Abstract
We hebben een protocol ontwikkeld verbetering van de huidige embryoiden Body (EB) cultuur die de studie van zelf-organisatie toelaat, symmetriebreking, axiale rek en lot van de cel specificatie met aggregaten van de muis embryonale stamcellen (mESCs) in suspensie cultuur. Kleine aantallen mESCs worden samengevoegd basismedium voor 48 uur in niet-weefselkweek behandeld, U-bodem 96-putjes platen, waarna ze competent te reageren op experimentele signalen. Na de behandeling, deze aggregaten beginnen tekenen van gepolariseerd genexpressie tonen en geleidelijk veranderen hun morfologie van een sferische celmassa tot een langwerpige, goed georganiseerde structuur in de afwezigheid van externe signalen asymmetrie. Deze structuren zijn niet alleen in staat om merkers van de drie kiembladen weergegeven, maar actief weergegeven gastrulatie-achtige bewegingen, blijkt uit een directionele losraken van individuele cellen uit het aggregaat, die cruciaal optreedt bij één gebied van de langwerpige structuur. Dit protocol geeft een gedetailleerde methode voor de reproduceerbare vorming van deze aggregaten, hun stimulatie met signalen zoals Wnt / β-catenine activering en BMP inhibitie en hun analyse door enkele keer-point of time-lapse fluorescentie microscopie. Daarnaast beschrijven we aanpassingen aan de huidige whole-mount muizenembryo kleuring procedures voor immunocytochemische analyse van specifieke markers in vaste aggregaten. De veranderingen in morfologie, genexpressie en lengte van de aggregaten kan kwantitatief worden gemeten, die informatie over signalen axiale lot kan veranderen. Verwacht wordt dat dit systeem kan worden toegepast zowel op de studie van de vroege ontwikkelingsgebeurtenissen zoals axiale afwikkeling en organisatie, en meer in het algemeen de processen van zelforganisatie en cellulaire besluitvorming. Ook kan een geschikte niche voor het genereren van celtypen die in het embryo dat onverkrijgbaar conventionele hechtende cultuur zoals ruggenmerg en motorische neuronen.
Introduction
De studie en het begrip van de cel-beslissingen over het lot in de vroege ontwikkeling van zoogdieren kunnen gebruik maken van de culturen van embryonale stamcellen (SER), klonale populaties afkomstig van blastocysten die de mogelijkheid om zichzelf te vernieuwen en te differentiëren in alle soorten cellen van een organisme hebben te maken dwz., ze zijn pluripotent 1,2. Hoewel deze culturen zijn en blijven bruikbaar voor het begrijpen van de moleculaire basis van cel beslissingen over het lot zijn, zij kan sommige van de ruimtelijke schikking en globale gedragingen die worden gegenereerd in embryo tijdens gastrulatie reproduceren. In het embryo, het proces van gastrulatie transformeert een epitheellaag in drie afzonderlijke kiemlagen en verleent het embryo een openlijke achterwaartse organisatie 3-5. Pogingen om deze gebeurtenissen ex vivo herhalen zijn gebaseerd op het genereren van driedimensionale aggregaten van SER, genoemd embryoid organen (EBS), en het onderwerpen van hen to differentiatie omstandigheden 6,7. Deze aggregaten kunnen worden overgehaald om te differentiëren in verschillende celtypes, waarvan sommige hetzij niet kunnen worden verkregen of geïnduceerd met lage efficiëntie in hechtende kweek of helemaal niet worden geproduceerd, bijv. Bloed en 8 primordiale kiemcellen 9. Een beperking bij het gebruik van EBS is echter dat ze niet in staat zijn de morfogenetische gedrag kiemlaag distributie of axiale organisatie die belangrijke kenmerken van de ontwikkelende embryo, wat resulteert in ruimtelijke desorganisatie 6,10 zijn weergegeven. In een rapport, behandeling van EBS met Wnt leidt tot een zwakke polarisatie in genexpressie in een aantal aggregaten, maar geen duidelijke morfogenese wordt waargenomen 7. In recentere rapporten EBS die zijn gekweekt gedurende langere tijd ontwikkelen anterieure structuren zoals retina, cortex en binnenoor sensorische cellen, waardoor hun embryonale tegenhangers nabootsen, maar ontwikkelen zonder de context van een axiale organization 11-13.
