Abstract
بكتيريا معينة قيد التحقيق هنا (س. pasteurii) هي فريدة من نوعها في قدرتها، في ظل الظروف المناسبة، للحث على التحلل من اليوريا (انحلال اليوريا) في البيئات التي تحدث بشكل طبيعي من خلال إفراز من اليورياز الانزيم. هذه عملية انحلال اليوريا، من خلال سلسلة من التفاعلات الكيميائية، ويؤدي إلى تشكيل رواسب كربونات الكالسيوم. هذا هو المعروف باسم الميكروبيولوجية المستحثة الكالسيت الهطول (MICP). وترد تفاصيل بروتوكولات الثقافة المناسبة لMICP هنا. وأخيرا، أجريت تجارب التصور تحت أوضاع مختلفة من الفحص المجهري لفهم الجوانب المختلفة لعملية هطول الأمطار. تقنيات مثل المجهر الضوئي، كانوا يعملون المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والأشعة السينية صور الإلكترون الطيفي (XPS) لتحديد خصائص كيميائيا المنتج النهائي. وعلاوة على ذلك، وقد تجلى قدرة هذه الرواسب لتسد المسام داخل وسط مسامي الطبيعي من خلال تجربة نوعية حيث الإسفنجواستخدمت قضبان لتقليد المسام شبكة مع مجموعة من المقاييس طول. شريط اسفنجة مغموسة في مستنبت التي تحتوي على الخلايا البكتيرية يصلب بسبب انسداد المسام الناتجة عن عملية مستمرة من الترسيب الكيميائي. هذا الشريط الإسفنج تصلب يسلك قوة متفوقة بالمقارنة مع شريط الإسفنج السيطرة التي تصبح مضغوطة وتقلص في إطار العمل من الحمولة الخارجية تطبيقها، في حين أن شريط صلابة غير قادرة على دعم نفس الوزن مع تشوه قليلا.
Introduction
Sporosarcina pasteurii هو نوع من البكتيريا إيجابية الجرام قادرة على البقاء على قيد الحياة في بيئات شديدة القلوية (الرقم الهيدروجيني ~ 10) 1 و هي واحدة من الأنواع البكتيرية التي يمكن أن تصبح عامل المسبب للظاهرة تسمى الميكروبيولوجية المستحثة الكالسيت الهطول (MICP) 2-4. MICP هو عملية يقوم فيها هو فعل ترسيب كربونات الكالسيوم من قبل بعض الميكروبات تحت ظروف بيئية مناسبة. س. وقد تولى pasteurii أهمية في السنوات الأخيرة بسبب هويتها كعامل محتمل للحمل كميات كبيرة من MICP في ظل ظروف معينة. ينبع هذا الاحتمال من كون س. pasteurii لديه قدرة فريدة على إفراز كميات وفيرة من اليورياز الانزيم. ويعمل هذا الانزيم كعامل محفز، والترويج لتحلل المتسارع من اليوريا (أ تحدث بشكل طبيعي مركب كيميائي حيوي مع العرض على نطاق واسع وفيرة) في وجود جزيئات الماء. من خلال سلسلة من ردود الفعل، وهذه العملية في نهاية المطافلاي يؤدي إلى توليد أيونات الكربونات سالبة الشحنة. هذه الأيونات، في المقابل، تتفاعل مع الأيونات المعدنية مثل الكالسيوم إيجابية لتشكيل أخيرا رواسب من كربونات الكالسيوم (الكالسيت)؛ ومن هنا جاءت التسمية MICP 5-9.
عرفت عملية MICP ودرس لعدة عقود 10،11. على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد تم التحقيق MICP لمجموعة واسعة من الهندسة والتطبيقات البيئية بما في ذلك من أسفل إلى أعلى البناء الأخضر 12، وتعزيز الهياكل على نطاق واسع 13،14 واحتجاز الكربون وتخزينه 15،16.
