinkel (ca. 30 °) for å forsiktig 150 ul medium fjernes fra siden of hver brønn av 96-brønns plate. Vask to ganger ved å pipettere 150 ul PBS til hver brønn. Legg igjen et par minutter mellom hver vask slik at aggregatene å bosette seg.
- Sett en P1000 pipette å dispensere 200 ul, feste den tilsvarende pipettespissen og kuttet av ca 3 mm fra enden av spissen med et par av steril saks. Trekke en del av PBS i hver brønn av 96-brønns plate en kort vei inn i tuppen og utvise det å agitere aggregatet.
- Bruk samme tipset å trekke opp hele volumet i brønnen inkludert tilslaget og pipette inn i en liten (30 mm diameter) glass Drosophila disseksjon godt. Overføre alle aggregatene fra den 96-brønns plate som gjennomgår identiske immunofarging regimer i det samme glasset disseksjon godt.
Merk: Bruk en ny cut pipettetupp ved overføring tilslag fra ulike forsøksbetingelser for å hindre overføring av aggregater. - Plasser glasset godt som inneholder aggregates mot en disseksjon mikroskop. Virvle glass godt for å tvinge aggregatene til sentrum og aspireres PBS fra en side av brønnen med et glass Pasteur pipette. Bruk mikroskop for å sikre aggregatene er ikke aspirert. La et lite volum av PBS i glasset godt til å dekke aggregatene for å hindre dem fra å tørke ut.
- Tilsett 1 ml nyfremstilt formaldehyd (4%) oppløst i PBS og inkuberes i 2 timer ved 4 ° C på en orbital-rystemaskin satt til en lav hastighet. Forsiktig: Paraformaldehyde er kjent for å være allergifremkallende, kreftfremkallende og giftige. Bruk egnet verneutstyr ved håndtering.
- Etter fiksering, suge formaldehyd-oppløsning på samme måte som beskrevet i avsnitt 4. 1. 4 og vask aggregatene med 1 ml PBS tre ganger, 10 minutter for hver vask, på en orbital-rystemaskin satt til en lav hastighet.
- Aspirer PBS som beskrevet i kapittel 4. 1. 4 og utføre ytterligere tre, 10 min vasker med PBS som inneholder 10% Føtal Bovine Serum og 0,2% Triton X-100 (PBSFT). Utføre vaskinger 10 min på en orbital shaker satt til en lav hastighet.
Merk: Bruk av føtalt bovint serum (FBS) resulterer i en klar vaskebuffer, redusere antall aggregater som ellers ville gått tapt i løpet av protokollen hvis melk ble benyttet. Det er viktig å merke seg at etter fiksering, kan immunhistokjemiske prosedyrer utføres i andre enn de som er beskrevet nedenfor ulike måter, og bør bestemmes og optimaliseres av undersøkeren. - Blokkere aggregatene i 1 time ved 4 ° C i PBSFT på en orbital vippe satt til en lav hastighet. Protokollen kan bli stanset på dette punktet, og aggregater blokkert O / N, med konstant omrøring på en horisontal gyratory rocker ved 4 ° C.
- Aspirer PBSFT som tidligere beskrevet (se seksjon 4. 1. 4) og inkuber aggregatene med 500 ul av den nødvendige primære antistoff fortynnet i PBSFT O / N ved 4 ° C på en orbital-rystemaskin innstilt på lav hastighet. Dekk med parafin film for å hindre fordampning.
- Sekundær Antistoff Inkubasjon
- Aspirer primær antistoffløsning og vask med 1 ml PBSFT (ved 4 ° C) på følgende måte: to ganger i 5 min; tre ganger i 15 min; og fire til syv ganger for 1 time. Utfør hvert vasketrinn ved 4 ° C og på en orbital rocker satt til lav hastighet. Merk: Chill vaske medium før bruk. Ikke utfør de vasker på is da dette kan føre til aggregatene til fragment.
- Aspirer endelige vaskemedium og inkuber aggregatene med den nødvendige sekundære antistoff i 500 ul PBSFT O / N ved 4 ° C i mørke på en horisontal roterende rocker. Legg nukleær flekk eksempel Hoechst hvis nødvendig.
