Abstract
Burada soruşturma kapsamında, özellikle bakteri (S. pasteurii) doğal bir enzim üreaz salgılama yoluyla ortamlarda meydana gelen üre (ureolysis) hidrolizini uyardığı, doğru koşullar altında, kendi yeteneği eşsizdir. ureolysis bu işlem olup, kimyasal reaksiyonlar zinciri yoluyla, kalsiyum karbonat çökeltilerinin oluşmasına neden olur. Bu Mikrobiyolojik Kaynaklı Kalsit Yağış (MICP) olarak da bilinir. MICP için uygun kültür protokolleri burada ayrıntılı. Son olarak, mikroskopi farklı mod altında görselleştirme deneyleri yağış sürecinin çeşitli yönlerini anlamak için yapılmıştır. optik mikroskop gibi teknikleri, Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve X-Işını Foto elektron spektroskopisi (XPS) kimyasal olarak son ürünü karakterize etmek için kullanılmıştır. Dahası, doğal gözenekli ortamın içinde gözeneklerini tıkar bu çökeltilerin yeteneği nerede sünger niteliksel bir deney yoluyla gösterilmiştirçubuklar uzunluk ölçekleri bir dizi olan bir gözenek ağı taklit etmek için kullanıldı. bakteriyel hücreler ihtiva eden kültür ortamı içinde daldırma bir sünger çubuğu nedeniyle kimyasal çöktürme sürekli işlemle elde edilen gözeneklerinin tıkanması sertleşir. sertleştirilmiş çubuk küçük deformasyon ile aynı ağırlığı desteklemek mümkün iken, sıkıştırılmış ve uygulanan bir dış yük altında sıkılmış olur bir kontrol sünger bar karşılaştırıldığında bu sertleştirilmiş sünger çubuk üstün güç sergiler.
Introduction
Sporosarcina pasteurii yüksek alkali ortamlarda (pH ~ 10) 1 hayatta mümkün gram pozitif bir bakteridir ve (MICP) 2-4 Mikrobiyolojik Kaynaklı Kalsit Yağış adında bir fenomenin bir etkeni olabilir bakteri türlerinden biridir. MICP kalsiyum karbonat çökelmesi uygun çevre koşulları altında, belirli mikropların neden olduğu bir işlemdir. S. pasteurii nedeniyle belirli koşullar altında MICP önemli miktarlarda uyarılması için olası bir ajan olarak tanımlanması son yıllarda önem kazanmıştır. Bu olasılık aslında kaynaklanıyor S. pasteurii üreaz enzimi bol miktarda salgılar eşsiz bir yeteneği vardır. Bu enzim, su moleküllerinin varlığında, üre hızlandırılmış bir lizis (yaygın ve bol kaynağı ile doğal olarak meydana gelen biyokimyasal bileşiği) teşvik bir katalizör olarak hareket eder. reaksiyon kaskadı, bu işlem nihai sayesindely negatif yüklü karbonat iyonlarının oluşmasına sebep olur. Bu iyonlar, sırayla, son olarak da, kalsiyum karbonat (kalsit) çökeltilerinin oluşturmak üzere kalsiyum gibi artı yüklü metal iyonları ile reaksiyona; dolayısıyla etiket MICP 5-9.
MICP süreci birkaç on 10,11 bilinen ve incelenmiştir. Geçtiğimiz birkaç yıl içinde, MICP mühendislik ve aşağıdan yukarıya yeşil inşaat 12, büyük ölçekli yapıların 13,14 ve karbon tutumu ve depolanması 15,16 artırılması da dahil olmak üzere çevresel geniş bir uygulama yelpazesi için incelenmiştir.
