Abstract
Wir haben ein Protokoll zu verbessern aktuellen Embryoidkörper (EB) Kultur, die die Untersuchung der Selbstorganisation ermöglicht, Symmetriebrechung, axiale Dehnung und Zellschicksal Spezifikation mit Aggregaten von embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) in Suspensionskultur entwickelt. Eine kleine Anzahl von mESCs in Basalmedium für 48 Stunden in nicht-gewebekulturbehandelten, U-förmigem Boden mit 96 Vertiefungen, wonach sie kompetent zu experimentellen Signale reagieren aggregiert. Nach der Behandlung beginnen diese Aggregate auf Anzeichen von polarisiertem Genexpression zeigen, deren Morphologie von einer sphärischen Masse von Zellen allmählich ändern, um einen langgestreckten, gut organisierte Struktur in Abwesenheit äußerer Asymmetrie Cues. Diese Strukturen sind nicht nur in der Lage, Markierungen der drei Keimblätter anzuzeigen, sondern aktiv angezeigt Gastrulation artigen Bewegungen durch einen Richtungsverlagerung von Einzelzellen aus dem Aggregat, die entscheidend an einem Bereich der länglichen Struktur auftritt belegt. Diese Protocol ein detailliertes Verfahren für die reproduzierbare Bildung dieser Aggregate, deren Stimulation mit Signale wie Wnt / β-Catenin-Aktivierung und BMP-Hemmung und deren Analyse durch einzelne Zeit-Punkt oder Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie. Darüber hinaus beschreiben wir Änderungen an aktuellen ganze-mount Mausembryo Färbeverfahren für das immunzytochemische Analyse von spezifischen Markern innerhalb fester Aggregate. Die Veränderungen in der Morphologie, Genexpression und Länge der Aggregate kann quantitativ gemessen werden und bietet Informationen darüber, wie Signale können axiale Schicksal zu ändern. Es ist vorgesehen, dass dieses System sowohl auf die Untersuchung der frühen Entwicklungsereignisse wie axiale Entwicklung und Gestaltung angewendet werden, und ganz allgemein für die Prozesse der Selbstorganisation und zellulären Entscheidungsfindung. Es kann auch eine geeignete Nische für die Erzeugung von im Embryo, nicht erhältlich aus herkömmlichen adhärenten Kultur vorhanden sind Zelltypen, wie Rückenmark und Motoneuronen.
Introduction
Die Studie und das Verständnis der Zell-Schicksal Entscheidungen in der frühen Entwicklung von Säugetieren können von Kulturen von embryonalen Stammzellen (ESC), klonalen Populationen aus Blastozysten, die die Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung in alle Zelltypen eines Organismus haben ableiten zu machen, dh., sie sind pluripotent 1,2. Während diese Kulturen wurden und werden weiterhin nützlich für das Verständnis der molekularen Basis der Zellschicksal Entscheidungen zu sein, sind sie nicht in der Lage, einige der räumlichen Anordnungen und globale Verhalten, die in Embryonen während der Gastrulation erzeugten reproduzieren. Im Embryo, der Prozess der Gastrulation verwandelt einen einzigen Epithelschicht in die drei verschiedenen Keimblätter und stattet den Embryo mit einem offenkundigen anteroposterior Organisation 3-5. Versuche, diese Ereignisse ex vivo zu rekapitulieren wurden auf die Erzeugung von dreidimensionalen Aggregaten WSR basiert, bezeichnet als Embryoid Bodies (EBS) und Unterziehen to Differenzierungsbedingungen 6,7. Diese Aggregate können entlockt werden in vielen verschiedenen Zelltypen, von denen einige entweder nicht erhalten werden oder nur mit geringer Effizienz in adhärenten Kultur induziert werden können oder überhaupt nicht hergestellt werden, zu unterscheiden;. ZB Blut 8 und Urkeimzellen 9. Eine Einschränkung bei der Verwendung von EVG ist jedoch, dass sie nicht in der Lage, um das morphogenetische Verhalten, Keimverteilung oder axiale Organisation, die wichtigsten Merkmale des sich entwickelnden Embryos, was zu einer räumlichen Desorganisation 6,10 sind anzuzeigen sind. In einem Bericht, Behandlung von EBs mit Wnt führt zu einer schwachen Polarisation in der Genexpression in einigen Aggregaten, aber keine klare Morphogenese beobachtet 7. In neueren Berichten EBs, die für längere Zeiträume kultiviert wurden entwickelt anterioren Strukturen wie Retina, Cortex und Innenohr Sinneszellen, die ihre Gegenstücke embryonalen imitieren aber entwickeln, ohne Zusammenhang mit einer axialen organizatIonen 11-13.
