Abstract
Vi har utvecklat ett protokoll förbättra nuvarande Embryoid Body (EB) kultur som gör det möjligt att studera självorganisering, symmetribrott, axiella förlängningen och cell öde specifikation med aggregat av mus embryonala stamceller (mESCs) i suspensionskultur. Litet antal mESCs aggregeras i basalt medium under 48 timmar i icke-vävnadskulturbehandlade, U-bottnade 96-brunnsplattor, varefter de är behöriga att svara på experimentella signaler. Efter behandling, dessa aggregat börjar visa tecken på polariserad genuttryck och gradvis förändra deras morfologi från en sfärisk massa av celler till en långsträckt, väl organiserad struktur i frånvaro av externa asymmetri signaler. Dessa strukturer är inte bara kan visa markörer för de tre groddblad, men aktivt visa gastrulation liknande rörelser, framgår av en riktad förflyttning av enskilda celler från aggregatet, som avgörande sker vid en region av det långsträckta strukturen. Denna protocol ger en detaljerad metod för reproducerbar bildandet av dessa aggregat, deras stimulering med signaler såsom Wnt / β-catenin aktivering och BMP hämning och deras analys av enda tidspunkt eller tidsförlopp fluorescensmikroskopi. Dessutom beskriver vi ändringar av nuvarande hel-mount mus embryo färgningsprocedurer för immuncytokemisk analys av specifika markörer inom fasta aggregat. Förändringarna i morfologi, genuttryck och längd av aggregaten kan mätas kvantitativt, med information om hur signalerna kan förändra axiella öden. Det är tänkt att detta system kan användas både för att studera tidiga utvecklings evenemang såsom axiell utveckling och organisation, och mer allmänt, processerna för självorganisering och cellulära beslutsfattandet. Den kan även ge en lämplig nisch för generering av celltyper som är närvarande i embryot som är omöjliga att erhålla från konventionell vidhäftande kultur såsom ryggmärgen och motoriska neuron.
Introduction
Studien och förståelse av cell öde beslut utveckling tidiga däggdjur kan utnyttja odlingar av embryonala stamceller (ESC), klonala populationer härledda från blastocyster som har förmågan att själv förnya och differentiera till alla celltyper i en organism dvs., de är pluripotenta 1,2. Även om dessa kulturer har varit och fortsätter att vara användbara för att förstå den molekylära grunden för cell öde beslut, de är oförmögna att återge några av de rumsliga arrangemang och globala beteenden som genereras i embryon under gastrulation. I embryot, processen för gastrulation omvandlar ett enda epitelskikt in i de tre distinkta groddblad och förser embryot med en uppenbar anteroposteriora organisation 3-5. Försök att rekapitulera dessa händelser ex vivo har baserats på alstringen av tre-dimensionella aggregat av ekonomiska och sociala råd, benämnd embryoidkroppar (EBS), och utsätta dem to differentieringsförhållanden 6,7. Dessa aggregat kan lirkade att differentiera till många olika celltyper, av vilka några är antingen inte kan erhållas eller framkallas med låg effektivitet i vidhäftande kulturen eller inte kan produceras alls,. T.ex., blod 8 och primordial könsceller 9. En begränsning av användningen av EBS är dock att de inte kan visa morfogenetiskt beteende, distribution GRODDBLAD eller axiell organisation som är viktiga egenskaper hos det växande embryot, vilket resulterar i fysisk desorganisation 6,10. I en rapport, behandling av EBS med Wnt leder till en svag polarisering i genuttryck i vissa aggregat men ingen tydlig morfogenes observeras 7. I senare rapporter, EBS som har odlats under längre tidsperioder utveckla främre strukturer såsom näthinnor, cortex och innerörat sensoriska celler, som efterliknar deras embryonala motsvarigheter men utvecklas utan samband med en axiell organizatjon 11-13.
En rapport från et al. Marikawa 14, samtidigt som man arbetar med aggregat av musen P19 Embryo cancer (EG) celler bildas genom hängande-släpp-metoden, rapporterade uppkomsten av långsträckta strukturer av mesodermalt ursprung påminner om förlängningar som observeras med exogastrulae i amfibie och sjöborre embryon och Keller Explantat 15-18. Eftersom detta inte hade observerats med mus embryonala stamceller (mESCs), försökte vi att återskapa problemet observeras med P19 EC-celler med hjälp av aggregat av mESCs 19 och vi rapporterar odlingsbetingelser som leder till deras symmetribrott och axiella förlängningen. En viktig skillnad från arbetet med P19-celler är att aggregationen Protokollet som beskrivs här utförs i en 96-brunnars platta, liknande den som beskrivits av et al. Eiraku 20, istället för att hänga droppar. Denna förändring resulterade i en ökad effektivitet när det gäller sammanlagd återhämtning och i bådainom och mellan experimentell reproducerbarhet. Det är viktigt att upprätthålla aggregat i enskilda brunnar säkerställer att fusion mellan aggregat (vanligt när sammanslagning aggregat från hängande droppar) inte förekommer. Dessutom är en viktig del av protokollet 24 timmar exponering för GSK3 hämmaren CHI99021 (Chi), en potent aktivator av Wnt / β-catenin signalering, efter aggregering.