Örneğin, Cunnigham 17 ve. Al bir Berea kumtaşı çekirdek ihtiva eden yüksek basınçlı bir uygun sıcaklık akış reaktörü tasarlanmıştır. Reaktör bakteri S ile aşılandı fridgidimarina ve yüksek basınçlı süper kritik karbon dioksit, enjeksiyon, gözenek hacim içinde biyokütle büyük birikim koşullarındaumes geçirgenliği fazla% 95 azalmaya yol olan gözlenmiştir. Jonkers ve Schlangen 18 betonda kendi kendini iyileştirme sürecine bakteri bazı özel suşları etkisini incelediler. yüzey boşluklarının giren gözenekli bir şebeke taşınan Harici su da MICP ile yapısal mukavemet yardımcı atıl bakteri aktive etmesi bekleniyor. Tobler 19 ve diğ. S. ureolytic aktivitesini karşılaştırdık büyük ölçekli MCIP lehine koşullar altında yerli yeraltı suyu ureolytic mikrokozmos ile pasteurii ve bulundu S. pasteurii yerli topluluklar önce üreaz aktivitesini yoksun bile kalsit yağış artırmak için tutarlı bir yeteneği vardır. Mortensen 20 et.al toprak tipi, amonyum klorür, tuzluluk, oksijen konsantrasyonu ve MICP üzerindeki hücrelerin parçalanması konsantrasyonu gibi dış faktörlerin etkilerini inceledik. Biyolojik tedavi süreci resp ile çok sağlamdır Onların gösteriEKT parametre uzayında geniş bir varyasyon için üstlenilen bakterileri güçlendirmek için uygun bir zenginleştirme sürecini sağlanan çeşitli büyük ölçekli iyileştirme uygulamaları için bu sürecin uygunluk kanıtlar. Phillips 21 ve. El S. enjekte edildikten sonra bir kum sütun ve bir kumtaşı çekirdek geçirgenliği ve gücü değişiklikleri incelemek için deneyler tasarlanmıştır pasteurii kültürler. kırılma mukavemeti üç kez artarken 4 kez - Onlar geçirgenlik 2 azalırken bulundu.
S. pasteurii ve MICP rolü aktif bir araştırma ve kimyasal çökelme mekanizması ile ilgili çeşitli konularda konu hala tam olarak anlaşılmış değildir vardır. Bunun ışığında, kadar doğru bir kültür S. uygun bir zenginleştirilmiş stok tutarlı standart protokoller bir dizi olması çok önemlidir MICP elde pasteurii. Burada, tekrarlanabilirlik ve yeniden sağlayacak titiz bir protokol özetlemektedir. bu manuscript S. kültür ayrıntılı protokollerini anlatır pasteurii ve uygun çökelmesine neden olmak için bir kültür ortamı zenginleştirmek. süreç optik ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve X-Işını Foto elektron Spektroskopisi (XPS) gibi çeşitli mikroskobik teknikler sayesinde incelenmiştir. Yazının odak noktası MICP süreci üzerinde olduğunu. köklü standart protokolleri olmak SEM ve SIMS gibi prosedürleri, ayrı ayrı tarif edilmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aşağıda açıklanan sırayla deneysel protokol gerçekleştirin. Bakteri kültürü protokolü Bölüm 1 'de tartışılmıştır (aynı zamanda bakınız Şekil 1). Bölüm 2 harici katkı maddeleri kullanılarak kültür ortamı zenginleştirmek için protokol açıklar. Bölüm 3 multi-mode mikroskopi için protokoller açıklanmaktadır. Tüm tek tek bileşenlerin ağırlıkları bir analitik terazi kullanılarak ölçülebilir. her solüsyonun hacmi volümetrik bir silindir kullanılarak ölçülebilir.
NOT: - ayrıntılar için kurumsal güvenlik ofisi danışın 2. Uygun biyogüvenlik protokolleri Bölüm 1 için takip edilmelidir.
1. Bakteriyel kültür
- Kültür Bakteri - Agar Orta Hazırlama Plate
- Bu Petri kapları, şişe gibi, ekipmanı ve malzemeleri monte, Tris-bazlı, HCI, ağar, ultra saf su, pH-metre etc.Sterilize kullanılmadan önce, 121 ° C'de otoklavda tutarak tüm kaplar.
- 0.1 1 L hazırlanmasıMillipore 1 L su ile 15.75 g Tris-bazlı bir karıştırılmasıyla Tris-tampon 3 M sulu çözeltisi. Orijinal çözeltisi (pH 10.4) pH seviyesini düşürmek için HCI (% 50 konsantrasyon) 2.800 ul ekleyin. PH = 9 ayarlamak için bir pH metre kullanılarak sürekli edin.