Ein Bericht von Marikawa et al. 14, während der Arbeit mit Aggregaten von Maus P19 Embryo Karzinom (EG) Zellen durch die hängenden Tropfen-Verfahren gebildet, berichtete die Entstehung von länglichen Strukturen mesodermalen Ursprungs erinnert an die Dehnungen, die mit exogastrulae in Amphibien beobachtet werden und Seeigel-Embryonen und Keller Explantaten 15-18. Da dies nicht mit embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) beobachtet wurden, haben wir versucht, die mit P19 EC Zellen unter Verwendung von Aggregaten von mESCs 19 beobachtete Verhalten zu reproduzieren, und wir Kulturbedingungen, die auf ihre Symmetriebrechung und axiale Dehnung führen zu melden. Ein wichtiger Unterschied gegenüber der Arbeit mit P19-Zellen ist, dass die hier beschriebenen Aggregation Protokoll wird in einer 96-Well-Platte, ähnlich dem von Eiraku et al. 20 beschrieben, anstelle von hängenden Tropfen durchgeführt. Diese Änderung führte zu einer Steigerung der Effizienz im Hinblick auf die Gesamtrückgewinnung und in beidenintra- und inter experimentelle Reproduzierbarkeit. Wichtig ist, dass die Aufrechterhaltung Aggregate in einzelne Vertiefungen wird sichergestellt, dass Fusion zwischen Aggregaten (common wenn Bündelung Aggregate von hängenden Tropfen) nicht auftritt. Zusätzlich ist ein wesentliches Merkmal des Protokolls ist es 24 h Exposition gegenüber der GSK3-Inhibitor CHI99021 (Chi), ein potenter Aktivator von Wnt / β-Catenin-Signalisierung folgende Aggregation.
Die hier beschriebene Methode bietet eine Grundlage für das Verständnis der Prozesse der Selbstorganisation, axiale Organisation und Keimblatt-Spezifikation in der Kultur, so dass Rückschlüsse über die axiale Entwicklung in vivo 19,21 erfolgen. Aus diesen Gründen hat das Verfahren das Potential, detaillierte mechanistische Analyse der Prozesse, die nur schwer im Embryo studieren gestatten. Ferner ist eine mögliche Anwendung bei der Erzeugung von Geweben und Organen, die nicht in adhärenten Kultur leicht erhältlich sind, aufgrund des Fehlens eines strukturierten zellulären Nische wieRückenmark Vorstufen 21 und Motoneuronen. Dreidimensionales Aggregat-Kultur bietet eine physikalische Struktur und Signalumgebung, die mit herkömmlichen Mitteln nicht zu erreichen sein können, was zu einem neuen Ansatz für die Gewinnung von embryonalen Linien räumlich organisierte Weise.
Protocol
1. Kulturbedingungen Vor der Aggregation
- Pflegen mESCs in ESLIF Medium (siehe Tabelle spezifischer Materialien und Geräte für die Formulierung) auf mit Gelatine beschichtete 25 cm 2 Gewebekultur-behandelten Flaschen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 21-25 Februar.
- Wachsen Zellen, die für mindestens zwei Durchgänge zu posten Auftauen vor der Verwendung in diesem Protokoll; Zellen bei niedrigeren Durchgänge sind im allgemeinen erfolgreich beim Erzeugen von reproduzierbaren Eigenschaften gesamten Experimentwiederholungen (dh., nicht mehr als 15 Passagen in Kultur), jedoch leichte Abweichungen zwischen verschiedenen ES-Zelllinien zu erwarten ist (siehe Tabelle 2 für die getesteten Zelllinien ).
- Wachsen Zellen 40-60% Konfluenz. Verwenden Sie keine Über konfluenten Zellen zur Aggregation.
2. Erzeugung von Aggregaten
- Pre-warmen PBS (+ Ca 2+, Mg 2+ +), ESLIF, N2B27 26,27
- Aspirat Kulturmedium aus der Gewebekulturflasche (Schritt 1.3). Der Kolben wird vorsichtig mit 5 ml PBS spülen, zweimal. Saugen Sie das PBS und fügen Sie 1 bis 2 ml vorgewärmter Trypsin-EDTA (0,25%), um die Zellen zu trennen.
- Der Kolben wird in den Inkubator für <5 min oder bis die Zellen vollständig von der Oberfläche des Kolbens freistehend. Pipette nach oben und unten mit einer 1 ml Pipette auf Einzelzellsuspension für eine genaue Zählung und einheitlichen Aggregatgröße Bildung zu erzeugen.
- Neutralisieren Trypsin mit 5-10 ml ESLIF; waschen Sie die Wachstumsfläche, um die Erholung der Zellen zu maximieren und in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie ein 1 ml-Aliquot aus dem Zentrifugenröhrchen und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
- Bestimmen das Volumen erforderlich sein, die 10 Zellen / ul Suspension (eine ganze Platte mit 96 Vertiefungen 5x10 4 Zellen in einem 5 ml Suspension benötigt). Zählen von Zellen genau, so groß deviatIonen von der genannten Anzahl von Zellen beeinträchtigen kann die Reaktion der Zuschlagstoffe auf Reize.
- In 5x10 4 Zellen auf 5 ml vorgewärmten PBS in einer frischen 50 ml Zentrifugenröhrchen und Spin bei ~ 170 xg für 5 min.
- Sorgfältig absaugen PBS und 5 ml vorgewärmten PBS vorsichtig; nicht das Pellet zu zerstören am Boden des Röhrchens. Zentrifuge bei ~ 170 g für 5 min.
- Sorgfältig absaugen PBS ein zweites Mal. Entfernen Sie so viel PBS wie möglich, ohne das Pellet wie PBS Übertragung stören können Aggregation beeinträchtigen. Das Pellet zuerst in 1 ml warmem N2B27 mit einer P1000-Pipette, um eine homogene Zellsuspension zu erzeugen, gefolgt von einer weiteren Zugabe von N2B27 auf das erforderliche Volumen (beispielsweise mit 4 ml einer 5x10 4 Zellen / 5 ml Suspension).
