Abstract
被调查的特定的细菌在这里（S.巴氏 ）是其独特的能力，在合适的条件下，促使尿素（尿素水解）的水解通过脲酶分泌的自然发生的环境。尿素水解的过程中，通过化学反应的链，导致碳酸钙沉淀的形成。这被称为微生物学诱导方解石降水（MICP）。对于MICP适宜的培养协议这里详述。最后，在显微镜下的不同模式的可视化实验以了解沉淀过程的各个方面。像光学显微技术，扫描电子显微镜（SEM）和X射线光电子能谱（XPS）进行了用于化学表征终产物。此外，这些沉淀物会堵塞一个天然的多孔介质毛孔里面的能力，通过定性实验，其中海绵证明棒用来模仿细孔网络与一系列长度尺度。在含有细菌细胞培养液中浸渍的海绵棒变硬由于其孔从化学沉淀的连续方法得到的的堵塞。相比其中被压缩和施加的外部负载的作用下挤压的控制海绵条时，而硬化杆能够支持相同重量很少变形此硬化海绵棒表现出优异的强度。
Introduction
Sporosarcina巴氏是革兰氏阳性细菌能够在高碱性环境（pH约10）1生存并且是细菌种类，可以成为一个所谓微生物学诱导方解石沉淀（MICP）2-4现象病原体之一。 MICP是一种方法，其中碳酸钙的沉淀是通过合适的环境的条件下某些微生物引起的。S.巴氏已假定近年来重要性由于其识别为在特定条件下诱导MICP的显著体积的可能剂。这种可能性来源于这样的事实即S.巴氏具有分泌丰富量的脲酶的独特能力。这种酶作为催化剂，促进尿素水分子的存在加速溶解（具有广泛和供应充足的天然存在的生化化合物）。通过反应的级联，该方法的最终LY导致带负电的碳酸根离子的生成。这些离子，又与正金属离子如钙，最终形成碳酸钙（方解石）的沉淀反应;因此标签MICP 5-9。
MICP的方法已经知道并研究了数十年10,11。在过去的几年中，MICP已经研究了一系列工程和环境应用，包括自下而上的绿化建设12，加强大型结构13,14和碳吸收和储存15,16的。
例如，Cunnigham 17等。人设计包含贝雷砂岩核心的高压中温流反应器。将反应器与细菌S.接种fridgidimarina和高压的超临界二氧化碳注入，生物量的孔隙体积内的大量积累的条件下超微电极观察到，这导致在透过性降低95％以上。 Jonkers和施兰根18研究在混凝土的自愈过程细菌的某些特殊菌株的效果。运入通过表面气孔进入孔隙网络外部的水有望激活休眠的细菌从而有助于结构强度通过MICP。托布勒19等。比较了S的尿素分解活性有利于大型MCIP条件下的地下水本土尿素分解缩影巴斯德发现S.巴斯德具有一致的能力，以提高方解石沉淀即使在土著社区缺乏事先脲酶活性。莫滕森20 et.al已经研究的外部因素，如土壤类型，氯化铵，盐度，氧浓度和MICP裂解细胞浓度的影响。他们论证了生物处理工艺非常稳健与RESP等在参数空间中的巨大差异证实了这一过程提供了一个合适的浓缩工艺，以加强细菌进行各种大型整治应用的健康。菲利普斯21等。人的实验设计与S.被注射后，研究在砂柱和砂岩核心的渗透性和强度的变化巴氏文化。他们发现，尽管渗透性下降了2 - 4倍，而断裂强度提高三倍。
S.巴氏及其在MICP的作用是积极的研究和有关化学沉淀机制若干问题的主题仍然没有完全理解。鉴于此，它拥有一套一致的标准化协议，以准确地文化S的适当丰富的股票是非常重要的巴斯德实现MICP。在这里，我们勾勒出一个严格的协议，以确保重复性和再现性。此马nuscript描述了详细的协议，培养S.巴斯德和适当丰富培养基，以诱使降雨。该过程通过各种显微镜技术如光学和扫描电子显微镜（SEM）和X射线光电子能谱（XPS）研究。手稿的重点是MICP的过程。程序，如：SEM和SIMS，是行之有效的标准协议，不单独介绍。
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Protocol
注意：在下面描述的顺序执行的实验方案。细菌培养协议在第一节中讨论（也如图1所示 ）。第2节描述欲得使用外部添加剂的培养基中的协议。部分3描述了一种用于多模式显微镜的协议。所有的单个组分的权重可以使用分析天平进行测定。各溶液的体积可以使用量筒来测定。
注意：正确的生物安全协议必须遵守的第1 - 2咨询机构安全办公室了解详情。
1.细菌培养
- 文化细菌-琼脂平板培养基的制备
