Abstract
Vi har udviklet en protokol forbedre strøm embryoide Krop (EB) kultur, der tillader studiet af selvorganisering, symmetribrud, aksial forlængelse og celle skæbne specifikation hjælp aggregater af muse embryonale stamceller (mESCs) i suspension kultur. Lille antal mESCs aggregeres i basalt medium i 48 timer i ikke-cellekultur-behandlede, U-bund 96 brønde, hvorefter de er kompetente til at reagere på eksperimentelle signaler. Efter behandling, begynder disse aggregater at vise tegn på polariseret genekspression og gradvist ændrer deres morfologi fra en sfærisk masse af celler til en aflang, velorganiseret struktur i fravær af eksterne asymmetri signaler. Disse strukturer er ikke kun i stand til at vise markører for de tre kimlag, men aktivt vise gastrulation-lignende bevægelser, der repræsenteres ved et retningsbestemt forskydning af individuelle celler fra aggregatet, som har en afgørende forekommer ved et område af den aflange struktur. Denne protocol giver en detaljeret metode til reproducerbar dannelsen af disse aggregater, deres stimulering med signaler såsom Wnt / β-Catenin aktivering og BMP hæmning og deres analyse ved en enkelt gang-point eller tidsforskudt fluorescerende mikroskopi. Desuden beskriver vi ændringer af de nuværende hel-mount mouse embryo farvningsprocedurer for immuncytokemisk analyse af specifikke markører indenfor faste aggregater. Ændringerne i morfologi, genekspression og længden af aggregaterne kan måles kvantitativt, at give oplysninger om, hvordan signaler kan ændre aksiale skæbner. Det forventes, at dette system kan anvendes både til studiet af tidlige udviklingsmæssige begivenheder såsom aksial udvikling og organisering, og mere bredt, de processer af selvorganisering og cellulære beslutningstagning. Det kan også tilvejebringe en egnet niche til frembringelse af celletyper til stede i embryoet som er uopnåelige fra konventionel klæbende kultur som rygmarv og motoriske neuroner.
Introduction
Undersøgelsen og forståelse af celle-skæbne beslutninger i tidlige udvikling pattedyr kan gøre brug af kulturer af embryonale stamceller (EKSF), klonpopulationer afledt af blastocyster, der har evnen til selv at forny og differentiere til alle celletyper i en organisme ie., de er pluripotente 1,2. Mens disse kulturer har været og fortsat være nyttige for forståelsen af den molekylære basis for celle-skæbne beslutninger, er de i stand til at gengive nogle af de rumlige arrangementer og globale adfærd, der genereres i fostre under gastrulation. I fosteret, processen med gastrulation forvandler et enkelt epithellaget i de tre særskilte kimlag og forlener embryo med en åbenlys anteroposterior organisation 3-5. Forsøg på at rekapitulere disse begivenheder ex vivo har været baseret på genereringen af tredimensionelle aggregater af økonomiske og sociale råd, kaldet embryoide organer (EBS), og udsætte dem to differentieringstilstande 6,7. Disse aggregater kan lokkes til at differentiere til mange forskellige celletyper, hvoraf nogle er enten ude af stand til at opnå eller induceret med lav effektivitet i vedhængende kultur eller ikke kan produceres på alle;. Fx, blod 8 og primordiale kønsceller 9. En begrænsning i brugen af EB'er er imidlertid, at de ikke kan vise den morfogenetiske adfærd, kim lag distribution eller aksial organisation, der er vigtige egenskaber for det udviklende foster, hvilket resulterer i rumlig forvaltningsmæssigt 6,10. I en rapport, behandling af EB'er med Wnt fører til en svag polarisering i genekspression i nogle aggregater, men observeres nogen klar morfogenese 7. I nyere rapporter, EBS, der er dyrket i længere perioder udvikle anteriore strukturer såsom nethinder, cortex og indre øre sensoriske celler, som efterligner deres embryonale modparter, men udvikle sig uden for rammerne af en aksial organization 11-13.