على سبيل المثال، Cunnigham 17 آخرون. آل تصميم ارتفاع ضغط درجة حرارة معتدلة مفاعل تدفق تحتوي على الحجر الرملي الأساسية بيريا. تم تلقيح المفاعل مع البكتيريا س. fridgidimarina وتحت ظروف الضغط العالي حقن ثاني أكسيد الكربون فوق الحرجة، وتراكم هائل من الكتلة الحيوية داخل المجلد المساموقد لوحظ umes، مما أدى إلى تخفيض أكثر من 95٪ في نفاذية. Jonkers وتشلانجين 18 دراسة تأثير بعض سلالات خاصة من البكتيريا على عملية الشفاء الذاتي في الخرسانة. ومن المتوقع لتنشيط البكتيريا نائمة والتي بدورها تساعد القوة الهيكلية عبر MICP المياه الخارجية نقلها إلى شبكة المسام تدخل من خلال مسام السطح. توبلر 19 آخرون. ومقارنة النشاط حال اليوريا س pasteurii مع المياه الجوفية حال اليوريا مصغرة الأصليين في ظل ظروف لصالح MCIP على نطاق واسع، ووجدت أن س. pasteurii لديه القدرة مستمرة لتحسين الكالسيت هطول الأمطار حتى عندما تفتقر إلى مجتمعات السكان الأصليين النشاط اليورياز مسبق. مورتنسن 20 et.al درسوا آثار العوامل الخارجية مثل نوع التربة، وتركيز كلوريد الأمونيوم، والملوحة، وتركيز الأكسجين وتحلل الخلايا على MICP. مظاهرتهم أن عملية المعالجة البيولوجية هي قوية جدا مع التركيبإلخ إلى تباين واسع في الفضاء المعلمة يجسد اللياقة البدنية من هذه العملية لمختلف التطبيقات العلاجية على نطاق واسع وفرت عملية تخصيب المناسبة لتعزيز البكتيريا والاضطلاع بها. فيليبس 21 آخرون. آل تصميم التجارب لدراسة التغيرات في نفاذية وقوة عمود الرمل والحجر الرملي الأساسية بعد حقنها مع س. الثقافات pasteurii. ووجد الباحثون أنه في حين انخفضت نفاذية 2-4 مرات في حين زادت قوة الكسر ثلاث مرات.
س pasteurii ودورها في MICP هم لا تزال غير مفهومة مواضيع البحث النشطة والعديد من القضايا المتصلة بآلية من الترسيب الكيميائي تماما. في ضوء ذلك، من المهم جدا أن يكون مجموعة من بروتوكولات موحدة متسقة لبدقة الثقافة مخزون المخصب بشكل مناسب من S. pasteurii لتحقيق MICP. هنا، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول صارم يضمن تكرار واستنساخ. هذا أماهيصف nuscript بروتوكولات مفصلة لزراعة س. pasteurii ومناسبة إثراء مستنبت للحث على هطول الأمطار. ويجري التحقيق في العملية من خلال تقنيات مختلفة المجهرية مثل الضوئي والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والأشعة السينية صور الإلكترون الطيفي (XPS). محور المخطوطة على عملية MICP. إجراءات مثل SEM وسيمز، ويجري البروتوكولات القياسية راسخة، لا يتم وصفها بشكل منفصل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تنفيذ البروتوكولات التجريبية بالترتيب الموضح أدناه. وناقش بروتوكول ثقافة البكتيرية في القسم 1 (انظر أيضا الشكل 1). ويصف الجزء 2 بروتوكول لإثراء الثقافة المتوسطة باستخدام إضافات خارجية. ويصف الجزء 3 بروتوكولات متعددة وضع المجهر. ويمكن قياس وزن كل عنصر على حدة باستخدام الميزان التحليلي. ويمكن قياس حجم كل الحل باستخدام اسطوانة الحجمي.
ملاحظة: البروتوكولات المناسبة للسلامة الأحيائية يجب اتباعها للأقسام 1 - 2. راجع مكتب سلامة المؤسسات للحصول على التفاصيل.
1. البكتيرية الثقافة
- البكتيريا الثقافة - آجار لوحة إعداد المتوسطة
- تجميع المعدات والمكونات مثل أطباق بتري، قارورة، تريس، قاعدة، حمض الهيدروكلوريك، أجار، ميليبور المياه، ودرجة الحموضة متر etc.Sterilize جميع الحاويات عن طريق التعقيم في درجة حرارة 121 مئوية قبل الاستخدام.