Den metod som beskrivs här ger en grund för att förstå processerna för självorganisering, axial organisation och GRODDBLAD specifikation i kultur, vilket gör att slutsatser ska kunna fattas om axiell utveckling in vivo 19,21. Av dessa skäl metoden har potential att tillåta detaljerade mekanistiska analys av processer som kan vara svåra att studera i embryot. Dessutom är en potentiell tillämpning i genereringen av vävnader och organ som inte är lätt att få tag i vidhäftande kulturen på grund av avsaknaden av en strukturerad cellulär nisch såsomryggmärg prekursorer 21 och motoriska neuron. Tredimensionell samlade kulturen erbjuder en fysisk struktur och signalering miljö som kanske inte uppnås på konventionellt sätt, vilket leder till en ny strategi för härledning av embryonala linjer i ett rumsligt organiserat sätt.
Protocol
1. odlingsbetingelser Före aggregering
- Behåll mESCs i ESLIF-medium (se tabell av specifika material och utrustning för beredning) på gelatinbelagda 25 cm 2 vävnadsodlingsbehandlade kolvar i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO 21-25 februari.
- Odla celler under minst två passager lägga upptining före användning i detta protokoll; celler vid lägre passager är i allmänhet mer framgångsrika på att skapa reproducerbara egenskaper genom experimentella replikat (ie., inte mer än 15 passager i kultur), men liten variation mellan olika ES cellinjer kan förväntas (se tabell 2 för cellinjer som testats ).
- Odla celler till 40-60% sammanflytning. Använd inte över konfluenta celler för aggregering.
2. Generation av aggregat
- Pre-varm PBS (+ Ca2 +, + Mg 2+), ESLIF, N2B27 26,27
- Aspirera odlingsmedium från vävnadsodlingskolv (steg 1,3). Skölj kolven försiktigt med 5 ml PBS, två gånger. Aspirera PBS och till en till 2 ml förvärmda trypsin-EDTA (0,25%) för att dissociera cellerna.
- Placera kolven i inkubatorn under <5 min eller tills cellerna har helt fristående från ytan av kolven. Pipettera upp och ned med en 1 ml pipett för att generera enkelcellsuspension för noggrann räkning och likformig aggregatstorlek bildning.
- Neutralisera Trypsin med 5-10 ml ESLIF; tvätta ned tillväxtytan för att maximera cellåterhämtning och överför till en 50 ml centrifugrör. Ta en 1 ml portion från centrifugröret och räkna cellerna med en hemocytometer.
- Fastställa omfattningen av krävs för att ge 10 celler / mikroliter (en hel 96-brunnar kräver 5x10 4 celler i en 5 ml suspension). Räkna celler noggrant, så stor Deviatjoner från det angivna antalet celler kan negativt påverka svaret av aggregaten på stimuli.
- Lägg 5x10 4 celler till 5 ml förvärmda PBS i en fräsch 50 ml centrifugrör och centrifugera vid ~ 170 xg under 5 minuter.
- Försiktigt aspirera PBS och tillsätt 5 ml förvärmda PBS försiktigt; inte störa pelleten i botten av röret. Centrifugera vid ~ 170 xg under 5 minuter.
- Försiktigt aspirera PBS för andra gången. Avlägsna så mycket PBS som möjligt utan att störa pelleten PBS överföring kan påverka aggregering. Återsuspendera pelleten först i 1 ml varm N2B27 med en P1000 pipett för att alstra en homogen cellsuspension, följt av ytterligare tillsats av N2B27 till den önskade volymen (t.ex., tillsätt 4 ml för en 5x10 4 celler / 5 ml suspension).
- Överför cellsuspensionen till en steril reservoar och pipettera en 40 pl droppe i botten av varje brunn i ett icke-vävnadsodlingsbehandlade, 'U'bottnad 96-well plattan med hjälp av en flerkanalspipett. Täck 96-brunnar med dess motsvarande lock och bekräfta närvaron av celler med en omvänd bänkmikroskop (Figur 1B).
Obs: Det är viktigt att dessa plattor används för att begränsa möjligheten att cellerna vidhäftar. Inte belägga botten av 96-brunnar med gelatin, fibronektin eller någon annan beläggning som främjar cellvidhäftning. - Inkubera cellerna i 48 h i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 under aggregering.
3. Tillämpa stimuli och ändra Medium
- Efter 48 timmars inkubationsperiod, observera förekomsten av mESCs inom varje brunn i 96-brunnars platta för att bekräfta lyckad aggregering (Figur 1E). Notera: Aggregat visas sfärisk till sin natur och cirka 150-200 | j, m i diameter. Se felsökningsavsnittet om det uppstår problem (tabell 1).
- 0; Tillsätt 150 pl färsk sekundärt medium (3 iM Chi99021 (Chi) i N2B27 19, lager framställd vid 10 mM i DMSO) till varje brunn med hjälp av en flerkanalspipett. Pipetten med tillräcklig kraft för att få bort eventuella aggregat som kan ha börjat att vidhäfta till botten av brunnarna. Inkubera aggregat i sekundära mediet för 24 h i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2 (Figur 1A).
Obs: Reproducerbara långsträckta och polariserade aggregat genereras med hjälp av denna sekundära mediet. Andra sekundära medel kompositioner kan också användas beroende på de experimentella villkoren och exempel visas i figur 3. - För efterföljande mediumbyten, använd en flerkanalspipett hålls i en vinkel (ungefär 30 °) för att försiktigt avlägsna 150 | il av den sekundära mediet från sidan av varje brunn. Sedan, för att pipett 150 ul färska N2B27 i varje brunn med tillräcklig kraft rubba eventuella aggregat som kan ha started att ansluta sig till botten av brunnarna.