En rapport fra Marikawa et al. 14, mens de arbejder med aggregater af mus P19 Embryo karcinom (EF) celler dannet ved hængning slip-metoden, rapporterede fremkomsten af langstrakte strukturer mesodermal oprindelse minder om forlængelserne, der er observeret med exogastrulae i padder og søpindsvin embryoner og Keller explanter 15-18. Da dette ikke var blevet observeret med mus embryonale stamceller (mESCs), vi forsøgte at gengive adfærden observeret med P19 EC-celler under anvendelse af aggregater af mESCs 19 og vi rapporterer dyrkningsbetingelser, der fører til deres symmetribrud og aksial forlængelse. En vigtig forskel fra arbejdet med P19 celler er, at aggregeringen protokollen beskrevet her udføres i en 96-brønds plade, der svarer til den beskrevet af Eiraku et al. 20, i stedet for at hænge dråber. Denne ændring medførte en øget effektivitet i form af samlede genopretning og i bådeinden for og mellem eksperimentelle reproducerbarhed. Vigtigere er det, at opretholde aggregater i individuelle brønde sikrer, at fusion mellem aggregater (fælles, når pooling aggregater fra hængende dråber) ikke forekommer. Hertil kommer, et centralt element i protokollen er 24 timers eksponering for GSK3 hæmmeren CHI99021 (Chi), en potent aktivator af Wnt / β-Catenin signalering, efter sammenlægning.
Den her beskrevne metode giver et grundlag for at forstå processerne i selvorganisering, aksial organisation og kim lag specifikation i kultur, så slutninger, der skal foretages vedrørende aksial udvikling in vivo 19,21. Af disse grunde metoden har potentiale til at tillade detaljeret mekanistisk analyse af processer, der kan være svære at studere i embryoet. Desuden er en mulig anvendelse er i dannelsen af væv og organer, der ikke er let tilgængelige i vedhængende kultur på grund af manglen på en struktureret cellulært niche såsomrygmarven forstadier 21 og motoriske neuroner. Tredimensionale aggregerede kultur giver en fysisk struktur og signalering miljø, kan muligvis ikke nås ved konventionelle metoder, hvilket fører til en ny tilgang til afledning af embryoniske afstamninger i et rumligt organiseret måde.
Protocol
1. Kultur Betingelser Forud for Aggregation
- Oprethold mESCs i ESLIF medium (se tabel af specifikke materialer og udstyr til formulering) på gelatineovertrukne 25 cm2 væv-kultur-behandlede kolber i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO Februar 21-25.
- Dyrk celler i mindst to passager skrive optøning før anvendelse i denne protokol; celler på lavere passager er generelt mere vellykket på at skabe reproducerbare karakteristika i hele eksperimentelle gentagelser (dvs.., ikke mere end 15 passager i kultur), men lille variation mellem forskellige ES celle-linjer kan forventes (se tabel 2 for de testede cellelinjer ).
- Grow celler til 40-60% konfluens. Brug ikke over-sammenflydende celler til sammenlægning.
2. generation af aggregater
- Pre-varme PBS (+ Ca 2+, Mg2 + +), ESLIF, N2B27 26,27
- Aspirer dyrkningsmedium fra vævskulturkolbe (trin 1.3). Skyl kolben forsigtigt med 5 ml PBS, to gange. Aspirer PBS og tilsæt 1 til 2 ml forvarmet Trypsin-EDTA (0,25%) for at dissociere cellerne.
- Anbring kolben i inkubatoren i <5 min eller indtil cellerne er helt løsrevet fra overfladen af kolben. Pipette op og ned med en 1 ml pipette til at generere enkeltstrenget cellesuspension til nøjagtig tælling og ensartet aggregatstørrelse formation.
- Neutraliser Trypsin med 5-10 ml ESLIF; spule vækstoverfladen at maksimere cellerestitueringen og overføres til en 50 ml centrifugerør. Fjern en 1 ml prøve fra centrifugerøret og tælle cellerne med et hæmocytometer.
- Bestem mængden af suspensionen forpligtet til at give 10 celler / pl (en hel plade med 96 brønde kræver 5x10 4 celler i et 5 ml suspension). Tæl celler præcist, så stor deviationer fra det angivne celle nummer kan påvirke responset af aggregaterne til stimuli.
- Tilføj 5x10 4 celler til 5 ml forvarmet PBS i en frisk 50 ml centrifugerør og centrifugering ved ~ 170 xg i 5 min.
- Aspirere forsigtigt PBS, og der tilsættes 5 ml forvarmet PBS blidt; ikke forstyrrer pellet på bunden af røret. Der centrifugeres ved 170 xg ~ i 5 minutter.
- Aspirere omhyggeligt PBS for anden gang. Fjern så meget PBS som muligt uden at forstyrre pelleten PBS fremførsel kan påvirke aggregering. Pellet resuspenderes først i 1 ml varmt N2B27 med en P1000 pipette til at generere en homogen cellesuspension, efterfulgt af yderligere tilsætning af N2B27 til den nødvendige mængde (f.eks tilsættes 4 ml til 5x10 4 celler / 5 ml suspension).
- Overfør cellesuspensionen til en steril beholder og afpipetteres en 40 pi dråbe i bunden af hver brønd i en ikke-vævskultur-behandlet, U'-bund 96-well plade ved hjælp af en multikanal pipette. Dæk 96-brønds plade med tilhørende låg og bekræfte tilstedeværelsen af celler med en omvendt bench-top mikroskop (figur 1B).