- إعداد 1 لتر من 0.13 M محلول مائي من تريس العازلة عن طريق خلط 15.75 ز تريس قاعدة مع 1 لتر من الماء ميليبور. لخفض مستوى الرقم الهيدروجيني من الحل الأصلي (درجة الحموضة 10.4) إضافة 2800 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك (تركيز 50٪). تحقق باستمرار باستخدام الرقم الهيدروجيني متر لضبط درجة الحموضة = 9.
- تقسيم حل العازلة 1 لتر إلى قسمين كما يلي:
- خذ 800 مل من هذا الحل. تقسيمها بالتساوي إلى قسمين من 400 مل لكل منهما. حل 8 ز (NH 4) 2 SO 4 إلى حل و16 ز خلاصة الخميرة إلى حل آخر واحد.
- خذ المتبقية (200 مل من) حل وتقسيمه مرة أخرى إلى قسمين من 100 مل لكل منهما. خلط 2 غرام (NH 4) 2 SO 4 إلى واحد. إضافة 4 ز خلاصة الخميرة و 4 ز أجار إلى أخرى.
- الأوتوكلاف 4 الحلول بشكل منفصل بعد التفاف قوارير منها في آل احباط والتمسك شريط الأوتوكلاف.
ملاحظة: إذا تم استخدام وحدة الفوق الأوتوكلاف، يجب تعيين حجم 500 مل (درجة الحرارة والضغط الآليمحدد ically بوصفها وظيفة من وحدة التخزين). - بعد اخراجها من الأوتوكلاف، وتعيين اثنين 400 ومل حلول جانبا لخطوة 1.3.1 (أدناه). مزج درجتين 100 ومل الحلول أن يكون لها حل 200 مل. صب الخليط في 10-12 أطباق بتري.
- البكتيريا الثقافة - إعداد نموذج لوحة أجار
- إزالة الأوراق المالية للبكتيريا من الثلاجة (-80 درجة مئوية) والسماح لذوبان الجليد. بعد ذوبان الجليد بشكل صحيح، ضع الأسهم البكتيرية ولوحة أجار داخل غطاء السلامة الأحيائية.
- حدد micropipette من أصغر البعد المتاحة (0،5 حتي 10 ميكرولتر هو خيار جيد) لتصيب طرف مع الأسهم Sporosarcina pasteurii. خط لوحة أجار مع طرف micropipette. وضع لوحة آغار يشوبه داخل الحاضنة غير مهتزة في 31 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- بعد 48 ساعة، وإزالة لوحة من الحاضنة وفحص البصر عن وجود المستعمرات واحد. إذا لم تكن هناك مستعمرات واحدة، ثم وضعه في تيانه الحاضنة لمدة 24 ساعة أخرى.
- كرر العملية حتى يتم الكشف عن المستعمرات واحد. لا يتجاوز 7 أيام من المحاكمة.
ملاحظة: إذا المستعمرات واحد لا تظهر حتى بعد أسبوع، ثم يستنتج أن لم تتبع الخطوات بشكل صحيح ويجب تكرار العملية برمتها من الخطوة 1.
- البكتيريا الثقافة - إعداد نموذج نهائي
- مزج درجتين 400 ومل حلول (عازلة تريس + (NH 4) 2 SO 4 و تريس عازلة + خلاصة الخميرة (1.5.1) معا للحصول على حل 800 مل. نقل 125 مل من هذا المحلول في قارورة.
- إجراء الفحص البصري للسطح لوحة أجار لتحديد المناطق ذات التركيز العالي من المستعمرات واحد. دفع بلطف وكسر واحدة من المستعمرات مع طرف micropipette.
- تراجع نفس micropipette طرف في مل قارورة 125 ويحرك جيدا لضمان عدد كاف من الخلايا للتكاثر قوي الحصول على نقلها. ضع قارورة في حاضنة تهتز في 150 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. بعد 2-3 أيام، وإزالة قارورة من الحاضنة.
- البكتيريا الثقافة - نهائي عدد خلايا
- أداء التخفيف المتسلسل من الحل ثقافة غير المخفف باستخدام برنامج تلفزيوني للوصول الى التخفيف من لا يقل عن عشرة ملايين (10 -7) لضمان تظهر المستعمرات واحد للعد. رسم سبعة خطوط متوازية مسافة واحدة على واحدة من لوحات أجار.