- Upprepa punkt 3. 3 varje 24 timmar tills tidsförloppet är klar (den typiska längden av en samlad kultur experiment är 120 timmar).
Obs: Se till att aggregaten fritt rörliga efter medel förändringar för att säkerställa reproducerbarhet och konsekvens inom och mellan varje 96-brunnar. Medium måste bytas dagligen efter sammanläggning perioden.
4. Framställning av Ballast för Immunofärgning och analys av konfokalmikroskopi
- Fixering och primär antikropp inkubation
Obs: Det protokoll som beskrivits av AK Hadjantonakis 28 har ändrats för att passa immunfärgning av Mesc aggregat. För de typiska antikroppar som användes i våra studier och deras utspädningar, se tidigare publicerade arbeten 19,21,24,25,29 och tabell 3.- Använd en flerkanalspipett hålls i en vinkel (ungefär 30 °) för att försiktigt avlägsna 150 | il medium från sido of varje brunn i 96-brunnar. Tvätta två gånger genom att pipettera 150 pl PBS i varje brunn. Lämna ett par minuter mellan varje tvätt för att låta aggregaten att bosätta sig.
- Ställ en P1000 pipett att dosera 200 l, fästa motsvarande pipettspetsen och avbröt cirka 3 mm från änden av spetsen med ett par steril sax. Rita en portion av PBS i varje brunn i 96-brunnsplatta en kort bit in i spetsen och utvisa den för att röra om aggregatet.
- Använd samma spetsen för att rita upp hela volymen inom brunnen inklusive aggregat och pipett till en liten (30 mm diameter) glas Drosophila dissektion väl. Överför alla aggregat från den 96-brunnar som kommer att genomgå identiska immunfärgning regimer i samma glas dissektion väl.
Obs: Använd en ny snitt pipettspets vid överföring aggregat från olika experimentella förhållanden för att förhindra överföring av aggregat. - Placera glas brunn som innehåller det aggregates på en dissektion mikroskop. Snurra glaset väl att tvinga aggregaten till centrum och aspirera PBS från en sida av brunnen med ett glas pasteurpipett. Använd mikroskop för att säkerställa att aggregaten inte aspire. Lämna en liten volym PBS i glas väl för att täcka de aggregat för att hindra dem från att torka ut.
- Tillsätt 1 ml nyberedd formaldehyd (4%) upplöst i PBS och inkubera i 2 h vid 4 ° C på en orbital skakanordning inställd på låg hastighet. Försiktighet: Paraformaldehyd är känt för att vara allergiframkallande, cancerframkallande och toxiskt. Bär lämpligt skydd samtidigt som hantering.
- Efter fixering, aspirera formaldehydlösningen på samma sätt som beskrivits i avsnitt 4. 1. 4 och tvätta aggregaten med 1 ml PBS tre gånger, 10 min för med varje tvätt, på en orbitalskakare inställd på låg hastighet.
- Aspirera PBS som beskrivs i avsnitt 4. 1. 4 och utför ytterligare tre, 10 min tvättar med PBS innehållande 10% fetalt bovint serum och 0,2% Tritons X-100 (PBSFT). Utför 10 minuterstvättar på en orbitalskakare inställd på låg hastighet.
Anm: Använda Fetalt bovint serum (FBS) resulterar i en klar tvättbuffert, en minskning av antalet aggregat som annars skulle gå förlorade under protokollet om mjölken användes. Det är viktigt att notera att efter fixering, kan immunohistokemiska procedurer utföras i andra fall än de som beskrivs nedan olika sätt och bör bestämmas och optimeras av prövaren. - Blockera aggregat för en timme vid 4 ° C i PBSFT på en orbital vippa inställd på låg hastighet. Protokollet kan pausas vid denna punkt, och aggregat blocke O / N, under konstant omröring på en horisontell gyratorisk rocker vid 4 ° C.
- Aspirera PBSFT såsom tidigare beskrivits (se avsnitt 4. 1. 4) och inkubera aggregaten med 500 | il av den erforderliga primära antikroppen utspädd i PBSFT O / N vid 4 ° C på en orbital skakanordning inställd på låg hastighet. Täck med paraffin film för att förhindra avdunstning.
- Sekundär antikropp Inkubation
- Aspirera den primära antikroppslösningen och tvätta med 1 ml PBSFT (vid 4 ° C) på följande sätt: två gånger under 5 min; tre gånger under 15 minuter; och fyra till sju gånger för en timme. Utför varje tvättsteg vid 4 ° C och på en orbital vippa inställd på låg hastighet. Obs: Chill tvättmedium före användning. Utför inte tvättar på is, eftersom detta kan leda till att aggregaten till fragment.
- Aspirera sista tvätten mediet och inkubera aggregaten med erforderlig sekundär antikropp i 500 ul PBSFT O / N vid 4 ° C i mörker på ett horisontellt spindel rocker. Lägg till kärn fläcken som Hoechst vid behov.
- Montering och Imaging av Confocal Microcopy
- Tvätta aggregaten som beskrivs i avsnitt 4. 1. 4 med 4 ° C PBSFT. Efter den slutliga tvätten, skölj aggregaten med en ml PBS innehållande 0,2% FBS och Triton X-100 (PBT) på följande sätt: två gånger under 5 min; tre gånger under 15 min. Utför tvättarvid RT på en orbital vippa skyddas från ljus.