Een rapport van Marikawa et al. 14, terwijl het werken met aggregaten van de muis P19 Embryo carcinoom (EC) cellen gevormd door de opknoping neerzetten, meldde de opkomst van de langwerpige structuren van mesodermale oorsprong die doet denken aan de verlengingen die worden waargenomen met exogastrulae in amfibie en zee-egels embryo's en Keller Explantaten 15-18. Aangezien dit niet was waargenomen met muis embryonale stamcellen (mESCs), hebben we geprobeerd om het gedrag waargenomen met P19 EG-cellen met behulp van aggregaten van mESCs 19 reproduceren en we melden kweekomstandigheden die leiden tot hun symmetriebreking en axiale verlenging. Een belangrijk verschil met het werken met P19 cellen is dat de samenvoeging protocol hier beschreven wordt uitgevoerd in een 96-wells plaat, gelijk aan die beschreven door Eiraku et al. 20 in plaats van opknoping druppels. Deze verandering leidde tot een verhoogde efficiëntie in termen van totale terugwinning en in beideintra- en inter-experimentele reproduceerbaarheid. Belangrijk handhaven aggregaten in afzonderlijke putjes zodat fusie tussen aggregaten (normaal bij poolen aggregaten opknoping druppels) niet voorkomt. Daarnaast is een belangrijk kenmerk van het protocol is 24 uur blootstelling aan de GSK3 remmer CHI99021 (chi), een potente activator van Wnt / β-catenine signalering, na aggregatie.
De hier beschreven methode vormt de basis voor het begrijpen van de processen van zelforganisatie, axiale organisatie en kiemlaag specificatie cultuur, waardoor gevolgtrekkingen worden gemaakt over axiale afwikkeling in vivo 19,21. Daarom heeft de werkwijze het mogelijk om gedetailleerde mechanistische onderzoek van de processen die moeilijk te bestuderen in het embryo kan toestaan. Ook een mogelijke toepassing bij het genereren van weefsels en organen die niet gemakkelijk verkrijgbaar in hechtende kweek door het ontbreken van een gestructureerde cellulaire niche zoalsruggenmerg precursors 21 en motorische neuronen. Driedimensionale aggregaat cultuur heeft een fysieke structuur en signalering omgeving die niet haalbaar met gebruikelijke middelen kan leiden tot een nieuwe benadering voor de afleiding van embryonale lineages in een ruimtelijk georganiseerde wijze.
Protocol
1. Cultuur Voorwaarden Voorafgaand aan Aggregation
- Handhaven mESCs in ESLIF medium (zie Tabel van specifieke materialen en materiaal voor de formulering) op gelatine gecoate 25 cm 2-weefselkweek behandeld kolven in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO 21-25 februari.
- Groeien cellen voor ten minste twee passages plaatsen ontdooien voor gebruik in dit protocol; cellen bij lagere passages over het algemeen meer succes bij het genereren reproduceerbare karakteristieken gehele experimentele replicaten (bijv. niet meer dan 15 passages in kweek), hoe gering variatie tussen verschillende ES cellijnen worden verwacht (zie Tabel 2 voor de geteste cellijnen ).
- Groeien cellen 40-60% confluentie. Gebruik geen over-samenvloeiende cellen voor aggregatie.
2. Generatie van Aggregaten
- Pre-warm PBS (+ Ca 2+ + Mg 2+), ESLIF, N2B27 26,27
- Aspireren kweekmedium van de weefselkweekfles (stap 1.3). Spoel de kolf voorzichtig met 5 ml PBS, twee keer. Zuig het PBS en voeg 1 tot 2 ml voorverwarmde trypsine-EDTA (0,25%) om de cellen te scheiden.
- Plaats de kolf in de incubator gedurende <5 min of totdat cellen volledig los van het oppervlak van de kolf. Pipet op en neer met een pipet 1 ml tot eencellige suspensie voor nauwkeurige telling en uniforme aggregaatgrootte vorming genereren.
- Neutraliseren trypsine met 5-10 ml ESLIF; spoelen van de groei oppervlak naar cel herstel te maximaliseren en over te dragen aan een 50 ml centrifugebuis. Verwijder een 1 ml aliquot van de centrifugebuis en tel de cellen met een hemocytometer.
- Bepaal de hoeveelheid suspensie nodig is om 10 cellen bevatten / ul (geheel 96-well plaat vereist 5x10 4 cellen in een 5 ml suspensie). Tellen cellen nauwkeurig, zo groot Deviationen uit het genoemde aantal cellen kan nadelig zijn voor de respons van de aggregaten stimuli.
- Voeg 5x10 4 cellen 5 ml voorverwarmde PBS in een verse 50 ml centrifugebuis en draaien op ~ 170 g gedurende 5 min.
- Zuig het PBS zorgvuldig en voeg 5 ml voorverwarmde PBS voorzichtig; hebben de pellet niet storen bij de bodem van de buis. Centrifugeer bij ~ 170 g gedurende 5 min.
- Aspireren PBS zorgvuldig voor een tweede keer. Verwijder zoveel PBS mogelijk zonder de pellet PBS overdracht nadelig kan beïnvloeden aggregatie. Resuspendeer de pellet in 1 ml eerste warme N2B27 met een P1000 pipet om een homogene celsuspensie gegenereerd, gevolgd door verdere toevoeging van N2B27 het gewenste volume (bijv voeg 4 ml voor een 5x10 4 cellen / 5 ml suspensie).