Bemærk: Det er vigtigt, at disse plader anvendes til at begrænse muligheden for celler klæber. Ikke coat bunden af 96-brønds plade med gelatine, fibronectin eller en anden belægning, der fremmer celleadhæsion. - Inkubér cellerne i 48 timer i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i aggregering.
3. Anvendelse Stimuli og ændring Medium
- Efter 48 timers inkubationstid, observere forekomsten af mESCs inden for hver brønd i 96-brønds plade til at bekræfte vellykket aggregering (figur 1E). Bemærk: Aggregater vises sfæriske karakter og ca. 150-200 um i diameter. Der henvises til afsnittet om fejlfinding, hvis der opstår problemer (tabel 1).
- 0; Tilsæt 150 pi frisk sekundære medium (3 uM Chi99021 (Chi) i N2B27 19 stock fremstillet ved 10 mM i DMSO) til hver brønd med en multikanalpipette. Pipette med tilstrækkelig kraft til at fjerne eventuelle aggregater, der kan have begyndt at klæbe til bunden af brøndene. Inkuber aggregater i sekundære medium i 24 timer i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO 2 (figur 1A).
Bemærk: Reproducerbare aflange og polariserede aggregater genereres ved hjælp af denne sekundære medium. Andre sekundære medium sammensætninger kan også anvendes afhængigt af de eksperimentelle betingelser og eksempler er vist i figur 3. - For efterfølgende medium ændringer, skal du bruge en multikanalpipette holdes i en vinkel (ca. 30 °) til forsigtigt at fjerne 150 pi af det sekundære medie fra den side af hver brønd. Så, for at pipette 150 pi frisk N2B27 til hver brønd med tilstrækkelig kraft fjerne eventuelle aggregater, der kan have begyndelseed til at klæbe til bunden af brøndene.
- Gentag punkt 3. 3 hver 24 timers indtil tidsforløbet er komplet (den typiske længde af en samlet kultur eksperiment er 120 timer).
Bemærk: Sørg for aggregater frit bevæger følgende medium ændringer for at sikre reproducerbarhed og sammenhæng inden for og mellem hver plade med 96 brønde. Medium skal ændres dagligt efter sammenlægning periode.
4. Fremstilling af aggregater for Immunfarvning og analyse af konfokalmikroskopi
- Fiksering og Primary Antibody Inkubation
Bemærk: beskrevet af AK Hadjantonakis 28 protokol er blevet ændret for at passe til immunfarvning af Mesc aggregater. For den typiske antistoffer anvendt i vore undersøgelser og deres fortyndinger henvises til tidligere offentliggjorte arbejde 19,21,24,25,29 og tabel 3.- Brug en multikanalpipette holdes i en vinkel (ca. 30 °) til forsigtigt at fjerne 150 pi medium fra siden of hver brønd i 96-brønds plade. Vask to gange ved pipettering 150 pi PBS i hver brønd. Efterlad et par minutter mellem hver vask for at give aggregaterne at bosætte.
- Indstil en P1000 pipette til at dispensere 200 pi, vedhæfte den tilsvarende pipettespids og afskære ca. 3 mm fra enden af spidsen med et par steril saks. Tegn en del af PBS i hver brønd i 96-brønds plade en kort vej ind i spidsen og uddrive det at omrøre aggregatet.
- Brug den samme spids til at udarbejde hele volumen inden brønden herunder den samlede og pipette i en lille (30 mm diameter) glas Drosophila dissektion godt. Overføre alle aggregater fra 96-brønds plade, der vil gennemgå identiske Immunofarvning regimer i det samme glas dissektion godt.
Bemærk: Brug en ny cut pipettespids når der overføres aggregater fra forskellige eksperimentelle betingelser for at forhindre overførsel af aggregater. - Anbring glas godt der indeholder aggregates ned på en dissektionsmikroskop. Swirl glasset godt at tvinge aggregaterne til centrum og Aspirer PBS fra den ene side af brønden med et glas Pasteur-pipette. Mikroskopet at sikre aggregaterne ikke aspireret. Efterlade et lille volumen af PBS i glasset og til dækning af aggregater for at forhindre dem i at tørre ud.
- Der tilsættes 1 ml frisk fremstillet formaldehyd (4%) opløst i PBS og inkuberes i 2 timer ved 4 ° C på en orbitalryster indstillet til en lav hastighed. Forsigtig: Paraformaldehyd er kendt for at være allergifremkaldende, kræftfremkaldende og giftige. Bær passende beskyttelse, samtidig med håndtering.