- القيام بذلك عن طريق رسم خطوط عريضة على السطح السفلي من طبق بيتري، بارز بما يكفي لتكون مرئية من أعلى. إسقاط 3 قطرات صغيرة من حل غير المخفف في جزء واحد. إضافة 1 مل من محلول غير المخفف إلى 9 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) للحصول على تخفيف 01:10.
- اتخاذ قسامة صغيرة (~ 0.1 مل) من هذه محلول مخفف حديثا مع ماصة وإسقاط 3 المزيد من قطرات صغيرة على الجزء التالي. نقل محلول مخفف حديثا إلى قارورة جديدة ومزيد من المخفف عشر مرات (10X) من خلالوأضاف في برنامج تلفزيوني. هذا يهبط التخفيف إلى 10 -2 أو 1: 100.
- استخدام هذا 1: حل 100 في الجزء التالي. كرر هذا هو معالجة مع كميات صغيرة من الحلول المخفف الطازج عن طريق نقل تباعا لهم قوارير جديدة وتمييع مستمر عشرة أضعاف (10X) جنبا إلى جنب مع برنامج تلفزيوني للحصول على المزيد وعينات أكثر المخففة من 10 -3 أو 1: 1000 على طول الطريق وصولا الى 10 -7 أو 01:10 مليون في قطاع الماضي.
- أداء مستعمرة-تشكيل عدد حدة (كفو) لوحة لحساب عدد الخلايا الموجودة في لوحة أجار بعد احتضان لوحة لمدة 1-2 أيام في 31 درجة مئوية. وهذا يعطي مقياس كمي لعدد البكتريا في العينة غير مخفف.
ملاحظة: يتم قياس قيمة كفو على أساس قدرة النظام أن تؤدي إلى المستعمرات وفقا للشروط المحددة من وسط الغذائي ودرجة الحرارة والوقت على افتراض أن كل مستعمرة منفصلة وتأسست من قبل خلية الميكروبية قابلة للحياة واحدة. - ختمأطباق بتري مع الذات ختم فيلم وتخزين المتبقي العناصر في الثلاجة لاستخدامها في المستقبل.
- أداء التخفيف المتسلسل من الحل ثقافة غير المخفف باستخدام برنامج تلفزيوني للوصول الى التخفيف من لا يقل عن عشرة ملايين (10 -7) لضمان تظهر المستعمرات واحد للعد. رسم سبعة خطوط متوازية مسافة واحدة على واحدة من لوحات أجار.
2. بروتوكول لإثراء المغذيات لتسريع الهطول
- نقل 9 مل من ثقافة السائل استعداد (خلايا + متوسطة) إلى عدة أنابيب الطرد المركزي معقمة، كل من 10 مل وحدة التخزين.
- إعداد محلول 100 مل الأسهم لتخصيب خارجي يتكون من أربعة عناصر في التركيزات التالية في متوسطة جديدة: اليوريا: 2 غرام / لتر، وكلوريد الأمونيوم: 1 جم / لتر، الصوديوم بيكربونات: 212 ملغم / لتر، كلوريد الكالسيوم: 280 ملغم / L. بعناية قياس كل المكونات باستخدام الميزان التحليلي وتخلط جميع ولكن اليوريا مع المتوسط الطازجة في كوب ومكان في الأوتوكلاف (121 درجة مئوية، و 15 رطل و 15 دقيقة).
- بعد الأوتوكلاف، مزيج الكمية المطلوبة من اليوريا (2 ملغ) مع 1 مل من المتوسط الطازجة ويمر عبر حقنة مزودة 0.22 ميكرون فلتر حقنة لإتمام عملية التخصيب.
- إضافة 1مل من هذه الوسيلة التخصيب مع إضافات إلى أنابيب الطرد المركزي معقمة تحتوي على 9 مل من ثقافة السائل استعداد (خلايا + متوسطة) (راجع الخطوة 2.1).
ملاحظة: من بين جميع هذه المكونات واليوريا كونها قابلة للتحلل في درجات حرارة مرتفعة، لا يمكن تعقيمها في الأوتوكلاف. وبالتالي، بعد أن تم تعقيمها المكونات الأخرى (121 درجة مئوية، و 15 رطل و 15 دقيقة)، وأضاف اليوريا آخر من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون.