- Montering og Imaging av Confocal Microcopy
- Vask aggregatene som nevnt i § 4. 1. 4 med 4 ° C PBSFT. Etter den siste vask, skylle aggregatene med 1 ml PBS inneholdende 0,2% FBS og Triton X-100 (PBT) på følgende måte: to ganger i 5 min; tre ganger i 15 min. Utfør vaskerved romtemperatur på en orbital rocker beskyttet mot lys.
- Aspirer medium som tidligere beskrevet (avsnitt 4. 1. 4) og inkuberes i 30 min i mørket med en 1: 1 oppløsning av glycerol: PBT (1 ml) etterfulgt av en andre 30 min inkubering med en 7: 3 oppløsning av glycerol: PBT (1 ml).
Merk: Bland glyserol og PBT løsninger ved 4 ° C ved hjelp av en rotator. - Aspirer endelige glyserol: PBT løsning og erstatte med 1 ml monterings medium 24. Protokollen kan bli stanset på dette punktet før montering (hvis pause, forsegle brønner med parafin film og lagre flekker brønnene ved 4 ° C).
- Monter aggregatene på objektglass ved å pipettere dem i 17 mL dråper med et kutt P20 tips (figur 2). Fold dobbeltsidige tapen tilbake på seg selv fire ganger for å generere avstandsstykker og feste til hver ende av objektglasset. Plasser toppen dekk (22 mm x 60 mm) på disse avstandsstykkene (figur 2).
Merk: det er viktig at et kutt tips erbrukt på dette stadiet ikke å skade prøvene. Avstandsstykkene hindre dekk knuse aggregater. - Når aggregatene er montert, bilde prøvene ved hjelp konfokalmikroskopi hjelp protokoller tidligere beskrevet 19,21,24,25. Når plassert på mikroskopet, forlater glide uforstyrret på scenen i noen minutter, slik at aggregatene til å slå seg ned inne i monteringsmedium.
Representative Results
Utseende Celler Umiddelbart etter plating og etter Aggregation
Umiddelbart etter plettering, kan man observere tilstedeværelsen av enkle celler i hver brønn av 96-brønns plate med en standard invertert vev-kultur mikroskop (figur 1B). I løpet av 8 timer fra plating, vil disse cellene har begynt å stige ned til bunnen av brønnen på grunn av gravitasjon, og vil ha begynt å smelte sammen i adskilte grupper (figur 1C). Etter 24 timer blir de koaleserende cellene har fullført den primære aggregering, og vil ha komprimeres til veldefinerte, men ujevne aggregater hvor de enkelte cellene er utydelig fra hverandre (figur 1D). Ved slutten av den andre dagen (48 t), bør aggregatene se "ren", etter å ha tatt opp alle cellene i brønnen (figur 1E); bunnen av brønnen kan ha noen celler som har blitt trafokiosk fra aggregatet på dette stadiet. Girat aggregatene er aggregert i N2B27, på dette tidspunktet-punktet, bør de være sfæriske, 150-200 pm i diameter, og fritt bevege seg inne i brønnen (ie., ikke er festet til bunnen av brønnene). Aggregering i andre medier (ie., ESLIF eller N2B27 med spesifikke faktorer) har potensial til å endre både den opprinnelige samlet morfologi og responsen til påfølgende stimuli (Turner et al., Under forberedelse).
Representant morfologiske endringer
Tilsetting av en 24-timers puls av sekundærmedium som inneholder Chi mellom 48 og 72 timer (figur 1A, 5A) genererer veldefinert langstrakte aggregater som viser polarisert uttrykk i spesifikke markører for kjønns lag 19,21. Umiddelbart etter Chi puls (72 timer), vil aggregatene begynne å felle celler og begynner å vise deres respons på disse signalene mot slutten av denne dagen (figur 3A). Disse svareneblir manifestert ved endringer i genekspresjon og morfologi, som begge er avhengig av den behandling som aggregatene har mottatt etter den første 48-timers periode aggregering i N2B27 (figur 3B). Dersom det kreves bare en sluttpunktanalyse, er den optimale tid for å bilde aggregatene ved omtrent 96 til 120 timer. På dette punktet aggregatene vil ha utviklet klare morfologi og genutrykksmønster (figur 3A), og deres størrelse og masse fremdeles er lave nok til at utstøting av medium fra P200 pipette er tilstrekkelig til å fjerne en hvilken som helst som kan ha festet. Unnlatelse av å hindre feste av aggregatet til brønnen vil påvirke aggregatdannelse (figur 5Biv). Den morfologi og genuttrykksmønstrene av aggregatene kan endres, avhengig av behandlingen. Representative resultater for vedvarende eller pulserte regimer med enten enkel behandling eller kombinasjoner av faktorer er vist for BMP4, Dorsomorphin H1 (BMP-reseptoren hemmer), ActivinA, SB43 (aktivin / Nodal hemmer), bFGF eller PD03 (MEK hemmer) (figur 3B).