- Efter fiksering, opsug formaldehydopløsning på samme måde som beskrevet i afsnit 4. 1. 4 og vask aggregaterne med 1 ml PBS tre gange, 10 min for hver vask med, på en orbitalryster indstillet til en lav hastighed.
- Aspirere PBS som beskrevet i afsnit 4. 1. 4 og udfører yderligere tre, 10 min vask med PBS indeholdende 10% føtalt bovint serum og 0,2% Triton X-100 (PBSFT). Udfør 10 minutters vaske på en orbitalryster indstillet til en lav hastighed.
Bemærk: Brug af Føtal bovint serum (FBS) resulterer i en klar vaskebuffer, reducere antallet af aggregater, der ellers ville gå tabt i løbet af protokollen, hvis mælken blev brugt. Det er vigtigt at bemærke, at efter fiksering kan immunhistokemiske procedurer udføres i andre end de beskrevet nedenfor forskellige måder og bør bestemmes og optimeres af investigator. - Blokere aggregater i 1 time ved 4 ° C i PBSFT på en orbital rocker indstillet til en lav hastighed. Protokollen kan sættes på pause på dette tidspunkt, og aggregater blokerede O / N, under konstant omrøring på en vandret roterende rocker ved 4 ° C.
- Aspirer PBSFT som tidligere beskrevet (se afsnit 4. 1. 4) og inkuber aggregaterne med 500 pi den krævede primære antistof fortyndet i PBSFT O / N ved 4 ° C på en orbitalryster sat til lav hastighed. Dæk med paraffin film for at forhindre fordampning.
- Sekundært antistof Inkubation
- Aspirer det primære antistof-opløsning og vaskes med 1 ml PBSFT (ved 4 ° C) på følgende måde: to gange i 5 minutter; tre gange i 15 minutter; og fire til syv gange i 1 time. Udføre hver vasketrin ved 4 ° C og på en orbital rocker sat til lav hastighed. Bemærk: Chill vaskemedium før brug. Udfør ikke vaskene på is, da dette kan medføre aggregaterne til fragment.
- Aspirere den sidste vask medium og inkuberes aggregaterne med den krævede sekundære antistof i 500 pi PBSFT O / N ved 4 ° C i mørke på et vandret roterende rocker. Tilføj nukleare plet såsom Hoechst, hvis det kræves.
- Montering og Imaging af Konfokal mikroskopi
- Vask aggregater som beskrevet i afsnit 4. 1. 4 med 4 ° C PBSFT. Efter den sidste vask, skyl aggregaterne med 1 ml PBS indeholdende 0,2% FBS og Triton X-100 (PBT) på følgende måde: to gange i 5 minutter; tre gange i 15 min. Udfør vaskerved stuetemperatur på en orbital rocker beskyttet mod lys.
- Aspirer medium som tidligere beskrevet (afsnit 4. 1. 4) og inkuberes i 30 minutter i mørke med en 1: 1 opløsning af glycerol: PBT (1 ml) efterfulgt af en anden 30 minutters inkubation med en 7: 3 opløsning af glycerol: PBT (1 ml).
Bemærk: Bland glycerol og PBT løsninger ved 4 ° C under anvendelse af en rotator. - Aspirere den endelige glycerol: PBT-opløsning og erstatte med 1 ml montering medium 24. Protokollen kan sættes på pause på dette tidspunkt før montering (hvis pause, forsegle brøndene med paraffin film og gemme farvning brønde ved 4 ° C).
- Monter aggregaterne på objektglas ved pipettering dem i dråber 17 pi med et snit P20 spids (figur 2). Fold dobbeltklæbende tape tilbage på sig selv fire gange for at generere afstandsstykker og vedhæfte til hver ende af slæden. Placere det øverste dækglas (22 mm x 60 mm) på disse afstandsstykker (figur 2).
Bemærk: Det er vigtigt, at et snit tip eranvendes på dette tidspunkt, så ikke at beskadige prøverne. Afstandsstykkerne forhindre dækglasset knuse aggregaterne. - Når aggregaterne er monteret, billede prøverne ved hjælp af konfokal mikroskopi hjælp protokoller tidligere beskrevet 19,21,24,25. Når placeret på mikroskopet, skal du lade det dias uforstyrret på scenen i et par minutter, så aggregaterne at bosætte inden monteringen medie.