- aşağıdaki gibi iki kısma 1 L tampon solüsyonu bölün:
- Bu çözeltinin 800 ml alın. 400 ml her biri iki kısma eşit olarak bölünür. 8 g (NH4) 2 SO4 diğer çözeltiye çözeltisi ve 16 g maya özütü, bir geçiş.
- çözeltinin kalan (200 ml) alın ve 100 ml her iki bölüme tekrar bölün. 2 g (NH4) 2 SO4 bir ila karıştırın. 4 g maya özütü ve 4 g agar ekleyin.
- ayrı ayrı Al folyo ilgili şişeler sarma ve otoklav bantları yapıştırma sonra 4 çözüm otoklavlayın.
Not: bir tezgah üstü bir otoklav birimi kullanıldığında, birim, 500 ml (sıcaklık ve basınç otomatları ayarlanmalıdırically) hacminin bir fonksiyonu olarak belirtilmiş. - otoklav onları dışarı aldıktan sonra bir kenara adım 1.3.1 (aşağıda) için iki 400 ml çözüm ayarlayın. 200 ml'lik bir çözelti için iki kez 100 mi çözüm karıştırın. 12 Petri kapları - 10 içine karışımı dökün.
- Kültür Bakteri - Agar Plaka Numune Hazırlama
- Dondurucu (-80 ° C), bakteri stok çıkarın ve erimesine izin verir. Düzgün çözündükten sonra, bakteriyel stok ve biyogüvenlik kaput içinde agar plaka koyun.
- Sporosarcina pasteurii hisse senedi ile ucu istila - (10 ul iyi bir seçimdir 0.5) en küçük mevcut boyutun mikropipet seçin. Streak mikropipet ucu ile bir agar plakası. 48 saat boyunca 31 ° C'de olmayan bir çalkalama inkübatör içinde çizgili agar plaka yerleştirin.
- 48 saat sonra, inkübatör plaka kaldırmak ve tek koloniler varlığını incelemek görsel. Tek bir koloni varsa, o zaman t yerleştirino başka 24 saat için inkübatör.
- Tek koloniler tespit edilene kadar işlemi tekrarlayın. deneme 7 gün aşmayın.
NOT: Tek koloniler bile bir hafta sonra, o adımlar düzgün takip edilmemiş ve tüm süreci adım 1'den tekrarlanması gerektiği sonucuna varılmıştır görünmüyorsa.
- Kültür Bakteriler - Final Numune Hazırlama
- İki 400 mi solüsyon (Tris tamponu + (NH4) karıştırın 2 SO4 ve Tris tamponu + maya özütü (1.5.1) birlikte 800 ml solüsyon. Bir şişe içine Bu çözeltiye 125 ml transfer elde edildi.
- Tek koloniler, yüksek konsantrasyonlu bölgelerin tespit etmek agar levhasının yüzeyi görsel inceleme yapın. Yavaşça dürtmek ve bir mikropipet ucu ile kolonilerin birini kırmak.
- 125 ml'lik bir şişe içine aynı mikropipet ucu batırın ve transfer olsun sağlam çarpma için hücrelerin yeterli sayıda sağlamak için iyice karıştırın. 3 gün - 150 rpm, 2, 30 ° C'de çalkalayıcı bir inkübatör içine yerleştirilir. 2 Sonra - 3 gün, inkübatör şişeyi çıkarın.
- Kültür Bakteriler - Final Hücre Sayısı
- Sayılabilen tek koloniler görünmesini sağlamak için en az on milyon (10 -7) bir seyreltme elde etmek için PBS kullanarak olmayan seyreltilmiş kültür çözeltisi seri seyreltme gerçekleştirin. Agar-plakaları birinde yedi paralel eşit çizgiler çizin.
- üstten görünür olması için yeterli belirgin Petri kabı, alt yüzeyinde kalın çizgiler çizerek bunu yapın. bir segmentine olmayan seyreltilmiş çözeltinin 3 küçük damla damla. 1:10 seyreltme elde etmek için fosfat tamponlu salin (PBS) 9 ml olmayan sulandırılmış çözeltisi 1 ml.