- Aspirera medium såsom tidigare beskrivits (avsnitt 4. 1. 4) och inkubera under 30 minuter i mörker med en 1: 1 lösning av glycerol: PBT (1 ml) följt av en andra 30 minuters inkubation med en 7: 3-lösning av glycerol: PBT (1 ml).
Obs: Blanda glycerolen och PBT lösningar vid 4 ° C med användning av en rotator. - Aspirera slutliga glycerol: PBT-lösning och ersätta med 1 ml monteringsmediet 24. Protokollet kan pausas vid denna tidpunkt före montering (om paus, försegla brunnarna med paraffin film och lagra färgnings brunnar vid 4 ° C).
- Montera aggregaten på objektglas genom att pipettera dem i 17 pl droppar med ett snitt P20 spets (Figur 2). Vik dubbelsidig tejp tillbaka på sig fyra gånger för att generera distanser och fäst i varje ände av bilden. Placera den övre täckglas (22 mm x 60 mm) på dessa distansorgan (Figur 2).
Obs: Det är viktigt att ett snitt tips äranvänds i detta skede för att inte skada proverna. Distanserna förhindrar täck krossa aggregaten. - När aggregaten är monterade, bild proverna med hjälp av konfokalmikroskopi med hjälp av protokoll som tidigare beskrivits 19,21,24,25. När placeras på mikroskopet, lämnar bilden ostört på scenen för några minuter så att aggregaten att bosätta sig inom monteringsmedium.
Representative Results
Utseende av celler omedelbart efter bordläggning och efter sammanläggning
Omedelbart efter plätering, kan man observera närvaron av enskilda celler inom varje brunn i 96-brunnar med en standard inverterad vävnadsodlingsmikroskop (Figur 1B). Inom 8 h av plätering, kommer dessa celler har börjat att sjunka till botten av brunnen på grund av tyngdkraften och kommer att ha börjat att koalescera till diskreta kluster (Figur 1C). Efter 24 timmar, kommer koalescerande cellerna har slutfört den primära aggregering, och kommer att ha komprimeras till väl definierade, men trasiga aggregat där enskilda celler är otydlig från varandra (figur 1D). I slutet av den andra dagen (48 timmar), bör aggregaten se "rena", efter att ha tagit upp alla celler i brunnen (Figur 1E); botten av brunnen kan ha vissa celler som har spridit från aggregatet i detta skede. Tillhandahållandeatt aggregaten har aggregerats i N2B27, vid denna tidpunkt, bör de vara sfärisk, cirka 150-200 nm i diameter och fritt rörliga inom brunnen (ie., inte anslutit sig till botten av brunnarna). Aggregation i andra medier (dvs., ESLIF eller N2B27 med specifika faktorer) har potential att förändra både den första samlade morfologi och svaret på följande stimuli (Turner et al., Som en förberedelse).
Representativa morfologiska förändringar
Tillsats av en 24 timmars puls av sekundär medium innehållande Chi mellan 48 och 72 timmar (Figur 1A, 5A) genererar väldefinierade avlånga aggregat som visar polariserade uttryck i specifika markörer av groddblad 19,21. Omedelbart efter Chi puls (72 tim), kommer aggregaten börja kasta celler och börjar visa deras svar på dessa signaler mot slutet av denna dag (figur 3A). Dessa svarmanifesteras av förändringar i genuttryck och morfologi, som båda är beroende av den behandling som aggregaten har fått efter den initiala 48 h period som fastställts i N2B27 (Figur 3B). Om endast en slutpunkts analys krävs, den optimala tiden för att avbilda aggregaten är vid approximativt 96-120 h. Vid denna punkt aggregaten kommer att ha utvecklat tydliga morfologier och genexpressionsmönster (Figur 3A), och deras storlek och massa är fortsatt låg nog så att utmatning av medium från P200 pipett är tillräcklig för att få bort alla som kan ha fäst. Underlåtenhet att förhindra fastsättning av aggregatet till brunnen kommer att påverka aggregatbildning (Figur 5Biv). Den morfologier och genuttrycksmönster av aggregaten kan ändras beroende på behandlingen. Representativa resultat för ihållande eller pulsade regimer med antingen enda behandling eller kombinationer av faktorer visas för BMP4, Dorsomorphin H1 (BMP-receptor-hämmare), ActivinA, SB43 (Activin / Nodal hämmare), bFGF eller PD03 (MEK-hämmare) (Figur 3B).