- Übertragen der Zellsuspension in einen sterilen Behälter und pipettieren 40 ul Tröpfchen in den Boden jeder Vertiefung einer nichtgewebekulturbehandelte "U'Boden 96-well-Platte unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. Decken Sie die Platte mit 96 Vertiefungen mit dem entsprechenden Deckel und bestätigen das Vorhandensein von Zellen mit einem umgekehrten Tischmikroskop (1B).
Anmerkung: Es ist wichtig, dass diese Platten werden verwendet, um die Möglichkeit von Zellen anhaften zu begrenzen. Nicht Beschichtung der Unterseite der Platte mit 96 Vertiefungen mit Gelatine, Fibronektin oder andere Beschichtung, die die Zelladhäsion fördert. - Die Zellen für 48 Stunden für die Aggregation Inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2.
3. Anwenden von Stimuli und Ändern Medium
- Nach 48 Stunden Inkubationszeit zu beobachten das Aussehen der mESCs in jede Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen, erfolgreiche Aggregation (1E) zu bestätigen. Hinweis: Aggregates wird kugelförmigen in der Natur und etwa 150 bis 200 & mgr; m im Durchmesser angezeigt. Siehe den Abschnitt zur Fehlerbehebung, wenn Probleme auftreten (Tabelle 1).
- 0; Add 150 ul frisches Sekundärmedium (3 uM Chi99021 (Chi) in N2B27 19; Aktien zu 10 mM in DMSO hergestellt) in jede Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette. Pipette mit genügend Kraft, um alle Aggregate, die der Autor kann, um zum Boden der Vertiefungen zu haften zu entfernen. Aggregate in Sekundärmediums einer Inkubationszeit von 24 Stunden in einem befeuchteten Inkubator bei 37ºC und 5% CO 2 (1A).
Hinweis: Reproduzierbare länglichen und polarisierte Aggregate werden mit diesen Sekundärmedium erzeugt wird. Andere Sekundärmedium Zusammensetzungen können auch abhängig von den erforderlichen und Beispiele sind in Abbildung 3 gezeigten experimentellen Bedingungen verwendet werden. - Für die Folgemediums ändert, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette in einem Winkel (ca. 30 °) gehalten wird zur schonenden Entfernung 150 ul des Sekundärmediums von der Seite der jede Vertiefung. Dann Pipette 150 ul frisches N2B27 in jede Vertiefung mit genügend Kraft, um alle Aggregate, die Start haben können lösened, um zum Boden der Vertiefungen zu haften.
- Wiederholen Sie Punkt 3. 3 alle 24 h bis zum Zeitverlauf abgeschlossen ist (die typische Länge eines Aggregats Kultur Experiments beträgt 120 h).
Hinweis: Stellen Sie sicher, Aggregate frei beweglichen folgenden Mediums Änderungen an Reproduzierbarkeit und Konsistenz innerhalb und zwischen den einzelnen 96-Well-Platte zu gewährleisten. Medium muss täglich nach der Globalisierungszeitraum geändert werden.
4. Herstellung von Gesteinskörnungen für Immunfärbung und Analyse durch konfokale Mikroskopie
- Fixierung und Primäre Antikörper-Inkubationszeit
Beachten Sie: Der von der AK Hadjantonakis 28 beschriebenen Protokoll wurde geändert, um Immunfärbung von MESC Aggregate entsprechen. Für den typischen Antikörper in unseren Studien und ihre Verdünnungen verwendet, beziehen sich auf bisher veröffentlichten Arbeiten 19,21,24,25,29 und Tabelle 3.- Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette in einem Winkel gehalten wird (ca. 30 °) zur schonenden Entfernung 150 ul Medium von der Seite of jedes Well der 96-Well-Platte. Zweimal waschen durch Pipettieren von 150 ul PBS in jede Vertiefung. Lassen Sie ein paar Minuten zwischen jeder Wäsche, damit die Aggregate zu begleichen.
- Legen Sie einen P1000 Pipette 200 ul zu verzichten, bringen Sie die entsprechende Pipettenspitze abgeschnitten und etwa 3 mm vom Ende der Spitze mit einem Paar von sterilen Schere. Zeichnen Sie einen Teil des PBS in jede Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen einen kurzen Weg in die Spitze und vertreiben sie, um das Aggregat zu agitieren.
- Verwenden Sie die gleiche Spitze, innerhalb der Brunnen einschließlich der aggregierten und Pipette in einer kleinen (30 mm Durchmesser) Glas Drosophila Dissektion und erarbeiten das gesamte Volumen. Übertragen Sie alle Aggregate von der Platte mit 96 Vertiefungen, die identisch Immunfärbung Regime ins gleiche Glas Dissektion gut unterziehen wird.