- Breng de celsuspensie een steriel reservoir en Pipetteer 40 ul druppel in de bodem van elk putje van een niet-weefselkweek behandeld, 'U' bodem 96-well plaat met behulp van een multichannel pipet. Bedek de 96-well plaat met bijbehorende deksel en bevestigt de aanwezigheid van cellen met een omgekeerde bench-top microscoop (Figuur 1B).
Opmerking: Het is essentieel dat deze platen worden gebruikt om de mogelijkheid van cellen hechten beperken. Niet jas de bodem van de 96-well plaat met gelatine, fibronectine of andere coating die celadhesie bevordert. - Incubeer de cellen gedurende 48 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende aggregatie.
3. Het toepassen van Stimuli en wijzigen Medium
- Na de 48 uur incubatieperiode op het uiterlijk van de mESCs binnen elk putje van de 96-putjesplaat succesvolle aggregatie (figuur 1E) bevestigen. Opmerking: Aggregaten zal sferische in de natuur en ongeveer 150-200 micrometer in diameter verschijnen. Raadpleeg het gedeelte Problemen oplossen als er problemen ontstaan (tabel 1).
- 0; Voeg 150 ul vers secundaire medium (3 uM Chi99021 (Chi) in N2B27 19; voorraad bereid in 10 mM in DMSO) aan elk putje met behulp van een multichannel pipet. Pipet met voldoende kracht om eventuele aggregaten die mogelijk zijn begonnen zich te houden aan de bodem van de putjes te verwijderen. Incubeer aggregaten in secundaire medium voor 24 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 (Figuur 1A).
Opmerking: Reproduceerbare langwerpig en gepolariseerde aggregaten worden gegenereerd met behulp van deze secundaire medium. Andere secundaire medium samenstellingen kunnen ook worden gebruikt afhankelijk van de vereiste en voorbeelden worden getoond in Figuur 3 experimentele omstandigheden. - Voor latere veranderingen van medium, gebruik een multichannel pipet schuin gehouden (ongeveer 30 °) om voorzichtig te verwijderen 150 ul van het secundaire medium vanaf de zijde van elk putje. Dan, pipet 150 ul vers N2B27 in elk putje met genoeg kracht om elke aggregaten die start kunnen hebben verjagened te houden aan de bodem van de putjes.
- Herhaal punt 3. 3 per 24 uur tot het tijdsverloop voltooid (de typische lengte van een aggregaat cultuur experiment 120 uur).
Opmerking: Zorg ervoor dat aggregaten zijn vrij bewegende volgende medium wijzigingen aan reproduceerbaarheid en consistentie binnen en tussen elke 96-well plaat. Medium moet dagelijks worden gewijzigd na de samenvoeging periode.
4. Voorbereiding van de Aggregaten voor Immunokleuring en analyse door confocale microscopie
- Fixatie en Primary Antibody incubatie
Opmerking: De door AK Hadjantonakis 28 protocol is gemodificeerd voor immunokleuring van mES aggregaten te passen. Voor de typische antilichamen gebruikt in onze studies en hun verdunningen, zie eerder gepubliceerde werk 19,21,24,25,29 en Tabel 3.- Gebruik een meerkanaalspipet schuin gehouden (ongeveer 30 °) om voorzichtig te verwijderen 150 ul medium vanaf de zijkant of elk putje van de 96-well plaat. Tweemaal wassen met 150 ul PBS pipetteren in elk putje. Laat een paar minuten tussen elke wasbeurt om de aggregaten te vestigen.
- Stel een P1000 pipet afzien 200 pl, sluit de overeenkomstige pipetpunt en afgesneden ongeveer 3 mm vanaf het einde van de tip met een paar steriele schaar. Teken een gedeelte van de PBS in elk putje van de 96-well plaat een korte weg naar de tip en verdrijven de geaggregeerde roeren.
- Gebruik dezelfde tip voor het opstellen van het gehele volume in de put met inbegrip van de geaggregeerde en pipet in een klein (30 mm diameter) glas Drosophila dissectie goed. Breng de aggregaten van de 96-well plaat die identiek immunokleuring regimes zal ondergaan in hetzelfde glas dissectie vormt.
Opmerking: Gebruik een nieuwe snit pipettip bij het overbrengen van aggregaten van verschillende experimentele condities om overdracht van aggregaten te voorkomen. - Plaats het glas goed dat de aggregat bevates op een dissectie microscoop. Wervel het glas goed op de aggregaten van het centrum en zuig PBS kracht van de ene kant van de put met een glazen Pasteur pipet. Gebruik de microscoop om ervoor te zorgen de aggregaten niet worden opgezogen. Laat een klein volume van PBS in het glas goed op de aggregaten te dekken om te voorkomen dat ze uitdrogen.
- Voeg 1 ml vers bereide formaldehyde (4%) opgelost in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij 4 ° C op een schudapparaat ingesteld op een lage snelheid. Let op: Paraformaldehyde bekend allergeen, kankerverwekkend en giftig. Draag geschikte bescherming tijdens het hanteren.