- دوامة كل أنبوب دقيق باستخدام وvortexer الميكانيكية. وضع السوائل التخصيب (خلايا + الإضافات + متوسطة) في حاضنة غير مهتزة عند 30 درجة مئوية. رصد جميع الوحدات بانتظام لبدء هطول الأمطار. باستخدام المجهر الضوئي، تبدأ الملاحظات المجهرية بمجرد الكشف عن بداية هطول الأمطار بالعين المجردة. وهذا عادة ما بين 30 - 36 ساعة بعد بدء التجارب.
3. بروتوكول متعدد وضع المجهر
- نقل كمية صغيرة (~ 1 مل) من السائل إلى أعلى مستوى تعظم-أيون المجهري غرف نظام ساترة لأداء الملاحظات الأولية مع وضع حقل مشرق. لتبدأ، وتبدأ جميع الملاحظات مع أدنى التكبير (4X). الذي يوفر مساحة واسعة من التغطية والمعلومات ومن ثم العالمية حول توزيع الرواسب.
- تحديد مناطق معينة مع كميات كبيرة من الامطار وتكبير (20X، 40X، 60X) عن طريق زيادة تدريجيا التكبير.
ملاحظة: بما أنه من المستحيل حل صحيح الخلايا من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) تحت مشرق الميدان (بسبب مؤشرات الانكسار وثيقة جدا)، والتحول في الوضع على النقيض من المرحلة كلما كان ذلك ضروريا. في هذا الوضع، فقط الخطوط العريضة للأغشية الخلايا (وهي مرحلة مختلفة من الخلية الأكبر) واضحة، وبالتالي تمكين التمايز البصرية. - وأخيرا، وصمة عار بعض الدوائر مع لايف وصمة عار / الميت أن الأصباغ بشكل انتقائي المكونات الحية كما الخضراء بينما تلوين العناصر الميتة باللون الأحمر. الرجوع إلى البروتوكولات القياسية 28 </ سوب>.
- التبديل على وضع الفلورسنت للتمييز بشكل صحيح بين المناطق الحمراء والخضراء. الأحمر (الأحمر مرشح مكعب مع الإثارة الطول الموجي من 540-580 نانومتر، مزدوج اللون مرآة من 595 نانومتر، والحاجز مرشح من 600-660 نانومتر) والأخضر (GFP طويل تمرير مرشح الأخضر مكعب مع الإثارة الطول الموجي من 440-480 نانومتر، مزدوج اللون مرآة وتستخدم 505 مرشح نانومتر، والحاجز من 510 نانومتر) مرشح مكعبات لتسهيل الميكروسكوب الفلورسنت.
- مرة واحدة وقد تم جمع جميع البيانات متعددة واسطة، واختيار أفضل الصور وتراكب يدويا (brightfield الفردي، على النقيض من المرحلة والصور الفلورسنت) للحصول على أفضل النقيض من الممكن والوضوح.
- أداء وزارة شؤون المرأة على العينات الصلبة المجففة لفهم هياكل الكريستال. هذا هو إجراء راسخة ومعيار 22 نفذ XPS لتحديد التوقيعات الكيميائية للمجموعات وظيفية (الكربونات). هذا هو إجراء راسخة والقياسية أيضا. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
س pasteurii كونه alkaliphile 24 يمكن البقاء على قيد الحياة ظروف قاسية نسبيا. عندما يتبع بروتوكول ثقافة المذكورة أعلاه، وس. ويزرع pasteurii داخل غرفة، والبكتيريا يؤدي إلى هطول الأمطار من كربونات الكالسيوم على مر الزمن (الشكل 2A). الشكل 2 (ب) يظهر على النقيض من المرحلة صورة مجهرية ضوئية من السكان الخلية البكتيرية داخل مستنبت. الخلايا الفردية يمكن تمييزها بوضوح، مع الأشكال مثل قضيب مميزة من الطبقة عصية من البكتيريا واضحة تماما. وقد استخدمت السهام البني صغيرة لتسليط الضوء على وجه التحديد اثنين من الخلايا الفردية. ترسيب كربونات الكالسيوم ويحدث على مدى فترة من عدة أيام. ويبين الشكل 2A كيف تستقر الرواسب إلى أسفل في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. ويمكن ملاحظة ذلك بوضوح بالعين المجردة على شكل مسحوق بيضاء يجلس تحت المتوسطة السائل معتناقض حاد في اللون بدلا من السائل مصفر. السائل الأصفر يحتوي على بكتيريا معلقة في المتوسط ثقافتهم. وقد تم جمع الرواسب البيضاء والمجففة وتصويرها في وقت لاحق باستخدام SEM (الشكل 2C).