- bir pipet ile bu yeni seyreltilmiş çözeltinin küçük bir kısım (~ 0.1 mi) almak ve bir sonraki bölüm 3 daha fazla küçük damla bırakın. yeni bir balona ve daha fazla seyreltilmiş on kat (10x) tarafından yeni seyreltilmiş çözüm aktarınPBS ekleyerek. Bu 10 -2 veya 1 seyreltme aşağı getiriyor: 100.
- Bir sonraki segmentte 100 çözüm: bu 1 kullanın. 1000 tüm yol: arka arkaya yeni şişelere aktarılması ve sürekli 10 -3 veya 1 den daha seyreltik örnekleri elde etmek PBS ile birlikte on kat (10x) seyreltilmesi o taze seyreltilmiş çözümlerin küçük hacimleri ile işlemek bu işlemi tekrarlayın geçen segmentine aşağı 10 -7 veya 01:10 milyon.
- 31 ° C'de 2 gün 1 - plaka inkübe edildikten sonra agar plakası içinde bulunan hücrelerin sayısını saymak için birim (CFU) plak sayısı koloni oluşturan gerçekleştirin. Bu sulandırılmamış örnekteki bakteri sayısının nicel ölçü verir.
NOT: CFU değeri her koloni ayrı ve tek bir canlı mikrobiyal hücre tarafından kurulan olduğunu varsayarak besleyici ortam, sıcaklık ve zaman belirli koşullar altında koloniler meydana getirmesi sistemin kabiliyetine dayanan ölçülür. - mühürfilmin kendi kendine kapanan ve mağaza gelecekteki kullanım için bir buzdolabı içinde aranan kalan petri tabaklarına konulur.
- Sayılabilen tek koloniler görünmesini sağlamak için en az on milyon (10 -7) bir seyreltme elde etmek için PBS kullanarak olmayan seyreltilmiş kültür çözeltisi seri seyreltme gerçekleştirin. Agar-plakaları birinde yedi paralel eşit çizgiler çizin.
Yağış Hızlandırmak için Besin Zenginleştirilmesi 2. Protokol
- Aktarım çok steril santrifüj tüplerine hazırlanan kültür sıvısı (hücreler + ortam) 9 mi, 10 ml hacim, her.
- Üre: 2 g / L, amonyum klorür: taze ortam aşağıdaki konsantrasyonlarda dört bileşenden oluşan dış zenginleşme 100 ml stok çözelti hazırlayın, 1 g / L sodyum bikarbonat: 212 mg / L, kalsiyum klorür: 280 mg / L'dir. Dikkatli bir analitik terazi kullanılarak tüm malzemeyi ölçülmesi ve otoklav taze bir beher içinde, orta ve yer (121 ° C, 15 psi, 15 dk) ile tüm ama üre karıştırılır.
- Otoklav sonra, taze ortam 1 ml üre (2 mg), gerekli miktarda karıştırmak ve zenginleştirme işlemi tamamlamak için 0.22 um şırınga filtresi ile donatılmış bir şırınga içinden geçmektedir.
- 1 ekleHazırlanan kültür sıvısı (hücreler + ortam) 9 ml ihtiva eden steril santrifüj tüplerine katkı maddeleri ile, bu zenginleştirici ml (adım 2.1).
Not: Tüm bu bileşenlerin, yüksek sıcaklıklarda bozunur olan üre, bir otoklav içinde sterilize edilemez. Diğer bileşenler otoklavlanmış sonra Böylece, (121 ° C, 15 psi, 15 dk), üre, 0.22 um'lik bir şırınga filtre ile en son eklenmektedir.
- Vortex her tüp iyice mekanik bir vorteks cihazı kullanılarak. 30 ° C 'de olmayan bir çalkalama inkübatöründe zenginleştirilmiş sıvı (hücreler + ortam + katkı maddeleri) yerleştirin. yağış başlatılması için düzenli olarak tüm birimleri izleyin. çökeltme başlangıcı çıplak gözle tespit sonra hafif bir mikroskop kullanarak mikroskobik gözlemler başlar. deneylerin başlamasından itibaren 36 saat - Bu, genellikle 30 arasındadır.