Hinweis: Verwenden Sie einen neuen Schnitt Pipettenspitze bei der Übertragung von Zuschlagstoffen aus verschiedenen experimentellen Bedingungen, um Verschleppung von Aggregaten zu verhindern. - Das Glas, das auch die aggregat enthältes auf eine Dissektionsmikroskop. Schwenken Sie das Glas gut, um die Aggregate zum Zentrum und absaugen PBS von einer Seite des Bohrlochs mit einer Glaspasteurpipette zu erzwingen. Verwenden Sie das Mikroskop, um sicherzustellen, werden die Aggregate nicht abgesaugt. Lassen Sie einen kleinen Volumen PBS innerhalb des Glases auch, um die Aggregate decken, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern.
- 1 ml frisch hergestellte Formaldehyd (4%), gelöst in PBS und Inkubation für 2 Stunden bei 4 ° C auf einem Orbitalschüttler auf eine niedrige Geschwindigkeit eingestellt. Vorsicht: Paraformaldehyd ist bekannt, allergen, krebserregend und giftig. Tragen Sie geeignete Schutz während der Handhabung.
- Nach der Fixierung absaugen Formaldehydlösung in der gleichen Weise wie in Abschnitt 4 1. 4 beschrieben und waschen die Aggregate mit 1 ml PBS dreimal 10 min mit jedem Waschen auf einem Orbitalschüttler auf eine niedrige Geschwindigkeit eingestellt.
- Saugen Sie das PBS, wie in Abschnitt 4. 1. 4 beschrieben, und führen Sie drei weitere, 10 min Waschen mit PBS, das 10% Fötales Rinderserum und 0,2% Triton X-100 (PBSFT). Führen Sie die 10 Minuten wäscht auf einem Orbitalschüttler auf eine niedrige Geschwindigkeit eingestellt.
Anmerkung: Die Verwendung Fötales Rinderserum (FBS) zu einer klaren Waschpuffer, Verringerung der Zahl der Aggregate, die sonst während der Protokoll verloren würde, wenn Milch verwendet werden. Es ist wichtig zu beachten, dass nach Fixierung kann immunhistochemischen Verfahren, andere als die unten beschriebenen verschiedenen Arten ausgeführt werden und sollte festgelegt und durch den Prüfer optimiert werden. - Blockieren die Aggregate für 1 h bei 4 ° C in einem Orbital PBSFT Wippe auf eine niedrige Geschwindigkeit eingestellt. Das Protokoll kann zu diesem Zeitpunkt angehalten werden, und Aggregate blockiert O / N, unter ständigem Rühren auf eine horizontale Kreisel Wippe bei 4 ° C.
- Saugen Sie das PBSFT wie zuvor beschrieben (siehe Abschnitt 4. 1. 4) und inkubieren Sie die Aggregate mit 500 ul der erforderlichen primären Antikörper in PBSFT O / N verdünnt bei 4 ° C auf einem Orbitalschüttler auf niedrige Geschwindigkeit eingestellt. Deckel mit Paraffinfilm um Verdunstung zu verhindern.
- Sekundäre Antikörper-Inkubationszeit
- Saugt den primären Antikörper-Lösung und Waschen mit 1 ml PBSFT (bei 4ºC) in der folgenden Weise: zweimal 5 min; dreimal für 15 Minuten; und vier bis sieben Mal für 1 Stunde. Führen Sie jede Waschschritt bei 4 ° C und auf einem Orbital Wippe auf niedrige Geschwindigkeit eingestellt. Hinweis: Gefühlt waschen Medium vor der Verwendung. Die Waschungen durchführen nicht auf Eis, da dies die Aggregate zu Fragment verursachen.
- Saugen Sie das letzte Waschmedium und Inkubation die Aggregate mit der erforderlichen sekundären Antikörper in 500 ul PBSFT O / N bei 4 ° C im Dunkeln auf einer horizontalen Kreisel Rocker. Hinzufügen Kernfärbung wie Hoechst, falls erforderlich.
- Montage und Imaging durch konfokale Microcopy
- Wie in Abschnitt 4. 1. 4 mit 4 ° C PBSFT beschriebenen Waschen Sie die Aggregate. Nach dem letzten Waschen, Spülen der Aggregate mit 1 ml PBS, das 0,2% FBS und Triton X-100 (PBT) in der folgenden Weise: zweimal 5 min; dreimal für 15 min. Führen Wäschenbei RT auf einem Orbital Wippe vor Licht geschützt.
- Absaugen Medium wie zuvor beschrieben (Abschnitt 4 1. 4) und Inkubation für 30 min im Dunkeln mit einer 1: 1-Lösung von Glycerin: PBT (1 ml) gefolgt von einer zweiten Inkubation für 30 min mit einem 7: 3-Lösung von Glycerin: PBT (1 ml).
Hinweis: Mischen Sie die Glycerin und PBT-Lösungen bei 4 ° C unter Verwendung einer Dreheinrichtung. - Saugen Sie das endgültige Glycerin: PBT-Lösung und ersetzen mit 1 ml Eindeckmittel 24. Das Protokoll kann an dieser Stelle vor der Montage angehalten werden (wenn angehalten, versiegeln Sie die Vertiefungen mit Paraffin-Film und die Färbung Brunnen lagern bei 4 ° C).
- Montieren Sie die Aggregate auf Objektträgern durch Pipettieren sie in 17 & mgr; l Tröpfchen mit einem Schnitt P20 Spitze (Abbildung 2). Fach doppelseitigem Klebeband auf sich selbst zurück viermal Abstandshalter zu erzeugen und heften sich an jedem Ende des Schlittens. Legen Sie den oberen Deckglas (22 mm x 60 mm) auf diese Abstandshalter (Abbildung 2).