في الشكل 3A، وخطوط الانقسام واضحة المعالم، وهي السمة المميزة من التبلور، يمكن التعرف عليها بسهولة. ويبين الشكل 3B الرسم البياني XPS لنفس العينة لتوصيف. قمم المقابلة لمجموعة الكربونات دبوس نقطة وجود كربونات الكالسيوم. وبالتالي، الشكل 3A و B معا بشكل قاطع يثبت الجيل من الكالسيت كما الكيميائية المترسبة.
تم إجراء التجربة النوعية من أجل تقييم قدرة MICP لتغيير خصائص وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها. تحقيقا لهذه الغاية، أجرينا تجربة تنطوي الإسفنج التي من المتوقع أن تقليد مساميةمتوسطة مع مجموعة من المقاييس طول الهياكل المسام، كما هو موجود في الهيكل الطبيعي المعتاد. وتغمر شريط الإسفنج (السيد النظيفة، P & G) في حل من S. pasteurii لمدة 7 أيام ثم يجفف. الاسفنجة بعد التعرض لفترة طويلة لعملية MICP تصلب وعرضها تعزيز قوة ضاغطة. ويصور هذا في الشكل 4 الاسفنجة قبل الغمر (حالة المراقبة)، وأظهر ضغط كبير عندما تتعرض لوزن 1 كغم (الشكل 4A - B). من ناحية أخرى، بعد تعرضه إلى الانغماس في س. حل pasteurii، أنها عانت مسام انسداد بسبب أدى هطول الأمطار الكالسيت. وأدى ذلك إلى زيادة هائلة في القوة الناتجة عن سد الفراغات المسامية وتمكين شريط لدعم الحمل 1 كغ دون السماح ضغط كبير (الشكل 4C - D) في وقت لاحق.
وهناك فكرة شبه الكميةبخصوص عملية تصلب يمكن الحصول عليها من خلال قياسات ارتفاع انحراف شريط تحميل. العينة الإسفنج الأصلي هو شريط مستطيل يبلغ ارتفاعه 4.5 سم. انحراف العينة السيطرة، قريبة جدا من وجهة تطبيق الحمل، ما يقرب من 1.6 سم. في حالة العينة المعالجة، وانحراف يقلل إلى 0.6 سم. وعلاوة على ذلك تقدير دقيق للعملية تصلب هو ممكن أيضا. على سبيل المثال، تم اقتراح التفسير الآلي لهذه العملية من حيث الزيادة في قوة القص، والإجهاد deviatoric الذروة والزوايا إيساع التي كتبها Tagliaferri 25 آخرون. القاعدة من خلال التصوير بالأشعة السينية وارتباط الصور الرقمية.
الشكل 1. الخطوط العريضة للبروتوكول الثقافة كامل يمثلها باعتباره تخطيطي حسابي. بادئ ذي بدء، تريس العازلة وحل أجار هو poureد في طبق بيتري. مرة واحدة لوحة أجار جاهزة، ومجزع مع تلميح تعج البكتيريا. والمحتضنة لوحة يشوبه أن تنمو المستعمرات واحد. يتم نقل واحدة من المستعمرات واحد إلى قارورة سائل الإعلام وحضنت مرة أخرى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. خلايا ورواسب (أ) الخلايا في مستنبت محصورة داخل الرصاص أنبوب الطرد المركزي لمسح ملاحظتها الترسيب الكيميائي (بعد 5-7 أيام). أن يستقر في القاع وغير مرئية للعين المجردة. (ب) عدد السكان من البكتيريا ثبتوا على سطح ينظر في إطار المرحلة على النقيض. يمكن أن ينظر إليها الخلايا على شكل قضيب الفردية (عصيات، وصفت يرة سورية) بشكل واضح (اثنين منهم أبرزها السهام). (C) ووزارة شؤون المرأة صورة راسب أبيض يظهر كل من خلايا (SP) وبلورات (نسخة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. بلورات وتوصيف تلك. (A) الضوئي الإلكترون صورة المجهر من راسب المجففة. البلورات الفردية وخطوط الانقسام المرتبطة بها واضحة