Representative Results
Udseende Celler Umiddelbart Efter Plating og efter sammenlægning
Umiddelbart efter udpladning kan man observere tilstedeværelsen af enkelte celler i hver brønd på 96-brønds plade med en standard omvendt cellekultur mikroskop (figur 1B). Inden 8 timer i yderklædningen, vil disse celler er begyndt at stige ned til bunden af brønden på grund af tyngdekraften og er begyndt at smelte sammen i adskilte klynger (figur 1C). Efter 24 timer, vil sammenløbelaget celler har gennemført den primære sammenlægning, og vil have komprimeret i veldefinerede, men laset aggregater, hvor enkelte celler er utydelige fra hinanden (figur 1D). Ved udgangen af den anden dag (48 timer), skal aggregaterne se "ren", at have taget alle celler i brønden (figur 1E); bunden af brønden kan have nogle celler, der er blevet kastet ud fra de aggregerede på dette tidspunkt. At sørge forat aggregaterne er blevet aggregeret i N2B27, på dette tidspunkt-punkt, bør de være sfærisk, ca. 150-200 um i diameter og frit bevæge sig inden for godt (dvs.., ikke levet op til bunden af brøndene). Aggregering i andre medier (dvs.., ESLIF eller N2B27 med specifikke faktorer) har potentialet til at ændre både den oprindelige samlede morfologi og reaktionen på de efterfølgende stimuli (Turner et al., Under forberedelse).
Repræsentant morfologiske ændringer
Tilsætning af en 24 timers puls af sekundær medium indeholdende Chi mellem 48 og 72 timer (figur 1A, 5A) genererer veldefineret aflange aggregater, der viser polariseret udtryk i specifikke markører for kimlag 19,21. Umiddelbart efter Chi puls (72 timer), vil aggregaterne begynder at kaste celler og begynder at vise deres reaktion på disse signaler mod slutningen af denne dag (figur 3A). Disse reaktionerer manifesteret ved ændringer i genekspression og morfologi, som begge er afhængige af behandlingen, at aggregaterne har modtaget efter den første 48 timer sammenlægning periode i N2B27 (figur 3B). Hvis der kun et endepunkt analyse er nødvendig, det optimale tidspunkt til at afbilde aggregaterne er omtrent 96-120 timer. På dette tidspunkt aggregaterne vil have udviklet klare morfologier og genekspressionsmønstre (figur 3A), og deres størrelse og masse er stadig så lav, at udstødningen af medium fra P200 pipette er tilstrækkelig til at løsne enhver, der kan have tilknyttet. Manglende forhindre fastgørelse af aggregatet til brønden vil påvirke aggregatdannelse (Figur 5Biv). Den morfologier og genekspression mønster af aggregaterne kan ændres afhængigt af behandlingen. Repræsentative resultater for vedvarende eller pulserende regimer med enten enkelt behandling eller kombinationer af faktorer er vist for BMP4, Dorsomorphin H1 (BMP-receptor-inhibitor), ActivinA, SB43 (activin / Nodal inhibitor), bFGF eller PD03 (MEK-inhibitor) (figur 3B).
Aggregat Imaging og Kvantitativ billedanalyse
Aggregater er modtagelige for billeddannelse ved enten vidvinklede mikroskopi (hovedsagelig time-lapse billeddannelse 19), eller faste og immunofarvet for konfokal billeddannelse 19,21 (figur 2). Den nuværende protokol og billedbehandling ovenstående beskrivelse giver kvantitative oplysninger, der kan opnås fra disse aggregater. Kan måles; Efter konfokal eller bred-felt billedoptagelse, længde og den tilsvarende genekspression langs diameter eller ryggen af den samlede (figur 4A, B sfærisk eller langstrakt henholdsvis). Disse analyser er også direkte anvendelse på time-lapse-billeder, hvor man kan få information om vækstraten, størrelse og forlængelse af aggregaterne under forskellige betingelser (figur 4
Figur 1. Typisk tidsforløbet og tidlige morfologier. (A) Den typiske tid-kursus for sammenlægning eksperimenter. Celler samles i 48 timer i N2B27 indeholdende en suspension af muse ES-celler (10 celler / ul) i en 96-brønds plade (P1, P2). (B) Umiddelbart efter udpladning (t = ~ 5min), kan de enkelte celler ses i suspension og er begyndt at danne klumper af 8h (C). (D) Efter 24 timer cellerne har dannet et enkelt aggregat i hver brønd, som er omtrent 100 um i diameter. (E) Efter 48 timer aggregering, den samlede diameter i området fra 150-200 um. På dette tidspunkt, sammenlægning medium (N2B27) er fjernet, og et sekundært medium tilsættes enten for resten af eksperimentet (p1 i del A) eller i 24 timer før ændring bACK til N2B27 (p2 i del A). Skala søjle repræsenterer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Montering aggregater onto mikroskopobjektglas. Når aggregaterne er blevet fastsat, immunfarvet og anbragt i monteringsmedium, er hvert aggregat pipetteres på et objektglas som en 17 pi dråbe (A, B, B '). Nok plads der er tilbage mellem de samlede dråber for at forhindre deres sammenlægning. Afstandsstykker er lavet med dobbeltsidet tape og anbragt ved hvert hjørne af objektglasset (A, A ', B). Det er på disse, at et dækglas er placeret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Virkningen af forskellige behandlinger på morfologien af aggregerede ES-celler. Efter 2 dage i N2B27, har ES-celler dannet aggregater. Tilsætning af specifikke faktorer enten som en 1 dag impuls (A) eller kontinuerligt (B) kan ændre fænotypen af aggregaterne med hensyn til polariteten af genekspression, forlængelse potentiale eller deres samlede form. Eksemplerne i denne figur er aggregater dannet ud fra enten Bra :: GFP 30 (A) eller Sox1 :: GFP 27 (B) muse ES-celler afbildes efter 120 timer og behandlet som angivet. Chi: CHIR 99.021 31; SB43: SB 431542 32 DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 Klik her for at se en større version af ther figur.