Hinweis: Es ist wichtig, dass ein Schnitt Spitzein dieser Stufe verwendet, um nicht die Proben beschädigen. Die Abstandshalter verhindern das Deckglas Zerkleinern der Aggregate. - Sobald die Aggregate montiert sind, zuvor beschriebenen Bild die Proben mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie unter Verwendung von Protokollen 19,21,24,25. Einmal auf das Mikroskop gelegt, lassen Sie die Folie auf der Bühne ungestört für ein paar Minuten, damit sich die Aggregate innerhalb der Einschlussmittel begleichen.
Representative Results
Auftreten von Zellen unmittelbar nach der Beschichtung und nach der Aggregation
Unmittelbar nach der Beschichtung kann man die Anwesenheit von einzelnen Zellen in jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen mit einer Standard invertiert Gewebekulturmikroskop (1B) zu beobachten. Innerhalb von 8 h von Plattieren, werden diese Zellen begonnen, zu dem Boden des Bohrlochs durch die Schwerkraft hinab haben und begonnen haben, in diskrete Cluster (1C) koaleszieren. Nach 24 Stunden werden die Zellen, die das Koaleszieren primären Aggregation abgeschlossen haben, und werden in gut definierte, aber zackig Aggregate, wo einzelne Zellen undeutlich von einander (1D) sind verdichtet haben. Bis zum Ende des zweiten Tages (48 Stunden), müssen die Aggregate sauber aussieht, nachdem aller Zellen innerhalb des Bohrlochs (1E) ist; der Boden der Vertiefung kann einige Zellen, die aus dem Aggregat zu diesem Zeitpunkt vergossen worden sind, haben. Providingdass die Aggregate in N2B27 aggregiert worden ist, zu diesem Zeitpunkt Punkt sie kugelförmig sein sollten, etwa 150-200 um im Durchmesser und frei beweglich innerhalb des Bohrlochs (dh., nicht mit dem Boden der Vertiefungen haftet). Aggregation in anderen Medien (dh., ESLIF oder N2B27 mit bestimmten Faktoren) hat das Potential, sowohl die ursprüngliche Gesamtmorphologie und das Ansprechen auf die folgende Stimuli zu verändern (Turner et al., In Vorbereitung).
Repräsentative morphologische Veränderungen
Zugabe einer 24-Stunden-Impuls von Sekundärmedium, das Chi zwischen 48 und 72 h (1A, 5A) erzeugt genau definierte längliche Aggregate, die polarisierte Expression in spezifischen Marker der Keimblätter 19,21 zeigen. Unmittelbar nach der Chi-Impuls (72 h), werden die Aggregate beginnen, um Zellen zu vergießen und zu starten, um ihre Reaktion auf diese Signale zum Ende des heutigen Tages (3A) zu zeigen. Diese Antwortenwerden durch Änderungen in der Genexpression und Morphologie, die beide in Abhängigkeit von der Behandlung, die die Aggregate nach dem anfänglichen 48 Stunden Aggregation Periode N2B27 (3B) empfangen werden manifestiert. Wenn nur ein Endpunkt-Analyse erforderlich ist, ist die optimale Zeit, um Bild die Aggregate bei etwa 96 bis 120 Stunden. An dieser Stelle werden die Aggregate wird klar, Morphologien und Genexpressionsmuster (3A) entwickelt haben, und ihre Größe und Masse sind immer noch niedrig genug, so dass Ausstoß von Medium aus P200 Pipette ist ausreichend, um alle, die angeschlossen haben können lösen. Versagen der Befestigung des Aggregats zum gut verhindert beeinträchtigen Aggregatbildung (Abbildung 5Biv). Die Morphologien und Genexpressionsmuster der Aggregate in Abhängigkeit von der Behandlung geändert werden. Repräsentative Ergebnisse für anhaltende oder gepulste Regime entweder einzelne Behandlung oder Kombinationen von Faktoren für BMP4, Dorsomorphin H1 (B gezeigt,MP-Rezeptor-Inhibitor), ActivinA, SB43 (Activin / Nodal-Inhibitor), bFGF oder PD03 (MEK-Inhibitor) (3B).