Aggregate Imaging och kvantitativ bildanalys
Ballast är mottagliga för avbildning av antingen widefield mikroskopi (huvudsakligen för time-lapse avbildning 19), eller fasta och immun för konfokal avbildning 19,21 (Figur 2). Det nuvarande protokollet och bildbehandling Beskrivningen ovan ger kvantitativ information att vinna på dessa aggregat. Efter konfokala eller brett fält bildtagning, längd och motsvarande genuttryck längs diametern eller ryggrad av aggregatet (sfärisk eller avlång respektive Fig 4A, B) kan mätas. Analyserna är också direkt tillämpliga på tidsförlopp bilder, där man kan få information om tillväxttakten, storlek och förlängning av aggregaten under olika förhållanden (Figur 4
Figur 1. Typisk tidsförlopp och tidiga morfologier. (A) Den typiska tid-kurs för aggregering experiment. Celler aggregeras för 48 h i N2B27 innehållande en suspension av mus-ES-celler (10 celler / | il) i en 96-brunnsplatta (P1, P2). (B) omedelbart efter plätering (t = ~ 5min), kan individuella celler vara sett i suspensionen och har börjat bilda klumpar av 8h (C). (D) Efter 24 timmar cellerna har bildat en enda samlings i varje brunn som är cirka 100 mikrometer i diameter. (E) Efter 48 timmar aggregering, den sammanlagda diameterområden 150-200 um. Vid denna punkt, avlägsnas aggregationen mediet (N2B27) och en sekundär medium sätts antingen för resten av experimentet (p1 i del A), eller för 24 timmar innan den ändras bACK till N2B27 (p2 i del A). Skala stapel representerar 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Monterings aggregat PÅ objektglas. När aggregaten har fixerats, immunostained och placerades i monteringsmedium, är varje aggregat pipetteras på ett objektglas som en 17 pl droppe (A, B, B '). Tillräckligt med utrymme lämnas mellan de aggregerade dropparna för att förhindra deras sammanslagning. Spacers är tillverkade med dubbelsidig tejp och placeras vid varje hörn av objektglas (A, A ', B). Det är på dessa som ett täckglas placeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Effekten av olika behandlingar på morfologin av aggregerade ES-celler. Efter 2 dagar i N2B27 har ES-celler bildade aggregat. Tillsats av specifika faktorer antingen som en dag puls (A) eller kontinuerligt (B) kan förändra fenotypen av aggregaten med avseende på polariteten av genuttryck, töjning potential, eller deras totala form. Exemplen i denna siffra är aggregat som bildas från antingen BH :: GFP 30 (A) eller Sox1 :: GFP 27 (B) mus ES-celler avbildas efter 120 timmar och behandlas som indikeras. Chi: CHIR 99021 31; SB43: SB 431542 32, DM: DorsomorphinH1 33,34; PD03. PD0325901 klicka Vänligen här för att se en större version av thär figur.
Figur 4. Kvantitativ analys av aggregat. Ett typiskt aggregat som bildas av Bra :: GFP mESCs 25,30 efter en 24 timmars puls Chi och avbildas på 120 timmar. Sammanslagna bilden av ljusfält och GFP-kanal visas med segmenterad linje som markerar "ryggrad" av aggregatet från punkt A till B (A), längs vilken fluorescens och längden på aggregatet kan mätas (B). Längden (C) och "rundhet" (D) från 24 aggregat inom samma experiment visas. Formdeskriptorer såsom rundheten (D), cirkularitet, omkrets och området kan mätas med användning av bildanalys kokbok plugin från bildanalysmjukvara FIJI 35. Mean anges med horisontell linje vid varje tidpunkt;felstaplar visar standardavvikelse; Skalstrecket i (A) indikerar 200 | im. Eftersom det finns små skillnader mellan reportercellinjer, förväntas det att efter en puls av Chi, kommer den genomsnittliga maximala längden och genomsnittlig minsta rundhet hos aggregaten variera. Mellan olika cellinjer, finner vi att den maximala genomsnittliga längden kan vara inom intervallet ~ 400-800 um och den genomsnittliga minsta rundhet mellan 0,4 och 0,6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Exempel på brister i aggregatbildning. Förmågan att generera reproducerbara aggregat (A) beror på kritiska faktorer såsom (Bi) färska och väl blandad sekundärmediet, (Bii, BIII) noggrannheten i att räkna initiala numbra av celler och (Biv) garanterar aggregaten inte bildar vidhäftande kolonier, dvs. "krasch" i ytan av brunnen. Typiska exempel på felen i aggregatbildning för var och en av de nämnda villkoren (B) visas. Skala-bar som anges; se felsökning tabellen för mer information (tabell 1). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Guide till felsökning. Typiska fel i samband med aggregering protokollet ges med förslag på deras upplösning.
Tabell 2. Tabell av cellinjer testades för bildningen av aggRegates. Ett antal cellinjer 19,22,27,30,36-40 har karaktäriserats för bildning av aggregat och, även om små skillnader mellan cellinjer förväntas och har observerats, alla ovannämnda linjerna visar liknande dynamik i termer av töjning och morfologi. I termer av genexpression, är expressionsmönstret specifikt till genen uttrycks, men inom varje cellinje, är i allmänhet konsekvent under ett antal passager expressionsmönstret. För enhetlighetens skull skapar vi aggregat från celler som inte har överskridit 15 passager i kultur.
Tabell 3. Förteckning över representativa antikroppar som används i dessa studier. Ett urval av antikropparna och utspädningsfaktorer som används för aggregerade immunfärgning.
Discussion
Den teknik som beskrivs i detta manuskript effektivt och reproducerbart genererar aggregat av mus embryonala stamceller (mESCs) som displayen organiserad symmetri brytande och förlängning 19, som kombinerar både droppe kultur beskrivs av Marikawa et al. 14 och EB-uppställning. Dessa aggregat går på att utveckla axiella förlängningar, komplettera befintliga metoder för generering av främre organ från ES-celler såsom optiska koppar 11 och hjärnbarken 13, och innehåller celler med identiteter tre germinallager som display processer som liknar dem under gastrulation såsom snabb cellrörelse 19,21.