- 组装设备和成分如陪替氏培养皿，烧瓶，Tris碱，盐酸，琼脂，Millipore公司水，pH计etc.Sterilize使用前在121℃的所有容器高压灭菌。
- 制备1升的0.1通过混合15.75克Tris-碱用1L微孔水的Tris-缓冲液的3M水溶液。为了降低原溶液（pH 10.4）的pH值增加2800微升盐酸（50％浓度）。连续查用pH计来设置的pH = 9。
- 除以1升缓冲溶液分成两部分，如下所示：
- 取800毫升此溶液。同样将其划分成各为400毫升双部分。溶解8克（NH 4）2 SO 4的一个溶液中，16克酵母提取物的其他解决方案。
- 取剩余（200毫升）溶液，并再次将其分成的每次100ml两部分。混合2克（NH 4）2 SO 4为一个。添加4个克酵母提取物和4g琼脂到另一个。
- 在铝箔包装各自的瓶贴及胶带高压锅分开后的高压灭菌4解决方案。
注意：如果一个台式高压釜单元被使用时，体积应设定为500毫升（温度和压力下自动贩卖机ically指定为体积的函数）。 - 从高压釜中取出来后，静置步1.3.1（下）设置两个400毫升解决方案。混合两个100ml的解决方案，有200毫升的溶液。将混合物倒入10 - 12培养皿中。
- 文化细菌-琼脂平板样品制备
- 从冰箱（-80°C）中取出细菌股票，并允许它解冻。正确解冻后，将细菌股票和生物安全罩内的琼脂平板上。
- 选择最小可用尺寸的微量（0.5 - 10微升是一个不错的选择）侵扰与Sporosarcina巴斯德股票一角。条纹的琼脂平板用枪头。将非振荡培养箱里面的条纹琼脂平板在31℃48小时。
- 48小时后，从孵化器中取出板，并目视检查单个菌落的存在。如果没有单个菌落，然后将其放置在叔他孵化另外24小时。
- 直到检测单菌落重复上述过程。不要超过7天试用。
注：如果甚至一个星期后，然后可以得出结论的步骤没有正确地遵循和全过程必须从步骤1重复不会出现单菌落。
- 文化细菌-最终样品制备
- 混合两种400毫升溶液（Tris缓冲液+（NH 4）2 SO 4和Tris缓冲液+酵母提取物（1.5.1）在一起，得到一个800 ml溶液。转移125毫升此溶液加入到烧瓶中。
- 执行琼脂平板的表面上的可视检查，以确定与单个菌落的高浓度区。轻轻轻推，打破了枪头的殖民地之一。
- 浸在同一枪头到125毫升烧瓶中，充分搅拌，以确保有足够数量的细胞的稳健乘法得到转移。放置烧瓶在振荡培养箱中于150rpm下，30℃下2 - 3天。经过2 - 3天，取出从孵化器的烧瓶中。
- 文化细菌-最终的细胞计数
- 执行使用PBS以获得至少十元（10 -7）的稀释液，以确保可数单个菌落出现的非稀释的培养液连续稀释。借鉴琼脂平板一七平行等距线。
- 在培养皿中，足以突出的是由上可见的底面上画上粗线做到这一点。降3个非稀溶液的小滴成一个段。 1毫升未稀释的溶液添加到9毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）中以获得1:10稀释。
- 采取用吸管这个新稀释的溶液中的一小等分试样（〜0.1ml）中，并滴在下一段3更小滴。新近稀释溶液转移到一个新的烧瓶中，并进一步稀释至10倍（10倍）加入PBS。这使向下稀释至10 -2或1：100。
- 使用此1：在接下来的段100的解决方案。 1000一路：通过连续将其转让给新瓶和串联不断稀释十倍（10X）用PBS从10 -3或1获得越来越稀的样品重复这一点，他与新鲜稀释溶液的小体积处理下降到10 -7或1:10万成最后一段。
- 执行集落形成单位（CFU）平板计数孵育该板1之后，计数存在于琼脂平板上的细胞数量 - 在31℃2天。这使未稀释样本中的细菌计数的定量量度。
注：CFU值是基于系统对产生的菌落的营养培养基，温度和时间的假定每菌落是单独的，并通过一个单一的存活的微生物细胞创办在特定条件下的能力进行测定。 - 密封培养皿具有自密封膜和储存以备将来使用冰箱剩余项目。
- 执行使用PBS以获得至少十元（10 -7）的稀释液，以确保可数单个菌落出现的非稀释的培养液连续稀释。借鉴琼脂平板一七平行等距线。
2.协议养分富集加速降水
- 传输9传毫升制备的培养液（细胞+培养基）的成若干灭菌离心管，每次10毫升体积。
- 准备在新鲜培养基下列浓度包含四个组件的外部富集的100毫升原液：尿素：2克/升，氯化铵1克/升，碳酸氢钠：212毫克/升，氯化钙：280毫克/升。使用分析的平衡仔细测量所有的成分，并与在烧杯中的高压釜新鲜培养基和地点（121℃，15psi的，15分钟）混合所有但尿素。