Aggregate Imaging und quantitativer Bildanalyse
Aggregate sind zugänglich für Bildgebung von beiden Weitfeldmikroskopie (hauptsächlich für Zeitraffer-Bildgebung 19) oder fixiert und für die konfokale Abbildung 19,21 (Abbildung 2) immungefärbt. Das aktuelle Protokoll und Abbildungsbeschreibung oben ermöglicht quantitative Informationen aus diesen Aggregaten gewonnen werden. Folgende konfokalen oder Weitfeldbildaufnahme, wobei die Länge und die entsprechende Gen-Expression entlang des Durchmessers oder der Wirbelsäule des Aggregats (sphärisch oder länglich sind; 4A, B) gemessen werden kann. Diese Analysen sind auch direkt auf Zeitraffer-Bilder, wo man Daten von der Wachstumsrate, Größe und Dehnung der Aggregate unter verschiedenen Bedingungen zu erhalten (Abbildung 4
Abbildung 1. Typische Zeitverlauf und Anfang Morphologien. (A) Der typische Zeitverlauf für die Aggregation Experimenten. Zellen werden für 48 h in N2B27 Unmittelbar nach dem Ausplattieren (t = ~ 5 min) zusammengefasst, die eine Suspension von Maus-ES-Zellen (10 Zellen / ul) in einer 96-Well-Platte (p1, p2). (B), einzelne Zellen sein können in der Suspension gesehen, und haben damit begonnen, um Klumpen von 8h (C). (D) Nach 24 h bilden die Zellen eine einzige Sammel in jeder Vertiefung, die ungefähr 100 um Durchmesser gebildet wird. (E) Nach 48 Stunden Aggregation, die Aggregat Durchmesserbereiche von 150 bis 200 & mgr; m. An diesem Punkt ist die Aggregation Medium (N2B27) entfernt und ein Sekundärmedium wird entweder für den Rest des Experiments (p1 in Teil A) oder 24 Stunden lang, bevor sie verändert b hinzugefügtACK N2B27 (p2 in Teil A). Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Montage Aggregate auf Objektträger. Sobald die Aggregate wurden behoben, immungefärbt und in Montagemedium platziert wird jedes Aggregat auf einen Objektträger als 17 & mgr; l Tröpfchen pipettiert (A, B, B '). Ausreichend Platz zwischen den aggregierten Tröpfchen ihre Verschmelzung zu verhindern gelassen. Abstandshalter werden mit doppelseitigem Klebeband hergestellt und an jeder Ecke des Objektträgers (A, A ', B) angeordnet sind. Es ist auf diese, die ein Deckglas gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Der Effekt von verschiedenen Behandlungen auf die Morphologie der aggregierten ES-Zellen. Nach 2 Tagen in N2B27 wurden ES-Zellen Aggregate gebildet. Zugabe spezieller Faktoren entweder als 1 Tag Impuls (A) oder kontinuierlich (B) kann der Phänotyp der Aggregate im Hinblick auf die Polarität der Genexpression Dehnungspotential oder ihre Gesamtform zu verändern. Die Beispiele in dieser Figur sind Aggregate entweder von Bra gebildet :: GFP 30 (A) oder SOX1 :: GFP 27 (B) Maus-ES-Zellen nach 120 h belichtet und behandelt wie angegeben. Chi: CHIR 99021 31; SB43: SB 431542 32; DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03:. PD0325901 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen thist Figur.
Abbildung 4. Die quantitative Analyse der Aggregate. Ein typisches Aggregat von Bra gebildet :: GFP mESCs 25,30 nach einer 24-Stunden-Puls des Chi und bei 120 h abgebildet. Fusionsbild des Hellfeld-und GFP-Kanal wird mit segmentierten Linie markiert den 'Rückgrat' des Aggregats von Punkt A nach B (A), entlang der die Fluoreszenz und die Länge des Aggregats gemessen werden kann (B) dargestellt ist. Die Länge (C) und "Rundheit" (D) von 24 Aggregaten innerhalb des gleichen Experiments sind dargestellt. Formdeskriptoren wie der Rundheit (D), Kreisförmigkeit, der Umfang und die Fläche kann mit Hilfe der Bildanalyse Koch Plugin von der Bildanalyse-Software FIJI 35 gemessen werden. Bedeuten, durch horizontale Linie bei jedem Zeitpunkt angegeben;Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung; Maßstabsleiste in (A) zeigt an, 200 um. So gibt es feine Unterschiede zwischen Reporterzellinien, wird erwartet, dass nach einem Impuls von Chi, die durchschnittliche maximale Länge und die durchschnittliche Mindestrundheit der Aggregate variiert. Zwischen verschiedenen Zelllinien, so finden wir, dass die durchschnittliche maximale Länge kann im Bereich von ~ 400-800 & mgr; m und die durchschnittliche Mindestrundheit zwischen 0,4 und 0,6 sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Beispiele für Misserfolge in Aggregatbildung. Die Fähigkeit, reproduzierbare Aggregate (A) zu erzeugen, hängt davon ab, kritische Faktoren wie (Bi) frisch und gut gemischt Sekundärmedium, (Bii, Biii) die Genauigkeit beim Zählen der ersten nUmbra von Zellen und (Biv) Gewährleistung der Aggregate bilden keine adhärenten Kolonien, dh., "Crash" in die Oberfläche des Brunnens. Typische Beispiele für die Fehler in der Aggregatbildung für jede der genannten Bedingungen (B) gezeigt. Scale-bar, wie angegeben; siehe Fehlersuche Tabelle für Details (Tabelle 1). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1 Leitfaden zur Fehlersuche. Typische Fehler bei der Aggregation Protokoll zugeordnet sind Vorschläge, deren Lösung gegeben.
Tabelle 2 Tabelle der getesteten Zelllinien für die Bildung von aggRegates. Eine Anzahl von Zellinien 19,22,27,30,36-40 für die Bildung von Aggregaten und charakterisiert worden, obwohl kleine Unterschiede zwischen Zelllinien werden erwartet und beobachtet wurden, die alle die obigen Zeilen zeigen ähnliche Dynamik bei Dehnung und Morphologie. In Bezug auf die Genexpression ist das Expressionsmuster spezifisch für das Gen exprimiert wird, aber innerhalb der einzelnen Zelllinie ist das Expressionsmuster im Allgemeinen über eine Anzahl von Passagen konsistent. Aus Gründen der Konsistenz erzeugen wir Aggregate von Zellen, die nicht 15 Passagen in Kultur überschritten haben.