Çok modlu Mikroskopi 3. Protokol
- yüksek Magnificat sıvının küçük bir hacim (~ 1 mi) aktarmakiyon parlak bir alan modu ile ilk gözlemler yapmak için coverglass sistemi mikroskopisi odacıklı. Ile başlayan en düşük büyütme (4X) ile tüm gözlemleri başlatın. hangi kapsama alanı ve çökeltilerin dağılımı hakkında dolayısıyla küresel geniş bir bilgi alanı sağlar.
- yağış önemli hacimlerde özellikle alanları seçin ve giderek büyütmeyi artırarak (20X, 40X, 60X) yakınlaştırmak.
NOT: Düzgün (nedeniyle çok yakın kırılma endeksleri) Ekstrasellüler Polimer Madde parlak alanının altındaki (EPS) hücreleri gidermek için imkansız yana gerektiğinde, faz-kontrast modunu açın. Bu modda, (toplu hücre farklı bir faz olarak) hücre membranlarının sadece ana hatları böylece görsel farklılaşma sağlayan görebilir. - Son olarak, kırmızı ölü bileşenleri boyama yaparken seçici yeşil canlı bileşenleri boyalar Live / Dead leke bazı odaları leke. Standart protokollere 28 Bakınız </ Sup>.
- floresan modu anahtarı düzgün kırmızı ve yeşil bölgeler arasında ayrım. Kırmızı (540 Uyarma dalga boyu ile kırmızı filtre küp - 660 nm - 580 nm, 600 595 nm ve Bariyer filtre Dichroic ayna) - 480 nm Dichroic aynanın 440 Uyarma dalga boyu ile ve Yeşil (GFP Uzun-pass Yeşil filtre küp 510 nm) filtre küp 505 nm ve Bariyer filtresi floresan mikrograflar kolaylaştırmak için kullanılır.
- Bir kez tüm multi-mode verileri mümkün olan en iyi kontrast ve netlik elde etmek için en iyi görüntü ve elle bindirme (bireysel aydınlık, faz-kontrast ve floresan görüntüleri) seçin, toplanmıştır.
- Kristal yapıları anlamak için kurutulmuş katı numuneler üzerinde SEM gerçekleştirin. Bu köklü ve standart prosedürdür. 22 fonksiyonel gruplar (karbonatlar) kimyasal imzalarını tespit XPS gerçekleştirin. Bu aynı zamanda köklü ve standart prosedürdür. 23
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S. bir alkaliphile 24 nispeten sert koşullar yaşayabilir olmaktan pasteurii. Yukarıda belirtilen kültür protokolü, S. takip edildiğinde pasteurii bakteri zaman (Şekil 2A) üzerinde kalsiyum karbonat çökelmesine yol açar, bir bölme içine yetiştirilir. Şekil 2 (b) kültür ortamı içinde, bakteriyel hücre popülasyonunun bir faz-kontrast optik mikroskopik bir görüntüsünü gösterir. Bireysel hücreler oldukça belirgin bakteri Bacillus sınıfının karakteristik çubuk benzeri şekiller açıkça ayırt edilebilir. Küçük kahverengi oklar özellikle iki ayrı hücre vurgulamak için kullanılmıştır. Kalsiyum karbonat yağış birkaç günlük bir süre içinde gerçekleşir. Şekil 2A çökeltilerin bir santrifüj tüpünün dibinde yerleşmek nasıl gösterir. Bu canlı ile sıvı ortamda altında oturan bir beyazımsı toz olarak çıplak gözle görülebilirsarımsı bir sıvı olarak karşı renk keskin bir kontrast. Sarımsı bir sıvı kendi kültür ortamında süspansiyon haline bakteriler içerir. Beyaz çökeltiler toplandı ve kurutuldu ve daha sonra SEM (Şekil 2C) kullanılarak görüntülendi.
Şekil 3A'da, iyi tanımlanmış bölme hatları, bir kristallik ayırt edici niteliği içinde kolayca tespit edilebilir. Şekil 3B karakterizasyon için aynı örnek için XPS grafiğini göstermektedir. Karbonat grupları pin noktasına kalsiyum karbonatın varlığı gelen bir zirve. Böylece, Şekil 3A ve B birlikte kesin çöktürülmüş kimyasal olarak kalsit nesil kanıtlamak.