Det är intressant att spekulera om vilken typ av symmetri brytande händelse, eftersom det förekommer i frånvaro av externa mönstrings vävnader och zygotisk asymmetri Köer 19. Den spontana bildandet av en rudimentär axel kan uppstå från befintlig heterogeneities i startkultur av celler, som ligger till grund för utvecklingen av asymmetri. Faktum populationer av celler som odlats i ESLIF indikering en blandning av självförnyande och differentiering celler, kan de relativa proportionerna av vilka varierar från en aggregat till en annan. Vidare föreslår förberedande arbete i vårt laboratorium som aggregat från en helt pluripotenta population av celler visar försenad utveckling och brister i mönstring, vilket tyder på en roll för heterogenitet i organiserad mönsterbildning (DA Turner & A. Martinez Arias, som en förberedelse). Det är också värt att överväga att ett reaktionsinert diffusionsmekanism kan generera mönstret, med diffusion av en inhibitor bort från ytan av aggregatet. Warmflash et al. 41 tyder på att en sådan mekanism skulle kunna ansvara för att utveckla radiell asymmetri i vidhäftande kultur, vilket gör det till en möjlig kandidat för mönstring i tre dimensioner.
Under inil 48 h samlingsperioden, celler nå ett tillstånd som liknar den i postimplantationsförlust epiblast, där de är behöriga att svara på signaler från den sekundära mediet 19,21,24. Typiskt protokollet beskrivet här ger celler med en puls av sekundära mediet som innehåller faktorer (såsom Wnt / β-catenin agonister) som ger de signaler som är tillräckliga för töjning. Tidigare odlingsförfaranden beskrivna av Lancaster et al. (Med användning av humana ESC 13) och Eiraku et al., (Med mESCs 11) används en kort period av aggregation i lågvidhäftande 96-brunnsplattor innan aggregerade cellerna överfördes till Matrigel droppar för on- går kultur. Även tiden mellan aggregering och Matrigel insättningen var annorlunda mellan studierna, i båda fallen, var ett stort antal celler som används för aggregatbildning (ca 3,000-4,500 celler). Däremot beskrev protokollet här 19 använder betydligt färre celler (ca 400 cellerper aggregat) som har bestämts att vara absolut nödvändig för processen för töjning, symmetri brytande och polarisationen som observeras 19. Dessutom är dessa långsträckta strukturer kan genereras i en mycket kortare tidsperiod utan att bädda i artificiella matriser: jämföra generering av definierade områden i hjärnan från Lancaster et al (> 20-30 dagar) 13 och optiska koppar från Eiraku. et al., (~ 11 dagar) 11 med de 5 dagar som krävs för generering av polariserade långsträckta strukturer.
En av begränsningarna med odlings här beskrivna metoden är emellertid att de endast kan odlas under cirka 5-6 dagar efter utstrykning tills deras storlek gör dem kompetenta under gravitation att sjunka till botten av brunnarna och tvingar en vidhäftning även på icke -belagd plast-ware. Ytterligare experiment med användning av artificiella matriser såsom de som tidigare nämnts, kan tillåta oss att öka tiden förobservationer och experiment, och arbete pågår för att bestämma effekterna av att begränsa aggregaten på ett sådant sätt. En ytterligare begränsning med denna teknik är att för att ändra det medium utan att avlägsna aggregaten måste en liten volym av medium lämnas i botten av brunnen. Konsekvenserna för kemisk genetik tillvägagångssätt är behovet av att beakta denna utspädning och eventuella kvarstående effekter från tidigare medier: på dagen för tre iM Chi puls, är 2,37 iM lösning som faktiskt har levererats, och efterföljande medel förändringar resulterar i en överföring av 0,499 iM (72-96 timmar) och 0,105 iM (96-120 h) mellan tidpunkterna. Pågående arbete har inte korrigerat för spädning och det antas att dagliga medel förändringar kommer att minimera kvarstående effekter.
Det finns ett antal kritiska steg i protokollet att säkerställa både inom och mellan experimentell reproducerbarhet. För det första måste startkultur mESCs vara väl underhållna och inte över confluent, och mediet bör alltid vara god kvalitet dvs., färska och väl blandade (fig 5A, B). Dåliga odlingsbetingelser påverkar aggregering (Figur 5Bi) negativt. Exakt räkning av celler för att få en ~ 400 celler / 40 | il cellsuspension är viktigt, eftersom större aggregat inte själv organisera och är mer benägna att bilda dubbla aggregat inom varje brunn (Figur 5Bii) medan mindre aggregat inte kan nå rätt densitet där de har möjlighet att svara på den stimulans (figur 5Biii). En viktig optimeringssteget var införandet av en andra PBS-tvätt som avlägsnar förorenande serum från cellsuspensionen (steg 2,6); detta förbättrade aggregationen frekvensen och påskyndat utvecklingen av aggregaten med cirka 24 tim. Därefter säkerställer medel ändringar tillämpas med tillräcklig kraft för att få bort eventuella aggregat som har potential att hålla sig till ytan av brunnen; underlåtenhet att göra detta Results i aggregaten 'kraschar "(figur 5Biv). Dessutom, och som tidigare nämnts (och nedan), är det viktigt att säkerställa att aggregaten upprätthålls i suspensionskultur och förhindras från att vidhäfta till någon yta. När aggregaten har anslutit sig, är mönstret av genuttryck och deras förlängning potential störs.