Tabelle 3. Liste der repräsentativen Antikörpern in diesen Studien verwendet. Eine Auswahl der Antikörper und der Verdünnungsfaktoren für aggregierte Immunfärbung verwendet.
Discussion
Die in diesem Manuskript beschriebene Technik effizient und reproduzierbar erzeugt Aggregate von embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) dieses Anzeige organisiert Symmetriebruch und Dehnung 19 und verbindet die durch Marikawa et al. 14 und EB Bildung beschriebenen Hängetropfenkultur. Diese Aggregate gehen auf axiale Dehnungen zu entwickeln, Ergänzung bestehender Methoden für die Erzeugung von vorderen Organe von ES-Zellen, wie beispielsweise Augenbecher 11 und der Großhirnrinde 13 und enthalten Zellen mit Identitäten der drei Keimblätter, welches Display ähnlich denen während der Gastrulation Prozesse wie schnelle Zellbewegung 19,21.
Es ist interessant, über die Natur der Symmetriebruch Ereignis spekulieren, da es in Abwesenheit einer äußeren Strukturierung Gewebe auftritt und zygotischen Asymmetrie queues 19. Die spontane Bildung einer rudimentären Achse könnten von bereits bestehenden heterogenen entsteheneities in der Ausgangskultur von Zellen, die die Grundlage für die Entwicklung der Asymmetrie zu bilden. Tatsächlich Populationen von Zellen in ESLIF Bedingungen kultiviert zeigen eine Mischung von sich selbst erneuernden und differenzierenden Zellen, können die relativen Anteile davon aus einem Aggregat zu einem anderen variieren. Außerdem Vorarbeiten in unserem Labor legt nahe, dass Aggregate von einer hundert pluripotenten Population von Zellen zeigen eine verzögerte Entwicklung und Defekte in Musterung, was auf eine Rolle für die Heterogenität der organisierten Musterbildung (DA Turner & A. Martinez Arias, in Vorbereitung). Es ist auch zu bedenken, dass ein Reaktions-Diffusionsmechanismus kann das Muster von der Oberfläche des Aggregats zu generieren, wobei die Diffusion eines Inhibitors. Warmflash et al. 41 legen nahe, dass ein solcher Mechanismus für die Entwicklung von radialen Asymmetrie in adhärente Kultur, so dass ein möglicher Kandidat zur Strukturierung in drei Dimensionen verantwortlich sein.
Während der Initial 48 Stunden Globalisierungszeitraum, Zellen erreichen einen Zustand ähnlich dem in der Postimplantations Epiblast, in denen sie zuständig ist, um Signale von dem Sekundärmedium 19,21,24 reagieren. Typischerweise ist das hier beschriebene Protokoll stellt Zellen mit einem Impuls des Sekundärmediums, die Faktoren (wie Wnt / β-Catenin-Agonisten), die die Signale ausreichend Dehnung bereitzustellen enthält. Vorherige durch Lancaster et al beschriebenen Kulturverfahren. (Unter Verwendung von menschlichen WSR 13) und Eiraku et al (mit mESCs 11). Verwendet eine kurze Zeit der Aggregation in niedriger Adhäsion 96-Well-Platten vor aggregierten Zellen auf Matrigel Tröpfchen für On- transferiert gehen Kultur. Obwohl die Zeit zwischen Aggregation und Matrigel Insertion unterschiedlich zwischen den Studien, in beiden Fällen eine große Anzahl von Zellen für die Aggregatbildung (ungefähr 3,000-4,500 Zellen) verwendet. Im Gegensatz dazu hier beschriebene Protokoll 19 weit weniger Zellen (ca. 400 Zellen verwendetpro Aggregat), der bestimmt worden zu sein, absolut notwendig, um den Prozess der Dehnung, Symmetriebrechung und Polarisation, die beobachtet wird, 19. Darüber hinaus sind diese länglichen Strukturen in der Lage, in einer sehr viel kürzeren Zeitdauer ohne Einbettung in künstlichen Matrizen erzeugt werden, Vergleichen der Erzeugung von definierten Gehirnregionen von Lancaster et al (> 20-30 Tage) 13 und der Augenbecher von Eiraku. et al. (~ 11 Tage) 11 mit den 5 Tagen zur Erzeugung von polarisiertem länglichen Strukturen erforderlich.