Niteliksel bir deney, gözenekli ortam özelliklerini değiştirmek için MICP kabiliyetini değerlendirmek amacıyla yapıldı. Bu amaçla, gözenekli bir taklit beklenen süngerler içeren bir deney gerçekleştirilmiştirgözenekli yapılarının ölçeklerde bir dizi ortamı olarak tipik bir doğal yapısı bulunur. Bir sünger çubuk (Bay Temiz, P & G) S eden bir çözeltiye daldırıldı 7 gün ve daha sonra kurutulur bir süre için pasteurii. MICP sürecine uzun maruz kaldıktan sonra sünger sertleştirilmiş ve basınç dayanımı artırılmış görüntülenen. Bu, Şekil 4'te gösterilen bir sünger, bir 1 kg ağırlığa (Şekil 4A - B) maruz bırakıldığında immersiyon (kontrol durum), kayda değer bir sıkıştırma gelmeden önce.. Diğer yandan, daha sonra S. daldırma maruz pasteurii çözüm, bunun nedeni ortaya çıkan kalsit yağış gözenek tıkanmasını yaşadı. Bu gözenek alanlarda bir köprü kaynaklanan gücü büyük bir artışa yol açtı ve daha sonra önemli sıkıştırma (Şekil 4C - D) izin vermeden 1 kg yükü desteklemek için bar sağladı.
Bir yarı-kantitatif bir fikirsertleşme sürecine ilişkin yüklü çubuğun sapma yüksekliği ölçümleri ile elde edilebilir. Orijinal sünger örnek 4.5 cm yüksekliğinde bir dikdörtgen çubuktur. çok yük uygulanması alanına yakın kontrol, numunenin eğilmesine, yaklaşık 1.6 cm'dir. muamele edilmiş numune halinde, saptırma 0.6 cm azaltır. sertleştirme işleminin daha sıkı bir miktar, aynı zamanda mümkündür. Örneğin, kesme mukavemeti, en yüksek deviatorik stres ve Genleşim açı artışı açısından bu işlemin mekanik bir açıklama Tagliaferri 25 ve arkadaşları tarafından önerilmiştir. X-ışını görüntüleme ve dijital görüntü korelasyon yoluyla ark.
Şekil 1. Bir Algoritmik Şematik olarak temsil Bütün Kültür Protokolü Anahat., Tris-tampon ve agar çözeltisi ile başlamak için poure olduğunuBir Petri kabındaki, d. Agar plaka hazır olduğunda, bu bakteri ile enfekte bir ipucu çizgiler var. çizgili plaka tek koloniler büyümeye inkübe edilir. Tek koloniler biri medya şişeye aktarılır ve tekrar inkübe edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Hücreler ve Çökelme (A) gözlemlenebilir kimyasal yağış temizlemek için bir santrifüj tüpü kurşun içinde sınırlı kültür ortamında (5 sonra - 7 gün) hücreler. Altta yerleşir ve çıplak gözle görülebilir. Faz kontrastı altında görülen bir yüzey üzerinde immobilize bakteri (B) nüfus. Bağımsız çubuk şeklindeki hücreler (basiller, etiketli Sp) açık bir şekilde görülebilir (oklarla vurgulanan onlardan bir çift). Her iki hücreleri (Sp) ve kristaller (Cc) gösteren beyaz çökelek (C) SEM görüntüsü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Kristaller ve Bunların Karakterizasyonu. Kurutulmuş çökelek (A) Taramalı elektron mikroskobu görüntüsü. Bireysel kristaller ve ilişkili bölünme çizgileri net bir şekilde görülebiliyor. Kimyasal çökelti (B) X-Işını Foto elektron spektroskopisi (XPS) grafik; fonksiyonel grup kalsit varlığına ihtimal güçlendirmek karbonat karşılık gelen kütle spektrometresi zirveleri. vi için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu Ew.