- Na fixatie, zuigen de formaldehyde oplossing op dezelfde wijze als beschreven in hoofdstuk 4. 1. 4 en was de aggregaten met 1 ml PBS driemaal 10 min met voor elke wasbeurt, op een schudapparaat ingesteld op een lage snelheid.
- Zuig het PBS zoals beschreven in hoofdstuk 4. 1. 4 en voer nog eens drie, 10 min wassingen met PBS dat 10% foetaal runderserum en 0,2% Triton X-100 (PBSFT). Voer de 10 min wassingen op een schudapparaat ingesteld op een lage snelheid.
Opmerking: Het gebruik van foetaal runderserum (FBS) resulteert in een duidelijke wasbuffer, waardoor het aantal aggregaten die anders verloren gaan tijdens het protocol als melk gebruikt. Het is belangrijk op te merken dat na fixatie, immunohistochemische procedures kunnen worden uitgevoerd in andere dan de hieronder verschillende wijzen en moeten worden bepaald en geoptimaliseerd door de onderzoeker. - Blokkeer de aggregaten gedurende 1 uur bij 4 ° C in PBSFT op een orbitale rocker ingesteld op een lage snelheid. Het protocol kan worden gepauzeerd op dit punt, en aggregaten geblokkeerd O / N, onder constant roeren op een horizontaal ronddraaiende rocker bij 4 ° C.
- Zuig het PBSFT zoals eerder beschreven (zie hoofdstuk 4. 1. 4) en incubeer de aggregaten met 500 ul van de vereiste primaire antilichaam verdund in PBSFT O / N bij 4 ° C op een schudapparaat ingesteld op lage snelheid. Bedek met paraffine film om verdamping te voorkomen.
- Secundair antilichaam incubatie
- Zuig het primaire antilichaam oplossing en was met 1 ml PBSFT (bij 4 ° C) als volgt: tweemaal gedurende 5 min; driemaal gedurende 15 min; en 4-7 maal gedurende 1 uur. Voer elke wasstap bij 4 ° C en op een orbitale rocker ingesteld op lage snelheid. Opmerking: Chill wasmedium vóór gebruik. Laat de wasbeurten niet uitvoeren op het ijs, omdat dit de aggregaten kan veroorzaken fragment.
- Zuig het uiteindelijke wasmedium en incubeer de aggregaten met de vereiste secundaire antilichaam in 500 ul PBSFT O / N bij 4 ° C in het donker op een horizontaal ronddraaiende rocker. Voeg nucleaire kleuring zoals Hoechst indien nodig.
- Montage en beeldvorming door confocale microkopie
- Was de aggregaten, zoals beschreven in hoofdstuk 4. 1. 4 bij 4 ° C PBSFT. Na de laatste wasbeurt, spoel de aggregaten met 1 ml PBS met 0,2% FBS en Triton X-100 (PBT) als volgt: tweemaal gedurende 5 min; driemaal gedurende 15 min. Voeren wastbij kamertemperatuur op een orbitale rocker beschermd tegen licht.
- Zuig het medium zoals eerder beschreven (hoofdstuk 4. 1. 4) en incubeer 30 minuten in het donker met een 1: 1 oplossing van glycerol: PBT (1 ml) gevolgd door een tweede 30 min incuberen met een 7: 3 oplossing van glycerol: PBT (1 ml).
Opmerking: Meng de glycerol en PBT oplossingen bij 4 ° C met een rotator. - Zuig het laatste glycerol: PBT-oplossing en te vervangen door 1 ml montage medium 24. Het protocol kan worden gepauzeerd op dit punt vóór montage (indien onderbroken, sluit de putjes paraffine film en bewaar de kleuring putjes bij 4 ° C).
- Monteer de aggregaten op microscoopglaasjes door pipetteren ze in 17 pl druppels met een cut P20 tip (figuur 2). Voudige dubbelzijdige tape op zichzelf terug vier keer naar spacers te genereren en te hechten aan elk uiteinde van de glijbaan. Plaats de bovenste dekglaasje (22 mm x 60 mm) op deze spacers (figuur 2).
Let op: het is essentieel dat een cut tipgebruikt in dit stadium om te voorkomen dat de monsters beschadigen. De afstandhouders voorkomen dat het dekglaasje pletten van de aggregaten. - Zodra de aggregaten worden gemonteerd, imago van de monsters met behulp van confocale microscopie met behulp van protocollen eerder beschreven 19,21,24,25. Eenmaal geplaatst op de microscoop, laat de dia ongestoord op het podium voor een paar minuten om de aggregaten te vestigen binnen de montage medium.