Aggregate Imaging og kvantitativ bildeanalyse
Aggregater er mottagelig for avbildning av enten Widefield mikroskopi (hovedsakelig for time-lapse avbildning 19), eller faste og immunostained for confocal bildebehandling 19,21 (figur 2). Den nåværende protokoll og bildebeskrivelse over tillater kvantitativ informasjon å hente fra disse aggregater. Etter confocal eller bred-feltet bildeopptak, lengden og tilsvarende genuttrykk langs diameter eller ryggraden av summen (sfærisk eller avlang henholdsvis figur 4A, B) kan måles. Disse analysene er også direkte relevant for time-lapse bilder, hvor man kan få informasjon om veksttakten, størrelse og forlengelse av aggregatene under forskjellige forhold (figur 4
Figur 1. Typisk tidsforløpet og tidlig morfologi. (A) Typisk tidsforløpet for aggregering eksperimenter. Cellene blir samlet i 48 timer i N2B27 inneholdende en suspensjon av mus ES-celler (10 celler / mL) i en 96-brønns plate (P1, P2). (B) Umiddelbart etter plating (t = ~ 5 minutter), kan individuelle celler bli sett i suspensjonen, og har begynt å danne klumper etter 8 timer (C). (D) Etter 24 timer ble cellene har dannet et enkelt aggregat i hver brønn som er omtrent 100 mikrometer i diameter. (E) Etter 48 timer aggregasjon, aggregert diameter varierer 150-200 mikrometer. På dette punkt er det aggregering medium (N2B27) fjernet, og et sekundært medium tilsettes enten for resten av eksperimentet (p1 i del A), eller i 24 timer før den ble endret back til N2B27 (p2 i del A). Scale bar representerer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Monterings aggregater bort på objektglass. Etter at aggregatene har blitt løst, immunostained og plassert i monteringsmedium, blir hvert aggregat pipettert på et objektglass som en 17 ul dråpe (A, B, B '). Nok plass er igjen mellom de samlede dråper for å hindre deres sammenslåing. Avstandsstykker er laget med dobbeltsidig tape og plassert ved hvert hjørne av objektglass (A, A ', B). Det er på disse som et glass dekkglass er plassert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Effekt av forskjellige behandlinger på morfologi av aggregerte ES-celler. Etter 2 dager i N2B27, ES-celler har dannet aggregater. Tilsetning av spesifikke faktorer enten som en 1 dagen puls (A) eller kontinuerlig (B) kan endre fenotypen av aggregatene med hensyn til polariteten av genekspresjon, forlengelse potensial, eller deres generelle form. Eksemplene i denne figur er aggregater dannet fra enten BH :: GFP 30 (A) eller Sox1 :: GFP 27 (B) mus ES-celler er fotografert etter 120 timer og behandles som angitt. Chi: tsjir 99021 31; SB43: SB 431 542 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03. PD0325901 Klikk her for å se en større versjon av ther figur.