Şekil 4. Bir Yarı kantitatif Prototip Gözenekli Medya olarak hizmet veren Sünger Barlar deneyin. (A) ve (B) daldırma değil taze kuru örneklerdir. (C) ve (D) ortam ve hücreler bir çözelti içinde boğulmuş Islak numuneler; bu, sabit bir ağırlığın etkisi altında buradan indirgenmiş basınç görüldüğü gibi kalsit çökeltme kaynaklanan gözenek tıkanması malzeme direncinde önemli bir artış sergilerler. Tedavi edilmeyen numuneler doğal gözenekli ve 1 kg ağırlığa maruz bırakıldığında hacminde büyük düşüş görülür. Gözenekler boyutunda genel bir azalmaya yol açan, havayı ve sözleşme sıkmak. Diğer taraftan, muamele edilen numune yapay gözenek tıkanması nedeniyle sertliği önemli miktarda kazanmıştır. Rahatça herhangi bir sıkıştırma olmadan aynı yükü destekleyen zaman gücü belirgin bir artışı göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritik Adımlar: Bu yazının S. uygulanabilir bir örneğini kültürü için detaylı protokolleri açıklar pasteurii. Kültür hazırlandılar sonra, uygun olarak zenginleştirilmiş olmalıdır. Uygun kimyasal ortamı sağlamak için bir başarısızlık ya çok uzun zaman ölçekleri yağış veya bunun tam eksikliği yol açar, çünkü bu deney başarısı için çok önemli bir adımdır. S. pasteurii birkaç dış ajanslar oldukça duyarlıdır ve biyokimyasal sağlamlık ve tekrarlanabilirlik sağlamak için bakım ve hassas bir yüksek derecesi ile kültür olmalıdır. zenginleşme miktarı ve dozaj hemen çökelme kimyasal yapısı dikte bilinmektedir ve bu nedenle de doğru bir şekilde kontrol edilmelidir.
Değişiklikler / Sorun Giderme: Çeşitli yönleri son sonuçlarında küçük varyans ile modifiye edilebilir. plaka sayısı th başına (Seri Seyreltme yukarıda anlatılan teknik başına gerçekleştirilen gerekmez) Miles Misra Yöntemi e. Burada, seri seyreltme alt yüzeyinde çizilen tonların yedi bölgelere bölerek tek agar plakası üzerine uygulanmıştır. Bu zorunlu değildir. Aynı zamanda, bir yayma levhasının hazırlanması, belirli bir seyreltme için bütün bir agar plaka kullanılması yaygın bir uygulamadır. Nihai hesaplanması için seçilir - Seri seyreltme izleyen dağılma plakalarından bir dizi tek koloniler (200 20) sayılabilir sayıda bir gerçekleştirilir. çeşitli hücre sayımı tekniklerden herhangi burada da uygulanabilir. Mikroskopi iyi basit kapak fişleri veya slaytlar ile yapılabilir. Bir bölme birimi tüm zorunlu değildir.
Bazen bakteriler çökelti oluşturma başarısız olabilir. İlk sıvı bir ortam içinde dondurulmuş kültürünün bir miktar aktarmak için yararlıdır. Büyüme, sıvı ilk oluştuktan sonra streaking gerçekleştirilebilir.
Sınırlamalar: Bu nu ile yavaş bir tekniktiradımlardan mber, birbirlerinden yol açar. tüm adımlarda kontaminasyon, çapraz kontaminasyon ve diğer kültürel kusurları önemli şansı vardır. Yoğun bakım her zaman muhafaza edilmelidir. çökeltinin yaklaşık 180 mg kültürü, çözeltinin ml'si başına oluşturulur.
Önemi: Mevcut protokol gerekli tüm adımları sağlamak için ayrıntılı olarak özetliyor bu bakterinin S. kültürü pasteurii sadakatle dıştan eklenen zenginleşme etkisi altında kalsit çöker. Bu bakterinin kendisi kültürü iyi kurulmuş bir protokol, zenginleştirme ve miktar tüm süreç olmasına rağmen değildir. Bu sorun burada ele alınmıştır.