Figur 4. Kvantitativ analyse af aggregater. Et typisk aggregat dannet af Bra :: GFP mESCs 25,30 efter en 24 timers puls af Chi og afbildet ved 120 timer. Sammenflettede billede af lysfeltsbillede og GFP kanal er vist med segmenteret linie, der markerer ryggrad af aggregatet fra punkt A til B (A), langs hvilken kan måles fluorescensen og længden af den samlede (B). Længden (C) og "rundhed '(D) fra 24 aggregater inden for samme forsøg er vist. Kan måles formdeskriptorer såsom rundhed (D), cirkularitet, omkreds og areal skal bruge billedanalyse Kogebog plugin fra billedet analyse software FIJI 35. Mean angivet med vandret linie ved hvert tidspunkt;fejlsøjler indikerer standardafvigelse; Målestokken i (A) angiver 200 um. Da der er subtile forskelle mellem reporter cellelinjer, forventes det, at efter en puls af Chi, den gennemsnitlige maksimale længde og gennemsnitlige mindste rundhed af aggregaterne vil variere. Mellem forskellige cellelinjer, finder vi, at den gennemsnitlige maksimale længde kan være inden for intervallet ~ 400-800 um og den gennemsnitlige minimale rundhed mellem 0,4 og 0,6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Eksempler på fejl i aggregatdannelse. Evnen til at generere reproducerbare aggregater (A) afhænger af kritiske faktorer såsom (Bi) frisk og godt blandet sekundært medie, (Bii, BIII) nøjagtigheden i at tælle den indledende numbra af celler og (BIV), således at aggregaterne ikke danner kolonier vedhængende dvs., 'nedbrud' ind i overfladen af brønden. Typiske eksempler på de fejl i aggregatdannelse for hver af de nævnte betingelser (B) er vist. Scale-bar som angivet; se fejlfinding tabel for detaljer (tabel 1). Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Guide til fejlfinding. Typiske fejl i forbindelse med sammenlægning protokollen er givet med forslag til, deres opløsning.
Tabel 2. Tabel cellelinier testet for dannelse af aggRegates. Et antal cellelinjer 19,22,27,30,36-40 er blevet karakteriseret for dannelsen af aggregater og, selv om der forventes subtile forskelle mellem cellelinier og er blevet observeret, alle ovenstående linier viser lignende dynamik i form af forlængelse og morfologi. Med hensyn til genekspression, ekspressionsmønsteret er specifik for genet udtrykkes, men inden for hver cellelinie, ekspressionsmønsteret er generelt i overensstemmelse over et antal passager. For konsistens, vi genererer aggregater fra celler, der ikke har overskredet 15 passager i kultur.
Tabel 3. Liste over repræsentative antistoffer, der anvendes i disse studier. Et udvalg af antistofferne og fortyndingen faktorer, der anvendes til samlet immunfarvning.
Discussion
Teknikken er beskrevet i dette manuskript effektivt og reproducerbart frembringer aggregater af muse embryonale stamceller (mESCs), som display organiseret symmetri-breaking og forlængelse 19, der kombinerer både hængende dråbe kultur beskrevet af Marikawa et al. 14 og EB formation. Disse aggregater gå på at udvikle aksiale forlængelser, der supplerer de eksisterende metoder til generering af forreste organer fra ES-celler, såsom optiske bægre 11 og hjernebarken 13, og indeholder celler med identitet tre kimlag som display processer svarende til dem i løbet af gastrulation såsom hurtigt cellebevægelse 19,21.