Figur 4. Kvantitativ analyse av aggregater. En typisk tilslag dannet fra BH :: GFP mESCs 25,30 etter en 24 timers puls av Chi og avbildes på 120 timer. Flettede bildet av den lyse-feltet og GFP kanal er vist med segmenterte linje som markerer "ryggrad" av aggregatet fra punkt A til B (A), langs hvilken fluorescens og lengden av aggregatet kan måles (B). Lengden (C) og "rundhet" (D) fra 24 aggregater innen samme eksperimentet er vist. Formbeskrivelser som rundhet (D), sirkularitet, perimeter og område kan måles ved hjelp av bildeanalyse kokeboken plugin fra bildeanalyse programvare FIJI 35. Bety angitt med horisontale linje ved hver tids-punkt;feilfelt indikerer standardavvik; skala bar i (A) indikerer 200 mikrometer. Som det er små forskjeller mellom rapportørcellelinjer, er det forventet at etter at en puls av Chi, vil den gjennomsnittlige maksimale lengde og gjennomsnittlig minimum rundhet på aggregatene varierer. Mellom ulike cellelinjer, finner vi at den gjennomsnittlige maksimale lengden kan være innen rekkevidde på ~ 400-800 mikrometer og gjennomsnittlig minimum rundhet mellom 0,4 og 0,6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Eksempler på feil i aggregatdannelse. Evnen til å danne reproduserbare aggregater (A) avhenger av kritiske faktorer som (Bi) friskt og godt blandet sekundært medium, (Bii, BIII) nøyaktigheten i å telle utgangs number av celler og (BIV) som sikrer at aggregatene ikke danner klebrige kolonier ie., "crash" inn i overflaten av brønnen. Typiske eksempler på feil i aggregatdannelse for hver av de nevnte betingelser (B) er vist. Scale-bar som angitt; se feilsøkingstabellen for detaljer (tabell 1). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1. Guide til feilsøking. Typiske feil knyttet til aggregering protokollen er gitt med forslag til deres oppløsning.
Tabell 2. Tabell over cellelinjer testet for dannelse av AGGRegates. Et antall cellelinjer 19,22,27,30,36-40 er blitt karakterisert for dannelse av aggregater og, selv om små forskjeller mellom cellelinjer er forventet, og er blitt observert, er alle de ovennevnte linjer viser lignende dynamikk i form av tøyelighet og morfologi. I form av genekspresjon, er uttrykket mønster som er spesifikk for genet uttrykkes, men innen hver cellelinje, er generelt i samsvar over et antall passasjer uttrykket mønster. For konsistens, genererer vi aggregater fra celler som ikke har overskredet 15 passasjer i kultur.
Tabell 3. Liste over representative antistoffer som brukes i disse studiene. Et utvalg av antistoffer og fortynningsfaktorer brukes for samlet farging.
Discussion
Teknikken er beskrevet i dette manuskriptet effektivt og reproduserbart genererer aggregater av mus embryonale stamceller (mESCs) at skjermen organisert symmetri-breaking og forlengelse 19, som kombinerer både hengende dråpe kultur beskrevet av Marikawa et al. 14 og EB formasjon. Disse aggregatene går på å utvikle aksiale forlengelser, supplerer eksisterende metoder for generering av fremre organer fra ES-celler som optiske kopper 11 og hjernebarken 13, og inneholder celler med identiteten til tre-bakterie lag som viser prosesser som ligner på dem i løpet gastrulation som for eksempel rask celle bevegelse 19,21.
Det er interessant å spekulere på arten av symmetrien brytende arrangement, ettersom det forekommer i fravær av eksterne mønster vev og zygotiske asymmetri pekepinner 19. Den spontane dannelse av en rudimentær akse kunne oppstå fra pre-eksisterende heterogeneities i startkultur av celler, som danner grunnlag for utvikling av asymmetri. Faktisk populasjoner av celler dyrket i ESLIF betingelser vise en blanding av selvpolerende og differensierende celler, kan de relative andeler av som varierer fra en aggregert til en annen. Videre forarbeid i vårt laboratorium tyder på at aggregater fra en helt pluripotent populasjon av celler viser forsinket utvikling og defekter i mønster, noe som tyder på en rolle for heterogenitet i organisert mønster formasjon (DA Turner & A. Martinez Arias, som forberedelse). Det er også verdt å vurdere som et reaksjons-diffusjon mekanismen kan danne et mønster, med diffusjon av en inhibitor bort fra overflaten av aggregatet. Warmflash et al. 41 tyder på at en slik mekanisme kan være ansvarlig for å utvikle radial asymmetri i tilhenger kultur, noe som gjør det til en mulig kandidat for mønster i tre dimensjoner.