Representative Results
Verschijning van cellen onmiddellijk na Plating en After Aggregation
Onmiddellijk na plateren, kan men de aanwezigheid van enkele cellen te observeren in elk putje van de 96-wells plaat met een standaard omgekeerde weefselkweek microscoop (Figuur 1B). Binnen 8 uur plateren, zullen deze cellen begonnen te dalen naar de bodem van de put als gevolg van de zwaartekracht en zal beginnen te versmelten in afzonderlijke clusters (figuur 1C). Na 24 uur wordt het samenvoegen cellen de primaire aggregatie voltooid en zal samengeperst in goed gedefinieerde, maar rafelige aggregaten waarbij individuele cellen niet verschillend van elkaar (figuur 1D). Tegen het einde van de tweede dag (48 uur), aggregaten moeten 'schone' kijken, alle cellen hebben genomen binnen de put (figuur 1E); de bodem van de put mogelijk een aantal cellen die zijn afgeworpen van het aggregaat in dit stadium. Het verstrekken vande aggregaten zijn samengevoegd in N2B27, op dit tijdpunt, moeten ze bolvormig zijn ongeveer 150-200 urn in diameter en vrijelijk bewegen binnen de bron (bijv., niet gehecht aan de bodem van de putjes). Aggregatie in andere media (bijv., ESLIF of N2B27 een bepaalde parameter) mogelijk om de initiële totale morfologie en de reactie op stimuli volgende wijziging (Turner et al., In voorbereiding).
Representatieve morfologische veranderingen
Toevoeging van een 24 uur puls van secundaire medium dat Chi tussen 48 en 72 uur (Figuur 1A, 5A) genereert goed gedefinieerde langwerpige aggregaten die gepolariseerde expressie in specifieke markers van de kiem lagen 19,21 tonen. Direct na de puls Chi (72 uur), wordt de aggregaten beginnen cellen werpen en beginnen hun reactie op deze signalen aan het einde van de dag (figuur 3A) tonen. Deze reactiesmanifesteren door veranderingen in genexpressie en morfologie, die beide zijn afhankelijk van de behandeling die de aggregaten hebben ontvangen na de initiële 48 uur periode omvat in N2B27 (figuur 3B). Als alleen een eindpunt analyse vereist, de optimale tijd om de afbeelding van de aggregaten is ongeveer 96-120 uur. Op dit punt de aggregaten duidelijk morfologie en genexpressie-patronen (figuur 3A) zal hebben ontwikkeld, en hun grootte en massa zijn nog steeds laag genoeg zodat het uitwerpen van het medium uit P200 pipet is voldoende om iemand die kan zijn aangesloten los. Gebrek aan bevestiging van het aggregaat te voorkomen dat het goed zal een negatieve invloed hebben op de totale formatie (Figuur 5Biv). De morfologieën en genexpressiepatroon van de aggregaten kan worden gewijzigd afhankelijk van de behandeling. Representatieve resultaten voor een duurzame of gepulseerde regimes met ofwel enkele behandeling of combinaties van factoren worden getoond voor BMP4, Dorsomorphin H1 (BMP receptor remmer), ActivinA, SB43 (Activine / Nodal remmer), bFGF of PD03 (MEK-inhibitor) (Figuur 3B).
Aggregate imaging en kwantitatieve beeldanalyse
Aggregaten zijn vatbaar voor beeldvorming door een groothoek microscopie (hoofdzakelijk met time-lapse imaging 19) of gefixeerd en immunologisch gekleurd voor confocale beeldvorming 19,21 (figuur 2). Het huidige protocol en imaging bovenstaande beschrijving maakt kwantitatieve informatie worden verkregen uit deze aggregaten. Na confocale of wide-field beeldopname, de lengte en de corresponderende genexpressie langs de diameter of rug van het aggregaat (bolvormige of langwerpige respectievelijk Figuur 4A, B) kan worden gemeten. Deze analyses zijn ook direct van toepassing op time-lapse beelden, waarbij een informatie van de groeisnelheid, grootte en verlenging van de aggregaten onder verschillende voorwaarden verkrijgen (Figuur 4
Figuur 1. Typische tijdsverloop en vroege morfologie. (A) De typische tijd-cursus voor aggregatie-experimenten. De cellen worden samengevoegd voor 48 uur in N2B27 met een suspensie van muizen ES cellen (10 cellen / ul) in een 96-well plaat (p1, p2). (B) Onmiddellijk na uitplaten (t = ~ 5min) kunnen individuele cellen gezien in de suspensie en beginnen klonten met 8h (C). (D) te vormen na 24 uur de cellen een aggregaat in elke well die ongeveer 100 micrometer in diameter gevormd. (E) na 48 uur aggregatie, het aggregaat diameter varieert 150-200 urn. Op dit moment, de aggregatie medium (N2B27) is verwijderd en een secundaire medium wordt toegevoegd hetzij voor de rest van het experiment (p1 deel A) of gedurende 24 uur alvorens te worden gewijzigd back aan N2B27 (p2 deel A). Schaal balk vertegenwoordigt 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Bevestiging aggregaten op microscoopglaasjes. Nadat de aggregaten zijn vastgesteld immunostained en in montage medium wordt elk aggregaat gepipetteerd op een microscoopglaasje als 17 ul druppel (A, B, B '). Genoeg ruimte wordt gelaten tussen de totale druppeltjes om hun fusie te voorkomen. Afstandhouders worden gemaakt met dubbelzijdig plakband en geplaatst op elke hoek van het microscoopglaasje (A, A ', B). Het is op deze die een glas dekglaasje wordt geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Het effect van verschillende behandelingen op de morfologie van geaggregeerde ES-cellen. Na 2 dagen in N2B27 zijn ES-cellen aggregaten gevormd. Toevoeging van specifieke factoren hetzij als 1 dag impuls (A) of continu (B) kan het fenotype van de aggregaten te veranderen ten opzichte van de polariteit van genexpressie, rek potentiële of hun algemene vorm. De voorbeelden in deze figuur zijn aggregaten gevormd van ofwel Bra :: GFP 30 (A) of SOX1 :: GFP 27 (B) muizen ES cellen afgebeeld na 120 uur en behandeld zoals aangegeven. Chi: CHIR 99.021 31; SB43: SB 431.542 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03. PD0325901 Klik hier om een grotere versie van th bekijkenis figuur.