Gelecekteki Uygulamalar: Bu basınç da çökeltilerin doğasına bağlı olarak, çeşitli uygulamalar için tasarlanmış olabilir farklı şekilde çöktürmek için bu bakteri modüle etmek mümkün olabilir. Daha önce sözü edilen oradaMICP S. karıştığı ile ilgili birkaç bilinmeyenler var pasteurii. Bu bilinmeyenlerin bazıları S. aggregative dinamiklerinin rolünü içerir Bu gözenekli ortam ve sıvı akışının etkisi, MICP işlemde mikro çevre 26,27 rolünü pasteurii. Bir standart bir protokol uygun multi-mode mikroskopisi gerçekleştirmek için net bir fırsat hızlı yağış sağlayan bu geliştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Petridish | Fisher Scientific | FB0875712 | Petridishes being used as Agar plate |
| Pyrex Flasks | Fisher Scientific | S63268 | Corning Erlenmeyer |
| Tris-Base | Promega | H5133 | being used to make Tris-Buffer |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1.0 N, Bioreagent, suitable for cell culture |
| Agar Powder | Sigma-Aldrich | A1296 | microbiology tested, plant cell culture tested, cell culture tested, powder |
| Ammonium Sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | for Molecular Biology |
| Yeast extract powder | Sigma-Aldrich | 51475 | |
| Measuring Cylinder | Cole-Parmer | CP08559GC | Cole-Parmer Class A Graduated Cylinder w/Cal Cert,TC; 1,000 ml,1/Pk |
| Analytical Balance | OHAUS | AX124E | being used to measure weight of reagents |
| Autoclave | Brinkmann | 58619000 | |
| Autoclave Tape | VWR | 52428864 | |
| Aluminum Foil | Sigma-Aldrich | Z185140 | being used to seal the flask before placing it in Autoclave |
| Bacterial Stock | Cedarlane | 11859 | -80 °C stock of S. pasteurii, ATCC No. is mentioned against Cat. No. |
| Mline Single-Channel Mechanical Pipettors, Variable Volume | Biohit | 725010 | Marketed by VWR under catalog number 14005976 |
| Micropipette Tip | Fisher Scientific | 212772B | Used for scratching Agar plates |
| Incubator | Binder | 80079098 | Microbiology Incubator,BF Series |
| Shaking Incubator | VWR | 14004300 | VWR Signature Benchtop Shaking Incubators |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P7059 | |
| BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetting Device | BD Biosciences | 357590 | Marketed by VWR under catalog number 53106220 |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Being used to seal Agar plates |
| Urea | Sigma-Aldrich | U1250 | Enrichment for nutrient medium |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S8875 | Enrichment for nutrient medium |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | Enrichment for nutrient medium |
References
- Gibson, T. An investigation of the Bacillus pasteurii group. Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).
- Greenfield, L. J. Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium. Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).
- Phillips, A. J. Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review. Biofouling. 29, 715-733 (2013).
- Dhami, N. K., et al. Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review. Frontiers in microbiology. 4, 314 (2013).
- Cuthbert, M. O., et al. Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation. Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).
- Okwadha, G. D., et al. Optimum conditions for microbial carbonate precipitation. Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).
- Stocks-Fischer, S., et al. Microbiological precipitation of CaCO3. Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).
- Lauchnor, E. G., et al. Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system. Environmental science & technology. 47, 1557-1564 (2013).
- Al Qabany, A., et al. Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation. Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).
- Morita, R. Y. Calcite precipitation by marine bacteria. Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).
- Chafetz, H. S. Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation. Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).
- Biomason.com. , Available from: http://www.biomason.com (2015).
- Whiffin, V. S. Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement. , Murdoch University. PhD thesis (2004).
- Paassen, L. A., et al. Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method. Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2. Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Cunningham, A. B., et al. Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers. Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).
- Jonkers, H. M., et al. Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete. Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).
- Tobler, D. J., et al. Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies. Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).
- Mortensen, B. M., et al. Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation. Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).
- Phillips, A. J., et al. Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation. Environmental science & technology. 47, 142-149 (2013).
- Robbins, R. Scanning Electron Microscope Operation. , Available from: http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf (2010).
- vander Heide, P. X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices. , John Wiley & Sons. (2011).
- Wiley, W. R., et al. Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii. Journal of Bacteriology. 84, (1962).
- Tagliaferri, F., et al. Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging. Granular Matter. 13, 247-250 (2011).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).
- Valiei, A., et al. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).
- LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf, https://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/live-dead-baclight-bacterial-viability-protocol.html (2004).