Under innledetl 48 timers periode aggregering, cellene når en tilstand lik den som er innenfor fostertap epiblast, der de er i stand til å reagere på signaler fra sekundærmediet 19,21,24. Typisk protokollen beskrevet her gir celler med en puls av sekundært medium som inneholder faktorer (for eksempel Wnt / β-catenin agonister) som gir de signaler som er tilstrekkelig for forlengelse. Tidligere dyrkningsfremgangsmåtene beskrevet av Lancaster et al. (Med humane ESCs 13) og Eiraku et al. (Med mESCs 11) anvendes en kort periode av aggregering i lav adhesjon 96-brønners plater før aggregerte celler ble overført til Matrigel dråper for on- kommer kultur. Selv om tiden mellom aggregering og Matrigel innsetting var forskjellig mellom studiene, i begge tilfeller, ble et stort antall celler som brukes til aggregatdannelse (ca. 3,000-4,500 celler). I motsetning til den protokoll som er beskrevet her 19 benytter langt færre celler (ca. 400 cellerpr aggregat) som er blitt bestemt å være helt avgjørende for prosessen av forlengelse, symmetri brytende og polarisasjonen som er observert 19. I tillegg er disse langstrakte strukturene er i stand til å bli generert i en mye kortere tidsrom uten å bygge i kunstige matriser: sammenligne generasjon av definerte områder av hjernen ved Lancaster et al (> 20-30 dager) 13 og optiske kopper fra Eiraku. et al. (~ 11 dager) 11 med de 5 dager som kreves for generering av polariserte langstrakte strukturer.
En av begrensningene med den dyrkningsmetode som er beskrevet her er imidlertid at de bare kan dyrkes i omtrent 5-6 dager etter utplating inntil deres størrelse gjør dem kompetent under gravitasjon for å synke til bunnen av brønnene og tvinge en adhesjon selv på ikke- belagte plast-ware. Ytterligere eksperimenter ved hjelp av kunstige matriser som for eksempel de som er nevnt tidligere, kan tillate oss å øke periodenobservasjon og eksperimentering, og arbeidet er pågå for å bestemme effektene av begrensende aggregatene på en slik måte. En ytterligere begrensning av denne teknikk er at for å endre mediet uten å fjerne aggregater, må et lite volum av mediet bli liggende i bunnen av brønnen. Konsekvensene for kjemiske genetikk tilnærminger er behov for å vurdere dette fortynning og eventuelle gjenværende effekter fra forrige media: på dagen for tre mikrometer Chi puls, er 2,37 mikrometer løsning faktisk levert, og påfølgende mellom endringer resultere i en carry-over av 0,499 mikrometer (72-96 timer) og 0,105 mikrometer (96-120 t) mellom tidspunktene. Nåværende arbeid har ikke korrigert for fortynning og det antas at daglige mellom endringene vil minimalisere gjenværende effekter.
Det finnes en rekke kritiske trinn i protokollen for å sikre både intra- og inter-eksperimentelle reproduserbarhet. For det første må utgangskultur mESCs være godt vedlikeholdt og ikke over confluent, og medium skal alltid være god kvalitet ie., friskt og godt blandet (figur 5A, B). Dårlige kulturbetingelser påvirke aggregering (figur 5Bi). Nøyaktig telling av celler for å oppnå et ~ 400 celler / 40 ul cellesuspensjon er viktig, da større aggregater ikke klarer å selv-organisere og er mer sannsynlig å danne doble aggregat innen hver brønn (figur 5Bii) mens mindre aggregater ikke er i stand til å nå den riktige tetthet hvor de er i stand til å svare på stimulus (figur 5Biii). Et viktig optimaliseringstrinnet var inkluderingen av en andre PBS vaske som fjerner forurensning serum fra cellesuspensjonen (trinn 2.6); Dette forbedret aggregering hyppigheten og påskyndet utviklingen av aggregatene med ca 24 timer. Deretter blir sikrer mellom endringer påføres med tilstrekkelig kraft til å løsne noen aggregater som har potensial til å holde fast på overflaten av brønnen; unnlatelse av å gjøre det resuLTS i aggregatene 'krasj' (figur 5Biv). I tillegg, og som nevnt tidligere (og under), er det viktig å sikre at aggregatene blir opprettholdt i suspensjonskultur, og er forhindret fra å følge en hvilken som helst overflate. Når aggregatene har levd, er mønsteret av genekspresjon og deres forlengelse potensial forstyrret.