Figuur 4. Kwantitatieve analyse van aggregaten. Een typische aggregaat gevormd uit Bra :: GFP mESCs 25,30 na een 24 uur puls van Chi en afgebeeld op 120 uur. Samengevoegde afbeelding van de heldere-veld en GFP-kanaal wordt getoond met gesegmenteerde lijn markering van de 'ruggengraat' van het aggregaat van punt A naar B (A), waarlangs de fluorescentie en de lengte van het aggregaat kan worden gemeten (B). De lengte (C) en "rondheid" (D) van 24 aggregaten in hetzelfde experiment worden getoond. Vorm omschrijvingen zoals de rondheid (D), circulariteit, omtrek en oppervlakte kan worden gemeten met behulp van het Image Analysis Cookbook plugin van de beeldanalyse software FIJI 35. Bedoel aangegeven door horizontale lijn op elk tijdstip-point;foutbalken geven standaarddeviatie; schaalbalk in (A) geeft 200 micrometer. Aangezien er subtiele verschillen tussen reporter cellijnen, wordt verwacht dat na een puls van Chi, de gemiddelde maximale lengte en gemiddelde minimale ronding van de aggregaten variëren. Tussen de verschillende cellijnen, vinden we dat de gemiddelde maximale lengte kan worden binnen het bereik van ~ 400-800 micrometer en de gemiddelde minimale rondheid tussen 0,4 en 0,6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Voorbeelden van storingen in de totale formatie. De mogelijkheid om reproduceerbare aggregaten (A) te genereren is afhankelijk van kritische factoren zoals (Bi), vers en goed gemengde secundaire medium, (Bii, Biii) de nauwkeurigheid bij het tellen van de eerste nomber van cellen en (Biv) het waarborgen van de aggregaten vormen geen aanhangend kolonies dwz., 'crash' in het oppervlak van de put. Typische voorbeelden van de fouten in aggregaatvorming voor elk van genoemde condities (B) getoond. Schaal-bar, zoals aangegeven; zie trouble-shooting tabel voor meer informatie (tabel 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. Gids voor het oplossen van problemen. Typische fouten in verband met de samenvoeging protocol worden gegeven met suggesties om hun resolutie.
Tabel 2. Tabel van cellijnen voor de vorming van aggRegates. Een aantal cellijnen 19,22,27,30,36-40 zijn gekarakteriseerd voor de vorming van aggregaten en hoewel subtiele verschillen tussen cellijnen worden verwacht en waargenomen, al deze lijnen tonen soortgelijke dynamiek in termen rek en morfologie. In termen van genexpressie, het expressiepatroon is specifiek voor het gen tot expressie, maar binnen elke cellijn, het expressiepatroon in het algemeen constant over een aantal passages. Consistentie, genereren we aggregaten van cellen die niet meer dan 15 passages in cultuur.
Tabel 3. Overzicht van representatieve antilichamen die in deze studies. Een selectie van de antilichamen en de verdunningsfactoren voor aggregaat immunokleuring.
Discussion
De in dit manuscript beschreven techniek efficiënt en reproduceerbaar genereert aggregaten van muis embryonale stamcellen (mESCs) die de weergave georganiseerde symmetrie breken en rek 19, die zowel de hangende druppel kweek beschreven door Marikawa et al. 14 en EB vorming. Deze aggregaten gaan axiale rek ontwikkelen aanvulling op de bestaande werkwijzen voor het genereren van anterior organen van ES cellen zoals optische koppen 11 en de cerebrale cortex 13 en bevatten cellen met identiteit van de drie kiembladen welk scherm werkwijzen vergelijkbaar met die tijdens gastrulatie zoals snelle cel beweging 19,21.