للعيان. (ب) X-راي صور الإلكترون الطيفي (XPS) الرسم البياني للراسب كيميائي؛ قمم مطياف الكتلة المقابلة لكربونات مجموعة وظيفية تعزز إمكانية وجود الكالسيت. الرجاء النقر هنا لالسادسEW نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. تجربة شبه الكمية مع أشرطة الإسفنج العامل بوصفه النموذج الأوساط المسامية. (A) و (B) هي عينات جافة جديدة لا تراجع. (C) و (D) وعينات الرطب منقوع في محلول المتوسطة والخلايا. أنها تظهر زيادة كبيرة في مقاومة مادية بسبب انسداد المسام الناتجة عن هطول الأمطار الكالسيت كما يتضح هنا من انخفاض ضغط في إطار العمل من وزن ثابت. عينات غير المعالجة هي التي يسهل اختراقها بصورة طبيعية وتعاني انخفاض كبير في حجم عندما تتعرض للوزن 1 كجم. المسام اخراج الهواء والعقد، مما أدى إلى انخفاض عام في الحجم. من ناحية أخرى، وقد اكتسب العينة تعامل بشكل مصطنع على كمية كبيرة من صلابة بحكم انسداد المسام. فإنه يدل على تعزيز ملحوظ في قوة عندما تدعم بشكل مريح تحميل نفسه من دون أي ضغط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة: تصف هذه المخطوطة في التفاصيل البروتوكولات لزراعة عينة قابلة للحياة س. pasteurii. مرة واحدة وقد اعدت الثقافة، لا بد من التخصيب بشكل مناسب. هذا هو خطوة رئيسية حيوية لنجاح التجربة لأن الفشل في توفير البيئة المناسبة الكيميائية يؤدي إلى أي جداول زمنية طويلة جدا من الأمطار أو انعدام تام منه. س. pasteurii حساس جدا للعديد من الوكالات الخارجية، ويجب أن يكون المثقف مع وجود درجة عالية من العناية والدقة لضمان متانة البيوكيميائية والتكرار. ومن المعروف مدى وجرعة من تخصيب الآن أن تملي طبيعة الكيميائية من هطول الأمطار، وبالتالي يجب السيطرة بدقة أيضا.
التعديلات / استكشاف الأخطاء وإصلاحها: عدة جوانب يمكن تعديلها مع تباين طفيف في النتائج النهائية. ليس من الضروري أن يتم تنفيذ عدد لوحة في تقنية المذكورة أعلاه (التخفيف المسلسل في الالبريد مايلز ميسرا الطريقة). هنا، قد تم تنفيذ التخفيف المتسلسل على لوحة أجار واحد عن طريق تقسيمه إلى سبع مناطق من الحبال مرسومة على سطحه السفلي. هذا ليس إلزاميا. كما انها ممارسة شائعة لاستخدام لوحة أجار كامل لتخفيف معين من خلال إعداد لوحة انتشار. يتم تنفيذ التخفيف المتسلسل على سلسلة من لوحات انتشار المتعاقبة واحد مع عدد معدود من المستعمرات واحد (20-200) يتم اختياره لحساب النهائي. أي من تقنيات مختلفة عد الخلايا الأخرى يمكن تطبيقها هنا كذلك. قد يكون جيدا أداء المجهري مع زلات تغطية بسيطة أو الشرائح. وحدة غرفة ليست إلزامية على الإطلاق.
في بعض الأحيان، قد تفشل البكتيريا لتشكيل الرواسب. ومن المفيد لنقل كمية صغيرة من ثقافة المجمدة في الوسط السائل أولا. ويمكن تنفيذ تسليط الضوء بعد وقوع النمو في أول السائل.
القيود: هذا هو أسلوب بطيئة مع نوmber من الخطوات، واحدة مما يؤدي إلى أخرى. هناك فرص كبيرة من التلوث، التلوث المتبادل والعيوب الثقافية الأخرى في جميع الخطوات. يجب الحفاظ على الرعاية المكثفة في جميع الأوقات. ويتكون حوالي 180 ملغ من راسب في مل من محلول الثقافة.