Eine der Einschränkungen bei der hier jedoch beschriebenen Kulturverfahren ist, dass sie nur für etwa 5-6 Tage kultiviert pfosten Plattieren werden, bis ihre Größe macht sie zuständigen unter der Schwerkraft auf den Boden der Vertiefungen Waschbecken und erzwingen eine Haftung sogar auf nicht beschichtete Kunststoff-ware. Weitere Experimente mit künstlichen Matrices, wie die zuvor erwähnt, kann es uns ermöglichen, die Periode zu erhöhenBeobachtungen und Experimente, und die Arbeit ist im Gange, um die Auswirkungen Beschränken der Aggregate in einer solchen Weise zu bestimmen. Eine weitere Einschränkung dieses Verfahrens besteht darin, dass, um das Medium ohne Entfernen der Aggregate zu ändern, wird ein kleines Volumen des Mediums müssen im Boden der Mulde verbleiben. Die Folgen für die chemische Genetik Ansätze sind die Notwendigkeit, diese Verdünnung und keine Nachwirkungen aus früheren Medien berücksichtigen: am Tag des 3 uM Chi Impuls wird 2,37 & mgr; M-Lösung tatsächlich gelieferte und nachfolgende Medium Änderungen in einem Übertrag von 0.499 führen um (72-96 h), und 0,105 & mgr; M (96-120 h) zwischen den Zeitpunkten. Aktuelle Arbeiten nicht um die Verdünnung korrigiert und es wird angenommen, dass die tägliche Medium Änderungen werden Restwirkungen zu minimieren.
Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte in dem Protokoll, um sowohl intra- und inter experimentelle Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Erstens muss die Startkultur mESCs gepflegt werden und nicht über Zusammenarbeitnfluent und Medium sollte immer gute Qualität dh ist., frisch und gut gemischt (5A, B). Schlechte Kulturbedingungen negativ auf die Aggregation (Abbildung 5BI). Genaue Zählung von Zellen, um eine ~ 400 Zellen / 40 ul Zellsuspension zu erhalten, ist von wesentlicher Bedeutung, da größere Aggregate nicht zur Selbstorganisation und sind eher zu Doppelaggregate in jeder Vertiefung (Abbildung 5Bii), wohingegen kleinere Aggregate sind nicht in der Lage die richtige zu erreichen bilden Dichte, wo sie in der Lage, auf den Reiz (Abbildung 5Biii) reagieren. Ein Schlüsseloptimierungsschritt war die Aufnahme eines zweiten PBS zu waschen, die Verunreinigung Serum aus der Zellsuspension entfernt (Schritt 2.6); Dies verbesserte die Aggregation Frequenz und beschleunigt die Entwicklung der Aggregate von ca. 24 Std. Als nächstes werden die Gewährleistung Mediumwechsel mit ausreichender Kraft angelegt, um irgendwelche Aggregate, die das Potential an der Oberfläche des Bohrlochs zu haften zu verdrängen; Andernfalls resu tunLTS in den Aggregaten 'Absturz' (Abbildung 5Biv). Darüber hinaus und wie bereits erwähnt (und darunter) ist es wichtig, sicherzustellen, dass die Aggregate in Suspensionskultur gehalten, und werden aus jeder Oberfläche anhaftet. Sobald die Aggregate anhaften, werden die Muster der Genexpression und ihre Dehnungspotential gestört.
Da diese Technik ist relativ einfach, und auch in den Zuständigkeitsbereich Personen mit guter Gewebekulturtechniken, die meisten der Probleme mit Aggregation verbunden sind, können relativ schnell, wenn diese kritische Schritte befolgt werden gelöst werden; eine vollständige Tabelle der Fehlersuche zur Verfügung (Tabelle 1). Sobald sie beherrscht, kann diese Technik verwendet, um eine axiale Entwicklung Symmetriebrechung und zell Entscheidung Ereignissen zu untersuchen. Genauer gesagt, haben diese Aggregate das Potenzial, um Pools von Zellen, die bisher nicht verfügbar gewesen, in der Kultur, wie das Rückenmark und moto generierenr Neuronen.
Ethische Hinweis: Es sollte mit der gebotenen Vorsicht zu beachten, dass die Übersetzung dieses Protokolls für die menschliche ES oder iPS-Zellkultur konnte den Experimentator in der Nähe der Rechtsgrundlage der 14 Tage Grenze für Embryonenforschung, nämlich die Erzeugung einer Primitivstreifen zu bringen, wie in der menschliche Befruchtung und Embryologie Act 2008 (UK) 42 beschrieben. Da das Gesetz gehören alle lebenden menschlichen Embryonen unabhängig von ihrer Art und Weise der Erstellung, würde Kultur der Menschen gastruloids über die primitive-Streifen wie Stufe über den Rahmen der lizenzierbaren Forschung sein.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird durch einen ERC Advanced Investigator Award AMA (DAT, TB) mit einem Beitrag von einem Projektstipendium des Wellcome Trust, um AMA, ein EPSRC studentship zu PB-J und Erasmus, Stichting dr finanziert. Hendrik Müller Vaderlandsch Fonds und Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage, um SCvdB. Wir wollen danken J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schröter und T. Rodriguez, für Diskussionen und konstruktive Kritik, Joaquín de Navascués für das Eindeckmedium Protokoll und sowohl AK Hadjantonakis und C. Budjan für den Austausch von Protokollen ihrer Labor in Bezug auf Färbung der gesamten Montage Embryonen. Eine frühere Version dieses Artikels wurde zuvor auf dem bioRxiv Preprint Server 29 hergestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
| 25 cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
| Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
| BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
| Centrifuge tubes (15 or 50 ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
| CHIR 99021 (Chi) | CSCR | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO | |
| Dissection Well (30 mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
| ESLIF | 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units). | ||
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
| Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
| Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. | |
| n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
| N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
| Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
| Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
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