- 以下高压釜中，混合脲（2毫克）用1ml新鲜培养基的所需量和穿过装配有0.22微米的注射器过滤器，以完成浓缩过程的注射器。
- 加1毫升添加剂，由9毫升准备好的培养液（细胞+培养基）的无菌离心管这种增菌培养基中（见步骤2.1）。
注：所有的这些组分中，尿素是在高温下可降解的，不能在高压灭菌器灭菌。因此，其它成分被高压灭菌后（121℃，15磅，15分钟），尿素最后通过0.22μm注射器式滤器加入。
- 涡流每个管彻底使用机械涡旋。放置富集液体（细胞+培养基+添加剂）在非振荡培养箱中于30℃。定期监测所有的单位降水开始。使用光学显微镜，一旦沉淀发作肉眼检测开始显微镜观察。实验开始后的36小时 - 这通常30之间。
3.协议的多模式显微镜
- 转移的流体的小体积（〜1ml）中，以高尊离子显微镜 - 腔玻璃罩系统执行与亮场模式初步意见。首先，先从最低放大倍率（4X）所有观测。其提供覆盖和关于析出物的分布，因此全局信息的广泛区域。
- 选择特定区域与析出物显著卷和通过逐渐增大放大倍数放大（20X，40X，60X）。
注：由于这是不可能妥善解决从胞外聚合物物质（EPS）在明场细胞（由于非常接近的折射率），开启相衬模式必要时。在这种模式下，小区膜（作为一个不同的相位比体细胞）的仅有的轮廓是可见的，从而使视觉分化。 - 最后，一些染色与商会选择性染带电部件的绿色，而着色红色死者组件活/死染色。参阅标准协议28 </ SUP>。
- 交换机上的荧光模式，以适当的红色和绿色区域之间区分。红（红色滤光器立方体540激发波长 - 580纳米，600 595 nm和屏障过滤器的分色镜 - 660 nm），而绿色（GFP长通绿色滤波器立方体440激发波长 - 480纳米，分色镜的510纳米）过滤器立方体505纳米和屏障过滤器是用来促进荧光显微镜照片。
- 一旦所有的多模式数据已经被收集，选择最佳的图像和手动覆盖（个体明，相衬和荧光图像），以获得最佳的对比度和清晰度。
- 在干涸的固体样品扫描电镜进行了解的晶体结构。这是一个行之有效的标准和程序。22执行XPS找出官能团（碳酸酯）的化学签名。这是一个行之有效的标准和程序以及23
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Representative Results
S.巴斯德作为一个alkaliphile 24能够生存条件比较苛刻。当上述培养协议之后，和S.巴氏生长的腔室的内部，该细菌会导致碳酸钙的随时间（ 图2A）的沉淀。 图2（b）表示在培养基中的细菌细胞群体的相差光学显微镜图像。单个细胞能够清楚地区分，与芽孢杆菌类的细菌很明显的特征棒状的形状。小棕色箭头已用于特异性突出两个单独的电池。碳酸钙的沉淀发生在一段数天。 图2A示出的析出物如何安定下来在离心管的底部。这可以用肉眼清楚地视为白色粉末坐在与液体介质下在颜色形成鲜明的对比，而不是到淡黄色液体。该微黄色液体含有悬浮在他们的培养液中的细菌。白色沉淀物收集，干燥和后使用SEM（ 图2C）成像。
在图3A中 ，该明确定义的切割线，结晶度的一个标志，可以容易地识别。 图3B示出了用于表征相同的样品的XPS图。相应于碳酸酯基针点碳酸钙的存在的峰。因此， 图3A和B一起最终证明方解石的产生作为沉淀的化学品。
定性实验，以评估MICP来改变多孔介质的性质的能力进行。为此目的，我们进行了实验，涉及海绵，预计以模仿多孔用的范围内的孔隙结构的长度尺度的介质，如在典型的自然结构被发现。海绵棒（清洁先生，P＆G）沉浸在S的解决方案巴氏为期7天，然后干燥。长时间暴露在MICP处理后的海绵硬化和显示增强抗压强度。这在图4描绘的海绵，浸渍前（对照情形），当经受1kg的重量（ 图4A - B）显示显著压缩。另一方面，后受到浸没在S.巴氏溶液，它遭受毛孔堵塞由于所得方解石沉淀。这导致强度从孔隙空间的桥接而产生的大量增加，并随后使栏，提供1千克加载，而不允许显著压缩（ 图4C - D）。