أهمية: ويحدد البروتوكول بالتفصيل جميع الخطوات اللازمة لضمان أن ثقافة بكتيريا S. pasteurii يترسب بأمانة الكالسيت تحت تأثير التخصيب وأضاف خارجيا. على الرغم من أن ثقافة هذه البكتيريا في حد ذاته هو بروتوكول الراسخة، والعملية برمتها من التخصيب والكمي ليست كذلك. وقد تم تناول هذه المسألة هنا.
التطبيقات المستقبلية: قد يكون من الممكن أن تعدل بشكل مناسب هذه البكتيريا لترسيب بطرق مختلفة وهذا بدوره يمكن هندستها لمختلف التطبيقات اعتمادا على طبيعة الرواسب. وقد ذكرنا سابقا أن هناكتوجد عدة المجهولة فيما يتعلق MICP تنطوي S. pasteurii. وتشمل بعض هذه المجهولة دور ديناميات حصري س pasteurii في عملية MICP، دور البيئة الميكروسكيل 26،27 مثل تأثير وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها وتدفق السوائل. بروتوكول موحد يمكن تطويرها بما يضمن هطول سريع مع فرصة واضحة للأداء السليم متعدد الأوضاع المجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridishes being used as Agar plate |
| Pyrex Flasks | Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer |
| Tris-Base | Promega | H5133 | being used to make Tris-Buffer |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture |
| Agar Powder | Sigma-Aldrich | A1296 | microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder |
| Ammonium Sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | for Molecular Biology |
| Yeast extract powder | Sigma-Aldrich | 51475 | |
| Measuring Cylinder | Cole-Parmer | CP08559GC | Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk |
| Analytical Balance | OHAUS | AX124E | being used to measure weight of reagents |
| Autoclave | Brinkmann | 58619000 | |
| Autoclave Tape | VWR | 52428864 | |
| Aluminum Foil | Sigma-Aldrich | Z185140 | being used to seal the flask before placing it in Autoclave |
| Bacterial Stock | Cedarlane | 11859 | -80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No. |
| Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume | Biohit | 725010 | Marketed by VWR under catalog number 14005976 |
| Micropipette Tip | Fisher Scientific | 212772B | Used for scratching Agar plates |
| Incubator | Binder | 80079098 | Microbiology Incubator,BF Series |
| Shaking Incubator | VWR | 14004300 | VWR Signature Benchtop Shaking Incubators |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
| BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device | BD Biosciences | 357590 | Marketed by VWR under catalog number 53106220 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Being used to seal Agar plates |
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | Enrichment for nutrient medium |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | Enrichment for nutrient medium |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | Enrichment for nutrient medium |
References
- Gibson, T. An investigation of the Bacillus pasteurii group. Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).
- Greenfield, L. J. Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium. Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).
- Phillips, A. J. Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review. Biofouling. 29, 715-733 (2013).
- Dhami, N. K., et al. Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review. Frontiers in microbiology. 4, 314 (2013).
- Cuthbert, M. O., et al. Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation. Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).
- Okwadha, G. D., et al. Optimum conditions for microbial carbonate precipitation. Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).
- Stocks-Fischer, S., et al. Microbiological precipitation of CaCO3. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).
- Lauchnor, E. G., et al. Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system. Environmental science & technology. 47, 1557-1564 (2013).
- Al Qabany, A., et al. Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation. Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).
- Morita, R. Y. Calcite precipitation by marine bacteria. Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).
- Chafetz, H. S. Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation. Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).
- Biomason.com. , Available from: http://www.biomason.com (2015).
- Whiffin, V. S. Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement. , Murdoch University. PhD thesis (2004).
- Paassen, L. A., et al. Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method. Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2. Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers. Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).
- Jonkers, H. M., et al. Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete. Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).
- Tobler, D. J., et al. Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies. Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).
- Mortensen, B. M., et al. Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation. Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).
- Phillips, A. J., et al. Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation. Environmental science & technology. 47, 142-149 (2013).
- Robbins, R. Scanning Electron Microscope Operation. , Available from: http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf (2010).
- vander Heide, P. X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices. , John Wiley & Sons. (2011).
- Wiley, W. R., et al. Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii. Journal of Bacteriology. 84, (1962).
- Tagliaferri, F., et al. Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging. Granular Matter. 13, 247-250 (2011).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).
- Valiei, A., et al. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).
- LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf, https://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/live-dead-baclight-bacterial-viability-protocol.html (2004).