Det er interessant at spekulere om karakteren af den symmetri-breaking begivenhed, da det forekommer i fravær af eksterne mønsterdannende væv og zygotisk asymmetri tidskoder 19. Den spontane dannelse af en rudimentær akse kan opstå fra allerede eksisterende heterogeneities i udgangs-kulturen af celler, som danner grundlag for udviklingen af asymmetri. Faktisk populationer af celler dyrket i ESLIF betingelser vise en blanding af selvfornyende og differentiere celler, kan de relative andele af som varierer fra den ene aggregat til en anden. Desuden indledende arbejde i vores laboratorium viser, at aggregater fra en helt pluripotente population af celler viser forsinket udvikling og defekter i mønster, hvilket tyder på en rolle for heterogenitet i mønsterdannelse organiseret (DA Turner & A. Martinez Arias, under forberedelse). Det er også værd at overveje, at en reaktion-diffusionsmekanisme kan generere det mønster, med diffusion af en inhibitor bort fra overfladen af aggregatet. Warmflash et al. 41 tyder på, at en sådan mekanisme kunne være ansvarlig for udvikling radial asymmetri i vedhængende kultur, hvilket gør det en mulig kandidat til mønsterdannelse i tre dimensioner.
Under initial 48 timers sammenlægning periode, celler nå en tilstand, der svarer til den i implantation epiblasten, hvor de er kompetente til at reagere på signaler fra det sekundære medium 19,21,24. Typisk protokollen beskrevet her giver celler med en impuls af sekundære medium, der indeholder faktorer (såsom Wnt / β-catenin-agonister), som giver de signaler der er tilstrækkelige til forlængelse. Tidligere kultur metoderne beskrevet af Lancaster et al. (Anvendelse af humane ESC 13) og Eiraku et al. (Med mESCs 11) anvendes en kort periode aggregering i lav friktionskoefficient 96-brønds plader før aggregerede celler blev overført til Matrigel dråber for on- gå kultur. Selvom tiden mellem aggregering og Matrigel indsættelse var forskellig mellem undersøgelserne, i begge tilfælde et stort antal celler blev anvendt til aggregatdannelse (ca. 3,000-4,500 celler). Derimod protokollen beskrevet her 19 bruger langt færre celler (ca. 400 cellerper aggregat), som er bestemt til at være helt afgørende i processen med forlængelse, symmetri-breaking og polarisering, der er observeret 19. Desuden er disse langstrakte strukturer er i stand til at blive genereret i et meget kortere tidsrum uden indlejring i kunstige matricer Sammenlign dannelsen af definerede områder af hjernen af Lancaster et al (> 20-30 dage) 13 og optiske kopper fra Eiraku. et al. (~ 11 dage) 11 med de 5 dage, der er nødvendige til frembringelse af polariserede langstrakte strukturer.
En af begrænsningerne med her beskrevne imidlertid dyrkningsmetode, er, at de kun kan dyrkes i ca. 5-6 dage efter udpladning, indtil deres størrelse gør dem kompetente ved hjælp af tyngdekraften til at synke til bunden af brøndene, og tvinge en vedhæftning selv på ikke overtrukne plast-ware. Yderligere eksperimenter ved hjælp af kunstige matricer såsom dem tidligere nævnt, kan tillade os at øge den periodeobservation og eksperimenter, og der arbejdes løbende for at bestemme virkningerne af begrænse aggregaterne på en sådan måde. En yderligere begrænsning ved denne teknik er, at for at ændre mediet uden at fjerne aggregaterne, skal et lille volumen af mediet tilbage i bunden af brønden. Konsekvenserne for kemiske genetik metoder er behovet for at overveje denne fortynding og eventuelle eftervirkninger fra tidligere medier: på dagen for de 3 uM Chi puls, er 2,37 uM løsning faktisk leveres, og de efterfølgende mellemstore ændringer resulterer i en fremførsel af 0,499 uM (72-96 timer) og 0,105 pM (96-120 time) mellem tidspunkter. Nuværende arbejde har ikke korrigeret for fortynding og det antages, at de daglige mellemstore ændringer vil minimere eftervirkninger.