半定量的想法关于硬化过程可通过装载杆的偏转高度的测量来获得。原来的海绵样品是4.5厘米高的长方形条。对照检查标本的偏转，非常靠近负载的应用的角度来看，是约16厘米在处理过的样品的情况下，偏转减少到0.6厘米硬化过程的进一步严格量化也是可能的。例如，该方法中在剪切强度，峰偏应力和剪胀角度增加方面具有机械解释已经提出Tagliaferri 25等。人通过X射线成像和数字图像相关。
图1 表示为算法原理整个培养协议的大纲。首先，三缓冲和琼脂溶液是poured在培养皿。一旦琼脂平板上准备好了，它有条纹与细菌出没的小费。划线平板孵育成长单菌落。其中单菌落被转移到媒体烧瓶中，再培养。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 细胞和沉淀物 （A）中在密闭离心管导内以清除可观察到的化学沉淀培养基中（后5 - 7天）的细胞。这在底部平息下来并是肉眼可见。固定下相衬看到表面上的细菌（B）人口。个别杆状细胞（杆菌，标记为SP）可以清楚地看出（他们夫妇用箭头高亮显示）。同时显示单元（SP）和晶体（CC）的白色沉淀物（C）SEM图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3. 晶体及其表征。干燥的沉淀物（A）的扫描电子显微镜图像。单个晶体和相关的裂解线是清晰可见。化学沉淀物（B）的X射线光电子能谱（XPS）图。相应的碳酸盐官能团加强方解石的存在的可能性质谱峰。 请点击此处为viEW这个数字的放大版本。
图 4. 半定量实验用海绵棒担任原型多孔介质中 （A）和（B）不新鲜蘸干样。 （C）和（D）是在培养基和细胞的溶液中湿透湿样品;它们显示出在料阻力显著增加由于从方解石沉淀得到恒重的作用下如这里从减少压缩可见毛孔堵塞。未处理的样品是天然多孔的并且当经受1kg的重物遭受体积大幅减少。孔挤出的空气和收缩，导致尺寸总体减少。另一方面，经处理的样品已人为地凭借孔隙堵塞获得刚度的显著量。它表明在实力明显强化，当它舒适支持无任何压缩相同的负载。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
关键步骤：该手稿详细介绍了协议的培养S的一个可行的样本巴斯德 。一旦培养已准备好，必须适当地富集。这是在实验的成功是至关重要的关键步骤，因为未提供适当的化学环境导致要么沉淀或其完全缺乏的很长的时间尺度。S.巴氏是几个外部机构相当敏感，并且必须以高度小心和精确的进行培养，以确保生化鲁棒性和可重复性。浓缩的程度和剂量现在已知口授沉淀的化学性质，因此，必须被精确地控制为好。
修改/故障排除：几个方面可能与最终结果有点变化进行修改。平板计数不必按照上述每第（串行稀释所描述的技术来执行Ë万里米斯拉法）。在这里，连续稀释已在单个琼脂板将其分成七个区域由在其底表面引出的和弦进行。这不是强制性的。这也是一种常见的做法通过准备扩展板使用整个琼脂平板特定稀释。被选择为最终计算 - 系列稀释是在一系列连续扩散板和一个与单菌落（200 20）的一个可数进行。任何的各种其他细胞计数技术可以在这里也可以应用。显微镜很可能是用简单的盖片或幻灯片进行。一室单元是不是在所有强制性的。
有时，细菌可能会失败，以形成沉淀物。它的冷冻培养少量第一转移到液体介质是有用的。发生生长后在液体中的第一，可以执行条纹。
限制：这是一个NU一个缓慢的技术步骤MBER，一条通往另一个。有在所有的步骤污染，交叉污染和其他文化缺陷显著机会。深层护理必须保持在任何时候都。约180毫克的沉淀物是每毫升培养液而形成的。
意义：本协议里面详细列举了所有必要的步骤，以确保细菌S.文化巴氏忠实沉淀外部添加富集的影响下方解石。虽然这种细菌本身的文化是一个成熟的协议，富集和量化的整个过程是没有的。此问题已得到解决在这里。
未来应用：这可能是可以适当调节这种细菌在这反过来可以被工程化以根据析出物的性质不同的应用不同的方式沉淀。这是以前提到，存在多个未知相对于MICP涉及S.巴斯德 。一些未知的包括S的聚集动力学作用巴氏在MICP过程中，微型环境26,27的作用，如多孔介质和流体流动的影响。一个标准化的协议，可以开发出确保与执行适当的多模镜一个明显的机会，快速沉淀。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridishes being used as Agar plate |
| Pyrex Flasks | Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer |
| Tris-Base | Promega | H5133 | being used to make Tris-Buffer |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture |
| Agar Powder | Sigma-Aldrich | A1296 | microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder |
| Ammonium Sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | for Molecular Biology |
| Yeast extract powder | Sigma-Aldrich | 51475 | |
| Measuring Cylinder | Cole-Parmer | CP08559GC | Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk |
| Analytical Balance | OHAUS | AX124E | being used to measure weight of reagents |
| Autoclave | Brinkmann | 58619000 | |
| Autoclave Tape | VWR | 52428864 | |
| Aluminum Foil | Sigma-Aldrich | Z185140 | being used to seal the flask before placing it in Autoclave |
| Bacterial Stock | Cedarlane | 11859 | -80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No. |
| Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume | Biohit | 725010 | Marketed by VWR under catalog number 14005976 |
| Micropipette Tip | Fisher Scientific | 212772B | Used for scratching Agar plates |
| Incubator | Binder | 80079098 | Microbiology Incubator,BF Series |
| Shaking Incubator | VWR | 14004300 | VWR Signature Benchtop Shaking Incubators |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
| BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device | BD Biosciences | 357590 | Marketed by VWR under catalog number 53106220 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Being used to seal Agar plates |
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | Enrichment for nutrient medium |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | Enrichment for nutrient medium |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | Enrichment for nutrient medium |
References
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