Het is interessant om te speculeren over de aard van de symmetrie-verbreking event, omdat het voorkomt in de afwezigheid van externe patroonvorming weefsels en zygote asymmetrie keuen 19. De spontane vorming van een rudimentaire as kan ontstaan uit reeds bestaande heterogeneities in de basis van cellen, die de basis voor de ontwikkeling van asymmetrie vormen. Inderdaad populaties van cellen gekweekt in ESLIF statusindicatie een mengsel van zelf-vernieuwing en differentiërende cellen kunnen de relatieve verhoudingen van die per aggregaat naar de andere. Bovendien voorbereidend werk in ons laboratorium blijkt dat aggregaten van een volledige populatie van pluripotente cellen vertonen een vertraagde ontwikkeling en afwijkingen in patronen, suggereert een rol voor heterogeniteit in georganiseerde patroonvorming (DA Turner & A. Martinez Arias, in voorbereiding). Ook bedenken dat een reactie-diffusie mechanisme patroon kan genereren met diffusie van een remmer van het oppervlak van het aggregaat. Warmflash et al. 41 blijkt dat een dergelijk mechanisme verantwoordelijk voor de ontwikkeling radiale asymmetrie in hechtende kweek, waardoor het een mogelijke kandidaat voor patronen driedimensionaal zijn.
Tijdens de Initial 48 uur periode omvat, cellen bereikt een toestand vergelijkbaar met die in de postimplantatie epiblast, waarin ze competent te reageren op signalen uit de secundaire medium 19,21,24 zijn. Kenmerkend de hier beschreven protocol cellen met een puls van secundaire medium welke factoren (zoals Wnt / β-catenine agonisten) die de signalen voldoende rek bieden bevat. Vorige kweekmethoden beschreven door Lancaster et al. (Waarbij menselijke SER 13) en Eiraku et al. (Met mESCs 11) die een korte aggregatie in lage wrijvingscoëfficiënt 96-well platen voor geaggregeerde cellen werden overgebracht naar Matrigel druppeltjes voor on gaat cultuur. Hoewel de tijd tussen aggregatie en Matrigel insertie verschilde tussen de onderzoeken, in beide gevallen grote aantallen cellen werden gebruikt voor aggregaatvorming (ongeveer 3,000-4,500 cellen). Daarentegen het protocol hier beschreven 19 gebruikt veel minder cellen (ongeveer 400 cellenper aggregaat) dat is vastgesteld absoluut essentieel voor het proces van rek, symmetrie breken en de polarisatie die wordt waargenomen 19 worden. Bovendien, deze langwerpige structuren kunnen worden opgewekt in een veel kortere tijdsperiode zonder inbedding in kunstmatige matrices: vergelijk het genereren van gedefinieerde hersengebieden door Lancaster et al (> 20-30 dagen) 13 en de optische cups uit Eiraku. et al. (~ 11 dagen) 11 met de 5 dagen nodig voor het genereren van gepolariseerde langwerpige structuren.
Een van de beperkingen van de kweekmethode echter hier beschreven, is dat ze alleen kunnen worden gekweekt gedurende ongeveer 5-6 dagen na uitplaten tot hun omvang maakt ze bevoegd onder zwaartekracht naar de bodem van de putten en een adhesiekracht zelfs non beklede plastic-ware. Verdere experimenten met kunstmatige matrices zoals eerder vermeld, kunnen toelaten de periode te vergrotenobservatie en experiment en werkzaamheden aan de gang om de effecten van de beperkende aggregaten zodanig bepalen. Een andere beperking van deze techniek is dat om het medium te wijzigen zonder de aggregaten een klein volume drager dient in de bodem van de put. De gevolgen voor de chemische genetica benaderingen zijn de noodzaak om deze verdunning en eventueel resterende effecten van de vorige media overwegen: op de dag van de 3 uM Chi puls, is 2,37 pM oplossing daadwerkelijk zijn geleverd, en de daaropvolgende medium wijzigingen resulteren in een carry-over van 0,499 urn (72-96 uur) en 0,105 urn (96-120 uur) tussen de tijdstippen. Huidig werk niet gecorrigeerd voor verdunning en er wordt aangenomen dat de dagelijkse mediumveranderingen resteffecten minimaliseren.