Der er en række kritiske trin i protokollen for at sikre både inden for og mellem eksperimentelle reproducerbarhed. For det første skal den start kultur mESCs være godt vedligeholdt og ikke over confluent og medium bør altid være god kvalitet ie., frisk og blandet godt (figur 5A, B). Dårlige dyrkningsbetingelser negativ indvirkning sammenlægning (Figur 5Bi). Præcis tælling af celler for at opnå en ~ 400 celler / 40 pi cellesuspension er afgørende, som større aggregater undlader at selv-organisere og er mere tilbøjelige til at danne dobbelte aggregater inden for hver brønd (figur 5Bii) mens mindre aggregater ikke er i stand til at nå den korrekte tæthed, hvor de er i stand til at reagere på stimulus (Figur 5Biii). Et vigtigt optimering skridt var indføjelsen af en anden PBS vask, der fjerner forurenende serum fra cellesuspensionen (Trin 2.6); dette forbedrede sammenlægning frekvens og fremskyndet udviklingen af aggregaterne med ca. 24 timer. Dernæst sikrer udskiftning af medium anvendes med tilstrækkelig kraft for at løsne eventuelle aggregater, der har potentiale til at klæbe til overfladen af brønden; undladelse results i aggregaterne 'nedbrud' (Figur 5Biv). Desuden og som tidligere nævnt (og nedenfor), er det vigtigt at sikre, at aggregaterne holdes i suspensionskultur og forhindres i at klæbe til en overflade. Når aggregaterne har levet, er mønsteret af genekspression og deres forlængelse potentiale afbrudt.
Da denne teknik er forholdsvis ligetil, og godt inden for rammerne af individer med gode cellekultur teknikker, kan de fleste af de problemer, der er forbundet med aggregering løses relativt hurtigt, hvis der følges disse kritiske trin; en fuld oversigt af fejlfinding er tilgængelig (tabel 1). Når beherskes, kan denne teknik anvendes til at studere aksiale udvikling, symmetribrud og celle-beslutning begivenheder. Mere specifikt disse aggregater har potentiale til at generere puljer af celler, der hidtil har været utilgængelig i kultur, såsom rygmarven og motoR neuroner.
Etisk Bemærk: Det skal bemærkes, med behørig forsigtighed, at oversættelsen af denne protokol til humane ES eller iPS cellekultur kunne bringe forsøgslederen tæt på retsgrundlaget for fjorten dage grænse for forskning i menneskelige embryoner, nemlig dannelsen af et primitivstriberne, som beskrevet i human fertilisering og embryologi Act 2008 (UK) 42. Da loven omfatter alle levende menneskelige embryoner uanset deres måde af skabelsen, vil dyrkning af humane gastruloids ud over den primitive-streak gerne scenen være uden for licensløsning forskning.
Acknowledgments
Dette arbejde er finansieret af et ERC Advanced Investigator Award til AMA (DAT, TB) med et bidrag på et projekt Grant fra Wellcome Trust til AMA, en EPSRC studentship til PB-J og Erasmus, Stichting dr. Hendrik Mullers Vaderlandsch Fonds og Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage til SCvdB. Vi vil gerne takke J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, og T. Rodriguez, for diskussioner og konstruktive kritik, Joaquin de Navascués for montering medium protokol og både AK Hadjantonakis og C. Budjan for at dele deres laboratoriets protokoller vedrørende farvning af hel-mount embryoner. En tidligere version af denne artikel er tidligere gjort tilgængelig på bioRxiv Preprint Server 29.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
| 25 cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
| Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
| BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
| Centrifuge tubes (15 or 50 ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
| CHIR 99021 (Chi) | CSCR | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO | |
| Dissection Well (30 mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
| ESLIF | 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units). | ||
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
| Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
| Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. | |
| n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
| N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
| Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
| Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
References
- Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 233-262 (2004).
- Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).
- ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
- Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood. Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).
- Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate. Cell. 160, 1-16 (2015).
- Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation. J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Koehler, K. R., Hashino, E. 3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids. Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).
- Lancaster, M. A., Renner, M., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis. Genesis. 47 (2), New York, N.Y. 93-106 (2000).
- Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
- Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation. J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).
- Horstadius, S. The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods. Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).
- Holtfreter, J. Die totale Exogastrulation, eine Selbstablösung des Ektoderms vom Entomesoderm. Wilhelm Roux'Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).
- van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Eiraku, M., Watanabe, K., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Turner, D. A., Hayward, P., et al. Wnt/β-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Faunes, F., Hayward, P., et al. A membrane-associated β-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells. Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).
- Kalmar, T., Lim, C., et al. Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells. PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).
- Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Rué, P., Martinez Arias,, A, An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells. Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).
- Turner, D. A., Rué, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias,, A, Brachyury cooperates with Wnt/β-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells. BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).
- Ying, Q. -L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Ying, Q. -L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
- Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. Molecular Embryology of the Mouse. , CSHL. 1-90 (2011).
- Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias,, A, Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro. bioRxiv. , (2014).
- Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation. Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).
- Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo. Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).
- Inman, G. J., Nicolás, F. J., et al. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).
- Hao, J., Daleo, M. A., et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).
- Neely, M. D., Litt, M. J., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. 12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal. Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).
- Chambers, I., Silva, J., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
- Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice. Genesis. 44 (4), New York, N.Y. 202-218 (2006).
- Serup, P., Gustavsen, C., et al. Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice. Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).
- Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).
- Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II. , The Stationery Office. (2008).