Eftersom denna teknik är relativt enkelt, och väl inom ansvarsområdet för personer med goda vävnadsodlingstekniker, de flesta av de problem som är förknippade med aggregering kan lösas relativt snabbt om dessa kritiska steg följs; ett fullt bord med felsökning finns (Tabell 1). När behärskar, kan denna metod användas för att studera axiella utsträckning, symmetribrott och cell-beslutshändelser. Mer specifikt, dessa aggregat har potential att generera pooler av celler som hittills har varit tillgängliga i kultur, såsom ryggmärgen och motor-neuroner.
Etiska Obs: Det bör noteras med försiktighet att översättningen av detta protokoll till humana ES eller iPS cellodling kunde få försöks nära den rättsliga grunden för de fjorton dagar gränsen för forskning på mänskliga embryon, nämligen för att generera en primitivstrimman, som beskrivs i den mänskliga fertilisering och embryologi Act 2008 (UK) 42. Eftersom lagen omfattar alla levande mänskliga embryon oavsett deras sätt att skapa, skulle odling av humana gastruloids utanför primitiva strimman som scenen vara utanför ramen för tillståndspliktig forskning.
Acknowledgments
Detta arbete finansieras av en ERC Advanced Investigator Award till AMA (DAT, TB) med ett bidrag på en Projektbidrag från Wellcome Trust för att AMA, en EPSRC STUDENT till PB-J och Erasmus, Stichting dr. Hendrik Mullers Vaderlandsch Fonds och Fundatie van de Vrijvrouwe van Renswoude te 's-Gravenhage till SCvdB. Vi vill tacka J. Briscoe, S. Muñoz-Descalzo, C. Schroeter, och T. Rodriguez, för diskussioner och konstruktiva kritik, Joaquin de Navascués för monteringsmedium protokollet och både AK Hadjantonakis och C. Budjan för att dela deras laboratorium protokoll avseende färgning av hela-mount embryon. En tidigare version av denna artikel har tidigare gjorts tillgängliga på bioRxiv Preprint Server 29.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco/Invitrogen | 31350-010 | |
| 25 cm2 Cell Culture Flask | Grenier Bio-one | 690 175 | |
| Benchtop Centrifuge | MSE | MSB020.CX1.5 | |
| BES Buffered Saline (BBS) | Sigma-Aldrich | B2891 | BBS+CaCl2 made by disolving 50 mM BES Sodium Salt, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4 in distilled water with 1 mM CaCl2 adjusted to pH 6.96 with 1 M HCl |
| Centrifuge tubes (15 or 50 ml) | Greiner Bio-One | 118271 or 227261 | |
| CHIR 99021 (Chi) | CSCR | Bought through the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. Stock concentration: 10 mM in DMSO | |
| Dissection Well (30 mm Internal Diameter) | Fisher Scientific | 12678586 | |
| ESLIF | 500 ml GMEM, 5 ml Sodium Pyruvate, 5 ml Non-Essential Amino Acids, 5 ml Glutamax, 1 ml beta-mercaptoethanol, 50 ml FBS and 550 µl LIF (1,000 units). | ||
| Foetal Bovine Serum (FBS) | Biosera | FB-1090/500 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Dissolved in distilled water to a 1 % (w/v) solution, autoclaved and diluted to 0.1% in PBS (see below) for individual use. |
| Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-038 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Improved Neubauer Haemocytometer | Hawksley | AS1000 | |
| Leukaemia Inhibitory Factor (LIF), Recombinant | CSCR | Produced in house by the Wellcome Trust-Medical Research Council Cambridge Stem Cell Institute. | |
| n-Propyl-gallate | Sigma-Aldrich | 02370 | |
| N2B27/NDiff 227 | Stemcells, Inc. | SCS-SF-NB-02 | http://www.stemcellsinc.com/_literature_40366/Technical_Specifications_Ndiff |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco/Invitrogen | 11140-035 | |
| Paraformaldehyde powder | Sigma-Aldrich | P6148 | Dissolved in water to form a 8% Formaldehyde stock solution. Diluted with BBS+CaCl2 to give a 4% working solution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | With Calcium and Magnesium |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360-039 | |
| Sterile Reservoir | STARLAB | E2310-1010 | |
| Sterile, Non-Tissue Culture Treated, U-Bottomed 96-well Plate | Grenier Bio-one | 650185 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
References
- Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl Acad. Sci. 78 (12), 7634-7638 (1981).
- Ramkumar, N., Anderson, K. V. SnapShot: mouse primitive streak. Cell. 146 (3), 488-488.e2 (2011).
- Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. Gastrulation: making and shaping germ layers. Annu Rev. Cell Dev. Biol. 28, 687-717 (2012).
- Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. Gastrulation: From Cells to Embryo. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. 233-262 (2004).
- Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies. Dev. Biol. 371 (2), 170-179 (2012).
- ten Berge, D., Koole, W., Fuerer, C., Fish, M., Eroglu, E., Nusse, R. Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies. Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).
- Nostro, M. C., Cheng, X., Keller, G. M., Gadue, P. Wnt, Activin, and BMP Signaling Regulate Distinct Stages in the Developmental Pathway from Embryonic Stem Cells to Blood. Cell Stem Cell. 2 (1), 60-71 (2008).
- Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 Is a Critical Specifier of Human Primordial Germ Cell Fate. Cell. 160, 1-16 (2015).
- Leahy, A., Xiong, J. W., Kuhnert, F., Stuhlmann, H. Use of developmental marker genes to define temporal and spatial patterns of differentiation during embryoid body formation. J. Exp. Zool. 284 (1), 67-81 (1999).
- Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Koehler, K. R., Hashino, E. 3D mouse embryonic stem cell culture for generating inner ear organoids. Nat. Protoc. 9 (6), 1229-1244 (2014).
- Lancaster, M. A., Renner, M., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Marikawa, Y., Tamashiro, D. A. A., Fujita, T. C., Alarcon, V. B. Aggregated P19 mouse embryonal carcinoma cells as a simple in vitro model to study the molecular regulations of mesoderm formation and axial elongation morphogenesis. Genesis. 47 (2), New York, N.Y. 93-106 (2000).
- Keller, R., Danilchik, M. Regional expression, pattern and timing of convergence and extension during gastrulation of Xenopus laevis. Development. 103 (1), 193-209 (1988).
- Ishihara, K., Tonegawa, Y., Suyemitsu, T., Kubo, H. The blastocoelic fluid of sea urchin embryo induces exogastrulation. J. Exp. Zool. 220 (2), 227-233 (1982).
- Horstadius, S. The Mechanisms of Sea Urchin Development, Studied by Operative Methods. Bio. Rev. 14 (2), 132-179 (1939).
- Holtfreter, J. Die totale Exogastrulation, eine Selbstablösung des Ektoderms vom Entomesoderm. Wilhelm Roux'Archiv für Entwicklungsmechanik der Organismen. 129 (4), 669-793 (1933).
- van den Brink, S. C., Baillie-Johnson, P., et al. Symmetry breaking, germ layer specification and axial organization in aggregates of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Eiraku, M., Watanabe, K., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Turner, D. A., Hayward, P., et al. Wnt/β-catenin and FGF signaling direct the specification and elongation of a neural axial progenitor in ensembles of mouse ES cells. Development. 141 (22), (2014).
- Faunes, F., Hayward, P., et al. A membrane-associated β-catenin/Oct4 complex correlates with ground-state pluripotency in mouse embryonic stem cells. Development. 140 (6), 1171-1183 (2013).
- Kalmar, T., Lim, C., et al. Regulated Fluctuations in Nanog Expression Mediate Cell Fate Decisions in Embryonic Stem Cells. PLoS Biol. 7 (7), e1000149 (2009).
- Turner, D. A., Trott, J., Hayward, P., Rué, P., Martinez Arias,, A, An interplay between extracellular signalling and the dynamics of the exit from pluripotency drives cell fate decisions in mouse ES cells. Biol. Open. 3 (7), 614-626 (2014).
- Turner, D. A., Rué, P., Mackenzie, J. P., Davies, E., Martinez Arias,, A, Brachyury cooperates with Wnt/β-Catenin signalling to elicit Primitive Streak like behaviour in differentiating mouse ES cells. BMC Biol. 12 (1), 63 (2014).
- Ying, Q. -L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
- Ying, Q. -L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat. Biotechnol. 21 (2), 183-186 (2003).
- Rivera-Perez, J. A., Hadjantonakis, A. -K., Johnson, R., Sun, X., Escalante-Alcalde, D. Molecular Embryology of the Mouse. , CSHL. 1-90 (2011).
- Baillie-Johnson, P., van den Brink, S. C., Balayo, T., Turner, D. A., Martinez Arias,, A, Generation of Aggregates of Mouse ES Cells that Show Symmetry Breaking, Polarisation and Emergent Collective Behaviour in vitro. bioRxiv. , (2014).
- Fehling, H. J., Lacaud, G., et al. Tracking mesoderm induction and its specification to the hemangioblast during embryonic stem cell differentiation. Development. 130 (17), 4217-4227 (2003).
- Ring, D. B., Johnson, K. W., et al. Selective Glycogen Synthase Kinase 3 Inhibitors Potentiate Insulin Activation of Glucose Transport and Utilization In Vitro and In Vivo. Diabetes. 52 (3), 588-595 (2003).
- Inman, G. J., Nicolás, F. J., et al. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol Pharmacol. 62 (1), 65-74 (2002).
- Hao, J., Daleo, M. A., et al. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PLoS ONE. 3 (8), e2904 (2008).
- Neely, M. D., Litt, M. J., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chem. Neurosci. 3 (6), 482-491 (2012).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Niakan, K. K., Ji, H., Eggan, K. 12 Sox17 promotes differentiation in mouse embryonic stem cells by directly regulating extraembryonic gene expression and indirectly antagonizing self-renewal. Genes Dev. 24 (3), 312-326 (2010).
- Chambers, I., Silva, J., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
- Rhee, J. M., Pirity, M. K., et al. et al. In vivo imaging and differential localization of lipid-modified GFP-variant fusions in embryonic stem cells and mice. Genesis. 44 (4), New York, N.Y. 202-218 (2006).
- Serup, P., Gustavsen, C., et al. Partial promoter substitutions generating transcriptional sentinels of diverse signaling pathways in embryonic stem cells and mice. Dis. Models Mech. 5 (6), 956-966 (2012).
- Hooper, M., Hardy, K., Handyside, A., Hunter, S., Monk, M. HPRT-deficient (Lesch-Nyhan) mouse embryos derived from germline colonization by cultured cells. Nature. 326 (6110), 292-295 (1987).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 11 (8), 847-854 (2014).
- Human Fertilisation and Embryology ACT 2008 - Elizabeth II. , The Stationery Office. (2008).