Er zijn een aantal kritische stappen in het protocol voor zowel intra- en inter-experimentele reproduceerbaarheid te garanderen. Ten eerste moet de beginnende cultuur van mESCs goed worden onderhouden en niet meer dan confluent, middelgrote en moet altijd van goede kwaliteit ie zijn., fris en goed gemengd (Figuur 5A, B). Slechte kweekomstandigheden negatieve invloed op de aggregatie (figuur 5BI). Nauwkeurige telling van cellen aan een ~ 400 cellen / 40 pi celsuspensie te verkrijgen is essentieel, aangezien grotere aggregaten mogelijk niet automatisch organiseren en vaker dubbele aggregaten in elk putje (figuur 5Bii) terwijl kleinere aggregaten niet in staat de juiste bereiken vormen dichtheid, waar ze in staat zijn om te reageren op de stimulus (figuur 5Biii). Een belangrijke optimalisatie stap was het opnemen van een tweede PBS-wassing dat contaminant serum verwijdert uit de celsuspensie (stap 2,6); Dit verbeterde de aggregatie frequentie en versnelde ontwikkeling van de aggregaten met ongeveer 24 uur. Vervolgens zorgen ervoor mediumveranderingen toegepast met voldoende kracht om eventuele aggregaten die het potentieel heeft om zich aan het oppervlak van de put heeft los; niet zo resu doenlts in de aggregaten 'crashen' (figuur 5Biv). Bovendien, en zoals eerder vermeld (en lager), is het essentieel dat de aggregaten worden gehandhaafd in suspensiekweek en wordt voorkomen hechten op elk oppervlak. Nadat de aggregaten zijn gehecht, het patroon van genexpressie en de rek potentieel worden verstoord.
Omdat deze techniek is relatief eenvoudig, en goed onder de bevoegdheid van personen met een goede weefselkweek technieken, kan het grootste deel van de problemen in verband met de samenvoeging relatief snel als deze kritische stappen worden gevolgd worden opgelost; een volledige lijst van trouble-shooting is beschikbaar (tabel 1). Eenmaal onder de knie, kan deze techniek worden gebruikt om de axiale ontwikkeling, symmetriebreking en cel-beslissing gebeurtenissen te bestuderen. Specifieker, deze aggregaten hebben het potentieel om pools van cellen die tot dusver beschikbaar zijn in kweek, zoals het ruggenmerg en moto genererenr neuronen.
Ethische NB: Opgemerkt dient te worden met de nodige voorzichtigheid dat de vertaling van dit protocol voor de menselijke ES of iPS celcultuur de onderzoeker dicht bij de juridische grondslag van de veertien dagen limiet op het menselijk embryo-onderzoek, namelijk het genereren van een primitieve streep zou kunnen brengen, zoals beschreven in de Menselijke Fertilisatie en Embryologie Act 2008 (UK) 42. Sinds de wet omvat alle levende menselijke embryo's, ongeacht hun manier van de schepping, zou de cultuur van menselijke gastruloids buiten de primitieve streep als stadium buiten de reikwijdte van licentieerbare onderzoek.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door een ERC Advanced Investigator Award aan AMA (DAT, TB) met een bijdrage van een projectsubsidie van de Wellcome Trust AMA, een EPSRC studententijd naar PB-J en Erasmus, Stichting dr. Hendrik Muller's Vaderlandsch Fonds en de Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage te SCvdB. We willen J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, en T. Rodriguez bedanken voor discussies en opbouwende kritiek, Joaquin de Navascués voor de montage medium protocol en beide AK Hadjantonakis en C. Budjan voor het delen van protocollen hun laboratorium betreffende kleuring van hele-mount embryo. Een eerdere versie van dit artikel is eerder beschikbaar gesteld op de bioRxiv Prepress Server 29.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
| 25 cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
| Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
| BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
| Centrifuge tubes (15 or 50 ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
| CHIR 99021 (Chi) | CSCR | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO | |
| Dissection Well (30 mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
| ESLIF | 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units). | ||
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
| Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
| Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. | |
| n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
| N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
| Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
| Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
References
- Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 233-262 (2004).
- Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).
- ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
- Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood. Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).
- Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate. Cell. 160, 1-16 (2015).
- Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation. J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Koehler, K. R., Hashino, E. 3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids. Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).
- Lancaster, M. A., Renner, M., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis. Genesis. 47 (2), New York, N.Y. 93-106 (2000).
- Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
- Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation. J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).
- Horstadius, S. The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods. Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).
- Holtfreter, J. Die totale Exogastrulation, eine Selbstablösung des Ektoderms vom Entomesoderm. Wilhelm Roux'Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).
- van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Eiraku, M., Watanabe, K., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Turner, D. A., Hayward, P., et al. Wnt/β-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Faunes, F., Hayward, P., et al. A membrane-associated β-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells. Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).
- Kalmar, T., Lim, C., et al. Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells. PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).
- Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Rué, P., Martinez Arias,, A, An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells. Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).
- Turner, D. A., Rué, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias,, A, Brachyury cooperates with Wnt/β-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells. BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).
- Ying, Q. -L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Ying, Q. -L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
- Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. Molecular Embryology of the Mouse. , CSHL. 1-90 (2011).
- Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias,, A, Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro. bioRxiv. , (2014).
- Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation. Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).
- Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo. Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).
- Inman, G. J., Nicolás, F. J., et al. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).
- Hao, J., Daleo, M. A., et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).
- Neely, M. D., Litt, M. J., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. 12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal. Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).
- Chambers, I., Silva, J., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
- Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice. Genesis. 44 (4), New York, N.Y. 202-218 (2006).
- Serup, P., Gustavsen, C., et al. Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice. Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).
- Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).
- Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II. , The Stationery Office. (2008).