Da denne teknikken er relativt enkel, og godt innenfor rammene av personer med gode vev-kulturteknikker, kan de fleste av problemene forbundet med aggregering løses relativt raskt dersom de kritiske trinn blir fulgt; en fullstendig oversikt over feilsøking er tilgjengelig (tabell 1). Når mestret, kan denne teknikken brukes til å studere aksial utvikling, symmetri bryte og celle-beslutning hendelser. Mer spesifikt er disse aggregater har potensial til å generere bassenger av celler som hittil har vært utilgjengelige i kultur, som for eksempel ryggmargen og motor neuroner.
Etisk Merk: Det bør bemerkes med tilbørlig varsomhet at oversettelsen av denne protokollen til menneskelige ES eller iPS cellekultur kunne bringe eksperimentator nær det juridiske grunnlaget for fjorten dagers frist på menneskelig embryo forskning, nemlig generasjon av en primitiv strek, som beskrevet i Human Gjødsling og Embryology Act 2008 (UK) 42. Siden loven dekker alle levende menneskelige embryoer uavhengig av deres måte av skapelsen, ville kultur av menneskelige gastruloids utover primitive-streak som stadium være utenfor rammen av konsesjonspliktig forskning.
Acknowledgments
Dette arbeidet er finansiert av en ERC Advanced Investigator Award til AMA (DAT, TB) med et bidrag på et prosjekt Grant fra Wellcome Trust til AMA, en EPSRC studieplass til PB-J og Erasmus, Stichting dr. Hendrik Muller Vaderlandsch Fonds og Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage til SCvdB. Vi ønsker å takke J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, og T. Rodriguez, for diskusjoner og konstruktiv kritikk, Joaquin de Navascués for montering medium protokollen og både AK Hadjantonakis og C. Budjan for å dele sine laboratorie protokoller knyttet til farging av hele montering embryoer. En tidligere versjon av denne artikkelen ble tidligere gjort tilgjengelig på bioRxiv Førtrykk Server 29.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
| 25 cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
| Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
| BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
| Centrifuge tubes (15 or 50 ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
| CHIR 99021 (Chi) | CSCR | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO | |
| Dissection Well (30 mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
| ESLIF | 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units). | ||
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
| Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
| Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. | |
| n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
| N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
| Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
| Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
References
- Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 233-262 (2004).
- Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).
- ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
- Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood. Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).
- Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate. Cell. 160, 1-16 (2015).
- Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation. J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Koehler, K. R., Hashino, E. 3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids. Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).
- Lancaster, M. A., Renner, M., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis. Genesis. 47 (2), New York, N.Y. 93-106 (2000).
- Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
- Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation. J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).
- Horstadius, S. The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods. Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).
- Holtfreter, J. Die totale Exogastrulation, eine Selbstablösung des Ektoderms vom Entomesoderm. Wilhelm Roux'Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).
- van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Eiraku, M., Watanabe, K., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Turner, D. A., Hayward, P., et al. Wnt/β-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Faunes, F., Hayward, P., et al. A membrane-associated β-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells. Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).
- Kalmar, T., Lim, C., et al. Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells. PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).
- Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Rué, P., Martinez Arias,, A, An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells. Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).
- Turner, D. A., Rué, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias,, A, Brachyury cooperates with Wnt/β-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells. BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).
- Ying, Q. -L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Ying, Q. -L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
- Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. Molecular Embryology of the Mouse. , CSHL. 1-90 (2011).
- Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias,, A, Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro. bioRxiv. , (2014).
- Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation. Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).
- Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo. Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).
- Inman, G. J., Nicolás, F. J., et al. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).
- Hao, J., Daleo, M. A., et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).
- Neely, M. D., Litt, M. J., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. 12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal. Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).
- Chambers, I., Silva, J., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
- Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice. Genesis. 44 (4), New York, N.Y. 202-218 (2006).
- Serup, P., Gustavsen, C., et al. Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice. Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).
- Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).
- Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II. , The Stationery Office. (2008).
